太子參總苷的製備方法及其在製備預防和治療心肌缺氧、缺血藥物中的用途的製作方法

2023-10-04 07:07:54

專利名稱：太子參總苷的製備方法及其在製備預防和治療心肌缺氧、缺血藥物中的用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於太子參總苷的製備方法及其用途，具體地說，太子參總苷的製備及其在製備預防和治療心肌缺氧、缺血藥物中的用途。
背景技術：
缺血性心臟病(IHD)常常表現為急性心肌梗死，是全球範圍內導致死亡和心臟衰竭的主要原因。心臟缺氧是產生缺血性心臟病的直接原因之一。使用抗心絞痛藥物進行抗心肌缺血治療以增加心肌供氧或者降低心肌耗氧量已被證明是一個非常重要的治療心肌缺血的手段(Al_Nimer,M.S.M., 2012.Evaluation ofAnt1-1schemic Therapy in CoronaryArtery Disease:A Review.1n:Chaikovsky, 1.(Ed.), CoronaryArtery Diseases.1nTechChina, Shanghai, China, pp.151-196)。太子參(Pseudostellariaheterophylla)為石竹科孩兒參屬植物孩兒參的乾燥塊根，具有益氣生津、補益脾肺、增強體質、提高機體免疫力、心腦血管活性等功效，是常用的補虛補氣藥，其主要化學成分包括糖類、胺基酸、苷類、環肽類、磷脂類等，已有文獻報導「太子參皂苷」具有抗應激、抗疲勞的作用、SOD樣作用並能延長壽命。文獻用水(①太子參皂苷提取工藝研究.食品工業科技，2005，26 (7) =135-137.,②太子參皂苷提取工藝優選.中草藥，2001，32 (9) =799-800.)或乙醇(大孔吸附樹脂提取太子參總皂苷工藝研究.中國實驗方劑學雜誌，2007，13(10):15-17)對太子參總皂苷的製備方法進行了研究，CN1957967公開了太子參的粗提取物在製備治療心血管疾病藥物中的應用，CN102512438A公開了太子參多糖提取物在預防、治療糖尿病和保健食品中的應用。然而，在前期藥理研究中，我們發現太子參總苷具有較強的抗心肌缺氧作用，而我們的化學成分研究表明，太子參總苷中除了皂苷類成分外還有黃酮苷以及其他苷類，而已有的文獻只是針對太子參粗提取物或皂苷組分進行了研究或應用，缺乏對太子參總苷的製備方法和應用。因此，進行總苷的製備和應用尤其重要。本發明正是依據太子參總苷各類成分與其它非苷類成分的結構特點及 理化性質上的差異，利用合理的提取、分離和檢測手段，最終提供一種有效提取、分離富集太子參總苷的方法，並將該類組分運用於抗心肌缺氧、缺血藥物的製備。

發明內容
本發明的目的是提供一種從太子參中製備含皂苷和黃酮苷等各類苷的太子參總苷提取物。所述的太子參總苷可以是太子參粗總苷或太子參精製總苷。本發明的另一個目的是提供該提取物太子參總苷的製備方法。本發明的再一個目的是提供該提取物的精製方法。本發明還有一個目的是提供該提取物在製備預防和治療心肌缺氧、缺血相關藥物中的用途。本發明的目的可通過下列措施來實現:
本發明所述的太子參總苷可以是太子參粗總苷或太子參精製總苷，採用水提醇沉和大孔樹脂層析的方法製備太子參粗總苷，再利用MC1、SephadexLH-20柱層析的方法製備太子參精製總苷。具體步驟如下:(I)將太子參粉碎過篩後用熱水提取1-3次，提取液合併減壓濃縮後，加高濃度乙醇至含乙醇量60 %以上以沉澱多糖，濾液回收乙醇,濃縮至無醇味。(2)將濃縮液上非極性或弱極性大孔吸附樹脂柱層析DlOl大孔樹脂柱，用水洗脫至流出液無還原糖後，柱上殘留部分用55-70%乙醇洗脫至苯酚-硫酸法檢測顯示無苷為止。收集所有經苯酚-硫酸法檢測顯示含苷的部分，合併後回收乙醇，乾燥得太子參粗總苷。(3)所得太子參粗總苷用25-35%乙醇溶解後上MCI柱，用25_35%乙醇洗脫5_12倍柱體積後，再用80-90%乙醇洗脫至苯酚-硫酸法檢測顯示無苷為止。分別收集25-35%乙醇與80-90%乙醇兩部分洗脫液，回收溶劑並濃縮至浸膏，得浸膏I和浸膏II。浸膏II用無水乙醇溶解後上S^hadex LH-20柱，用無水乙醇洗脫，以苯酚-硫酸法檢測，將所有經檢測顯示含苷的部分收集合併，回收乙醇，濃縮所得的浸膏與浸膏I合併，乾燥得太子參精製總苷。所述的太子參總苷在製備預防和治療心肌缺氧、缺血相關藥物中的用途。本發明的太子參總苷提·取物中含有皂苷、黃酮苷和其它苷類物質。太子參粗總苷還含有環肽類成分，太子參精製總苷則已基本去除了環肽。本發明的有益效果:本發明的太子參總苷提取物製備工藝可行性高，在安全濃度範圍內治療心肌缺氧缺血方面療效好、用量低。


圖1為不同作用濃度的太子參粗總苷對H9c2細胞的毒性(以細胞存活率表示)。(與空白組相比 < 0.001，**P < 0.01)。圖2為不同作用濃度的太子參精製總苷對H9c2細胞的毒性(以細胞存活率表示)。(與空白組相比 < 0.001，**P < 0.01)。圖3為不同作用濃度的太子參粗總苷對二氯化鈷誘導的H9c2細胞缺氧的保護作用(以細胞存活率表示)。(與空白對照組相比-P < 0.001，與CoCl2組相比< 0.001，*P < 0.05)。圖4為不同作用濃度的太子參精製總苷對二氯化鈷誘導的H9c2細胞缺氧的保護作用(以細胞存活率表示)。(與空白對照組相比.ρ < 0.001，與CoCl2組相比<0.001,*Ρ < 0.05)。圖5為太子參精製總苷對二氯化鈷(CoCl2)所致H9c2細胞缺氧狀態下超氧化物歧化酶(SOD)的影響(以空白組的百分率表示)。(與空白對照組相比.Ρ < 0.001，flP< 0.05 ;與 CoCl2 組相比 ***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05)。圖6為太子參精製總苷對二氯化鈷(CoCl2)所致H9c2細胞缺氧狀態下脂質過氧化物(MDA)的影響(以空白組的百分率表示)。(與空白對照組相比.Ρ <0.001，flP < 0.05 ；與 CoCl2 組相比 ***Ρ < 0.001, **Ρ < 0.01, *Ρ < 0.05)。
圖7為太子參精製總苷對二氯化鈷(CoCl2)所致H9c2細胞缺氧狀態下乳酸脫氫酶(LDH)的影響(以空白組的百分率表示)。(與空白對照組相比.Ρ < 0.001，flP < 0.05 ；與 CoCl2 組相比 ***P < 0.001, **P < 0.01, *P < 0.05)。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。實施例一、太子參總苷的製備方法1、太子參粗總苷的製備方法(1)將Ikg太子參粉碎後用熱水提取3次，提取液合併減壓濃縮後，加95%乙醇至含乙醇量60%以沉澱多糖，以沉澱多糖，濾液回收乙醇，濃縮至無醇味。(2)濃縮液上DlOl大孔樹脂柱，用2.5倍柱體積水洗脫至流出液無還原糖後，用10倍柱體積60%乙醇洗脫至苯酚-硫酸法檢測顯示無苷為止。收集所有經苯酚-硫酸法檢測顯示含苷的部分，合併後回收乙醇，乾燥得太子參粗總苷。2、太子參精製總苷的製備方法

(1)所得粗總苷用30%乙醇溶解後上MCI柱，用10倍柱體積的30%乙醇洗脫後，再用2.5倍柱體積的85%乙醇洗脫至苯酚-硫酸法檢測顯示無苷為止。分別收集30%乙醇與85%乙醇洗脫液，回收溶劑並濃縮至浸膏，得浸膏I和浸膏II。浸膏II用無水乙醇溶解後上S^hadex LH-20柱，用無水乙醇洗脫，以苯酚-硫酸法檢測，將所有經檢測顯示含苷的部分收集合併，回收乙醇，濃縮所得的浸膏與浸膏I合併，乾燥得太子參精製總苷。實施例二、太子參總苷在製備預防和治療心肌缺氧、缺血相關的藥物中的用途以下實施例是部分安全性和藥效學實驗，有助於本領域技術人員更好理解本發明的用途，但不以任何方式限制本發明的用途。太子參粗總苷與精製總苷由貴州省藥物製劑重點實驗室提供，為研究其抗心肌缺氧的作用，本實驗在體外H9c2大鼠心肌細胞系中檢測太子參總苷對二氯化鈷(CoCl2)造成的心肌缺氧的保護作用。結果顯示:在安全濃度範圍內，太子參粗總苷或精製總苷均對CoCl2造成的心肌缺氧具有明顯的保護作用，與對照組比較具有顯著性差異(P < 0.05)。在較高安全濃度下具有與陽性藥N-乙醯-L-半胱氨酸(326.4μ8/πιυ相當的作用強度。對太子參精製總苷進行初步的抗心肌缺氧機制研究表明，太子參總苷對心肌細胞有顯著保護作用，太子參精製總苷可在500和800 μ g/mL時顯著降低心肌細胞乳酸脫氫酶(LDH)的洩露率，在800 μ g/mL時顯著提高SOD的活性並顯著降低MDA的水平。實驗材料1、受試藥物:太子參粗總苷與精製總苷由貴州省藥物製劑重點實驗室提供，太子參總苷為棕色浸膏，太子參精製總苷為棕色粉末。實驗時用超純水溶解。2、受試細胞:H9c2大鼠心肌細胞購自中科院上海細胞庫。3、試劑:乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；微量丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)。4、陽性藥:N-乙醯-L-半胱氨酸(NAC)，購自sigma，用超純水溶解為200mmol/L，實驗時用DMEM培養液溶解至所需濃度。
實驗方法與結果1、對H9c2培養細胞無毒濃度的確定選取對數生長期H9c2細胞，以每孔100 μ L，30-40 X 104個/mL種植於96孔培養板中，將培養板置37°C、5% CO2培養箱中孵育24h。正常對照組每孔加入100 μ LDMEM培養液；太子參粗總苷組加入不同濃度含藥培養液(0.25,0.5、1、2.5、5mg/mL)、太子參精製總苷組加入不同濃度含藥培養液(0.5、1、2.5、5、6mg/mL)作用H9c2細胞24h後用MTT法檢測。MTT法檢測:即在96孔培養板中每孔加入2.5mg/mL MTT溶液10μ L，最終作用濃度為0.25mg/mL,繼續在培養箱中培養4h，小心吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μ L，溶解結晶，用酶標儀490nm波長處檢測每孔吸光度OD值，存活率=實驗組OD/正常對照組0DX100%。實驗結果:如I圖所示，太子參粗總苷的安全濃度為lmg/mL，因此在藥效評價實驗中，太子參粗總苷在lmg/mL內選用4個濃度進行藥效評價。如2圖所示，太子參精製總苷的安全濃度也為lmg/mL，因此在藥效評價實驗中，在太子參精製總苷lmg/mL以內選用4個濃度進行藥效評價。2、對二氯化鈷(CoCl2)所致H9c2細胞缺氧狀態下細胞存活率的影響選取對數生長期H9c2細胞，以每孔100 μ L，15-18 X 104個/mL種植於96孔培養板中，將培養板置37°C、5% CO2培養箱中孵育24h。實驗分為正常對照組、CoCl2組、NAC陽性對照組、太子參粗總苷不同濃度組和太子參精製總苷不同濃度組。正常對照組與CoCl2組每孔加入100 μ L DMEM培養液；NAC組加入含2000 μ mo I/LNAC的DMEM培養液100 μ L ;太子參粗總苷組加入不同濃度含藥培養液(0.1,0.25,0.5、lmg/mL)、太子參精製總苷組加入不同濃度含藥培養液(50、100、250、500、800 μ g/mL)各100 μ L作用於H9c2細胞24h後，正常對照組每孔加入100 μ L DMEM培養液，其餘各組加入含CoC121200 μ mol/L的DMEM培養液，作用24h後用MTT法檢測細胞存活率。圖3、4所示=CoCl2在1200 μ mol/L時作用24h可使H9c2心肌細胞的存活率下降至50%左右(與空白對照組相比P < 0.001)，陽性藥NAC在2000 μ mol/L(即326.4 μ g/mL)時預培養24h可抵抗CoCl2造成的細胞死亡，使細胞存活率上升。太子參粗總苷在0.5、
1.0mg/mL預培養24h與太子參精製總苷在作用濃度250、500、800 μ g/mL預培養24h均可顯著減少細胞因CoCl2作用而造成的細胞存活率下降。3、對二氯化鈷(CoCl2)所致H9c2細胞缺氧狀態下超氧化物歧化酶(SOD)的影響選取對數生長期H9c2細胞，以每孔2mL，4-5 X IO5個/mL種植於6孔培養板中，將培養板置37°C、5% CO2培養箱中孵育24h。實驗分為正常對照組、CoCl2組、NAC陽性對照組、太子參精製總苷不同濃度組。正常對照組與CoCl2組每孔加入2mL DMEM培養液；NAC組加入含2000 μ mol/L NAC的DMEM培養液2mL，太子參精製總苷組加入不同濃度含藥培養液(0.25,0.5,0.8mg/mL)2mL作用H9c2細胞24h後，正常對照組每孔加入2mL DMEM培養液，其餘各組加入COCl2 (1200 μ mol/L) 2mL作用24h後，吸出培養液後加入600 μ L 0.5%細胞裂解液於_80°C作用30min後，用SOD試劑盒檢測細胞中SOD含量。

如圖3所示:1200ymol/L CoCl2作用24h可使H9c2心肌細胞內的SOD含量降至正常細胞內的80%，與空白對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。加入陽性藥NAC(326.4 μ g/mL)預培養24h後，可使細胞內SOD含量上升。太子參精製總苷在作用濃度為800 μ g/mL預培養24h後，其細胞內SOD含量與對照組(CoCl2組)相比具有明顯上升作用(P < 0.05)。4、對二氯化鈷(CoCl2)所致H9c2細胞缺氧狀態下脂質過氧化物(MDA)的影響選取對數生長期H9c2細胞，以每孔2mL，4-5 X IO5個/mL種植於6孔培養板中，將培養板置37°C、5% CO2培養箱中孵育24h。實驗分為正常對照組、CoCl2組、NAC陽性對照組、太子參精製總苷不同濃度組。正常對照組與CoCl2組每孔加入2mL DMEM培養液；NAC組加入含2000 μ mol/L NAC的DMEM培養液2mL，太子參精製苷組加入不同濃度含藥培養液(250、500,800 μ g/mL) 2mL作用H9c2細胞24h後，吸出培養液，正常對照組每孔加入2mL DMEM培養液，其餘各組加入COCl2 (1200 μ mol/L) 2mL作用24h後，吸出培養液後加入600 μ L 0.5%細胞裂解液於_80°C作用30min後，用MDA試劑盒檢測細胞中MDA含量。如圖6所示:1200 μ mol/L CoCl2作用24h可使H9c2心肌細胞內的MDA含量上升至134%，與空白對照組相比具有顯著性差異(P < 0.001)。加入陽性藥NAC(326.4 μ g/mL)預培養24h後，可使細胞內MDA含量下降(P < 0.05)。太子參精製總苷在作用濃度為800 μ g/mL預培養24h後，其細胞內MDA含量與對照組(CoCl2組)相比具有明顯上升趨勢(P < 0.05)。5、對二氯化鈷(CoCl2)所致H9c2細胞缺氧狀態下乳酸脫氫酶(LDH)的影響選取對數生長期H9c2細胞，以每孔100 μ L，15-18 X IO4個/mL種植於96孔培養板中，將培養板置37°C、5% CO2培養箱中孵育24h。實驗分為正常對照組、CoCl2組、NAC陽性對照組、太子參精製總苷不同濃度組。正常對照組與CoCl2組每孔加入100 μ L DMEM培養液；NAC組加入含2000 μ mol/L NAC的DMEM培養液100 μ L，太子參精製總苷組加入不同濃度含藥培養液(0.25,0.5,0.8mg/mL ) 100 μ L作用H9c2細胞24h後，吸出培養液，正常對照組每孔加入100 μ L DMEM培養液， 其餘各組加入COCl2 (1200 μ mol/L) 100 μ L作用24h後，吸出培養液後加入100 μ L 0.5%細胞裂解液於-80°C作用30min後，用SOD試劑盒檢測細胞上清液與細胞裂解液中LDH含量，計算LDH洩漏率。LDH洩漏率=細胞上清液LDH/ (細胞上清液LDH+細胞裂解液LDH) X 100%。如圖7所示:1200 μ mol/L CoCl2作用24h可使H9c2心肌細胞LDH釋放量上升至28%，與空白對照組(LDH洩漏率為19% )相比具有顯著性差異(P < 0.001)。加入陽性藥NAC (326.4 μ g/mL)預培養24h後，可使LDH洩漏率明顯下降(P < 0.001)。太子參精製總苷在作用濃度為500、800 μ g/mL預培養24h後，其LDH洩漏率與對照組(CoCl2組)相比具有明顯下降趨勢(P < 0.05)。結論:太子參粗總苷在500、100(^8/11^時與太子參精製總苷在250、500、80(^8/mL時可顯著降低二氯化鈷造成的H9c2心肌細胞死亡，使細胞存活率增加。太子參精製總苷在800 μ g/mL時可顯著抑制二氯化鈷造成的細胞內SOD活性降低、MDA含量的增加以及LDH洩漏率的降低。上述結果表明，太子參粗總苷與太子參精製總苷具有抗心肌缺氧、缺血的作用。以上參考具體實施方式
和附圖詳細描述了本發明，但應理解，提供這些實施例只是出於闡釋性目的，並非限制本發明。本發明範圍只受所附權利要求書的限制。本領域技術人員理解，可對本發明做出很多改動和變化而不脫離本發明的精神和範圍，這些改動和變化都落在本發明範圍之內。
權利要求
1.一種太子參總苷，其特徵在於，所說的總苷是由石竹科孩兒參屬植物孩兒參的乾燥塊根(即太子參)提取分離製備的太子參粗總苷或太子參精製總苷，主要含有皂苷和黃酮苷。
2.根據權利要求1所說太子參總苷的製備方法，其特徵在於所說的方法是將太子參藥材粉碎過篩後，採用水提醇沉和大孔吸附樹脂層析的方法製備太子參粗總苷，採用MCI和Sephadex LH-20柱層析的方法除去太子參粗總苷中的環肽類成分後製備太子參精製總苷。
3.根據權利要求2所說太子參總苷的製備方法，其特徵在於在水提醇沉中醇沉時的溶液為60-95%的乙醇溶液。
4.根據權利要求2所說太子參總苷的製備方法，其特徵在於所用的大孔吸附樹脂為非極性或弱極性大孔吸附樹脂，型號是HPD-100，HPD-400, AB-8, D-101，D-301，NKA-9。
5.根據權利要求2所說太子參總苷的製備方法，其特徵在於在大孔吸附樹脂層析中，先用用水洗脫至流出液無還原糖後，柱上殘留部分用55-70%乙醇洗脫至苯酚-硫酸法檢測顯示無苷為止。收集所有經苯酚-硫酸法檢測顯示含苷的部分，合併後回收乙醇，乾燥得太子參粗總苷。
6.根據權利要求2所說太子參總苷的製備方法，其特徵在於在MCI柱層析中，先用25-35 %乙醇洗脫5-12倍柱體積後，再用80-90 %乙醇洗脫至苯酚-硫酸法檢測顯示無苷為止。分別收集25-35%乙醇與80-90%乙醇兩部分洗脫液，回收溶劑並濃縮至浸膏，得浸膏I和浸膏II。
7.根據權利要求6所說太子參總苷的製備方法，其特徵在於在SephadexLH-20柱層析中，浸膏II用無水乙醇溶解後上S^hadex LH-20柱，用無水乙醇洗脫，將所有經苯酚-硫酸法檢測顯示含苷的部分收集合併，回收乙醇，濃縮所得的浸膏與浸膏I合併得太子參精製總苷。
8.如權利要求1所述的製備方法製得的太子參粗總苷和精製總苷用於製備預防和治療心肌缺氧、缺血的藥物。
全文摘要
本發明涉及太子參總苷的製備方法及其在製備預防和治療心肌缺氧、缺血藥物中的用途。所說的總苷可以是太子參粗總苷或太子參精製總苷，主要含有皂苷和黃酮苷。將太子參藥材粉碎過篩後，採用水提醇沉和大孔吸附樹脂層析的方法製備太子參粗總苷，採用MCI和Sephadex LH-20柱層析的方法除去太子參粗總苷中的環肽類成分後製備太子參精製總苷。安全性和藥效學實驗表明，所得的總苷安全性高，在預防和治療心肌缺氧中效果突出，可望用於製備預防和治療心肌缺氧、缺血藥物。
文檔編號A61K36/36GK103142678SQ20121042129
公開日2013年6月12日 申請日期2012年10月30日 優先權日2012年10月30日
發明者廖尚高, 王永林, 王珍, 蘭燕宇, 王愛民, 李勇軍, 李靖, 肖婷婷 申請人:貴陽醫學院