一種β‑內醯胺類抗生素敏感性的快速檢測方法與流程

2023-10-05 01:08:49 1

本發明涉及一種抗生素敏感性快速檢測方法，具體涉及採用等溫微量熱法檢測β-內醯胺酶抗生素敏感性的快速檢測方法，屬於生化分析領域。

背景技術：

β-內醯胺類抗生素是一類含有β-內醯胺環的抗菌藥物，包括青黴素類，頭孢菌素類，碳青黴烯類以及單環β-內醯胺類等。β-內醯胺抗生素主要通過抑制與細菌細胞壁肽聚糖合成相關的 PBPs 轉肽酶來實現殺菌目的。自1928年青黴素的發現以來，β-內醯胺類抗生素被長期用於細菌感染的治療，顯著提高了人類的生命健康質量。然而，隨著抗生素的不合理使用，細菌的耐藥性問題日益凸顯。在全球範圍內，抗生素耐藥已成為導致患者發病及死亡的重要原因。因此，及時監測細菌耐藥對於感染病人治療方案的確定和預防醫院內病菌的交叉感染具有重要意義。

傳統的抗生素敏感性檢測方法為瓊脂稀釋法，即最小抑菌濃度MIC檢測法。該方法通過將抗菌藥物配製到瓊脂培養基中，製成一系列藥物濃度遞減的培養基以用於細菌過夜培養，以未見細菌生長的最低抗生素濃度（即MIC值）來評估細菌的藥敏性。該方法的優點是定量、準確，其主要缺點是操作複雜耗時長，通常得到測試結果需要16到24小時，對於一些生長較慢的菌種所需時間更長。細菌對β-內醯胺類抗生素耐藥的主要機制是細菌進化產生一種抗生素鈍化酶，即β-內醯胺酶，其催化的β-內醯胺環水解反應可以導致該類抗生素失效。因此，近年來，基於抗生素鈍化酶基因或生化活性的耐藥檢測方法越來越受歡迎。該方法的優點是可以較快地從分子水平確定特定β-內醯酶的表達，缺點是其所用引物只能用於檢測已知基因，不能用於新β-內醯胺酶基因和突變基因的檢測。直接檢測細菌β-內醯胺酶活性的實驗方法也有報導，例如伯納烏、皮雷利等人採用紫外分光光度法分析細菌裂解液水解β-內醯胺抗生素水平以提供其耐藥信息。但是該方法工作量大，而且仍需要數個小時才能得出測試結果。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種方便快捷、操作簡單，基於等溫滴定微量熱技術快速檢測β-內醯胺酶耐藥特徵的方法。該方法通過實時觀察樣品（e.g. β-內醯胺酶溶液或臨床細菌）與抗生素混合後是否產生熱量變化（抗生素水解是放熱反應）從而快速獲得藥物對樣品的敏感信息，或樣品是否含β-內醯胺酶（e.g. 產酶菌株），對臨床用藥指導和預防耐藥細菌傳播具有重要指導意義。

本發明實現過程如下：

一種β-內醯胺酶藥敏快速檢測方法：將待測樣品與β-內醯胺類抗生素在等溫滴定微量熱儀反應池中混合，記錄實時熱量變化，通過是否產生熱量變化判斷樣品對藥物的敏感信息，若放出熱量，則待測樣品含有β-內醯胺酶活。

上述待測樣品為純化的蛋白質、細菌裂解液或臨床細菌。

上述臨床細菌為大腸桿菌、鮑曼不動桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌或金黃色葡萄球菌。

上述β-內醯胺類抗生素為青黴素類、頭孢菌素類、碳青黴烯類、單環β-內醯胺類。

具體地說，上述的β-內醯胺酶藥敏快速檢測方法，包括以下步驟：

1)給等溫滴定微量熱儀樣品池加待測樣品，待測樣品濃度為純化蛋白質0.5-50 nM 或細菌懸液 OD600 = 1~20;

2)滴定針加樣β-內醯胺類抗生素藥物，抗生素濃度 1-5 mM，緩衝液含50 mM Tris，pH 7.0；

3)將滴定針中β-內醯胺類抗生素藥物加入樣品池，實時記錄樣品池中熱量變化；反應條件：滴定體積 20-40μL，spacing time = 400s，滴定針轉速750 rpm, 反應溫度25 ºC。

本發明具有如下優點：

（1）該方法靈敏快速，可以在10分鐘內快速獲得β-內醯胺酶是否對特定抗生素具有水解活性或樣品是否含β-內醯胺酶的信息。大大節省了傳統藥敏測試的時間，因此可以用於臨床實驗室進行快速耐藥分析，指導醫生確定臨床用藥方案。

（2）該方法操作簡單，無需標記抗生素也無需根據不同抗生素調整實驗條件，唯一的探針是熱量的變化。因此，所有的β-內醯胺抗生素都可以採用相同的實驗體系進行測試，避免了紫外分光光度法中不同抗生素需要選擇不同檢測波長的缺點。

（3）本方法應用性廣，既可用於純化的蛋白，也可用於細菌裂解液、甚至是活細菌的耐藥檢測，而紫外分光光度法不適用於懸濁液的分析。

附圖說明

圖1為實施例1中純化的金屬β-內醯胺酶L1與青黴素G、亞胺培南、先鋒黴素（V）進行滴定的ITC圖譜；

圖2為實施例1中表達L1蛋白的重組大腸桿菌細胞（E.coli-L1）與青黴素G、亞胺培南、先鋒黴素（V）進行滴定的ITC圖譜；

圖3為實施例2中臨床大腸桿菌與三種β-內醯胺抗生素的ITC圖譜；

圖4為實施例3中臨床鮑曼不動桿菌與三種β-內醯胺藥物的ITC圖譜。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實例中所用等溫滴定微量熱儀型號為馬爾文公司所生產的ITC200量熱儀。

本發明採用等溫滴定微量熱儀（ITC）進行抗生素耐藥性分析的實驗方法，包括如下步驟：

（1）在等溫滴定微量熱儀（ITC）的滴定針內加入1mM 待測抗生素（青黴素、亞胺培南、先鋒黴素等）；

（2）在等溫滴定微量熱儀（ITC）的樣品池內加入含有待測β-內醯胺酶的溶液或待測細菌懸濁液；

（3）設置電腦程式滴加20-40 μL 抗生素至樣品池，滴定針轉速750 rpm, 檢測溫度25 ºC， 在20 min 內通過電腦記錄樣品池中實時熱量變化，直至熱量變化回到基線（所有抗生素被水解完全）；

（4）根據電腦記錄的熱量隨時間變化曲線判定藥物的敏感性，如所述樣品對抗生素具有水解活性，即可觀察到負熱量變化（抗生素水解為放熱反應）。如所述樣品對抗生素無水解活性，或所述樣品不含有β-內醯胺酶，則觀察不到負熱量變化。

實施例1、金屬β-內醯胺酶L1耐藥分析

如圖1-2所示，本發明提供的實驗方法可以用於分析金屬β-內醯胺酶L1的耐藥性，該實例中圖1使用的樣品是純化的L1蛋白質，圖2使用的是表達L1蛋白的重組大腸桿菌細胞（E.coli-L1）。根據該圖，L1 可以水解青黴素G鈉鹽、亞胺培南、先鋒黴素V這三種抗生素，與文獻報導L1抗生素耐藥譜一致。

耐藥分析具體步驟如下：

（1）將L1單克隆大腸桿菌（pET26b-L1）接種於50 mL LB培養液中，37 ℃恆溫隔夜培養；

（2）隔天接菌擴大培養，待 OD600 達到 0.6，加入 IPTG 誘導反應 3 h 後，離心收集細胞；

（3）步驟（2）所述細胞經超聲破碎，收集清液用陰離子交換柱（Q柱）進行純化；

（4）步驟（3）所述純化蛋白透析至ITC緩衝液 (50 mM Tris, pH 7.0)，用注射器吸取210 μL上樣至樣品池。優選蛋白濃度為20 nM；

（5）如果是細菌實驗，將步驟（2）收集的細菌用ITC緩衝液 (50 mM Tris, pH 7.0)配製成菌懸液，優選濃度OD600 = 0.6，用注射器吸取210 μL上樣至樣品池；

（6）配製1 mM 抗生素溶液至 ITC 緩衝液 (50 mM Tris, pH 7.0)，上樣至滴定針。設置電腦程式分別滴加20 μL 抗生素溶液至樣品池，實時記錄樣品池內熱量變化曲線。滴定針轉速優選750 rpm，檢測溫度優選25 ºC；

（7）如圖1，三種抗生素與L1酶混合後均可檢測到負的熱量變化，說明L1可以水解這三種抗生素，且該水解反應是放熱反應。其中L1酶催化青黴素G鈉鹽的水解反應最快，熱量變化最快回到基線水平（180 sec）。如圖2，三種抗生素與步驟（2）中重組大腸桿菌細胞（E.coli-L1）混合後檢測到的熱量變化曲線與圖1類似，說明該方法同樣適用於細菌對β-內醯胺的藥敏分析。

實施例2、臨床大腸桿菌β-內醯胺耐藥性分析

如圖3所示，本發明提供的實驗方法可以用於分析臨床大腸桿菌對β-內醯胺藥物的耐藥特徵，且單次分析在400 sec 內即可完成。該實例中使用的樣品是經西安交通大學第一附屬醫院從臨床病人體液中分離得到的一株大腸桿菌菌株。

具體步驟如下：

（1）挑取新鮮血平板上的單菌落用MH肉湯培養液在37℃進行隔夜培養；

（2）離心培養液，用 ITC 緩衝液 (50 mM Tris, pH 7.0) 配製成 OD600 = 1~4 的菌懸液，優選濃度 OD600 = 3，用注射器吸取210 μL至樣品池；

（3）如實施例1步驟（6）進行菌液ITC藥敏實驗。步驟（2）中的臨床菌懸液分別與1mM 的青黴素G、亞胺培南、先鋒黴素（V）進行滴定。 反應條件：滴定體積 20 μL，spacing time = 400 s，轉速750 rpm, 反應溫度25 ºC。標準菌株E.coli ATCC 25922 作為陰性參照；

（4）圖3為三種抗生素滴定臨床大腸桿菌和陰性菌株的熱量變化。三種抗生素滴定陰性菌株 E.coli ATCC 25922 均無熱量變化，符合該菌株對抗生素敏感的特徵。青黴素G與先鋒黴素（V）滴定臨床大腸桿菌產生負的熱量變化，而滴定亞胺培南無熱量變化，說明該臨床菌株對青黴素G鈉鹽與先鋒黴素（V）有水解活性，對亞胺培南無水解活性；

（5）採用瓊脂稀釋法對該臨床大腸桿菌菌株進行藥敏實驗，結果表明該菌株對

青黴素G、先鋒黴素（V）和亞胺培南的最小抑菌濃度（MIC）分別為 25000、6300 和 1 μg/mL。該測試結果與ITC檢測結果一致，此臨床菌株對青黴素G與先鋒黴素（V）耐藥，對亞胺培南敏感。

實施例3、臨床鮑曼不動桿菌β-內醯胺耐藥性分析

如圖4所示，本發明提供的實驗方法可以用於分析臨床鮑曼不動桿菌對β-內醯胺藥物的耐藥特徵，且單次分析可在500 sec 內完成。該實例中使用的樣品是經西安交通大學第一附屬醫院從臨床病人體液中分離得到的一株鮑曼不動桿菌菌株。

具體步驟如下：

（1）用接種環在新鮮血平板上直接刮取鮑曼不動桿菌菌落，用ITC緩衝液 (50 mM Tris, pH 7.0) 配製成 OD600 = 1~4 的菌懸液，優選濃度 OD600 = 1.4，用注射器吸取210 μL至樣品池；

（2）如實施例1步驟（6）進行菌液ITC藥敏實驗。步驟（1）中的菌液及陰性參照菌液分別與1mM 的青黴素G鈉鹽、亞胺培南、先鋒黴素（V）進行滴定。 反應條件：滴定體積 20μL，spacing time = 400s，轉速750 rpm, 反應溫度25 ºC；

（4）圖4為三種抗生素滴定臨床大腸桿菌和陰性菌株的熱量變化。三種抗生素滴定陰性菌株均無熱量變化，滴定待測鮑曼不動桿菌均有明顯負的熱量變化，表明該菌株對青黴素G、先鋒黴素（V）和亞胺培南均可水解；

（5）採用瓊脂稀釋法對該臨床鮑曼不動桿菌菌株進行藥敏實驗，結果表明該菌株對青黴素G鈉鹽、先鋒黴素（V）和亞胺培南的最小抑菌濃度（MIC）分別為 25000、6300 和 60 μg/mL。該測試結果與ITC檢測結果一致，此臨床菌株對青黴素G、先鋒黴素（V）以及亞胺培南均耐藥。