川產九節龍皂甙作為製備抗腫瘤藥物的應用的製作方法

2023-10-04 17:08:09 3

專利名稱：川產九節龍皂甙作為製備抗腫瘤藥物的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及從植物中提取出的化合物。
川產九節龍(Ardisea pusilla A.DC)系紫金牛科紫金牛屬植物的全草，有清熱解毒、消腫止痛的功用，民間用於跌打損傷，活血通絡，亦可用於蛇咬傷。從川產九節龍中提取出的化合物——川產九節龍皂甙用於製備抗腫瘤藥物，國內外尚未見報導。
本發明的目的在於從川產九節龍中提取出的化合物——川產九節龍皂甙，用於製備抗腫瘤藥物。
本發明的技術實施方案用95％的乙醇提取九節龍全草粗粉，減壓濃縮得浸膏，加水攪拌後，靜置過濾，濾液用石油醚，乙醚，乙酸乙脂和正丁醇順次萃取，將萃取物丙酮沉澱，經矽膠低壓柱、層析，加溶劑CHCL3-MeOH-H2O(65∶35∶10，下層)洗脫得晶體化合物。化合物為白色針晶，mp239-241C，紅外光譜顯示有羥基(3423cm-1)，醛基(2700和1716cm-1)和環醚(1075和1044cm-1)。質譜m/21097(M+Na)+，分子量1074，結合元素分析分子式為C53H86O22.2H2o.化合物的C13核磁共振譜δ101.7，104.4，105.3和103.2ppm信號，其乙醯化物1H核磁共振譜有11個乙醯基信號，都表明化合物中存在四個糖基，化合物在高效矽膠薄層板上用酸蒸氣水解，檢出D-葡萄糖、L-阿拉伯糖和L-鼠李糖，經薄層掃描得各糖的比例為2∶1∶1，化合物13C核磁共振譜δc-389.1ppm比甙元向低場移 11.0ppm，δc-226.6ppm比甙元向高場移1.7ppm(表1)，說明糖鏈與甙元C3-OH相連接。質譜提示了糖鏈連接的重要信息m/z1097(M+Na)+951(M+Na-146)+，935(M+Na-162)+，626(甙元+Na+132)+，表明糖鏈是分枝的。化合物的乙醯化物的質譜m/z273(乙醯鼠李糖)、331(乙醯葡萄糖)、561(乙醯鼠李糖-乙醯葡萄糖)。化合物的分步水解試驗檢出各糖水解順序為鼠李糖、葡萄糖和阿拉伯糖，以上都表明糖連接順序為一個葡萄糖和一個鼠李糖葡萄雙糖同時與阿拉伯糖相連。由化合物的13C-1H相關譜四個糖基的端基質子(1-H)信號分別出現在δ6.39、5.37、5.21和4.94ppm，在δ3.8-4.7譜區內各糖基的質子信號彼此重迭，用一般方法難以確定其歸屬，遂採用了一維多重接力相關譜新方法作了研究，此法可以從高度重迭的譜峰中分離和識別出每個糖基的全部質子信號，各糖基質子的化學位移和偶合常數總結於表2。由各糖端基碳的13C核磁共振譜信號確定了各糖的構型，葡萄糖為β-D-型，鼠李糖和阿拉伯糖為α-L-型，再結合NOE差譜(照射1H核使與它偶合的13C核的信號強度增大的效應稱為核奧呋豪斯效應即NOE效應或NOE差譜)選擇激發各糖基的1-H，觀基NOE增益信號，再與一維多重接力譜相對照，這些NOE增益信號得以歸屬(見表3)。根據NOE效應與核間距關係，從而測定出糖鏈的結構為
化合物的結構式為3-0-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)][β-D-吡喃葡萄糖(1→2)]α-L-阿拉伯糖-西克拉敏A分子式
表1在氘代吡啶溶液中甙元分子的13C化學位移值C九節龍皂甙I西克拉明皂甙A C 九節龍皂甙I西克拉明皂甙A1 39.639.5 16 76.976.82 26.628.3 17 48.348.23 89.178.1 18 50.450.64 39.239.5 19 24.224.15 55.655.7 20 36.937.36 18.018.2 21 36.836.87 32.732.7 22 32.432.38 44.144.0 23 28.128.69 53.453.3 24 16.416.310 42.642.6 25 16.516.511 19.219.2 26 19.819.812 30.530.7 27 18.618.613 86.586.4 28 77.777.714 44.644.6 29 24.424.115 33.433.4 30 207.9 207.3
表2在氘代吡啶溶液中糖分子質子的化學位移值和偶合常數
表3 在氘代吡啶溶液中糖分子的NOE值
川產九節龍皂甙對體外培養的癌細胞分化誘導作用-MTT法其原理是四唑藍化合物MTT(Methylthiazolyl tertrazolium)在活細胞線業體酶作用下可裂解為紫色不溶性的甲化合物，加入二甲基亞碸後用酶標儀測出其光密度變化，可求出抗癌藥物作用的瘤細胞數量變化，以此求出細胞的存活率，根據腫瘤細胞的半數致死量(ID50)判斷腫瘤細胞對抗癌藥的敏感程度。將肝癌(SMMC-7721)、肝癌(HCC-9204)、肺癌(A549)、胃癌(SGC-7901)、卵巢癌(HO-8910)、宮頸癌(Hela)、食管癌(Eca-109)、腎癌(GRC-1)8種人腫瘤細胞製成單細胞懸液，在96孔平面培養板中，細胞(5×104/ml)和川產九節龍皂甙水溶液一起培養72h後，加入MTT20ul，繼續培養4h，離心，棄上清液，加150ul二甲基亞碸溶液沉澱，測定OD490。
計算細胞存活率的公式
結果MTT法測定表明川產九節龍皂甙對8種人腫瘤細胞的抑制作用皆至劑量-效應關係，隨藥物的濃度增加，細胞存活率逐漸下降。(見下表)MTT法測定8種腫瘤細胞存活率(％)<
>本發明的優點從川產九節龍中提取的化合物——川產九節龍皂甙，系新發現的具有抗腫瘤藥物的化合物，實驗表明此化合物對8種人腫瘤細胞的抑制作用皆呈劑量——效應關係，隨藥物濃度增加，細胞存活率逐漸下降。
實驗還表明川產九節龍皂甙水溶液小鼠LD50分別為iv10.29±0.84mg/kg，95％可信限為9.50-11.17mg/kg；ig666.70±55.82mg/kg，95％可信限為613.30-724.82mg/kg。說明化合物iv給藥LD50很小，不宜推薦為臨床給藥方式，而口服給藥LD50約為最小有效量的12倍，說明本途徑安全性較大，值得進一步開發。
具體實施例方式九節龍全草粗粉20kg用95％乙醇EtOH提取，減壓濃縮得浸膏1785g，加H2O攪拌後，靜置過濾，濾液用石油醚，乙醚Et2O，乙酸乙脂EtOAc，和正丁醇n-BuOH順次萃取，正丁醇n-BuOH萃取物丙酮Me2CO沉澱得總皂甙61g，經矽膠低壓柱層析，溶劑CHCl3-MeOH-H2O(65∶35∶10下層)洗脫得晶體化合物20g。
權利要求
1.川產九節龍皂甙作為製備抗腫瘤藥物的應用，其特徵在於用95％的乙醇提取九節龍全草粗粉，減壓濃縮得浸膏，加水攪拌後，靜置過濾，濾液用石油醚，乙醚，乙酸乙脂和正丁醇順次萃取，將萃取物丙酮沉澱，經矽膠低壓柱層析，加溶劑CHCl3-MOH-H2O(65∶35∶10下層)洗脫得晶體化合物；經化學分析鑑定，此化合物的分子結構式為3-0-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)][β-D-吡喃葡萄糖(1→2)]α-L-阿拉伯糖-西克拉敏A分子式
將此化合物命名為川產九節龍皂甙。
2.根據權利要求1所述的川產九節龍皂甙作為製備抗腫瘤藥物的應用，其特徵在於化合物川產九節龍皂甙對腫瘤細胞有抑制作用，可用於製備抗腫瘤藥物。
全文摘要
川產九節龍皂甙作為製備抗腫瘤藥物的應用,涉及從植物中提取出的化合物,以川產九節龍為原料,經醇提、減壓濃縮,萃取、低壓層析,洗脫等一系列提取方法,得晶體化合物—川產九節龍皂甙,經實驗,川產九節龍皂甙對腫瘤細胞的基因複製有抑制作用,而口腹給藥LD
文檔編號A61P35/00GK1266687SQ9911573
公開日2000年9月20日 申請日期1999年3月12日 優先權日1999年3月12日
發明者王曉娟, 朱玲珍, 王四旺 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學