愈傷組織起始發育相關蛋白GaLBD-2及其相關生物材料與應用的製作方法

2023-10-06 19:52:34 2

本發明涉及生物
技術領域：
中愈傷組織起始發育相關蛋白GaLBD-2及其相關生物材料與應用。
背景技術：
：植物的遺傳轉化體系必須有一個有效的轉化篩選標記系統。目前轉基因研究中被廣泛應用的轉化細胞篩選標記系統主要有兩類：一類是將抗性基因作為選擇標記，將非轉化細胞殺死而使轉化細胞存活的負向篩選系統，主要包括兩種，一種是編碼使抗生素失活的蛋白酶基因如新黴素磷酸轉移酶基因nptII和潮黴素磷酸轉移酶基因hpt等，另一種是可使除草劑失活的基因如膦絲菌素乙醯轉移酶基因bar和5-烯醇丙酮醯草莽酸-3-磷酸合成酶基因epsps。這兩種方法都是通過將外源的篩選標記基因轉入受體細胞中，在培養基中添加篩選物質，不僅增加了培養成本，使用過的培養基增加了環境中的抗生素、除草劑等篩選物質的殘留量。同時完成篩選作用後，這些抗性基因便失去了作用，成為轉基因植物的一種負擔。由於標記基因數量有限，這些基因的存在給轉基因植物的再次轉化帶來了困難，無法將多種優良性狀積累到同一轉化植株內從而得到產量、品質等多種性狀同步改善的作物。另一類則是無抗生素和除草劑抗性，基因及其編碼的蛋白對生態環境和生物無毒無抗性，相對安全，被稱為區別於傳統抗性標記基因的新一代標記基因。安全標記基因策略不是依靠對非轉化細胞致死作用篩選出轉化細胞，而是將轉化細胞處於某種有利的環境，從而篩選出轉化細胞。這種方法的優點在於選擇劑無毒副作用，操作簡單，在多數情況下有利於轉化植株的再生。新一代標記基因主要為編碼激素、抗逆、糖類、胺基酸、葉綠體和解毒等代謝系統的酶類基因。其中，愈傷組織起始發育基因通過調節植物內源生長素信號轉導，使轉化細胞的生長與分化不同於非轉化細胞，從而有效篩選出轉化細胞和植株，具有不需要在培養基中添加任何篩選標記的優勢。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是如何建立無抗生素和除草劑抗性的植物遺傳轉化正向篩選體系。為解決上述技術問題，本發明首先提供了名稱為GaLBD-2的蛋白質。本發明所提供的蛋白質GaLBD-2，來源於亞洲棉(GossypiumarboreumL.)，為如下a)或b)或c)的蛋白質：a)胺基酸序列是SEQIDNo.2所示的蛋白質；b)在SEQIDNo.2所示的蛋白質的N端或/和C端連接標籤得到的融合蛋白質；c)將SEQIDNo.2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與愈傷組織起始發育相關的蛋白質。其中，SEQIDNo.2由201個胺基酸組成。為了使a)中的蛋白質便於純化，可在SEQIDNo.2所示的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。表1、標籤的序列標籤殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質GaLBD-2，所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質GaLBD-2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述c)中的蛋白質GaLBD-2的編碼基因可通過將SEQIDNo.1所示的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標籤的編碼序列得到。為解決上述技術問題，本發明還提供了與所述GaLBD-2相關的生物材料。本發明所提供的與GaLBD-2相關的生物材料，為下述A1)至A20)中的任一種：A1)編碼所述GaLBD-2的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；A10)含有A2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；A11)含有A3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；A12)含有A4)所述重組載體的轉基因植物細胞系；A13)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物組織；A14)含有A2)所述表達盒的轉基因植物組織；A15)含有A3)所述重組載體的轉基因植物組織；A16)含有A4)所述重組載體的轉基因植物組織；A17)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物器官；A18)含有A2)所述表達盒的轉基因植物器官；A19)含有A3)所述重組載體的轉基因植物器官；A20)含有A4)所述重組載體的轉基因植物器官。上述生物材料中，A1)所述核酸分子為如下a1)或a2)或a3)所示的基因：a1)其編碼序列是SEQIDNo.1的cDNA分子或DNA分子；a2)與a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼胺基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子；a3)在嚴格條件下與a1)或a2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼胺基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，SEQIDNo.1由606個核苷酸組成，SEQIDNo.1的核苷酸編碼SEQIDNo.2所示的胺基酸序列。本領域普通技術人員可以很容易地採用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發明的編碼GaLBD-2的核苷酸序列進行突變。那些經過人工修飾的，具有與本發明分離得到的GaLBD-2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼GaLBD-2且具有GaLBD-2功能，均是衍生於本發明的核苷酸序列並且等同於本發明的序列。這裡使用的術語「同一性」指與天然核酸序列的序列相似性。「同一性」包括與本發明的編碼SEQIDNo.2所示的胺基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟體進行評價。使用計算機軟體，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。上述生物材料中，所述嚴格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交並洗膜2次，每次5min，又於0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交並洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交並洗膜。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，A2)所述的含有編碼GaLBD-2的核酸分子的表達盒(GaLBD-2基因表達盒)，是指能夠在宿主細胞中表達GaLBD-2的DNA，該DNA不但可包括啟動GaLBD-2基因轉錄的啟動子，還可包括終止GaLBD-2基因轉錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。可用於本發明的啟動子包括但不限於：組成型啟動子，組織、器官和發育特異的啟動子，和誘導型啟動子。啟動子的例子包括但不限於：花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S：來自西紅柿的創傷誘導型啟動子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；來自菸草的化學誘導型啟動子，發病機理相關1(PR1)(由水楊酸和BTH(苯並噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導)；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子(PIN2)或LAP啟動子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導)；熱休克啟動子(美國專利5,187,267)；四環素誘導型啟動子(美國專利5,057,422)；種子特異性啟動子，如穀子種子特異性啟動子pF128(CN101063139B(中國專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用。此處引用的所有參考文獻均全文引用。合適的轉錄終止子包括但不限於：農桿菌胭脂鹼合成酶終止子(NOS終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcSE9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。可用現有的表達載體構建含有所述GaLBD-2基因表達盒的重組載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用於植物微彈轟擊的載體等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3′端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂鹼合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確 翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。上述生物材料中，所述載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌，如農桿菌。上述生物材料中，所述轉基因植物細胞系、轉基因植物組織和轉基因植物器官均不包括繁殖材料。在本發明的實施例中，所述重組表達載體中啟動所述GaLBD-2基因轉錄的啟動子具體為35S啟動子。在本發明的一個實施方式中，GaLBD-2的編碼基因(即SEQIDNo.1所示的DNA分子)通過含有GaLBD-2的編碼基因的表達盒的重組載體導入根癌農桿菌LBA4404中。所述重組載體為用SEQIDNo.1所示的DNA分子替換pCAMBIA2301的KpnI和AscI識別序列間的片段(pCAMBIA2301被限制性核酸內切酶KpnI和AscI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)得到的重組載體pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS，pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS表達GUS蛋白和SEQIDNo.2所示的GaLBD-2。所述pCAMBIA2301與pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS的差別僅在於將pCAMBIA2301的KpnI和AscI識別序列間的DNA片段(pCAMBIA2301被限制性核酸內切酶KpnI和AscI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為SEQIDNo.1所示的DNA分子。為解決上述技術問題，本發明還提供了所述蛋白質、或所述生物材料在誘導植物愈傷組織起始中的應用。為解決上述技術問題，本發明還提供了所述蛋白質、或所述生物材料在作為植物轉化篩選標記中的應用。為解決上述技術問題，本發明還提供了所述蛋白質、或所述生物材料在培育無抗生素抗性和除草劑抗性的轉基因植物中的應用。為解決上述技術問題，本發明還提供了所述蛋白質、或所述生物材料在培育愈傷組織快速脫分化的轉基因植物中的應用。上述應用中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為錦葵科植物，如棉花(Gossypiumspp)。所述棉花具體可為棉花品種中棉所24。上述應用中，所述愈傷組織起始具體可為愈傷組織脫分化並增殖。上述應用中，所述激素可為生長素(Auxin)、赤黴素(Gibberellins,GA)、細胞分裂素(Cytokinin,CTK)、脫落酸(Abscisicacid,ABA)、乙烯(ethyne，ETH)和油菜素甾醇(Brassinosteroids，BR)中的六種、五種、四種、三種、兩種或一種。為解決上述技術問題，本發明還提供了培育無抗生素和除草劑抗性基因的轉基因 植物的方法和培育愈傷組織快速脫分化的轉基因植物的方法。本發明所提供的培育無抗生素抗性和除草劑抗性基因的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入所述GaLBD-2的編碼基因得到轉基因植物的步驟；所述轉基因植物無抗生素抗性和除草劑抗性。本發明所提供的培育無抗生素抗性和除草劑抗性的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入所述GaLBD-2的編碼基因和目的基因，得到含有目的基因的轉基因植物的步驟；所述轉基因植物與所述受體植物相比無抗生素和除草劑抗性。在本發明的一個實施例中，所述目的基因可為編碼GUS蛋白的基因。上述培育無抗生素抗性和除草劑抗性基因的轉基因植物的方法中，所述受體植物無抗生素和除草劑抗性。本發明所提供的培育愈傷組織快速脫分化的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入所述GaLBD-2的編碼基因得到轉基因植物的步驟；所述轉基因植物的愈傷組織脫分化速度高於所述受體植物的愈傷組織脫分化速度。本發明所提供的培育愈傷組織快速脫分化的轉基因植物的方法，包括向受體植物中導入所述GaLBD-2的編碼基因和目的基因，得到含有目的基因的轉基因植物的步驟；所述轉基因植物的愈傷組織脫分化速度高於所述受體植物的愈傷組織脫分化速度。上述方法中，所述GaLBD-2的編碼基因的編碼序列為如下a1)或a2)或a3)所示的基因：a1)其編碼序列是SEQIDNo.1的cDNA分子或DNA分子；a2)與a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼胺基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子；a3)在嚴格條件下與a1)或a2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼胺基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述方法中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為錦葵科植物，如棉花(Gossypiumspp)。所述棉花具體可為棉花品種中棉所24。上述方法中，其中所述GaLBD-2基因可先進行如下修飾，再導入受體種子植物中，以達到更好的表達效果：1)根據實際需要進行修飾和優化，以使基因高效表達；例如，可根據受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發明所述GaLBD-2基因的胺基酸序列的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性；優化過程中，最好能使優化後的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現植物中導入基因的高水平表達，其中GC含量可為35％、 多於45％、多於50％或多於約60％；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進行修飾；3)與各種植物表達的啟動子連接，以利於其在植物中的表達；所述啟動子可包括組成型、誘導型、時序調節、發育調節、化學調節、組織優選和組織特異性啟動子；啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決於靶物種；例如組織或器官的特異性表達啟動子，根據需要受體在發育的什麼時期而定；儘管證明了來源於雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用於雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用於單子葉植物中的表達；4)與適合的轉錄終止子連接，也可以提高本發明基因的表達效率；例如來源於CaMV的tml，來源於rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發明基因進行連接；5)引入增強子序列，如內含子序列(例如來源於Adhl和bronzel)和病毒前導序列(例如來源於TMV,MCMV和AMV)。所述GaLBD-2基因重組表達載體可通過使用Ti質粒，植物病毒載體，直接DNA轉化，微注射，電穿孔等常規生物技術方法導入植物細胞(Weissbach,1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII,AcademyPress,NewYork,pp.411-463；GeisersonandCorey,1998,PlantMolecularBiology(2ndEdition).)。上述方法中，所述轉基因植物理解為不僅包含將所述GaLBD-2基因轉化目的植物得到的第一代轉基因植物，也包括其子代。對於轉基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規育種技術將該基因轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業品種中。所述轉基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。實驗證明，本發明提供的愈傷組織起始發育相關蛋白GaLBD-2及其編碼基因能促進植物愈傷組織的起始：在不添加外源生長素的愈傷誘導培養基上培養的轉GaLBD-2基因的下胚軸組織和轉空載體的下胚軸組織產生的愈傷組織的質地和大小均不一樣：轉GaLBD-2基因的下胚軸組織很容易喚醒愈傷組織的增殖進程，其兩端愈傷組織起始程度大，產生的愈傷組織顏色較淺，質地疏鬆，而轉空載體的下胚軸組織很難或幾乎不能脫分化從而產生愈傷組織，仍然停留在下胚軸切斷的狀態。以本發明提供的愈傷組織起始發育相關蛋白GaLBD-2作為篩選標記建立的正向篩選體系能夠起到與使用大量抗生素或除草劑的負向篩選體系同樣的篩選效果。結果表明，愈傷組織起始發育相關蛋白GaLBD-2可替代抗生素和/或除草劑作為植物轉基因的篩選標記，與目的基因共轉化，然後根據愈傷組織起始程度篩選並獲得含有目的基因的 無抗生素和除草劑抗性的轉基因植物。附圖說明圖1為植物表達載體pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S：GUS的T-DNA區示意圖。圖2為轉GaLBD-2基因愈傷組織及轉空載體愈傷組織在誘導30天的表型。其中圖2中左上為轉空載體愈傷組織，圖2中右上、左下和右下為轉GaLBD-2基因愈傷組織。圖3為轉GaLBD-2基因的三種類型的愈傷組織表型。其中，S為大塊愈傷組織(strongtype)，I為中塊愈傷組織(intermediatetype)，W為小塊愈傷組織(weaktype)。圖4為轉GaLBD-2基因的棉花愈傷組織的GUS(β-葡萄糖醛酸糖苷酶)染色結果。其中A為愈傷組織起始較快的棉花愈傷組織；B為愈傷組織起始較慢的棉花愈傷組織。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。下述實施例中的植物表達載體pCambia2301為北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司的產品，產品目錄號為MCV037，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。下述實施例中的根癌農桿菌LBA4404為北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司的產品，產品目錄號為MCC026，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。下述實施例中的2,4-D為sigma公司產品，產品目錄號為D7299。下述實施例中的棉花品種陸地棉(GossypiumhirsutumL.)品種中棉所24來源於中國農業科學院棉花研究所種質庫，記載在如下文獻中：ZhangC,YuS,FanS,etal.Inheritanceofsomaticembryogenesisusingleafpetiolesasexplantsinuplandcotton[J].Euphytica,2011,181(1):55-63.，在下文中簡稱中棉所24。下述實施例中所用的培養基如下：基本培養基MSB：溶質及其濃度為：NH4NO31650mg/L，KNO31900mg/L，KH2PO4170mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，FeSO4·7H2O27.85mg/L，Na2EDTA37.25mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L， H3BO36.2mg/L，KI0.83mg/L，Na2MOO4·2H2O0.25mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，COCl2·6H2O0.025mg/L，肌醇100mg/L，VB110mg/L，VB61.0mg/L，煙酸1.0mg/L，28g/L蔗糖，5.6g/L瓊脂；溶劑為蒸餾水；pH5.8。愈傷誘導培養基MSB1：向基本培養基MSB加入2,4-D和KT，使2,4-D和KT含量均為0.5mol/L得到的培養基。愈傷誘導培養基MSB2：向基本培養基MSB加入KT至其含量為0.5mol/L得到的培養基。無菌苗培養基：溶質及其濃度為：NH4NO31650mg/L，KNO31900mg/L，KH2PO4170mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，25g/L蔗糖，2g/L植物凝膠；溶劑為蒸餾水；pH5.8。實施例1、愈傷組織起始發育相關蛋白GaLBD-2編碼基因的克隆及其載體構建1、愈傷組織起始發育相關蛋白GaLBD-2編碼基因的克隆本發明的發明人從亞洲棉(GossypiumarboreumL.)石系亞1號(中國農業科學院棉花研究所)中分離克隆出愈傷組織起始發育相關蛋白GaLBD-2基因。具體克隆方法如下：採用Trizol法(TianGen)提取的棉花品種亞洲棉(GossypiumarboreumL.)石系亞1號的葉片總RNA，用反轉錄酶XL(AMV)合成第一鏈cDNA為模板，以GaLBD-2-F：5'-GGCGCGCCATGGCATCCTCT-3』(下劃線為酶切位點AscI)和GaLBD-2-R：5'-GGTACCTCAGTTCCTCATCATTC-3』(下劃線為酶切位點KpnI)為引物，進行PCR擴增，擴增得到核苷酸序列為SEQIDNo.1所示的DNA分子，該DNA分子編碼SEQIDNo.2所示的蛋白質，將SEQIDNo.2所示的蛋白質命名為GaLBD-2。2、重組載體和重組農桿菌的構建將植物表達載體pCambia2301的限制性核酸內切酶AscI識別序列和限制性核酸內切酶KpnI識別序列間的DNA(植物表達載體pCambia2301被限制性核酸內切酶AscI和KpnI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為核苷酸序列是SEQIDNo.1的DNA分子，保持植物表達載體pCambia2301的其它序列不變得到GaLBD-2基因表達載體，其名稱為pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS，載體構建示意圖見圖1。pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS表達SEQIDNo.2所示的GaLBD-2蛋白。將重組載體pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS導入根癌農桿菌LBA4404中，得到含有重組載體pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS的重組農桿菌1。將空載體質粒pCambia2301轉入根癌農桿菌LBA4404，得到含有質粒pCambia2301的重組農桿菌2。實施例2、轉GaLBD-2基因棉花愈傷組織在不同愈傷誘導培養基上的表型1、將實施例1的重組農桿菌1接種到含卡那黴素50mg/l的LB液體培養基，28℃，150rpm振蕩培養，得到OD600＝0.3-0.5的重組農桿菌1菌液。將實施例1的重組農桿菌2接種到含卡那黴素50mg/l的LB液體培養基，28℃，150rpm振蕩培養，得到OD600＝0.3-0.5的重組農桿菌2菌液。2、以棉花品種中棉所24為實驗材料，剝去棉籽的外殼後，棉仁用0.1％的升汞浸泡消毒5min，然後用無菌水衝洗3-5次，播於無菌苗培養基上使其萌發並長成無菌苗。在無菌工作檯上，用經過酒精燈火焰消毒的手術刀片將生長至7天的無菌苗的下胚軸切成0.5釐米的小段。3、採用農桿菌介導轉化法用步驟1中的重組農桿菌1轉化步驟2得到的下胚軸組織，共培養兩天後分別平放於愈傷誘導培養基MSB1、愈傷誘導培養基MSB2上，30天後觀察轉GaLBD-2基因愈傷組織的表型。採用農桿菌介導法用步驟1中的重組農桿菌2轉化步驟2得到的下胚軸組織，共培養兩天後分別平放於愈傷誘導培養基MSB1、愈傷誘導培養基MSB2上，30天後觀察轉空載體愈傷組織的表型，作為空載體對照。培養條件：28±2℃，人工光照強度2000Lx，光照周期14h/10h。實驗重複三次，每次重複侵染下胚軸組織100個。實驗結果見圖2。結果表明，在不含生長素的愈傷誘導培養基MSB2上培養的轉GaLBD-2基因的下胚軸組織和在含生長素的愈傷誘導培養基MSB1上培養的轉空載體的下胚軸組織產生的愈傷組織質地和顏色大致相同。但是與轉空載體產生的愈傷組織相比，轉GaLBD-2基因產生的愈傷組織生長速度更快：轉空載體的愈傷組織在愈傷誘導培養基MSB2上培養30天時，愈傷組織的兩端剛剛呈現愈傷起始狀態，而轉GaLBD-2基因的愈傷組織在愈傷誘導培養基MSB2上培養30天時，愈傷組織生長旺盛，質地溼潤疏鬆，生長狀態良好，兩者差異顯著。轉空載體產生的愈傷組織培養15天時，轉GaLBD-2基因的愈傷組織在愈傷誘導培養基MSB2上正常進行愈傷起始，其愈傷組織生長形態與轉空載體的愈傷組織在愈傷誘導培養基MSB1上生長的愈傷組織的生長形態基本一致。實驗證明，GaLBD-2基因能夠代替外源生長激素使得愈傷組織正常起始。實施例3、愈傷組織起始發育相關蛋白GaLBD-2作為篩選標記用於棉花的遺傳轉化本實施例以GUS基因作為目的基因，愈傷組織起始發育相關基因GaLBD-2作為篩選基因。實驗重複三次，每次重複的步驟如下：1、採用農桿菌介導轉化法用實施例2步驟1中的重組農桿菌1菌液轉化實施例 2步驟2得到的下胚軸組織，共培養兩天後平放於愈傷誘導培養基MSB2上，培養30天得到轉GaLBD-2基因的愈傷組織。培養條件為：28±2℃，人工光照強度2000Lx，光照周期14h/10h。2、將上述步驟1得到的轉GaLBD-2基因的愈傷組織依據愈傷組織起始狀況是否明顯分為三組：分別命名為S組(大塊愈傷組織)、I組(中塊愈傷組織)和W組(小塊愈傷組織)。以100塊愈傷組織為一組，重複三次。3、完成步驟2後，將S組、I組(中塊愈傷組織)和W組的愈傷組織分別進行GUS染色，重複三次，統計其陽性率。染色結果表明(圖4)，S組陽性率達到100％，I組陽性率也達到75.29％，W組陽性率為10％。這一結果說明非轉化愈傷組織由於不具有GaLBD-2基因，細胞脫分化及增殖非常緩慢，能夠明顯的與轉化外植體形成明顯差異表型。利用這一表型，在陽性愈傷組織再生成植株的過程中，選擇大塊愈傷組織作為陽性愈傷塊，培養基中不添加卡那黴素，篩選可得到陽性轉基因植株。將步驟1中S組愈傷組織進一步分化、再生培養後得到棉花再生植株。用CTAB法分別提取棉花再生植株的幼嫩葉片DNA，並以該DNA為模板，以35S-F:ACATCAAGTGCAAAAGAAAGAA和GaLBD-2-R:GGTACCTCAGTTCCTCATCATTC為引物，分別進行PCR擴增。PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃30s，56℃40s，72℃60s，30個循環；72℃延伸10min。將PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,能得到1200bp目的條帶的棉花再生植株即為陽性轉GaLBD-2基因棉花植株；以水和未轉基因棉花植株的葉片DNA為模板進行上述鑑定實驗無目的條帶；以質粒pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS為模板進行上述鑑定實驗能得到1200bp目的條帶。經統計，愈傷組織起始相關蛋白GaLBD-2作為篩選標記建立的正向篩選體系的陽性率為62.5％，與長期使用的大量抗生素和/或除草劑的負向篩選體系(陽性率60％)相比，能夠起到同樣的篩選效果。結果表明，愈傷組織起始發育相關蛋白GaLBD-2可替代抗生素和/或除草劑作為植物轉基因的篩選標記，與目的基因共轉化，然後根據愈傷組織起始程度篩選並獲得含有目的基因的無抗生素和除草劑抗性的轉基因植物。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp