一種始興石斛優質種苗無性克隆快速繁殖方法與流程

2023-10-06 22:13:24

本發明涉及通過組織培養技術的植物再生領域，具體涉及一種始興石斛優質種苗無性克隆快速繁殖方法和所使用的培養基。

背景技術：

始興石斛，拉丁名Dendrobium shixingense，於2010年發現於廣東北部始興縣，現僅在廣東及其與江西交界的少數地區發現有分布，適生海拔約400-600米，具有重要的藥用、觀賞、科研、保護等價值。與目前市場價值良好的鐵皮石斛相比，始興石斛的葉色、莖色為紅棕色，更具觀賞性，花色紫紅色，色彩更加迷人，嚼之粘性更強、口感更清甜，加上其萌芽率高，抗逆性、抗病蟲性較強，其發展前景十分廣闊，適合栽培觀賞和科研保護以及作為藥用的石斛原材料。

現有的繁殖方式發現對始興石斛種子進行無菌播種時，培養出來的後代有分離現象，各種形狀參差不齊。由於種源間的顯著差異，傳統的無菌播種有性繁殖體系很難解決種苗的一致性和穩定性，難以保持母株的優良性狀，針對此問題，現在無性繁殖已經被業內很多專家認為是具有發展前景的技術。例如公告號為CN101855993B、名稱為「齒瓣石斛無性系種苗繁殖方法」的專利就公開了一種齒瓣石斛無性系種苗繁殖方法，其以齒瓣石斛優質單株為材料，以莖段作為外植體，經消毒處理後進行誘導培養、增殖培養、生根培養等過程不僅使種苗保持母株的優良性狀，而且還提高了種苗繁殖係數。因此有必要探索適合於始興石斛的無性快速繁殖方法，即探索以優良單株的嫩芽為外植體，利用離體組織，培養無性克隆的快速繁殖方法，以提高其繁殖倍數，繁殖出規格劃一、形狀穩定一致的優質種苗，滿足新優石斛藥材的發展需求。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是探索始興石斛的無性快速繁殖方法，以解決繁殖後代的分離現象、形狀參差不齊，不利於商品化生產的問題。

為了解決上述技術問題，本發明提出一種始興石斛優質種苗無性克隆快速繁殖方法及其所使用的培養基，技術方案包括以下步驟：

一、預處理、誘導培養

選取始興石斛株系，用水衝洗乾淨，剪去葉片，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒5～10分鐘，無菌水衝洗4～5次，切取高1～2釐米帶節的莖段，接種到類原球莖誘導培養基M1，45天後，莖段在培養基上有腋芽產生，莖段基部切口膨大形成顆粒突起；

二、形成類原球莖

轉接至上述培養基M1上，再經過50天培養，形成類原球莖，誘導類原球莖階段的培養溫度為25±2℃，光照度1500～2000Lx，光照12小時/天；

三、類原球莖增殖

將獲得的類原球莖繁殖材料轉接至增殖培養基M2中，在該培養基上培養45天後，類原球莖增殖倍數可達到8倍以上；經過3代類原球莖增殖培養可獲得足夠的繁殖材料進行類原球莖分化培養，類原球莖增殖階段的培養溫度為25±2℃，光照度1500～2000Lx，光照12小時/天；

四、分化培養

將獲得的類原球莖繁殖材料轉接至分化培養基M3中，45天後，類原球莖在培養基上分化形成高3～5釐米不定芽，類原球莖分化階段的培養溫度為27±2℃，光照度2000～3000Lx，光照12小時/天；

五、生根壯苗

將高3～5釐米的不定芽，轉到生根壯苗培養基M4，培養60天時，苗高可達到5～7釐米，根數3～5條，生根率為95％以上，生根壯苗階段的培養溫度為27±2℃，光照度2000～3000Lx，光照12小時/天；

六、移栽

將生根培養50-70天的試管苗在強光照下煉苗7天後出瓶，移栽時，從培養瓶中取出生根苗，洗淨附著的培養基後，用千分之一的高錳酸鉀溶液浸泡5分鐘，種植基質採用已經發酵好的闊葉林樹皮和木屑的混合基質，注意保持適宜溼度和溫度，置於陰涼通風處栽培，成活率可達95％以上，25-35天成活後的植株產生新的根系，移入大棚進行正常水、肥、藥管理。

上述類原球莖誘導培養基M1的成分為：每升含花寶1號1～2g，蛋白腖0.5～2g，椰子汁50～100mL，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，6-苄基嘌呤5.0～8.0毫克，萘乙酸0.2～2mg，蔗糖15～30g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6。

上述增殖培養基M2的成分為：每升含花寶1號1～2g，蛋白腖0.5～2g，土豆泥40～80g，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，6-苄基嘌呤2.0～5.0毫克，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖15～30g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6。

上述分化培養基M3的成分為：每升含花寶1號1～2g，蛋白腖0.5～2g，土豆泥40～80g，活性碳50～100mg，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，6-苄基嘌呤3.0～6.0毫克，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖15～30g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6。

上述生根壯苗培養基M4的成分為：每升含花寶1號1～2g，蛋白腖0.5～2g，土豆泥40～80g，活性碳500～1000mg，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖15～30g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6。

本發明的有益效果在於：

1，本發明通過選取始興石斛優良單株，然後利用植物組織培養技術進行優質種苗的快速大量繁殖，有利於實現始興石斛種苗的規模化、商品化生產。

2，本發明只需有簡單的植物組織培養設備即可進行，利用植物組織細胞的全能性和植物組織培養等技術進行珍稀植物種苗的規模化生產，可以成功地進行始興石斛無性克隆和快速大量繁殖，具有低成本，高效率的特點。

附圖說明

圖1為本發明的流程示意圖。

具體實施方式

現結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步的說明。

如圖1所示，本發明提出的一種始興石斛優質種苗無性克隆快速繁殖方法，主要步驟包括預處理、誘導培養，形成類原球莖，類原球莖增殖，分化培養，生根壯苗和移栽。

以下通過實施例形式對本發明的上述步驟內容再作進一步的詳細說明。

實施例1

1.取材：在生長季節在華南植物園選取始興石斛種質圃生長旺盛的優良單株的當年生嫩芽為外植體。

2.選取始興石斛株系，用水衝洗乾淨，剪去葉片，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒5分鐘，無菌水衝洗4～5次，切取高1～2釐米帶節的莖段，接種到類原球莖誘導培養基M1，45天後，莖段在培養基上有腋芽產生，莖段基部切口膨大形成顆粒突起；轉接至上述培養基M1上，再經過50天培養，形成類原球莖，誘導類原球莖階段的培養溫度為25±2℃，光照度1500Lx，光照12小時/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉接至增殖培養基為M2，在該培養基上培養45天後，類原球莖增殖倍數可達到8倍以上；經過3代類原球莖增殖培養可獲得足夠的繁殖材料進行類原球莖分化培養，類原球莖增殖階段的培養溫度為25±2℃，光照度2000Lx，光照12小時/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉接至分化培養基為M3，45天後，類原球莖在培養基上分化形成高3～5釐米不定芽，類原球莖分化階段的培養溫度為27±2℃，光照度2000Lx，光照12小時/天；將高3～5釐米的不定芽，轉到生根壯苗培養基M4，培養60天時，苗高可達到5～7釐米，根數3～5條，生根率為95％以上，生根壯苗階段的培養溫度為27±2℃，光照度3000Lx，光照12小時/天；將生根培養50-70天的試管苗在強光照下煉苗7天後出瓶，移栽時，從培養瓶中取出生根苗，洗淨附著的培養基後，用千分之一的高錳酸鉀溶液浸泡5min，種植基質採用已經發酵好的闊葉林樹皮和木屑的混合基質，注意保持適宜溼度和溫度，置於陰涼通風處栽培，成活率可達95％以上，25-35天成活後的植株產生新的根系，移入大棚進行正常水、肥、藥管理。

類原球莖誘導培養基M1的成分為：每升含花寶1號1g，蛋白腖2g，椰子汁50mL，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4mg，煙酸0.8mg，6-苄基嘌呤5.0毫克，萘乙酸2mg，蔗糖15g，瓊脂7g，pH 5.4。

增殖培養基為M2的成分為：每升含花寶1號1g，蛋白腖2g，土豆泥40g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4mg，煙酸0.8mg，6-苄基嘌呤2.0毫克，萘乙酸0.5mg，蔗糖15g，瓊脂7g，pH 5.4。

分化培養基為M3的成分為：每升含花寶1號1g，蛋白腖2g，土豆泥40g，活性碳100mg，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素0.05mg，鹽酸吡哆醇0.8mg，煙酸0.4mg，6-苄基嘌呤6.0毫克，萘乙酸0.2mg，蔗糖30g，瓊脂6g，pH 5.6。

生根壯苗培養基M4的成分為：每升含花寶1號1g，蛋白腖2g，土豆泥40g，活性碳1000mg，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素0.05mg，鹽酸吡哆醇0.8mg，煙酸0.4mg，萘乙酸0.5mg，蔗糖15g，瓊脂7g，pH 5.4。

實施例2

1.取材：在生長季節在華南植物園選取始興石斛種質圃生長旺盛的優良單株的當年生嫩芽為外植體。

2.選取始興石斛株系，用水衝洗乾淨，剪去葉片，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒10分鐘，無菌水衝洗4～5次，切取高1～2釐米帶節的莖段，接種到類原球莖誘導培養基M1，45天後，莖段在培養基上有腋芽產生，莖段基部切口膨大形成顆粒突起；轉接至上述培養基M1上，再經過50天培養，形成類原球莖，誘導類原球莖階段的培養溫度為25±2℃，光照度2000Lx，光照12小時/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉接至增殖培養基為M2，在該培養基上培養45天後，類原球莖增殖倍數可達到8倍以上；經過3代類原球莖增殖培養可獲得足夠的繁殖材料進行類原球莖分化培養，類原球莖增殖階段的培養溫度為25±2℃，光照度1500Lx，光照12小時/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉接至分化培養基為M3，45天後，類原球莖在培養基上分化形成高3～5釐米不定芽，類原球莖分化階段的培養溫度為27±2℃，光照度3000Lx，光照12小時/天；將高3～5釐米的不定芽，轉到生根壯苗培養基M4，培養60天時，苗高可達到5～7釐米，根數3～5條，生根率為95％以上，生根壯苗階段的培養溫度為27±2℃，光照度2000Lx，光照12小時/天；將生根培養50-70天的試管苗在強光照下煉苗7天後出瓶，移栽時，從培養瓶中取出生根苗，洗淨附著的培養基後，用千分之一的高錳酸鉀溶液浸泡5min，種植基質採用已經發酵好的闊葉林樹皮和木屑的混合基質，注意保持適宜溼度和溫度，置於陰涼通風處栽培，成活率可達95％以上，25-35天成活後的植株產生新的根系，移入大棚進行正常水、肥、藥管理。

類原球莖誘導培養基M1的成分為：每升含花寶1號2g，蛋白腖0.5g，椰子汁100mL，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素0.05mg，鹽酸吡哆醇0.8mg，煙酸0.4mg，6-苄基嘌呤8.0毫克，萘乙酸0.2mg，蔗糖30g，瓊脂6g，pH 5.6。

增殖培養基為M2的成分為：每升含花寶1號2g，蛋白腖0.5g，土豆泥80g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素0.05mg，鹽酸吡哆醇0.8mg，煙酸0.4mg，6-苄基嘌呤5.0毫克，萘乙酸0.2mg，蔗糖30g，瓊脂6g，pH 5.6。

分化培養基為M3的成分為：每升含花寶1號2g，蛋白腖0.5g，土豆泥80g，活性碳50mg，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4mg，煙酸0.8mg，6-苄基嘌呤3.0毫克，萘乙酸0.5mg，蔗糖15g，瓊脂7g，pH 5.4。

生根壯苗培養基M4的成分為：每升含花寶1號2g，蛋白腖0.5g，土豆泥80g，活性碳500mg，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4mg，煙酸0.8mg，萘乙酸0.2mg，蔗糖30g，瓊脂6g，pH 5.6。

實施例3

1.取材：在生長季節在華南植物園選取始興石斛種質圃生長旺盛的優良單株的當年生嫩芽為外植體。

2.選取始興石斛株系，用水衝洗乾淨，剪去葉片，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒7.5分鐘，無菌水衝洗4～5次，切取高1～2釐米帶節的莖段，接種到類原球莖誘導培養基M1，45天後，莖段在培養基上有腋芽產生，莖段基部切口膨大形成顆粒突起；轉接至上述培養基M1上，再經過50天培養，形成類原球莖，誘導類原球莖階段的培養溫度為25±2℃，光照度1800Lx，光照12小時/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉接至增殖培養基為M2，在該培養基上培養45天後，類原球莖增殖倍數可達到8倍以上；經過3代類原球莖增殖培養可獲得足夠的繁殖材料進行類原球莖分化培養，類原球莖增殖階段的培養溫度為25±2℃，光照度1800Lx，光照12小時/天；將獲得的類原球莖繁殖材料轉接至分化培養基為M3，45天後，類原球莖在培養基上分化形成高3～5釐米不定芽，類原球莖分化階段的培養溫度為27±2℃，光照度2500Lx，光照12小時/天；將高3～5釐米的不定芽，轉到生根壯苗培養基M4，培養60天時，苗高可達到5～7釐米，根數3～5條，生根率為95％以上，生根壯苗階段的培養溫度為27±2℃，光照度2500Lx，光照12小時/天；將生根培養50-70天的試管苗在強光照下煉苗7天後出瓶，移栽時，從培養瓶中取出生根苗，洗淨附著的培養基後，用千分之一的高錳酸鉀溶液浸泡5min，種植基質採用已經發酵好的闊葉林樹皮和木屑的混合基質，注意保持適宜溼度和溫度，置於陰涼通風處栽培，成活率可達95％以上，25-35天成活後的植株產生新的根系，移入大棚進行正常水、肥、藥管理。

類原球莖誘導培養基M1的成分為：每升含花寶1號1.5g，蛋白腖1g，椰子汁75mL，肌醇100mg，甘氨酸2mg，鹽酸硫胺素0.1mg，鹽酸吡哆醇0.6mg，煙酸0.6mg，6-苄基嘌呤7毫克，萘乙酸1mg，蔗糖25g，瓊脂6.5g，pH 5.5。

增殖培養基為M2的成分為：每升含花寶1號1.5g，蛋白腖1g，土豆泥60g，肌醇100mg，甘氨酸2mg，鹽酸硫胺素0.1mg，鹽酸吡哆醇0.6mg，煙酸0.6mg，6-苄基嘌呤4毫克，萘乙酸0.4mg，蔗糖25g，瓊脂6.5g，pH 5.5。

分化培養基為M3的成分為：每升含花寶1號1.5g，蛋白腖1g，土豆泥60g，活性碳75mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，鹽酸硫胺素0.1mg，鹽酸吡哆醇0.6mg，煙酸0.6mg，6-苄基嘌呤5毫克，萘乙酸0.4mg，蔗糖25g，瓊脂6.5g，pH 5.5。

生根壯苗培養基M4的成分為：每升含花寶1號1.5g，蛋白腖1g，土豆泥60g，活性碳750mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，鹽酸硫胺素0.1mg，鹽酸吡哆醇0.6mg，煙酸0.6mg，萘乙酸0.4mg，蔗糖25g，瓊脂6.5g，pH 5.5。

需要說明的是，本發明所提供的上述實施例僅具有示意性，不具有限定本發明的具體實施的範圍的作用。本發明的保護範圍應包括那些對於本領域的普通技術人員來說顯而易見的變換或替代方案。