成品煙菸絲總dna的提取方法

2023-08-22 08:41:31

專利名稱：成品煙菸絲總dna的提取方法
技術領域：
本發明涉及菸絲技術領域，尤其是成品煙菸絲總DNA的提取方法。
背景技術：
在實際生產中，由於年景的不同，菸葉會受到氣候等因素的影響，某些地區的菸葉質量會發生波動，造成捲菸質量也發生波動。捲菸企業就會根據菸葉變化情況對葉組配方進行調整，即進行菸葉臨時替代。在菸葉臨時替代過程中，菸葉品種的變化對捲菸感官品質有重要影響。通過提取得到捲菸菸絲中DNA，建立捲菸產品的DNA指紋資料庫，將捲菸配方 DNA指紋圖譜與捲菸感官評吸相結合，能對捲菸市場產品質量監督檢查提供更科學的依據， 如通過對捲菸菸絲DNA的分析，能從根本上鑑別出捲菸的真偽；捲菸作為一種轉基因的模式植物，為杜絕進出口捲菸中的轉基因成分，對捲菸進行出口前檢測是必不可少的工作環節。因此，研究一種簡單、快速的捲菸菸絲中DNA的提取方法對捲菸質量的監控、捲菸真偽鑑別和捲菸轉基因檢測都有重要意義。然而捲菸是一種深加工食品，而加工程度越深， DNA的提取難度就越大。成品捲菸菸絲已經不能提取得到完整的基因組DNA。因為成品菸絲與新鮮菸葉的不同在於其經過初烤、復烤、切絲、烘絲等工序中的高溫、高壓、高溼、機械加工剪切以及加香加料後製成菸絲，不但增加了 DNA提取過程中的汙染物，還使基因組DNA 嚴重降解，成為小於IOOObp的小片段。由於菸草植物中次生代謝產物多酚類化合物可介導 DNA降解，而多糖的汙染也是影響菸草DNA純度最常見的問題。朱生偉等利用改良後SDS法提取得到新鮮菸葉中可用菸草育種，較純淨、高產率、 大分子量的基因組DNA。寇姝燕等通過對比研究表明二次選擇法得到的高分子量DNA總量更高，同時二次選擇法得到的純度更高，可以用於製備菸草BAC文庫。任如意等以改良CTAB法提取復烤菸葉DNA，經U-3000紫外分光光度計測定，所獲 DNA呈典型的吸收曲線，且0擬60/0D280在1. 7 1. 9之間；對菸草葉綠體不編碼序列進行 PCR擴增，獲得理想條帶。國際菸草科學研究中心介紹了提取新鮮菸葉基因組DNA的鹼裂解法、改良後的 CTAB法和酚/氯仿抽提法，同時指出，菸絲DNA的提取還需進一步研究。國內外關於菸草DNA的提取技術研究都是基於新鮮菸葉或者復烤菸葉，而對成品捲菸菸絲的DNA提取技術研究，國內外鮮見相關文獻報導。

發明內容
本發明針對不足，提出一種成品煙菸絲總DNA的提取方法，減少成品煙菸絲中的雜質，提高菸絲總DNA的提取效率，便於後續的成品菸品牌鑑定和轉基因檢測等。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案一種成品煙菸絲總DNA的提取方法，包括以下步驟
①、用65% 80%的乙醇水溶液浸泡成品煙菸絲，室溫下7 9小時；過濾取濾 液，40°C 50°C烘乾；②、向步驟①烘乾產品中加入2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩衝液，充分混勻， 於 60°C 70°C保溫 20 40min ；③、步驟②反應產物降溫至室溫，加入與步驟②提取緩衝液相同體積的氯仿/異 戊醇混合液，混勻後離心，取上清液；④、步驟③上清液中加入用量與步驟②提取緩衝液相同體積的2X十六烷基三乙 基溴化銨提取緩衝液，以及用量與步驟②提取緩衝液相同體積的氯仿/異戊醇混合液，混 勻；離心，取上清液；⑤、向步驟④上清液中加入1 2倍體積的十六烷基三乙基溴化銨沉澱緩衝液，混 勻，靜置；離心，得沉澱物；⑥、向步驟⑤的沉澱物中加入1. 2 1. 5mol/L NaCl溶液，攪拌溶解；離心取上清 液；⑦、向步驟⑥得到的上清液中加入2 4倍體積經-20°C _30°C預冷的無水乙 醇，混勻，靜置；離心，得沉澱物。優選的，步驟③、④、⑤、⑥或⑦中離心的條件為12000 15000r/min，10 15min。優選的，所述步驟②或④中2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩衝液由下述組分構
成
100腿ol/L三羥曱基氨基曱烷鹽酸溶液，PH為8.0
2Ommol /L乙ニ胺四乙酸
1.4mmol/LNaCl
2wt %十六坑基三乙基溴化銨
4 Ommo 1 / L p-疏基乙醇。優選的，所述步驟⑤中十六烷基三乙基溴化銨沉澱緩衝液由下述組分構成
50匪ol/L三羥曱基氨基曱烷鹽酸溶液，pH為8.0
IOmmol /L乙ニ胺四乙酸
Iwt %十六坑基三乙基溴化銨
2Ommot /L 疏基乙醇。優選的，步驟②中的2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩衝液為在65°C預熱過的。優選的，步驟①中用的乙醇水溶液為70%。優選的，步驟①中浸泡時間為8小吋。優選的，步驟⑤中十六烷基三乙基溴化銨沉澱緩衝液的用量為上清液體積的2倍。優選的，步驟⑤中靜置為0.8 2小吋。
優選的，步驟⑦中靜置為20°C下靜置30min。與現有技術相比，本發明根據菸絲中的外加香精香料，如單糖等，大部分是水溶性或醇溶性混合物，以及DNA在一定濃度(65% 80%)的乙醇水溶液中溶解度最小，利用乙醇水溶液處理成品煙菸絲，處理掉部分雜質，而又不溶出部分菸絲斷面細胞中的DNA。本發明的提取方法與傳統的十六烷基三乙基溴化銨法(CTAB法)相比，將傳統 CTAB法在DNA沉澱時使用的等體積CTAB沉澱緩衝液，增加直至2. 0倍體積CTAB沉澱緩衝液，提高了 DNA的沉澱效率，降低DNA提取難度。


圖1是本發明實施例1產品的菸絲總DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；圖2是本發明實施例2產品的菸絲總DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測
1 為 DNA 標樣；M 為 250bp DNA ladder marker。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細描述，本部分的描述僅是示範性和解釋性，不應對本發明的保護範圍有任何的限制作用。實施例1從成品煙的菸絲中提取總DNA的方法，包括以下步驟1)將購於鄭州某品牌捲菸一支成品煙的菸絲取出，用70%的乙醇水溶液浸泡菸絲，室溫放置8小時；2)吸出浸泡之後的溶液，40 0C，30分鐘烘乾；3)轉至研缽中，用液氮冷卻研磨，將煙末分裝置6個1. 5mL離心管中。4)向盛有樣品的1.5ml離心管中，加入750 μ L 65°C預熱的2XCTAB提取緩衝液， 充分混勻；5)於65°C溫育30min，期間顛倒混勻離心管4_5次；6)冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒混勻後，12000r/min離心 IOmin ；7)取上清，加入等體積的2 X CTAB提取緩衝液和氯仿/異戊醇，混勻，12000r/min 離心IOmin ；8)加入2. 0倍體積CTAB沉澱緩衝液，顛倒混勻後，室溫靜置lh，使沉澱生成；9) 10000r/min 離心 lOmin，棄去上清液；10)沉澱用 800 μ L 1. 2mol/L NaCl 溶液溶解；11) 12000r/min 離心 lOmin，棄不溶物；12)轉移上層水相至1. 5mL離心管中，加入2倍體積的無水乙醇(_20°C預冷)，顛倒混勻後，於20°C下靜置30min ；13) 12000r/min離心20min，小心棄去上清液；14)沉澱溶於40 μ L超純水中，4°C保存備用。實施例2從成品煙的菸絲中提取總DNA的方法，包括以下步驟
1)將購於鄭州某品牌A捲菸一支成品煙的菸絲取出，用70%的乙醇水溶液浸泡菸絲，室溫放置8小時；2)吸出浸泡之後的溶液，40 0C，30分鐘烘乾；3)轉至研缽中，用液氮冷卻研磨，將煙末分裝置6個1. 5mL離心管中。4)向盛有樣品的1.5ml離心管中，加入750 μ L 65°C預熱的2XCTAB提取緩衝液， 充分混勻；5)於65°C溫育30min，期間顛倒混勻離心管4_5次；6)冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒混勻後，12000r/min離心 IOmin ；7)取上清，加入等體積的2 X CTAB提取緩衝液和氯仿/異戊醇，混勻，12000r/min 離心IOmin ；8)加入1. 0倍體積CTAB沉澱緩衝液，顛倒混勻後，室溫靜置lh，使沉澱生成；9) 10000r/min 離心 lOmin，棄去上清液；10)沉澱用 800 μ L 1. 2mol/L NaCl 溶液溶解；11) 12000r/min 離心 lOmin，棄不溶物；12)轉移上層水相至1. 5mL離心管中，加入2倍體積的無水乙醇(_20°C預冷)，顛倒混勻後，於20°C下靜置30min ；13) 12000r/min離心20min，小心棄去上清液；14)沉澱溶於40 μ L超純水中，4°C保存備用。實施例1和實施例2中，採用相同的某品牌捲菸，不同的是實施例1中DNA沉澱 (步驟8)採用的是2XCTAB沉澱緩衝液。對實施例1和2的產品進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖1和2所示。在DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析中，DNA與溴化乙錠結合後，在紫外透射的情況下顯紅色，瓊脂糖顯淡藍色，但是在文獻、著作中常採用黑白圖片。DAN分子通過具有網絡結構的瓊脂糖凝膠時會受到阻力，大分子物質在泳動時受到的阻力大，因此，在相同時間相同電壓下，DNA片段越大，位移越小，DNA片段越小，位移越大。此外，DNA片段濃度越大，在瓊脂糖凝膠上顯示的亮度越亮。如圖2，在250bp DNA ladder marker條帶中，IOOObp條帶到點樣孔的距離比500bp條帶小。IOOObp條帶DNA片段量為150ng，而500bp條帶DNA片段量為50ng (參照250bp DNA ladder marker使用說明書每次取5 μ L 250bp DNA ladder marker電泳時，每條帶的DNA量為50ng，其中IOOObp 的DNA片段量為150ng，顯示亮帶)，因此IOOObp條帶比500bp條帶亮。本發明中，提取得到的成品煙菸絲總DNA是大小不一的DNA片段，在瓊脂糖凝膠上顯示白色塗帶。圖1中樣品DNA在IOOObp以下都出現亮帶，說明圖1中樣品DNA最大片段為lOOObp，同理在圖2中樣品DNA最大片段為500bp，且圖1中樣品DNA明顯比圖2中樣品 DNA亮，說明圖1中樣品DNA濃度比圖2中樣品DNA大。 因此，本發明中採用的2. 0倍體積CTAB沉澱緩衝液，不但能提高DNA的濃度，而且能獲得菸絲中更大片段DNA(IOOObp)。 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種成品煙菸絲總DNA的提取方法，包括以下步驟①、用65% 80%的乙醇水溶液浸泡成品煙菸絲，室溫下7 9小時；過濾取濾液， 40°C 50°C烘乾；②、向步驟①烘乾產品中加入2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩衝液，充分混勻，於 60°C 70°C保溫 20 40min ；③、步驟②反應產物降溫至室溫，加入與步驟②提取緩衝液相同體積的氯仿/異戊醇混合液，混勻後離心，取上清液；④、步驟③上清液中加入用量與步驟②提取緩衝液相同體積的2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩衝液，以及用量與步驟②提取緩衝液相同體積的氯仿/異戊醇混合液，混勻 』離心，取上清液；⑤、向步驟④上清液中加入1 2倍體積的十六烷基三乙基溴化銨沉澱緩衝液，混勻， 靜置；離心，得沉澱物；⑥、向步驟⑤的沉澱物中加入1.2 1. 5mo 1/L NaCl溶液，攪拌溶解；離心取上清液；⑦、向步驟⑥得到的上清液中加入2 4倍體積經_20°C -30°C預冷的無水乙醇，混勻，靜置；離心，得沉澱物。
2.如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於步驟③、④、⑤、⑥或⑦中離心的條件為 12000 15000r/min，10 15min。
3.如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於所述步驟②或④中2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩衝液由下述組分構成100腿ol/L 三羥曱基氨基曱烷鹽酸溶液，PH為8.02Ommol /L 乙二胺四乙酸1.4mmol/L NaCl2wt %十六坑基三乙基溴化銨4 Ommo 1 / L ρ-疏基乙醇。
4.如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於所述步驟⑤中十六烷基三乙基溴化銨沉澱緩衝液由下述組分構成50匪ol/L 三羥曱基氨基曱烷鹽酸溶液，pH為8.0IOmmol /L 乙二胺四乙酸Iwt %十六坑基三乙基溴化銨2Ommot /L 疏基乙醇。
5.如權利要求1或3所述的提取方法，其特徵在於步驟②中的2X十六烷基三乙基溴化銨提取緩衝液為在65°C預熱過的。
6.如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於步驟①中用的乙醇水溶液為70%。
7.如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於步驟①中浸泡時間為8小時。
8.如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於步驟⑤中十六烷基三乙基溴化銨沉澱緩衝液的用量為上清液體積的2倍。
9.如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於步驟⑤中靜置為0.8 2小時。
10.如權利要求1所述的提取方法，其特徵在於步驟⑦中靜置為20°C下靜置30min。
全文摘要
本發明公開了一種成品煙菸絲總DNA的提取方法，改良了傳統的CTAB法提取DNA方法，事先採用70％乙醇水溶液對樣品的前處理，加大CTAB沉澱緩衝液體積，解決了成品煙菸絲中DNA提取難度大的難題，為各類捲菸的總DNA提取提供了一套穩定、完整、可行的方法。本發明的提取方法提高了DNA的沉澱效率，降低DNA提取難度。
文檔編號C12N15/10GK102286461SQ20111017218
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月24日 優先權日2011年6月24日
發明者於海順, 崔成哲, 樸永革, 李元實, 王春利, 金哲, 馬林 申請人:吉林菸草工業有限責任公司, 鄭州輕工業學院