含有胃促胰酶抑制劑作為有效成分的預防和治療皮炎的藥物的製作方法

2023-10-10 15:08:09 2

專利名稱：含有胃促胰酶抑制劑作為有效成分的預防和治療皮炎的藥物的製作方法
技術領域：
本發明涉及胃促胰酶抑制劑的醫藥應用，更具體地說，是涉及一種預防或治療皮炎的藥物，該藥物含胃促胰酶抑制劑作為有效成分。
背景技術：
炎性反應由細菌、病毒和其它病原體以及由損傷、外源性物質等引起。它們是免疫反應，其中粒細胞、單核細胞、淋巴細胞和其它免疫細胞排除病原體或受傷組織或外源性物質。皮炎是一種皮膚的急性或慢性炎症，具體而言，一個主要問題是近些年特應性皮炎顯著增多。
特應性皮炎是一種慢性疾病，其主要症狀伴隨發癢的溼疹，同時觀察到症狀加重或減輕交替發生的現象。在多數情況下，患者或其家族有蕁麻疹、變應性鼻炎及支氣管哮喘和其它變應性疾患的病史(變應臨床免疫學雜誌(J.Allergy Clin.Immunol.)104，S123，1999)。特應性皮炎的症狀多樣，其原因仍不清楚，據認為該疾病主要由下列物質引起多種天然物質，包括蜱、毛髮、羽毛、細菌和黴菌；或者食品，包括蛋類、牛奶；或者合成產品，包括化學纖維和清潔劑等。還有人指出由於乾性皮膚導致的皮膚屏障功能障礙在特應性皮炎中扮演著重要角色。
特應性皮炎發生的機理尚不清楚。據認為，與IgE和肥大細胞有關的I型變態反應(直接變態反應)在特應性皮炎中起著重要作用，因為該疾病是對一系列抗原的過敏反應之一，患者或其家族有時也患有其它變應性疾病，在許多情況下觀察到血清IgE水平升高。但是，抑制I型變態反應的抗變應性藥物對特應性皮炎無效或不顯示治療作用，這表明I型反應與該病的發病機理僅有部分關係。
另一方面，據報導，當與變應原接觸時，特應性皮炎患者表現出雙相皮膚反應(J.Allergy Clin.Immunol.101，222，1998)。例如，在對動物皮內給予抗原，如Ascalis提取物的情況下，觀察到了雙相皮膚反應，所述動物是對該相同抗原敏感的(免疫學雜誌(J.Immunol.)131，1096，1983)。第一個反應，稱為早期反應，在抗原誘發後1小時達到高峰。第二個反應，即晚期反應，在8-24小時後顯示最強反應(Biol.Pharm.Bull.18，239，1995)。早期反應可被組胺受體拮抗劑抑制，表明該反應是由IgE和肥大細胞誘發的。相反，對晚期反應的機制還不清楚，但其特徵是皮膚中嗜酸性粒細胞的顯著浸潤(國際變應免疫學通訊(Int.Arch.Allergy Immunol.)113，196，1997)，這是在特應性皮炎患者中觀察到的典型組織學特徵(美國科學院皮膚病學雜誌(J.Am.Acad.Dermatol.)24，1101，1991)。另外，已知特應性皮炎患者的嚴重性與血清ECP(嗜酸性粒細胞陽離子蛋白)水平和周圍嗜酸性粒細胞數量有關(藥物(Medicina)34，220，1997)。再者，在最近幾年，有人指出特應性皮炎的臨床症狀與被劃分為IV型變態反應的接觸性皮炎非常相似(Medicina 34，220，1997)。這些發現提示我們IV型變態反應可能與該疾病的發病機理有關。
一般認為，作為IV型變態反應代表的接觸性過敏反應是由於對小鼠使用半抗原，如DNFB(二硝基氟苯)引起的，該小鼠是曾經用DNFB半抗原致敏過的，但最近報導當對皮膚重複使用此類半抗原時，除誘發IV型變態反應外，還誘發I型變態反應(皮膚病學研究雜誌(J.Invest.Dermatol.)105，749，1995)。例如，通過重複應用半抗原，血液IgE水升高，並且重複半抗原刺激時，反應的時間過程移向I型變態反應。在這類動物模型中，對半抗原刺激的暫時性反應和皮膚厚度基準，半抗原刺激前的厚度都逐漸增加，這看起來似乎是慢性皮炎的特徵。通過這些發現認為，重複使用半抗原誘發的皮炎可作為特應性皮炎的動物模型(Anitex 10，23，1998)。
最近，據報導NC/Nga小鼠自發地發生了類似於特應性皮炎的皮炎(國際免疫學(Int.Immunol.)9，461，1997)。以常規方式在沒有特定病原體的環境中餵養的NC/Nga小鼠在約七-八周齡後開始出現明顯的搔癢行為和紅斑，隨後出現皮膚出血、瘢痕和潰瘍。進一步地說，它們表現出與人類特應性皮炎的臨床觀察類似的症狀，例如皮膚乾燥或增厚。其它種系的小鼠，如BALB/c不患有類似的皮炎，即使將它們與NC/Nga小鼠共同室餵養的情況下，這提示我們認為該種皮炎是NC/Nga小鼠所特有的(最新醫藥(Latest Medicine)，53，2848，1998)。此外，在沒有特定病原體(SPF)的環境下飼養這些小鼠時，絲毫沒有觀察到皮膚異常，這表明某些環境因素可能與這些小鼠皮炎的發作有關。當對在SPF環境下飼養的NC/Nga小鼠重複塗以半抗原時，在致敏的開始階段僅產生所謂接觸性皮炎的延遲性過敏反應，但隨著致敏作用增強，觀察到了類似特應性皮炎的症狀(CRJ Letters 11，1，1998)。因此，雖然對造成這些小鼠自發性皮炎的天然性刺激物尚不清楚，但十分清楚的是，與自然環境中某些種類的抗原重複接觸是一個重要因素。因此，作為由於與存在於空氣中的變應原重複接觸引起的自發性特應性皮炎模型，這些小鼠是非常有用的。
治療特應性皮炎最有效的藥物是激素軟膏(J.Allergy Clin.Immunol.104，S123，1999)。但是，使用這類激素軟膏需要根據用藥部位和時間謹慎地選擇使用的藥物。如果使用方法不適當，不會產生明顯效果或者症狀反而加重了。另外，當長期使用激素軟膏時，會出現副作用，如萎縮和酒糟鼻。還有，如果中途停用這類藥物，有時會觀察到反彈現象，即皮膚症狀明顯加重。
除激素軟膏外，組胺拮抗劑和抗變應性藥物也已用於治療特應性皮炎。組胺拮抗劑可有效消除瘙癢，但不能治癒該病。抗變應性藥物，如曲尼司特、酮替芬、奧沙米特和氮卓斯汀對特應性皮炎的症狀沒有療效，即使有，作用也較弱。據認為，這是由於這些藥物對I性變態反應具有抑制作用，因而對嗜酸性粒細胞或IC型變態反應的作用幾乎沒有作用(日本藥理學雜誌(Jap.J.Pharmacol.)63，73，1993，Jap.J.Pharmacol.51，93，1989)。最近，tacrolimus(一種免疫抑制劑)軟膏已被開發為治療特應性皮炎的藥物(J.Allergy Clin.Immunol.104，S126，1999)，但不能避免由於這種藥物對免疫反應抑制作用導致的各自副作用。總之，現有的藥物，無論在效力和副作用方面都很難說是十分令人滿意的，因此，仍需要開發更高效和安全的藥物。
另一方面，胃促胰酶是一種貯藏在肥大細胞顆粒中的絲氨酸蛋白酶，並廣泛地存在於各自組織，如皮膚、心臟、血管壁、小腸等中(免疫學和生物學中的肥大細胞蛋白酶(Mast cell protease in Immunolgy andBiology)；Caughey，G.H.，Ed；Marcel Dekker，Inc.；New York，1995))。很久以前曾報導胃促胰酶作用於大鼠腹膜肥大細胞並引起脫粒(J.Immunol.136，3812，1986)，胃促胰酶抑制劑抑制Ig-E介導的肥大細胞脫粒(國際生物化學(Biochem.Int.)10，863，1985)，還有人指出胃促胰酶與肥大細胞的功能有關。最近報導對小鼠和豚鼠施以人胃促胰酶引發包括嗜酸性粒細胞在內的白細胞浸潤(英格蘭藥理學雜誌(Br.J.Pharmacol.)125，1491，1998)，人胃促胰酶作用於IL-1β(白介素1β)並將其轉化為活化型IL-1β(J.Exp.Med.174，821，1991)，以及人胃促胰酶具有部分消化膜結合的幹細胞因子(SCF)並將其轉化為可溶性SCF的功能(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94，9017，1997)等。這些發現表明胃促胰酶在變態反應性疾病，如特應性皮炎中可能具有某種作用。但是，還不能說通過這些研究就已經闡明了胃促胰酶的病生理學作用。目前，為搞清胃促胰酶在各自疾病中的作用和胃促胰酶抑制劑作為藥物的可能性，正在積極地研究可抑制體內胃促胰酶活性的物質。
已經報導了一些胃促胰酶抑制劑，例如低分子量胃促胰酶抑制劑，如教科書中給出的(蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitors)；Barrett等編；Elssevier Science B.V.；Amsterdam，196)；報導為肽類抑制劑的α-酮酸衍生物(WO 93-25574，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA，1995，92，6738)；α，α-二氟-β-酮酸衍生物(日本未審專利申請(公開)9-124691)；三肽抑制劑(WO 93-03625)；磷酸衍生物(Oleksyszyn等，生物化學(Biochemistry)30，485，1991)；肽類抑制劑，如三氟甲基酮衍生物(WO 96-33974，日本未審專利申請(公開)10-53579)和乙醯胺衍生物(日本未審專利申請(公開)10-7661，日本未審專利申請(公開)10-53579，日本未審專利申請(公開)11-246437，WO 99-41277，WO98-18794，WO96-39373)；非肽類抑制劑，如三嗪衍生物(日本未審專利申請(公開)8-208654和日本未審專利申請(公開)10-245384)；苯酚酯衍生物(日本未審專利申請(公開)10-87567)；頭孢烯衍生物(日本未審專利申請(公開)10-87493)；異噁唑衍生物(日本未審專利申請(公開)11-1479)；咪唑烷衍生物(WO96-04248)；乙內醯脲衍生物(日本未審專利申請(公開)9-31061)；喹唑啉衍生物(WO97-11941)等，但仍沒有確立用抑制胃促胰酶活性為治療策略的令人滿意的藥物或治療方法。
發明公開本發明的目的是提供一種預防或治療皮炎，如特應性皮炎的無副作用的安全性藥物，所述皮炎表現出雙相皮膚反應或是由於重複接觸抗原誘發的，所述藥物抑制該適應症的發展並改善患者的生活質量。
本發明者通過深入研究，注意到特應性皮炎表現出雙相皮膚反應並且晚期反應在該適應症中起重要作用的事實。結果，本發明者發現胃促胰酶抑制劑可用於緩解皮炎的雙相皮膚反應的晚期反應，且甚至可有效對抗由於重複接觸抗原引起的皮炎，因此完成了本發明。
本發明提供一種預防或治療表現出雙相皮膚反應的皮炎的藥物，它含有胃促胰酶抑制劑作為有效成分。
本發明還提供一種緩解表現出雙相皮膚反應的皮膚的晚期反應的藥物，它含有胃促胰酶作為有效成分。
本發明還提供一種預防或治療的由於重複接觸抗原誘發的皮炎的藥物，它含有胃促胰酶作為有效成分。
本發明提供一種預防或治療表現出雙相皮膚反應的皮炎的藥物組合物，它含有緩解晚期反應量的胃促胰酶作為有效成分和可藥用賦形劑。
附圖的簡要說明附

圖1是實施例2中蛔蟲屬誘導的小鼠雙相皮膚反應的皮膚反應-時間過程圖。
附圖2A、2B和2C表示實施例3中胃促胰酶抑制劑(附圖2A)和對照藥物潑尼松龍(附圖2B)和苯海拉明(附圖2C)對蛔蟲屬(Ascaris)引發的雙相皮膚反應的作用的圖。
附圖3A和3B表示實施例4中當對小鼠皮內施以人胃促胰酶(附圖3A)或組胺(附圖3B)時的皮膚反應-時間過程圖。
附圖4A和4B表示實施例4中當對小鼠皮內施以人胃促胰酶時皮膚反應的胃促胰酶劑量-依賴性圖(附圖4A，施用胃促胰酶後1小時；附圖4B，施用胃促胰酶後16小時)。
附圖5表示實施例5中加熱處理對人胃促胰酶對誘發皮炎的作用的影響的圖。
附圖6A-6E表示實施例6中由皮內注射人胃促胰酶誘發的皮炎的組織學分析照片，其中附圖6A是正常小鼠；附圖6B是由蛔蟲提取物誘發的皮炎(1小時後)；附圖6C是由蛔蟲提取物誘發的皮炎(24小時後)；附圖6D是由人胃促胰酶誘發的皮炎(1小時後)；附圖6E是由人胃促胰酶誘發的皮炎(24小時後)。
附圖7A和7B表示實施例7中對缺乏肥大細胞的小鼠皮內施用人胃促胰酶時的皮膚反應圖(附圖7A，1小時後的反應；附圖7B，16小時後的反應)。
附圖8A表示實施例8中人胃促胰酶對人多形核白細胞(PMN)遷移的體外影響的濃度依賴性的圖。附圖8B是表示實施例8中胃促胰酶抑制劑對胃促胰酶誘發的PMN遷移的影響圖。
附圖9表示實施例9中通過重複應用半抗原誘發的皮炎中的耳的厚度增加的時間過程圖。
附圖10表示實施例9中通過重複應用半抗原誘發的皮炎中的耳中胃促胰酶樣活性的變化圖。
附圖11A-11D表示實施例10中胃促胰酶抑制劑對通過重複應用半抗原誘發的皮炎的作用(附圖11A是對照藥物潑尼松龍；附圖11B-附圖11D分別是化合物35、化合物34和化合物18)。
附圖12表示實施例11中胃促胰酶抑制劑對通過重複應用半抗原誘發的皮炎中嗜酸性粒細胞數量增多的影響作用圖。
附圖13表示實施例12中胃促胰酶抑制劑對通過重複應用半抗原誘發的皮炎中肥大細胞數量增多的影響作用圖。
附圖14A、14B和14C分別表示實施例12中胃促胰酶抑制劑對通過重複應用半抗原誘發的皮炎中嗜酸性粒細胞數量增多的影響的照片。
附圖15表示實施例13中當給小鼠重複皮內注射人胃促胰酶時，皮膚厚度變化的時間過程圖。
附圖16表示實施例4中當給小鼠重複皮內注射人胃促胰酶時嗜酸性粒細胞數量增多的時間過程圖。
附圖17表示實施例15中當給小鼠重複皮內注射人胃促胰酶時組胺含量變化的時間過程圖。
附圖18A和18B是實施例16中當給小鼠重複皮內注射人胃促胰酶時的SCF表達的免疫組織分析的代表性照片(附圖18A是正常皮膚；附圖18B是注射了胃促胰酶的)。
附圖19是實施例17中人胃促胰酶在體外對人角化細胞中SCF表達的影響圖。
附圖20A和20B表示實施例18中胃促胰酶抑制劑對NC/Nga小鼠的臨床皮膚評分的影響圖。附圖20A是在實驗開始時；附圖20B是開始施用胃促胰酶後35天。
附圖21表示實施例18中胃促胰酶抑制劑對NC/Nga小鼠的組織學評分的影響圖。
附圖22A和22B表示實施例18中胃促胰酶抑制劑對NC/Nga小鼠中皮膚肥大細胞數量的影響圖。
附圖23A和23B表示實施例18中胃促胰酶抑制劑對NC/Nga小鼠中皮膚嗜酸性粒細胞數量的影響圖。圖23A，耳；圖23B，背部。
實施本發明的最佳方式通過本領域普通專業人員可使用的方法，選擇能夠表現出抑制胃促胰酶活性作用的物質作為本發明的胃促胰酶抑制劑。作為選擇方法，可提及例如後面描述的實施例1的方法。以此方式獲得的化合物包括以前已經報導作為胃促胰酶抑制劑的已知化合物，例如低分子量胃促胰酶抑制劑，如教科書中給出的(蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitors)；Barrett等編；Elssevier Science B.V.；Amsterdam，196)；報導為肽類抑制劑的α-酮酸衍生物(WO 93-25574，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6738)；α，α-二氟-β-酮酸衍生物(日本未審專利申請(公開)9-124691)；三肽抑制劑(WO 93-03625)；磷酸衍生物(Oleksyszyn等，Biochemistry 30，485，1991)；肽樣抑制劑，如三氟甲基酮衍生物(WO96-33974，日本未審專利申請(公開)10-53579)和乙醯胺衍生物(日本未審專利申請(公開)10-7661，日本未審專利申請(公開)10-53579，日本未審專利申請(公開)11-246437，WO 99-41277，WO98-18794，WO96-39373)；非肽類抑制劑，如三嗪衍生物(日本未審專利申請(公開)8-208654和日本未審專利申請(公開)10-245384)；苯酚酯衍生物(日本未審專利申請(公開)10-87567)；頭孢烯衍生物(日本未審專利申請(公開)10-87493)；異噁唑衍生物(日本未審專利申請(公開)11-1479)；咪唑烷衍生物(WO96-04248)；乙內醯脲衍生物(日本未審專利申請(公開)9-31061)；喹唑啉衍生物(WO97-11941)等，但是作為優選胃促胰酶抑制劑的代表性實例，可提及下式(I)化合物及其可藥用鹽。 其中，A環表示芳基；R1表示羥基、氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基氨基、可被羧酸基取代的C7-C10低級芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基或者可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基；R2和R3可以相同或不同，並且表示氫原子、未取代的或取代的C1-C4低級烷基、滷原子、羥基、C1-C4低級烷氧基、氨基、未取代的或取代的C1-C4低級烷基氨基、未取代的或取代的C7-C10芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基，或者羧酸基，或者當A環是苯環時，R1和R2可與該取代的苯環一起形成可被羧酸取代的稠合雜環，其中環中的碳原子可形成羰基並且R3定義如上；並且X表示氫原子、C1-C4低級烷基、C1-C4低級烷氧基、滷原子、羥基、氨基或硝基。
在通式(I)中，A環表示的芳基的優選實例是苯環和萘環。
R1表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基氨基和可被羧酸基取代的C7-C12低級芳烷基氨基的優選實例是甲氨基、乙氨基、丙氨基、丁氨基、羧甲基氨基、羧乙基氨基、羧丙基氨基、羧丁基氨基、苄氨基、苯乙氨基、苯丙基氨基、苯丁基氨基、羧基苄氨基、羧基苯乙氨基、羧基苯丙基氨基、羧基苯丁基氨基等。
R1表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基和可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基的優選實例是甲醯氨基、乙醯氨基、丙醯氨基、丁醯氨基、苯甲醯氨基、萘甲醯氨基、吡啶甲醯氨基、吡咯甲醯氨基、羧基乙醯氨基、羧基丙醯氨基、羧基丁醯氨基、羧基苯甲醯氨基、羧基萘甲醯氨基、羧基吡啶甲醯氨基、羧基吡咯甲醯氨基等。
R1表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基和可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基的優選實例是甲磺醯氨基、乙磺醯氨基、丙磺醯氨基、丁磺醯氨基、苯磺醯氨基、萘磺醯氨基、吡啶磺醯氨基、吡咯磺醯氨基、羧基甲磺醯氨基、羧基乙磺醯氨基、羧基丙磺醯氨基、羧基丁磺醯氨基、羧基苯磺醯氨基、羧基萘磺醯氨基、羧基吡啶磺醯氨基、羧基吡咯磺醯氨基等。
R1表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基的優選實例是乙酸基、丙酸基、丁酸基、戊酸基等。
R1表示的可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基的優選實例是丙烯酸基、巴豆酸基等。
R2或R3表示的未取代的或取代的C1-C4低級烷基的優選實例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基；以及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基。
C1-C4低級烷基的取代基的優選實例是羧酸基；滷原子，如氟原子和氯原子；C1-C4低級烷氧基；氨基；甲氨基；二甲氨基、羧甲基氨基、羧乙基氨基等。
R2或R3表示的滷原子的優選實例是氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。
R2或R3表示的C1-C4低級烷氧基的優選實例是直鏈烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和正丁氧基；以及支鏈烷氧基，如異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。
R2或R3表示的未取代的或取代的C1-C4低級烷基氨基的優選實例是甲氨基、乙氨基、丙氨基、丁氨基等。
C1-C4低級烷基氨基的取代基的優選實例是羧酸基；滷原子，如氟原子和氯原子；C1-C4低級烷氧基等。
R2或R3表示的未取代的或取代的C7-C12低級芳烷基氨基的優選實例是苄氨基、苯乙氨基、苯丙基氨基、苯丁基氨基等。
芳烷基氨基的取代基的優選實例是羧酸基；滷原子，如氟原子和氯原子；C1-C4低級烷氧基等。
R2或R3表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基和可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基的優選實例是甲醯氨基、乙醯氨基、丙醯氨基、丁醯氨基、苯甲醯氨基、萘甲醯氨基、吡啶甲醯氨基、吡咯甲醯氨基、羧基乙醯氨基、羧基丙醯氨基、羧基丁醯氨基、羧基苯甲醯氨基、羧基萘甲醯氨基、羧基吡啶甲醯氨基、羧基吡咯甲醯氨基等。
R2或R3表示的可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基和可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基的優選實例是甲磺醯氨基、乙磺醯氨基、丙磺醯氨基、苯磺醯氨基、萘磺醯氨基、吡啶磺醯氨基、吡咯磺醯氨基、羧基甲磺醯氨基、羧基乙磺醯氨基、羧基丙磺醯氨基、羧基苯磺醯氨基、羧基萘磺醯氨基、羧基吡啶磺醯氨基、羧基吡咯磺醯氨基等。
當A環是苯環時，R1和R2與該取代的苯環一起形成的可被羧酸基取代的稠合雜環(其中環中的碳原子可形成羰基)的優選實例是四氫喹啉環和苯並噁嗪環，如四氫喹啉、苯並噁嗪、喹喔啉、苯並二噁烷、羧基四氫喹啉、羧基苯並噁嗪、羧基喹喔啉、羧基苯並二噁烷等。
X表示的C1-C4低級烷基的優選實例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基；以及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基。
X表示的C1-C4低級烷氧基的優選實例是直鏈烷基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和正丁氧基；以及支鏈烷基，如異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。
X表示的滷原子的優選實例是氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。
此外，可藥用的實例是酸鹽，如鹽酸鹽、甲磺酸鹽和三氟乙酸鹽；及鹼金屬鹽，如鈉鹽和鉀鹽。
優選的胃促胰酶抑制劑的其它代表性實例是式(II)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，其中B環表示苯環、吡啶環、吡咯環或吡唑環，m表示0、1或2，Y表示羥基、硝基、氯原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基、可被滷原子取代的C1-C4低級烷氧基或C7-C12芳烷氧基，或者Y表示與所示被所述Y取代的苯環一起形成萘環或喹啉環，R5和R6可以相同或不同，並且表示氫原子、滷原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基、硝基、氰基、吡唑基、四唑基、可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基或者可被一個或多個選自下列的取代基取代的C1-C4低級烷氧基滷原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基；或者當B環表示苯環時，R5和R6代表與所示被所述R5和R6取代的苯環一起形成萘環或喹啉環的基團，並且Z表示氫原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基，C2-C5鏈烯基，未取代的或取代的芳烷基，未取代的或取代的芳香雜環烷基，可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧甲基，被伯胺、仲胺或環狀胺醯胺化的甲醯甲基，未取代的或取代芳甲醯甲基，或者未取代的或取代的芳烷氧基甲基。
在通式(II)中，Y表示的滷原子的優選實例氟、氯、溴或碘。Y表示的可被滷原子取代的C1-C4低級烷基的實例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基，而Y表示的可被滷原子取代C1-C4低級烷基的滷原子的實例是氟、氯、溴和碘。Y表示的可被滷原子取代的C1-C4低級烷氧基的實例是直鏈烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和正丁氧基，及支鏈烷氧基，如異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基，而Y表示的可被滷原子取代的C1-C4低級烷氧基的滷原子的實例是氟、氯、溴和碘。Y表示的C7-C12的芳烷氧基的實例是苄氧基、苯基乙氧基、苯基丙氧基和萘基乙氧基等，優選苄氧基。
R5和R6表示的滷原子的優選實例是氟、氯、溴或碘。R5和R6表示的可被滷原子取代的C1-C4低級烷基的實例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基，而可被滷原子取代C1-C4低級烷基的滷原子的實例是氟、氯、溴或碘。R5和R6表示的可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基的C1-C4低級烷基的優選實例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基。R5或R6的可被一個或多個取代基取代的C1-C4低級烷氧基的實例是直鏈烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和正丁氧基，及支鏈烷氧基，如異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基，所述取代基選自滷原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基。所示作為上述取代基的滷原子的實例是氟、氯、溴或碘，並且可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基的C1-C4低級烷基的優選實例是甲基、乙基、正丙基，正丁基，和其它直鏈烷基及異丙基、仲丁基和叔丁基，和其它支鏈烷基。
Z表示的可被滷素取代的C1-C4低級烷基中的烷基的實例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基，而可被滷原子取代C1-C4低級烷基的滷原子的實例是氟、氯、溴或碘。Z表示的C2-C5鏈烯基的實例是烯丙基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基等。
Z所示的未取代的或取代的芳烷基中的芳烷基的實例C7-C12芳烷基，優選苄基、苯乙基、苯丙基或萘乙基。未取代的或取代的芳烷基的取代基的優選實例是可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基、氰基、硝基、被伯胺醯胺化的(amidized)羰基、可被羧酸或胺基酸醯胺化的胺基和可被低級烷氧羰基取代的胍基。可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基中的低級烷基的實例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，以及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基。被伯胺醯胺化的羰基中的伯胺的實例是C1-C4低級烷胺或者可被羧基取代的那些，例如優選甲胺、乙胺、異丙基胺和羧基甲胺；具有單環或多環芳烴基的胺，例如苯胺和萘胺；具有芳雜環基的胺，如氨基吡啶、氨基吡咯等。可被羧酸或胺基酸醯胺化的氨基中的羧酸實例優選是C2-C5脂族一元羧酸或脂族二元羧酸，如新戊酸、琥珀酸，而胺基酸的實例是其中羧基可被酯化或者其中的氨基可被醯胺化的胺基酸，例如L-天冬氨酸、α-O-叔丁基-N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸等。可被低級烷氧羰基取代的胍基的實例優選是可被C2-C5低級烷氧羰基取代的的胍基，例如胍基和2，3-二-叔丁氧羰基胍基。
Z表示的未取代的或取代的芳雜環烷基中的芳雜環烷基實例是噻吩烷基，如2-噻吩基和2-噻吩乙基；呋喃烷基，如2-呋喃甲基和2-呋喃乙基；吡啶烷基，如2-吡啶甲基、3-吡啶甲基、4-吡啶甲基和4-吡啶乙基；嘧啶烷基，如5-嘧啶甲基；吡嗪烷基，如2-吡嗪甲基；噠嗪烷基，如3-噠嗪甲基；四唑烷基，如5-四唑烷基；異噻唑烷基，如4-異噻唑甲基和5-異噻唑甲基；噻唑烷基，如5-噻唑甲基；噁唑烷基，如5-噁唑甲基；和異噁唑烷基，如4-異噁唑甲基和5-異噁唑甲基。未取代的或取代的雜環烷基中的取代基的優選實例是C1-C4低級烷基，如甲基和乙基；以及C1-C4羧基低級烷基，如羧甲基和羧乙基。
Z表示的可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧甲基中的低級烷基的實例是直鏈烷基，如甲基、乙基、正丙基和正丁基，以及支鏈烷基，如異丙基、仲丁基和叔丁基。
Z表示的可被伯胺或仲胺或環狀胺醯胺化的甲醯甲基中的伯胺的實例是C1-C4低級烷胺或者可被羧基取代的那些，例如優選甲胺、乙胺、異丙基胺和羧基甲胺；具有單環飽和烴基的胺，如環己胺；具有單環或多環芳烴基的胺，例如苯胺、苄胺和萘胺；和具有芳雜環基的胺，如氨基吡啶、氨甲基吡啶、氨基吡咯、氨基嘧啶、氨基吲哚和氨基喹啉，其中具有芳烴基和芳雜環基的胺在其環上可帶有一個或多個取代基，如1)羥基，2)-OPO(OH)2，3)氨基，4)氧代，5)滷原子，6)羧基，該羧基可被C1-C4低級烷基，如甲基、乙基、異丙基和叔丁基；或者烯丙基酯化，7)直鏈或支鏈的C1-C4低級烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和正丁氧基，這些基團可被羧基取代，所述羧基可被C1-C4低級烷基，如甲基、乙基、異丙基和叔丁基或者丙烯基酯化，8)直鏈或支鏈的C1-C4低級烷基，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基、異丙基、仲丁基和叔丁基，它們可被取代。
上述8)的可被取代的C1-C4低級烷基的取代基的優選實例是a)羧基，該羧基可被C1-C4低級烷基，如甲基、乙基、異丙基和叔丁基，或者烯丙基酯化，b)哌啶基(piperadinyl)，該基團可被羧基N-取代，該羧基可被C1-C4低級烷基，如甲基、乙基、異丙基和叔丁基或者烯丙基酯化，c)嗎啉代，和d)可被羧酸或胺基酸醯胺化的氨基。
上述d)的可被羧酸或胺基酸醯胺化的氨基的羧酸的實例優選是C2-C5脂族一或二元羧酸，如新戊酸和琥珀酸，而胺基酸的實例是其中羧基可被酯化或者其中的氨基可被醯胺化的胺基酸，例如L-天冬氨酸、α-O-叔丁基-N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸和β-O-叔丁基-N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸。具有芳雜環基的胺可在其環上包含氮原子，其可被C1-C4低級烷基，如甲基和乙基取代，或者被可被酯化的羧基低級烷基，如羧甲基和叔丁氧甲醯甲基取代。
Z表示的可被伯胺、仲胺或環狀胺醯胺化的甲醯甲基(carbonylmethyl)中的仲胺的實例是二低級烷基胺，如二甲胺和二乙胺。Z表示的可被伯胺、仲胺或環狀胺醯胺化的甲醯甲基中的環狀胺的實例是吡咯烷和哌啶。
Z表示的未取代的或取代的芳甲醯甲基中的芳甲醯甲基實例是苯甲醯甲基和萘甲醯甲基，取代基的優選實例是羥基；硝基；滷原子，如氟、氯、溴和碘；直鏈或支鏈C1-C4低級烷基，該烷基可被滷原子取代，如甲基、乙基、正丙基、正丁基、異丙基、仲丁基和叔丁基；直鏈或支鏈C1-C4低級烷氧基，該烷氧基可被滷原子取代，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、正丁氧基、異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。
Z表示的未取代的或取代的芳烷氧基甲基中的芳烷氧基甲基的實例優選是C8-C13芳烷氧基甲基，例如苄氧甲基、苯乙氧基甲基和萘乙氧基甲基，而取代基的優選實例是羥基；硝基；滷原子，如氟、氯、溴和碘；直鏈或支鏈C1-C4低級烷基，該烷基可被滷原子取代，如甲基、乙基、正丙基、正丁基、異丙基、仲丁基和叔丁基；直鏈或支鏈C1-C4低級烷氧基，該烷氧基可被滷原子取代，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、正丁氧基、異丙氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。
此外，可藥用鹽的實例是酸鹽，如氯酸鹽和硝酸鹽以及鹼金屬鹽，如鈉鹽和鉀鹽。
本發明的式(I)的喹唑啉衍生物可，例如通過下列(A)和(B)的合成方法合成。
合成方法(A)採用，例如JP-A-6-199839中描述的方法，使式(I-1)的化合物 其中A環定義如上並且R1』、R2』和R3』分別表示R1、R2和R3，它們可被保護基保護，R1、R2和R3定義如上與式(I-2)的鄰氨基苯甲酸衍生物反應 其中X』表示X，該基團可被保護基保護，並且X定義如上獲得式(I-3)的磺醯脲衍生物 其中A、R1』、R2』、R3』和X』定義如上，然後使用縮合試劑，例如1，1』-羰基二咪唑(下文稱之為CDI)，獲得喹唑啉環，如果需要，將脫去R1、R2、R3和X的保護基。
在該反應中，當R1、R2或R3表示含羥基、氨基或羧基的基團時，R1、R2或R3可任選地用保護基保護，所述保護基是，例如苄氧羰基、叔丁氧羰基、苄基、烯丙基、叔丁基等。當X表示羥基或氨基時，X可任選地用保護基保護，所述保護基是，例如苄氧羰基、叔丁氧羰基、苄基、烯丙基、叔丁基等。
用於該反應的式(I-1)化合物包括市售的或已知化合物或者可採用已知方法合成的化合物。例如，可使用按照歐洲專利說明書0269141中描述的合成方法，用氯磺醯異氰酸酯，由相應的磺醯胺衍生物合成的化合物。例如，可使用3-烯丙氧羰基-甲基苯磺醯基異氰酸酯、4-烯丙氧羰基-甲基苯磺醯基異氰酸酯和4-烯丙氧基苯磺醯基異氰酸酯等。
用於該反應的式(I-2)的鄰苯甲酸衍生物可使用市售的或已知化合物或者通過已知方法合成的化合物。例如，可使用4-氯鄰氨基苯甲酸、4-甲氧基鄰氨基苯甲酸、5-氯鄰氨基苯甲酸、4-羥基鄰氨基苯甲酸等。
由式(I-3)的磺醯脲衍生物獲得喹唑啉環的反應可在質子惰性的溶劑中於-50-50℃，優選在-20℃-室溫下進行，溶劑是，例如醚類溶劑，如四氫呋喃和二噁烷；含滷原子的溶劑，如二氯甲烷；或者二甲基甲醯胺等。此外，對於該環合反應，可使用常規的縮合試劑，包括，例如CDI、二環己基碳二亞胺及類似的碳二亞胺化合物；混合酸酐等。脫保護反應可用常規方法進行，如用酸或鹼水解，還原或氧化等。
合成方法(B)使其中A環、R1』、R2』和R3』定義如上的式(I-4)化合物 與式(I-5)的鄰氨基苯甲酸衍生物縮合 其中X』定義如上，Ph表示苯基，並且R4表示羧基的保護基，羧基是可通過水解或氫解被釋放出的特定基團，例如甲基、乙基或苄基使用，例如1，8-二氮雜雙環[5，4，0]-7-十一碳烯(下文稱之為DBU)形成式(I-6)的磺醯脲衍生物 其中A環、R1』、R2』、R3』、R4』和X定義如上，然後用鹼水解或氫解得到式(I-3)的相應羧酸，再得到喹唑啉環並任選地以與合成方法(A)中相同的方法，脫去R1、R2、R3和X的保護基。在該反應中，當R1、R2、R3表示含羥基、氨基或羧基的基團時，R1、R2或R3可任選地用保護基，例如苄氧羰基、叔丁氧羰基、苄基、烯丙基、叔丁基等保護。當X表示羥基或氨基時，X可任選地用保護基，例如苄氧羰基、叔丁氧羰基、苄基、烯丙基、叔丁基等保護。
作為用於該反應的式(I-4)化合物，可使用市售的或已知化合物或者通過已知方法合成的化合物。例如，可使用3-羥基苯磺醯胺，2-氨基苯磺醯胺，3-氨基苯磺醯胺，4-氨基苯磺醯胺，(±)-2-(4-氨基磺醯基苯基)丁酸，3-苄氧羰基氨基-4-氯苯磺醯胺，4-苄氧羰基氨基-3-氯苯磺醯胺，4-氨基-3，5-二氯苯磺醯胺，3-苄氧羰基氨基-4-甲基苯磺醯胺，4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺醯胺，3-苄氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺醯胺，4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺醯胺，3-叔丁氧羰基-4-羥基苯磺醯胺，3-乙醯胺-4-甲氧基苯磺醯胺，3-(3-氨基磺醯基)苯基丙烯酸叔丁基酯，3-氨基-4-甲氧基苯磺醯胺，4-甲氧基-3-甲基磺醯氨基苯磺醯胺，3-羧基-4-羥基-2-萘磺醯胺，4-苄氧羰基氨基-3-叔丁氧羰基苯磺醯胺，(±)-3-叔丁氧羰基-2-氧代-1H，3H-喹啉-7-磺醯胺，(±)-2-叔丁氧羰基-3-氧代-1，4-苯並噁嗪-6-磺醯胺等。
作為用於該反應的式(I-5)鄰氨基苯甲酸，可使用市售的或已知化合物或者通過已知方法合成的化合物。例如，可使用4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸乙酯，4-氯-2--N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，5-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸乙酯，5-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，4-甲氧基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，4-甲氧基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸乙酯，4-甲氧基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，4-羥基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，4-羥基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸乙酯，4-羥基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯等。
獲得式(I-4)化合物和式(I-5)的鄰氨基苯甲酸衍生物縮合得到式(I-6)的磺醯脲衍生物的反應可用質子惰性溶劑在-50-50℃，優選-20-室溫下進行，所述溶劑是，例如醚類溶劑，如四氫呋喃或二噁烷；含滷溶劑，如二氯甲烷；或者二甲基甲醯胺等。此外，作為該縮合反應可使用的有機強鹼，可使用例如DBU；無機鹼是，例如碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鉀和氫氧化鈉；或者金屬鹼，如氫化鈉。
對於在鹼水解或氫解由此得到的式(I-6)的磺醯脲衍生物獲得式(I-3)磺醯脲衍生物的反應，可採用用於酯的常規水解條件和氫化條件。
注意到上述反應可在被保護的官能團不參與反應的情況下進行。依據保護基的類型，可通過化學還原或者其它常規脫保護反應脫除保護。例如，當保護基是叔丁基時或者叔丁氧羰基時，可使用三氟乙酸；當保護基是烯丙基時，可使用鈀催化劑，如四(三苯基膦)鈀(O)。
其中R1表示被可被羧酸取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基，被可被羧酸取代的芳環羧酸醯化的氨基，和被可被羧酸取代的雜芳環羧酸醯化的氨基的式(I)化合物可使用常規方法，由其中R1表示氨基的式(I)化合物通過用羧酸、醯氯、酸酐醯化得到。
其中R1表示被可被羧酸取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基，被可被羧酸取代的芳環磺酸磺醯化的氨基和可被羧酸取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基的式(I)化合物可採用常規方法，由其中R1表示氨基的式(I)化合物通過用磺酸或磺醯氯磺醯化得到。
本發明的式(II)化合物可通過上述類似的方法獲得，該方法在國際公開WO 97/11941中有詳細描述。
獲得的式(I)或(II)化合物可通過常規方法，如重結晶或柱色譜純化。
另外，如果需要，通過上述方法獲得的式(I)或(II)化合物可通過使其與各種類型的酸或鹼反應轉化為鹽。可用於將式(I)或(II)化合物轉化為鹽的酸可提及，例如無機酸，如氫氯酸、氫溴酸、硝酸、硫酸或磷酸；以及有機酸，如甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、三氟乙酸、檸檬酸、乳酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、乙酸、己二酸、棕櫚酸和鞣酸。
可用於將式(I)或(II)化合物轉化為鹽的鹼可提及，例如氫氧化鈉、氫氧化鋰和氫氧化鉀。
式(I)或(II)化合物包括含不對稱中心的化合物。外消旋混合物可通過一種或多種方法分離為旋光活性單體。可使用，例如(1)使用旋光活性柱的方法(2)通過旋光活性酸或鹼轉化為鹽，然後重結晶的方法(3)(1)和(2)的結合方法。
採用後面實施例3、8、10、11、12和18中解釋的方法，可評價這些混合物預防或緩解表現出雙相皮膚反應的皮炎和由於與抗原重複接觸引發的皮炎的作用。
當使用本發明的化合物作為預防或治療表現出雙相皮膚反應的皮炎，作為緩解表現出雙相皮膚反應的皮炎的晚期反應的藥物，或者作為預防或治療由於與抗原重複接觸引發的皮炎的藥物時，可使用一種本發明化合物或者兩種或多種本發明化合物的混合物來製備適於按照常規方法給藥的製劑。例如口服製劑形式的實例包括膠囊、片劑、顆粒、細顆粒、糖漿、幹糖漿和其它製劑；非口服製劑的實例包括注射劑和栓劑如直腸栓劑和陰道栓劑；經鼻製劑是，例如噴霧劑和軟膏；及透皮製劑，如透皮吸收帶劑。
本發明化合物的臨床劑量可根據症狀、嚴重程度、年齡、存在的併發症等變化，以及根據製劑形式變化。在口服給藥的情況下，有效成分的成人劑量一般為1-1000mg天。在非口服給藥的情況下，施用1/10-1/2口服劑量的量足以。這些劑量範圍可根據患者的年齡、症狀等進行調整。
在本發明中，胃促胰酶抑制劑可不與其它活性成分混合而單獨給藥，但考慮到有關疾病、症狀、併發症等，也可施用含有其它有效成分的藥物製劑。此外，也可與其它有效成分聯合。對其它有效成分的用量沒有特別限制，但可考慮其單獨產生作用的最低量、產生的副作用等來確定。
在治療中，包括僅含胃促胰酶抑制劑作為活性成分的製劑和含有其它有效成分的製劑聯合治療的製劑形式和方法宜由醫師按照患者的年齡、症狀等選擇。
本發明化合物的毒性較低。給5周齡雄性小鼠口服給藥後24小時時的急性毒性值LD50為1g/kg或更高。該值高於預期臨床劑量的50倍。因此，本發明化合物具有高安全性。
實施例通過下列非限制性實施例進一步描述本發明，但無需贅述，本發明的範圍不限於這些實施例。
在實施例2和實施例3中，用表現出雙相皮膚反應的皮炎的小鼠模型通過顯示胃促胰酶抑制劑的抑制作用體現胃促胰酶抑制劑的有用性。另外，在實施例4至實施例6中，進一步證明了胃促胰酶與表現出雙相皮膚反應的皮炎有關的論點，給出了通過對小鼠耳部皮內接種人胃促胰酶引發表現出雙相皮膚反應的皮炎的事實。在實施例7和實施例8中，顯示了胃促胰酶在此類雙相皮膚反應中的作用機制的分析結果。
另一方面，在實施例9至實施例12中，使用由重複使用半抗原引發的皮炎模型，並分析該模型和胃促胰酶抑制劑在該模型中的作用證明胃促胰酶抑制的有用性。另外，在實施例13至15中，由於可了解特應性皮炎等患者因與抗原重複接觸導致肥大細胞進行重複脫粒反應，分析對耳部重複施用人胃促胰酶引發的皮炎，由此研究皮膚的重複脫粒反應作用。再者，在實施例16-17中，顯示了胃促胰酶對肥大細胞的主要細胞因子SCF表達的影響是胃促胰酶引發皮炎的機制之一。在實施例18中，用NC/Nga小鼠作為通過與抗原重複接觸引發的第二模型檢測胃促胰酶抑制劑對皮炎的作用。
製備實施例17-氯-3-(3-羥基苯磺醯基)-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物1)的合成按照合成方法(B)，將938mg(5.42mmol)3-羥基苯磺醯胺溶於40ml四氫呋喃中，然後滴加892μl(5.96mmol)1，8-氮雜雙環[5.4.0]-7-十一碳烯(下文稱之為DBU)。將該反應溶液在室溫攪拌15分鐘，然後加入1.66g(5.42mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯並將該混合物在室溫攪拌過夜。將過量水到入該反應溶液中，然後用鹽酸使該混合物呈酸性並用乙酸乙酯萃取。有機層用水和飽和鹽水洗滌，經無水硫酸鎂乾燥並濃縮。如此獲得的粗產物經矽膠柱色譜(0-5％甲醇/二氯甲烷)純化，得到1.32g(產率59％)的4-氯-2-{[(3-羥基苯磺醯氨基)羰基]氨基}苯甲酸甲酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)3.91(3H，s)，7.02(1H，m)，7.09(1H，m)，7.34(1H，t)，7.57(2H，m)，7.89(1H，d)，8.38(1H，d)，10.94(1H，s).接下來，將如此獲得的1.23g(3.2mmol)該化合物溶於20ml甲醇，然後滴加10ml 2N氫氧化鈉水溶液。將該反應溶液在室溫下攪拌15分鐘，然後加入過量的水並用鹽酸使該混合物呈酸性。然後攪拌，產生結晶沉澱，然後過濾並乾燥得到羧酸。將如此獲得的產物溶於50ml四氫呋喃中，在冰冷卻下加入434mg(2.68mmol)CDI並將該混合物攪拌30分鐘。該反應溶液用乙酸乙酯稀釋，用水和飽和鹽水洗滌，經無色硫酸鎂乾燥，然後濃縮得到粗產物。該粗產物經矽膠柱色譜(乙酸乙酯∶正己烷＝1∶2)，得到230mg(2步產率為20％)標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.12(2H，s)，7.24(1H，d)，7.48(1H，t)，7.58(2H，s)，7.85(1H，d)，10.28(1H，s)，11.63(1H，s).
製備實施例23-(2-氨基苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物2)的合成以與製備實施例1相同的方式處理2.7g(15.7mmol)2-氨基苯磺醯胺和4.8g(15.7mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到3.2g(3步產率為58％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.46(2H，s)，6.65(1H，t)，6.81(1H，d)，7.12(1H，s)，7.23(1H，d)，7.34(1H，t)，7.76(1H，d)，7.86(1H，d).
製備實施例37-氯-3-(2-甲磺醯氨基苯磺醯基)-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物3)的合成將22mg(0.06mmol)化合物2溶於200μl1吡啶，滴加1.6μl(0.15mmol)甲磺醯氯，然後將所得混合物在室溫攪拌過夜。往該反應溶液中加入過量水，該混合物用乙酸乙酯萃取。有機層用1N鹽酸水溶液和飽和鹽水洗滌，然後經無水硫酸鎂乾燥並濃縮，得到粗產物。該粗產物經乙醚結晶，得到16mg(0.04mmol)標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.61(3H，s)，7.10(1H，d)，7.20(1H，d)，7.74(1H，d)，7.82-7.90(4H，m)，8.34(1H，d)，11.70(1H，s).
製備實施例43-(4-氨基苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物4)的合成以與製備實施例1相同的方式處理2.7g(15.7mmol)4-氨基苯磺醯胺和4.8g(15.7mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到7.9g(產率94％)2-{[(4-氨基苯磺醯氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸甲酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)3.59(3H，s)，5.37(2H，s)，6.45(2H，d)，6.83(1H，dd)，7.41(2H，d)，7.81(1H，d)，8.66(1H，d)，9.64(1H，s).
然後，以相同方式，由所得的7.9g(14.8mmol)磺醯脲產物，獲得4.3g(2步產率83％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.39(2H，s)，6.63(2H，d)，7.09(1H，s)，7.22(1H，d)，7.76(2H，d)，7.83(1H，d)，11.51(1H，s).
製備實施例53-(3-羧甲基-苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物5)的合成按照合成方法(A)，將3.27g(11.6mmol)3-烯丙氧羰基甲基苯磺醯基異氰酸酯溶於100ml無水THF中，然後加入1.98g(11.5mmol)4-氯鄰氨基苯甲酸並將該混合物在室溫攪拌2小時。該反應溶液用冰水冷卻後，加入1.87g(11.5mmol)CDI並將所得混合物在並冷卻下攪拌30分鐘。將過量水加到反應溶液中，然後用乙酸乙酯萃取該混合物。將有機層洗滌，乾燥並用少量乙酸乙酯使其結晶，得到2.0g(產率40％)3-(3-烯丙基氧羰基-苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮。如此獲得的烯丙基產物溶於100ml甲酸-THF(1∶9)混合物中，加入700mg三苯基膦。使反應器避光並保持在氮氣氛下，然加入700mg四(三苯基膦)鈀(O)並將所得混合物在室溫避光條件下攪拌過夜。將反應溶液真空濃縮，所得固體用二氯甲烷洗滌，得到1.47g(產率81％)標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.76(2H，s)，7.13(1H，s)，7.24(1H，d)，7.61-7.69(2H，m)，7.86(1H，d)，8.05(2H，s)，12.50(1H，br).
製備實施例63-(4-羧甲基-苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物6)的合成以與實施例5相同的方式處理1.10g(3.95mmol)4-烯丙氧羰基甲基-苯磺醯基異氰酸酯和678mg(3.95mmol)4-氯鄰氨基苯甲酸，獲得657mg(產率38％)3-(4-烯丙氧羰基苯磺醯基)-7-氯-2，4-(1H，3H)-喹唑啉二酮。以相同方式處理538mg(1.24mmol)該化合物，得到342mg(產率70％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.75(2H，s)，7.13(1H，s)，7.23(1H，d)，7.61-7.69(2H，m)，7.86(1H，d)，8.05(2H，s)，12.07(2H，br).
製備實施例7(±)-2-{4-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉-3-基)磺醯基]苯基}丁酸(化合物7)的合成以與製備實施例1相同的方式處理1.02g(3.41mmol)(±)-2-(4-氨基磺醯基苯基)丁酸叔丁基酯和1.04g(3.41mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到1.46g(產率84％)1-[({4-[1-(叔丁氧羰基)丙基]苯磺醯氨基}羰基)氨基]-4-氯苯甲酸甲酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)0.89(3H，t)，1.38(9H，s)，1.69-1.76(1H，m)，2.03-2.10(1H，m)，3.42(1H，t)，3.94(3H，s)，7.04(1H，d)，7.47(2H，d)，7.93(1H，d)，8.01(2H，d)，8.45(1H，br)，11.04(1H，br).
接下來，用4.3ml(8.6mmol)2N氫氧化鈉水溶液類似地形成1.43g羧酸，再用463mg(2.86mmol)CDI得到970mg(2步產率71％)(±)-2-{4-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉-3-基)磺醯基]苯}丁酸叔丁基酯。
將如此獲得的叔丁基酯溶於5ml二氯甲烷中，然後加入5ml三氟乙酸並將所得混合物在室溫攪拌40分鐘。將該反應溶液真空濃縮並將所得粗產物用少量乙醚洗滌，得到820mg(產率96％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)0.84(3H，t)，1.67-1.75(1H，m)，1.98-2.05(1H，m)，3.62(1H，t)，7.11(1H，s)，7.24(1H，d)，7.61(2H，d)，7.86(1H，d)，8.13(2H，d)，11.62(1H，s).
製備實施例83-(3-氨基-4-氯苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物8)的合成以與製備實施例1相同的方式處理1.0g(2.93mmol)3-苄氧羰基氨基-4-氯苯磺醯胺和1.18g(2.93mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到1.43g(產率78％)2-{[(3-苄氧羰基氨基-4-氯苯磺醯氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸苄基酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)5.19(2H，s)，5.36(2H，s)，7.21(1H，dd)，7.34-7.48(10H，m)，7.72-7.76(2H，m)，7.97(1H，d)，8.25(1H，d)，8.30(1H，d)，9.53(1H，s)，10.30(1H，s).
將1.38g(2.20mmol)該化合物溶於50ml THF中，然後加入200mg鈀-碳(10％)並將該混合物在氫氣流下攪拌2小時。將反應混合物濾過硅藻土以除去鈀-碳，然後真空濃縮濾液，得到羧酸。將如此獲得的產物懸浮於50ml THF中，然後在冰冷卻下加入356mg(2.20mmol)CDI並以與製備實施例1相同的方式處理該所得混合物，獲得560mg(2步產率66％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.00(2H，s)，7.12(1H，s)，7.26(2H，t)，7.48(1H，d)，7.66(1H，s)，7.86(1H，d)，11.76(1H，br).
製備實施例93-(4-氨基-3，5-二氯苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物9)的合成以與製備實施例1相同的方式處理1.06g(4.40mmol)4-氨基-3，5-二氯苯磺醯胺和1.34g(4.40mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到905mg(產率44％)2-{[(4-氨基-3，5-二氯苯磺醯氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸甲酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)3.87(3H，s)，6.59(2H，br)，7.22(1H，dd)，7.72(2H，s)，7.93(1H，d)，8.24(1H，d)，10.17(1H，s).
然後，以相同方式處理905mg(2.0mmol)所得磺醯脲產物，得到660mg(2步產率82％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.80(2H，s)，7.12(1H，s)，7.24(1H，d)，7.86(1H，d)，7.92(2H，s)，11.63(1H，br).
製備實施例103-(3-氨基-4-甲基苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物10)的合成以與製備實施例8相同的方式處理960mg(3.00mmol)3-苄氧羰基氨基-4-甲基苯磺醯胺和1.14g(3.00mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到1.14g(產率62％)2-{[(3-苄氧羰基氨基-4-甲基苯磺醯氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸苄基酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)2.30(3H，s)，5.17(2H，s)，5.36(2H，s)，7.20(1H，dd)，7.33-7.48(11H，m)，7.63(1H，d)，7.97(1H，d)，8.11(1H，s)，8.25(1H，s)，9.27(1H，s)，10.30(1H，s)，12.20(1H，br).然後，以相同方式處理1.14g(1.87mmol)所得磺醯脲產物，得到190mg(2步產率27％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)2.12(3H，s)，5.47(2H，s)，7.12(1H，s)，7.16-7.25(3H，m)，7.38(1H，s)，7.85(1H，d)，11.58(1H，s).
製備實施例113-[(3-羧甲基氨基苯基)磺醯基]-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物11)的合成以與製備實施例7相同的方式處理1.62g(5.65mmol)3-叔丁氧羰基甲氨基苯磺醯胺和1.73g(5.65mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到209mg(4步產率9％)標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.86(2H，s)，6.88(1H，s)，7.12(1H，s)，7.24(1H，d)，7.30-7.38(3H，m)，7.86(1H，d)，11.61(1H，br).
製備實施例123-(3-氨基苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物12)的合成以與製備實施例7相同的方式處理3.5g(12.9mmol)3-叔丁氧羰基氨基苯磺醯胺和3.9g(12.8mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到2.2g(4步產率49％)標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)5.72(2H，s)，6.87(1H，d)，7.12(1H，s)，7.23-7.27(2H，m)，7.33(1H，s)，7.86(1H，d)，11.61(1H，s).
製備實施例132-{3-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]苯氨基羰基}丙酸(化合物13)的合成將100mg(0.28mmol)化合物12溶於5ml THF中，加入100mg(1.0mmol)琥珀酸酐並將所得混合物加熱回流3小時。將反應溶液真空濃縮，如此獲得的粗產物用乙酸乙酯-乙醚結晶，得到120mg(產率96％)標題化合物。性質無色結晶，熔點187-188℃，PMR(δppm，DMSO-d6)2.54(2H，d)，2.59(2H，d)，7.12(1H，s)，7.24(1H，d)，7.59(1H，t)，7.80(1H，d)，7.86(1H，d)，7.96(1H，d)，8.41(1H，s)，10.40(1H，s)，11.63(1H，br)，12.10(1H，br).
製備實施例143-{3-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]苯基}丙烯酸(化合物14)的合成以與製備實施例7相同的方式處理1.54g(5.44mmol)3-(3-氨基磺醯基)苯基丙烯酸叔丁基酯和1.66g(5.44mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到2.18g(產率81％)2-({[3-(3-叔丁氧基-3-氧代-1-丙烯基)苯磺醯氨基]羰基}氨基)-4-氯苯甲酸甲酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)1.53(9H，s)，3.95(3H，s)，6.46(1H，d)，7.05(1H，d)，7.55(1H，m)，7.57(1H，d)，7.72(1H，m)，7.93(1H，m)，8.04(1H，m)，8.27(1H，s)，8.46(1H，d)，11.05(1H，br).
然後，以相同方式處理2.18g(4.4mmol)所得磺醯脲產物，得到698mg(3步產率37％)標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.65(1H，d)，7.12(1H，s)，7.25(1H，d)，7.69(1H，d)，7.72(1H，t)，7.87(1H，d)，8.12(2H，q)，8.37(1H，s)，11.64(1H，s).
製備實施例154-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]水楊酸(化合物15)的合成以與製備實施例7相同的方式處理1.0g(3.66mmol)4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺醯胺和1.12g(3.66mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到1.79g(產率100％)2-{[(4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺醯氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸甲酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)1.57(9H，s)，3.87(3H，s)，7.14(1H，d)，7.40-7.45(2H，m)，7.85(1H，d)，7.92(1H，d)，8.32(1H，d)，10.13(1H，s)，10.82(1H，s).
然後，以相同方式處理1.78g(3.66mmol)所得磺醯脲產物，得到370mg(3步產率25％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.13(1H，s)，7.26(1H，d)，7.69(1H，d)，7.87(1H，d)，8.01(1H，d)，11.67(1H，s).
製備實施例164-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]水楊酸一鈉鹽(化合物16)的合成將50mg(0.13mmol)化合物15懸浮於約1ml THF中，然後滴加126μl 1N氫氧化鈉水溶液。證實該溶液達到均勻後，加入30ml水並將該混合物凍幹，定量地得到52mg非晶形標題化合物。性質無色非晶形物，PMR(δppm，CD3OD)7.11(1H，s)，7.19(1H，d)，7.58(1H，d)，7.63(1H，s)，7.92(1H，d)，8.03(1H，d).
製備實施例174-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]鄰氨基苯甲酸(化合物17)的合成以與製備實施例8相同的方式處理2.84g(6.9mmol)3-苯氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺醯胺和2.67g(6.99mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到3.74g(產率77％)2-{[(3-苯氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺醯氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸苄基酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)1.54(9H，s)，5.19(2H，s)，5.34(2H，s)，7.05(1H，m)，7.34-7.58(10H，m)，7.60(1H，d)，7.90(1H，d)，7.98(1H，d)，8.50(1H，br)，8.62(1H，s)，10.00(1H，br)，10.41(1H，s).
然後，以相同方式處理3.74g(5.39mmol)所得磺醯脲，得到690mg(2步產率30％)的4-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]鄰氨基苯甲酸叔丁基酯，然後進行類似的脫丁基反應，得到503mg(產率84％)標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.14(1H，s)，7.18(1H，d)，7.25(1H，d)，7.59(1H，s)，7.87(1H，d)，7.89(1H，d)，11.62(1H，s).
製備實施例184-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]鄰氨基苯甲酸一鈉鹽(化合物18)的合成將50mg(0.13mmol)化合物17懸浮於約1ml THF中，然後滴加126μl 1N氫氧化鈉水溶液。證實該溶液達到均勻後，加入30ml水並將該混合物凍幹，定量地得到52mg非晶形標題化合物。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)7.11-7.22(3H，m)，7.37(1H，s)，7.83(1H，d)，7.91(1H，d).
製備實施例193-(4-羥基苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物19)的合成以與製備實施例5相同的方式處理1.50g(7.03mmol)4-烯丙氧基苯磺醯基異氰酸酯和1.2g(7.03mmol)4-氯鄰氨基苯甲酸，得到1.5g(53％)3-(4-烯丙氧基苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮。類似地處理500mg(1.27mmol)該產物，得到405mg(產率90％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.98(2H，d)，7.11(1H，s)，7.23(1H，d)，7.85(1H，d)，8.00(2H，d)，11.25(1H，br).
製備實施例204-[(2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]水楊酸(化合物20)的合成以與製備實施例17相同的方式處理618mg(2.26mmol)4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺醯胺和613mg(2.26mmol)2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸甲酯，得到792mg(產率78％)2-{[(4-叔丁氧羰基-3-羥基苯磺醯氨基)羰基]氨基}苯甲酸甲酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)1.60(9H，s)，3.97(3H，s)，7.09(1H，t)，7.49-7.52(2H，m)，7.65(1H，d)，7.90(1H，d)，8.01(1H，dd)，8.33(1H，d)，10.98(1H，s)，11.18(1H，s).
然後，以相同方式處理790mg(1.75mmol)所得磺醯脲產物，得到100mg(3步產率8％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.13(1H，d)，7.22(1H，t)，7.63-7.69(3H，m)，7.87(1H，d)，8.01(1H，d)，11.57(1H，s).
製備實施例215-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]水楊酸(化合物21)的合成以與製備實施例17相同的方式處理320mg(1.17mmol)3-叔丁氧羰基-4-羥基苯磺醯胺和447mg(1.17mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到611mg(產率93％)2-{[(3-叔丁氧羰基-4-羥基苯磺醯氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸甲酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)1.62(9H，s)，5.35(2H，s)，7.01-7.05(2H，m)，7.37-7.41(5H，m)，7.96(1H，d)，8.10(1H，dd)，8.46-8.48(2H，m)，10.99(1H，s)，11.66(1H，s).
然後，以相同方式處理611mg(1.09mmol)所得磺醯脲產物，得到114mg(3步產率33％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)， PMR(δppm，DMSO-d6)7.11(1H，s)，7.19(1H，d)，7.24(1H，d)，7.86(1H，d)，8.20(1H，d)，8.56(1H，s)，11.57(1H，s).
製備實施例223-(3-乙醯胺基-4-甲氧基苯磺醯基)-7-氯-2.4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物22)的合成以與製備實施例8相同的方式處理500mg(2.19mmol)3-乙醯氨基-4-甲氧基苯磺醯胺和836mg(2.19mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到812mg(產率70％)2-{[(3-乙醯氨基-4-甲氧基苯磺醯氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸苄基酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)2.12(3H，s)，3.93(3H，s)，5.36(2H，s)，7.20(1H，d)，7.24(1H，d)，7.36-7.48(5H，m)，7.69(1H，d)，7.96(1H，d)，8.24(1H，s)，8.67(1H，s)，9.39(1H，s)，10.25(1H，s)，12.11(1H，br).
然後，以相同方式處理611mg(1.09mmol)所得磺醯脲產物，得到250mg(2步產率39％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)2.12(3H，s)，3.95(3H，s)，7.12(1H，s)，7.23(1H，d)，7.30(1H，d)，7.85(1H，d)，7.89(1H，d)，8.80(1H，s)，9.42(1H，s)，11.59(1H，br).
製備實施例233-(3-氨基-4-甲氧基苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物23)的合成以與製備實施例17相同的方式處理400mg(1.40mmol)3-叔丁氧羰基氨基-4-甲氧基苯磺醯胺和533mg(1.40mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到86mg(4步產率16％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.81(3H，s)，7.26-7.37(5H，m)，7.77(1H，s)，7.90(1H，d)，7.94(1H，d)，11.73(1H，s).
製備實施例247-氯-3-(4-甲氧基-3-甲基磺醯氨基苯磺醯基)-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(化合物24)的合成以與製備實施例8相同的方式處理500mg(1.89mmol)4-甲氧基-3-甲磺醯氨基苯磺醯胺和722mg(1.89mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到888mg(產率83％)2-({[(4-甲氧基-3-甲磺醯氨基)苯磺醯氨基]羰基}氨基)-4-氯苯甲酸苄基酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)2.12(3H，s)，3.93(3H，s)，5.36(2H，s)，7.20(1H，d)，7.24(1H，d)，7.36-7.48(5H，m)，7.69(1H，d)，7.96(1H，d)，8.24(1H，s)，8.67(1H，s)，9.39(1H，s)，10.25(1H，s)，12.11(1H，br).
然後，以相同方式處理880mg(1.55mmol)所得磺醯脲產物，得到620mg(2步產率85％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)， PMR(δppm，DMSO-d6)3.04(3H，s)，3.94(3H，s)，7.11(1H，s)，7.23(1H，d)，7.34(1H，d)，7.86(1H，d)，7.99(1H，d)，8.10(1H，s).
製備實施例254-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]-1-羥基萘-2-甲酸(化合物25)的合成以與製備實施例17相同的方式處理323mg(1.00mmol)3-叔丁氧羰基-4-羥基-1-萘磺醯胺和381mg(1.00mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到447mg(產率73％)4-({[(2-苯氧羰基-5-氯苯氨基)羰基]氨基}磺醯基)-1-羥基-2-萘甲酸叔丁基酯。性質無色非晶形物， PMR(δppm，DMSO-d6)1.66(9H，s)，5.34(3H，s)，6.98(1H，d)，7.35-7.48(5H，m)，7.66(1H，m)，7.81(1H，m)，7.89(1H，d)，8.37(2H，m)，8.44(1H，s)，8.71(1H，d)，10.02(1H，br)，12.52(1H，br).
然後，以相同方式處理445mg(0.72mmol)所得磺醯脲產物，得到56mg(3步產率18％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.08(1H，s)，7.20(1H，d)，7.63(1H，t)，7.77(1H，t)，7.84(1H，d)，8.42(1H，d)，8.51(1H，d)，8.75(1H，s)，11.57(1H，s).
製備實施例265-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]鄰氨基苯甲酸(化合物26)的合成以與製備實施例17相同的方式處理834mg(2.05mmol)4-苯氧羰基氨基-3-叔丁氧羰基苯磺醯胺和783mg(2.05mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到1.18g(產率83％)2-{[(4-苄氧羰基-3-叔丁氧羰基苯磺醯氨基)羰基]氨基}-4-氯苯甲酸苄基酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)1.56(9H，s)，5.22(2H，s)，5.37(2H，s)，7.04(1H，dd)，7.33-7.42(10H，m)，7.97(1H，d)，8.14(1H，d)，8.45(1H，d)，8.60(1H，d)，8.65(1H，d)，11.01(1H，s)，11.11(1H，s).
然後，以相同方式處理1.17g(1.69mmol)所得磺醯脲產物，得到404mg(3步產率60％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.89(1H，d)，7.11(1H，s)，7.23(1H，d)，7.85(1H，d)，7.98(1H，d)，8.51(1H，s)，11.51(1H，s).
製備實施例274-[(7-甲氧基-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]鄰氨基苯甲酸(化合物27)的合成以與製備實施例17相同的方式處理500mg(1.23mmol)3-苄氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺醯胺和460mg(1.22mmol)4-甲氧基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到15mg(4步產率3.1％)標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)， PMR(δppm，DMSO-d6)3.82(3H，s)，6.58(1H，s)，6.80(1H，d)，7.16(1H，d)，7.56(1H，s)，7.80(1H，d)，7.90(1H，d)，11.49(1H，s).
製備實施例28(±)-7-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]-2-氧代-1H，3H-喹啉-3-甲酸(化合物28)的合成以與製備實施例17相同的方式處理400mg(1.23mmol)(±)-3-叔丁氧羰基-2-氧代-1H，3H-喹啉-7-磺醯胺和468mg(1.23mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到649mg(產率86％)8-({[(2-苄氧羰基-5-氯苯氨基)羰基]氨基}磺醯基)-2-氧代-1，2，3，4-四氫-3-喹啉甲酸叔丁基酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，CDCl3)1.32(9H，s)，3.18-3.30(2H，m)，3.54(1H，m)，5.35(2H，s)，6.85(1H，m)，7.00(1H，m)，7.35-7.39(5H，m)，7.87-7.96(3H，m)，8.47(1H，m)，8.78(1H，br)，10.92(1H，br).
然後，以相同方式處理640mg(1.04mmol)所得磺醯脲產物，得到258mg(3步產率55％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.23-3.31(2H，m)，3.59(1H，t)，7.07(1H，d)，7.12(1H，s)，7.25(1H，d)，7.86(1H，d)，7.96(1H，d)，7.98(1H，d)，10.84(1H，s)，11.60(1H，s).
製備實施例29(±)-6-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]-3-氧代-1，4-苯並噁嗪-2-甲酸(化合物29)的合成以與製備實施例17相同的方式處理300mg(0.91mmol)(±)-2-叔丁氧羰基-3-氧代-1，4-苯並噁嗪-6-磺醯胺和349mg(0.91mmol)4-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到417mg(產率74％)5-({[(2-苄氧羰基-5-氯苯氨基)羰基]氨基}磺醯基)-3-氧代-3，4-二氫-2H-1，4-苯並噁嗪-2-甲酸叔丁基酯。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)1.29(9H，s)，5.37(2H，s)，5.42(2H，s)，7.19-7.26(2H，m)，7.37-7.57(7H，m)，7.97(1H，d)，8.25(1H，d)，10.27(1H，s)，11.25(1H，s)，12.22(1H，br).
然後，以相同方式處理417mg(0.68mmol)所得磺醯脲產物，得到100mg(3步產率32％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)5.47(1H，s)，7.11(1H，s)，7.24(1H，d)，7.29(1H，d)，7.76(1H，s)，7.78(1H，d)，7.86(1H，d)，11.25(1H，s)，11.62(1H，s).
製備實施例304-[(7-羥基-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]鄰氨基苯甲酸(化合物30)的合成以與製備實施例17相同的方式處理620mg(1.53mmol)3-苄氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺醯胺和550mg(1.51mmol)4-羥基-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到25mg(4步產率4％)標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)6.48(1H，s)，6.61(1H，d)，7.14(1H，d)，7.51(1H，s)，7.70(1H，d)，7.90(1H，d)，10.80(1H，s)，11.39(1H，s).
製備實施例314-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]-2-N-丙醯基鄰氨基苯甲酸(化合物31)的合成將840mg(1.86mmol)化合物17溶於8ml 1，4-二噁烷中，加入240μl(2.79mmol)丙醯氯，然後將所得混合物在60℃下攪拌過夜。往該反應溶液中加入過量水並用乙酸乙酯萃取該混合物。將如此得到的有機層洗滌，乾燥並濃縮，得到粗產物4-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]-2-N-丙醯基鄰氨基苯甲酸叔丁基酯。將所得該粗產物在室溫下在3ml三氟乙酸中攪拌1小時，然後真空濃縮該反應溶液，得到粗產物。該產物經乙醚洗滌，得到400mg(2步產率48％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)1.10(3H，t)，2.45(2H，dd)，7.11(1H，s)，7.24(1H，d)，7.85(1H，d)，7.88(1H，d)，8.17(1H，d)，9.18(1H，s)，11.07(1H，s)，11.63(1H，s).
製備實施例324-[(6-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]鄰氨基苯甲酸(化合物32)的合成以與製備實施例17相同的方式處理300mg(0.74mmol)3-苄氧羰基氨基-4-叔丁氧羰基苯磺醯胺和310mg(0.81mmol)5-氯-2-N-苯氧羰基鄰氨基苯甲酸苄基酯，得到75mg(4步產率26％)標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)7.13-7.20(2H，m)，7.56(1H，s)，7.72(1H，d)，7.82(1H，s)，7.90(1H，d)，11.68(1H，s).
製備實施例334-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]-2-N-甲磺醯基鄰氨基苯甲酸(化合物33)的合成以與製備實施例3相同的方式處理200mg(0.44mmol)化合物17，得到81mg 4-[(7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮-3-基)磺醯基]-2-N-甲磺醯基鄰氨基苯甲酸叔丁基酯。對該產物進行相同的脫丁基反應，得到53mg(2步產率25％)的標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)，PMR(δppm，DMSO-d6)3.24(3H，s)，7.11(1H，s)，7.25(1H，d)，7.85-7.91(2H，m)，8.23(1H，d)，8.39(1H，s)，11.05(1H，br)，11.70(1H，s).
製備實施例343-(3-氨基苯磺醯基)-7-氯-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮甲磺酸鹽(化合物34)的合成將2.15g(6.10mmol)化合物12溶於65ml THF中並滴加0.4ml甲磺酸。往該溶液中，加入200ml乙醚並將過濾所得沉澱，得到2.59g(產率95％)的標題化合物。性質無色非晶形物，PMR(δppm，DMSO-d6)2.35(3H，s)，6.98(1H，d)，7.12(1H，m)，7.25(1H，m)，7.34(2H，s)，7.43(1H，m)，7.86(1H，s)，11.64(1H，s).
製備實施例357-氯-3-[4-(吡唑-3-基)苯磺醯基]-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮鹽酸鹽(化合物35)的合成按照合成方法(B)，將5.65g(25.34mmol)4-(吡唑-3-基)苯磺醯胺溶於60ml THF中，然後滴加7.8ml(52.16mmol)DBU。該反應溶液在室溫攪拌10分鐘後，加入8.5g(27.86mmol)4-氯-2-苯氧羰基-氨基苯甲酸甲酯並在室溫攪拌3小時。然後，往該反應溶液中再加入400mg(0.131mmol)4-氯-2-苯氧羰基氨基苯甲酸甲酯，之後再在室溫下攪拌2小時。將過量的檸檬酸水溶液加到該反應溶液中後，用乙酸乙酯萃取。有機層用水和飽和鹽水洗滌，然後經無水硫酸鈉乾燥並濃縮。將甲醇加到濃縮過的殘餘物中，攪拌該混合物，過濾所得的結晶，得到10.49g粗產物。
將所得10.49g粗產物懸浮於45ml甲醇中，然後加入90ml 1N氫氧化鈉水溶液。該反應溶液在60℃攪拌40分鐘後，過濾除去沉澱。將濾液真空濃縮並蒸除甲醇，然後將所得水性混合物用乙酸乙酯洗滌。用鹽酸使水層呈酸性，產生結晶沉澱。過濾得到結晶。濾液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和鹽水洗滌後，乾燥並經無水硫酸鈉濃縮。將濃縮殘餘物和上面過濾得到的結晶合併後，用THF-乙酸乙酯-己烷重結晶，得到7.70g(72％)N-[4-(吡唑-3-基)苯磺醯基]-N』-(2-羧基-5-氯苯基)脲(性質無色結晶，熔點129-132℃，PMR(δppm，DMSO-d6)6.81(1H，d)，7.02(1H，dd)，7.78(1H，s)，7.89-7.92(3H，m)，7.96(2H，d)，8.24(1H，s)，10.57(1H，br).
3.0g(7.14mmol)上面得到的脲衍生物溶於60ml THF中。然後在冰冷下加入1.2g(7.40mmol)CDI並將所得反應物攪拌2小時。該反應溶液用乙酸乙酯稀釋後，順序用檸檬酸水溶液、飽和鹽水、0.5M碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌。有機層經無水硫酸鈉乾燥後，濃縮得到粗產物。該粗產物用乙酸乙酯重結晶，得到1.93g(產率67％)7-氯-3-[4-(吡唑-3-基)苯磺醯基]-2，4(1H，3H)-喹唑啉二酮(性質無色結晶，熔點124-126℃(分解))，PMR(δppm，CDCl3-CD3OD)6.73(1H，s)，7.09(1H，s)，7.16(2H，d)，7.48(1H，s)，7.66(1H，s)，7.9-8.1(3H，m)，8.32(2H，d).
將545mg(1.35mmol)上面得到的喹唑啉衍生物溶於35ml THF中，然後滴加0.4ml 4M鹽酸的1，4-二噁烷溶液。將20ml乙醚加到該溶液中，然後過濾得到的沉澱結晶，得到572mg(產率96％)標題化合物。性質無色結晶，熔點＞200℃(分解)， PMR(δppm，DMSO-d6)6.91(1H，d)，7.15(1H，d)，7.24(1H，dd)，7.84(1H，d)，7.86(1H，d)，8.01(2H，d)，8.17(2H，d)，11.7(1H，s).
實施例1胃促胰酶抑制活性的測定按照Urata等的方法(J.Biol.Chem.，1990，265，22348)純化人心臟胃促胰酶。以下列方式測定本發明喹唑啉衍生物對胃促胰酶的抑制活性。即，將純化的酶溶液用0.01M Tris-鹽酸緩衝液(pH＝7.5)、1M氯化鈉和0.01％Triton X-100稀釋到適宜濃度得到酶溶液。將10mMSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA(Peptide Institute)的二甲亞碸(下文稱DMSO)溶液用0.01M Tris-鹽酸緩衝液(pH＝7.5)、1M氯化鈉和0.01％Triton X-100稀釋20倍，得到底物溶液。
將溫熱到30℃的75μl酶溶液與5μl試驗樣品的DMSO溶液混合。該混合物在30℃預先保溫10分鐘。然後，將溫熱到30℃的20μl底物溶液與該試驗樣品-酶混合物混合併於30℃保溫。10分鐘後，加入50μl30％的乙酸以使酶反應停止。用螢光光度計定量測定產生的AMC的量。同時，用5μl DMSO代替試驗樣品溶液並進行相同的反應，作為空白試驗。胃促胰酶抑制活性以抑制率，即基於空白試驗值的50％抑制濃度(IC50)表示。
本發明的喹唑啉衍生物在100μM濃度下均強烈地抑制人胃促胰酶。代表性化合物的IC50示於表I。
表1

實施例2蛔蟲屬誘發的小鼠雙相皮炎模型中皮膚反應的時間過程按照先前描述的方法(Folia Pharmacol.Jap.112，221，1998)誘發蛔蟲屬引發的雙相皮炎。即，經腹膜內注射0.5ml蛔蟲 提取物(800μg/ml，Cosmo BIo Co.，Ltd.)和明礬的鹽水懸浮液(16mg/ml在鹽水中懸浮液)的1∶1混合物敏化8周齡BALB/c小鼠(日本Charles River)。敏化兩周後，向小鼠右耳皮內注射10ml蛔蟲提取物(1mg/ml)。在蛔蟲提取物注射之前(n＝3)和注射之後1小時(n＝4)、2小時(n＝4)、4小時(n＝4)、6小時(n＝4)、16小時(n＝4)和24小時(n＝4)，通過稱重用衝床(直徑6mm，Fukui Kiko Shokai)製備的耳部活檢組織評價在耳部誘發的水腫。以同一隻小鼠右耳與左耳間的耳部活檢組織的重量差表示水腫(mg)。
通過向以相同抗原致敏的小鼠的耳部皮內施以蛔蟲提取物引發雙相皮炎(附圖1)。1小時後，第一反應達到頂峰，16小時後，第二反應達到頂峰。
實施例3胃促胰酶抑制劑在蛔蟲屬誘發的小鼠雙相皮炎模型中作用按照實施例2描述的方法誘發皮炎，並以實施例2的相同方式測定耳部水腫，在對耳部皮內施用蛔蟲提取物後1小時(n＝6)和16小時(n＝8)，觀察試驗物質對皮炎的作用。使用化合物34作為胃促胰酶抑制劑。使用diphenhydrazine(抗組胺藥，Sigma)和潑尼松龍(甾類，Nakarai TescCo.)作為對照藥物。將研究的各種藥物懸浮於含0.5％羥丙基纖維素的鹽水中，在皮內施用蛔蟲提取物後60分鐘時經腹膜內施用。用以蛔蟲提取物致敏的並經皮內注射鹽水挑戰的小鼠作為對照(n＝3)。
結果腹膜內施用胃促胰酶抑制劑(化合物34)的結果是，蛔蟲提取物誘發1小時後的反應(早期反應)和16小時後的反應(晚期反應)均以劑量方式被抑制。在50mg/kg劑量下觀察到統計學顯著性差異(附圖2A)。50mg/kg下的早期反應抑制率為約41％，晚期反應抑制率為約45％(p都小於0.01，Dunnett檢驗)。對特應性皮炎有效的潑尼松龍，在30mg/kg劑量下對早期反應基本無效，但強烈抑制晚期反應(抑制率67％)(附圖2B)。另一方面，diphenhydrazine明顯抑制早期反應(抑制率79％)，但對晚期反應基本上沒有作用(附圖2C)。
胃促胰酶抑制劑對表現出雙相皮膚反應的變應性皮炎模型表現出抑制作用的事實表明，胃促胰酶與變應性雙相皮炎有關，因此胃促胰酶抑制劑可用於此類皮炎。特別是，胃促胰酶抑制劑同甾類一樣，明顯抑制晚期反應，而抗組胺藥和抗變應性藥物對晚期反應基本沒有作用的發現表明胃促胰酶抑制劑可用於特應性皮炎。在下面的實施例4-6中，為進一步證實胃促胰酶在雙相皮膚反應中的重要性，分析對小鼠耳部接種人胃促胰酶誘發的皮膚病症。
實施例4單次施用人胃促胰酶誘發皮炎的能力在該實施例中施用重組人胃促胰酶。按照生產絲氨酸蛋白酶的已知方法(Biochem.Biophys.Acta 1350，11，1997)，通過表達和純化獲得重組的人胃促胰酶。即，首先，通過PCR方法擴增編碼成熟人胃促胰酶(J.Biol.Chem.266，17173，1991)的cDNA(79-756)。將PCR產物與人胰蛋白酶II的信號序列和包括腸激酶裂解位點的區域(23個胺基酸)一起克隆到pDE載體中。將構建的人胃促胰酶表達制粒轉染到CHOdhfr細胞中，並通過已知方法(Arch.Biochem.BIophys.307，133，1993)選擇轉染過的細胞。用HiTrap Heparin柱(Amersham Pharmacia Biotech)濃縮所得細胞的培養上清液中的分泌的人胃促胰酶和胰蛋白酶的融合蛋白，然後用腸激酶(Invitrogen)裂解，產生人的成熟胃促胰酶。用肝素5PW柱(Tosoh Corp.)純化人的成熟胃促胰酶。在SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析中，純化的胃促胰酶顯示33-36kDa的譜帶。另外，在0.1MTris/HCl緩衝液(pH8.0)中，用1mM Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA(PeplideInstitute)作為底物並測定游離MCA的螢光強度來測定胃促胰酶的活性。結果證實純化的胃促胰酶確實具有酶活性。
然後，為研究胃促胰酶對皮炎的作用，將20μl上述重組人胃促胰酶(下文稱人胃促胰酶)(0.1mg/ml)皮內施用於BALB/c小鼠(日本Charles River)的耳部，並採用實施例2中描述的方法測定耳部的水腫反應的時間過程(n＝3-4)。此外，類似地皮內施用組胺(肥大細胞的炎性介質)並將該反應過程與施用人胃促胰酶的情況進行比較。組胺(Sigma-Aldrich)以溶於鹽水的形式(0.25mg/ml)進行注射。
如附圖3A所示，通過對小鼠耳部施用人胃促胰酶(2.0μg/耳)，誘發類似於實施例2中的變應性皮膚反應的雙相水腫反應。即，在施用人胃促胰酶後立即誘發第一皮膚反應，該反應在30分鐘-1小時時達到頂峰。再者，第二皮膚反應在6小時後達到頂峰並持續至少24小時。另一方面，甚至在接種組胺時也誘發立即的水腫反應，但與接種胃促胰酶的情況相反，該反應在接種後20小時時完全消失(附圖3B)。對胃促胰酶誘發皮炎的劑量-依賴性分析揭示了早期反應(1小時後)是劑量依賴性的，在實驗中使用2.0μg/耳的量觀察到最大反應(附圖4A)。另一方面，在第二反應(16小時後)，在0.5μg/耳和1.0μg/耳劑量下的具有大約相同的反應水平，以與第一反應相同的方式，在2.0μg/耳劑量下可獲得最大反應(附圖4B)如上顯示，對小鼠皮內施用人胃促胰酶誘發了皮炎，其時間過程類似於抗原誘發的雙相皮炎(一種急性皮炎模型)的時間過程，表明胃促胰酶與雙相皮炎有關。
實施例5胃促胰酶活性與單次施用胃促胰酶誘發的皮炎的關係為研究胃促胰酶的酶活性是否與所示由人胃促胰酶誘發的皮炎有關，觀察熱處理過的胃促胰酶誘發皮炎的能力。通過將0.1mg/ml人胃促胰酶溶液在50℃保溫2小時，然後在100℃煮沸5分鐘，使人胃促胰酶失活。按照實施例4中描述的方法，對耳部施用失活的人胃促胰酶(2.0μg/耳)，施用後1小時評價皮炎。
熱處理人胃促胰酶的結果是由人胃促胰酶誘發的水腫反應完全消失(與未處理的胃促胰酶施用組相比的p＜0.01，學生t檢驗，N＝4)(附圖5)。結果顯示胃促胰酶活性為誘發皮炎所必要。
實施例6單次施用胃促胰酶誘發的皮炎的組織學分析為進一步研究胃促胰酶與雙相皮炎的關係，對胃促胰酶誘發的皮炎的進行病理組織學分析，並與將其實施例2中所示雙相皮炎進行比較。按照實施例2和實施例4描述的方法(人胃促胰酶的劑量為2.0μg/耳)誘發這些類型的皮炎。在兩種模型施用後1小時和24小時時，按照常規方法，在福馬林中固定鼠耳並製備石蠟切片。將切片用蘇木精和曙紅染色，然後在顯微鏡下觀察並照相。另外，用正常BALB/c小鼠的耳部切片作為陰性對照。
與正常小鼠的耳部切片相比，在胃促胰酶性皮炎引發後1小時的切片(附圖6D)中，觀察到明顯的增厚(附圖6A)；但在白細胞浸潤上，觀察到兩組沒有明顯區別。但是，如附圖6E所示，在胃促胰酶注射後24小時的切片中觀察到了白細胞的明顯浸潤。胃促胰酶性皮炎顯示的組織學類型類似於蛔蟲誘發的雙相皮炎模型(附圖6B和6C)。即，1小時時的組織顯著增厚，但僅在24後才觀察到細胞浸潤。總之，即使在病理組織分析方面，胃促胰酶誘發的皮炎也與抗原誘發的雙相皮炎類似。
在下列實施例7和實施例8中，為研究胃促胰酶在雙相皮炎中的作用，分析胃促胰酶誘發皮炎的機理。
實施例7人胃促胰酶誘發缺乏肥大細胞的小鼠皮炎的能力因為據報導，胃促胰酶誘發大鼠腹膜肥大細胞脫粒(J.Immunol.136，3812，1986)，故認為胃促胰酶可能是通過肥大細胞釋放炎性介質而誘發皮炎的。由此，隨之用肥大細胞缺乏的小鼠研究了肥大細胞與胃促胰酶誘發皮炎的關係(Blood 52，447-425，1978)。從日本SLC獲得肥大細胞缺乏的(WBB6F1-W/Wv)小鼠和它們的對照小鼠(WBB6F1-+/+)。採用實施例4中描述的方法，通過皮內施用人胃促胰酶(2.0μg/耳)誘發胃促胰酶性皮炎並在1小時和16小時後評價水腫反應。
如附圖7A和7B所示，在1小時(附圖7A)和16小時(附圖7B)後，即使在肥大細胞缺乏的(WBB6F1-W/Wv)小鼠中也觀察到了與對照小鼠(Wbb6F1-+/+)程度類似的皮膚反應。該結果表明，無論是否存在肥大細胞，胃促胰酶都誘發雙相皮膚反應。
實施例8人胃促胰酶促進多形核白細胞遷移的能力實施例6顯示，在人胃促胰酶誘發的皮炎的晚期反應中觀察到明顯的白細胞浸潤。為研究胃促胰酶誘發白細胞浸潤的機理，體外觀察人胃促胰酶對多形核白細胞(PMN)遷移的作用。如下分離PMN向取自正常健康者的肝素化全血中加入1/5體積的6％葡聚糖溶液，並使其在37℃下放置1小時，然後在Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia Biotech)中使上清液分層並離心。再按照教科書的方法(BiopharmacologyExperiment Lectures 12，315，Hirokawa Shoten)，用48孔趨化性小室(Neuroprobe Co.)測定PMN的遷移。即，在小室的下部孔中放入含人胃促胰酶(200-800nM)或fMLP(N-甲醯-L-甲硫氨醯-L-亮氨醯-L-苯丙氨酸，Sigma-Aldrich Co.)(10mM)的培養基。通過聚碳酸酯纖維(5μm孔徑)(Neuroprobe Co.)隔離上部孔和下部孔，將PMN(1×106/ml)加到上部孔中並在37℃培養1小時，然後固定濾膜，染色並在顯微鏡(400X)下計數膜中的細胞數(Seibutsu Yakkagaku Jikken Koza(Biopharmacology Experiment Lectures)12，315)。用hemacolor溶液(Merck)進行細胞染色。在該試驗中，當研究胃促胰酶抑制劑的作用時，將胃促胰酶抑制劑(化合物18或化合物34)溶於二甲亞碸並在臨加入人胃促胰酶之前將其加到小室的下部孔中。調整化合物的濃度以使二甲亞碸的終濃度為1％。
由附圖8A，觀察到人胃促胰酶以濃度依賴方式促進人PMN的遷移(在≥400nM時具有統計學顯著意義，p＜0.05，Dunett’s檢驗)。200-400nM濃度的人胃促胰酶表現出與10nM fMLP相同的促進遷移活性的事實，推斷其活性約為fMLP的1/30。人胃促胰酶促進人PMN遷移的作用被人胃促胰酶抑制劑(化合物18和化合物34)顯著抑制(附圖8B)。這些結果表明胃促胰酶直接作用於多形核白細胞，促進它們的遷移，並顯示胃促胰酶的酶活性與該作用有關。
總而言之，因為當對小鼠耳部皮內注射時，在抗原刺激下，由肥大細胞釋放的胃促胰酶誘發雙相皮膚反應(實施例4-6)，因此，十分清楚，胃促胰酶在表現出雙相反應的皮膚反應中起著重要作用。實施例7和8的數據提示人們，胃促胰酶與雙相皮膚反應有關的機制。此外，還顯示胃促胰酶抑制劑抑制由蛔蟲誘發的皮炎(一種雙相皮膚反應)(實施例2和實施例3)。
其次，以重複應用半抗原的誘發性小鼠皮炎模型作為與抗原重複接觸誘發性皮炎模型進行分析並顯示胃促胰酶抑制劑在該模型中的作用。
實施例9通過重複應用半抗原誘發的小鼠皮炎模型中耳部厚度增加的時間過程按照已知方法(J.Pharmacol.Exp.Ther.283，321，1997)，用二硝基氟代苯(DNFB)作為半抗原誘發皮炎。即，對8周齡雌性C3H/HeN小鼠(Nippon Clare)(n＝7)的右耳塗以0.15％ DNFB溶於丙酮/橄欖油(3∶1)中的溶液(25μl)，每七天塗抹6次。在每次應用半抗原時，在臨應用前以及應用後1、6、24和48小時後立即用測微計(DigimaticIndicator，Mitsutoyo Co.)測定耳部厚度，以得出與第一次應用半抗原之前的耳部厚度相比的增加量。另外，類似地，用不含DNFB的丙酮/橄欖油溶液(3∶1)處理的組作為對照組。再者，在一個與上面試驗分離的試驗中，在臨應用第三次半抗原之前立即切割下耳朵，按照已知方法測定皮膚的胃促胰酶樣活性(n＝3)，並將其與用不含DNFB丙酮/橄欖油溶液(3∶1)處理過的小鼠(n＝3)的活性進行比較。
應用DNFB誘發暫時性皮膚反應。該暫時性皮膚反應隨每次應用逐漸增大(附圖9)。重複應用DNFB，除對DNFB的反應增強外，應用前(基值)的耳部厚度也逐漸增加。例如，與第一次應用前的耳部相比，在開始應用後第五周時，臨應用前的耳部厚度增加了約240μm(附圖9)。在僅用不含DNFB的溶劑處理的對照組中，在任何時間點測定的耳部厚度幾乎都沒有增加。第三次臨應用前的耳部的胃促胰酶活性明顯高於僅用不含DNFB的溶劑處理的對照組(p＜0.05，學生t檢驗)(附圖10)。總之，表明對小鼠耳部重複應用半抗原DNFB除增強胃促胰酶活性和引發明顯的暫時性反應外，還誘發持久的耳部增厚。
實施例10胃促胰酶抑制劑在重複應用半抗原誘發的小鼠皮炎模型中的作用按照實施例9中描述的方法，通過誘發皮炎研究試驗物質對皮炎的作用(n＝7)並以相同於實施例9的方式測定耳部厚度。使用三種胃促胰酶抑制劑(化合物18、化合物34和化合物35)作為試驗物質，同時使用甾類潑尼松龍(Nakarai Tesc Inc.)作為對照。另外，以相同於實施例3的方式，將試驗物質懸浮於含0.5％羥丙基纖維素的鹽水(HPC/鹽水)中並以每天10mg/kg或50mg/kg的劑量經腹膜內給予，每周連續給予五天直至試驗結束；在臨開始應用半抗原前進行第一次給藥。另外，用類似地以DNFB處理的和用HPC/鹽水代替試驗物質的組作為對照組。
潑尼松龍以劑量-依賴方式抑制該模型的皮炎(附圖11A)。另一方面，胃促胰酶抑制劑也顯著抑制應用半抗原誘發的暫時性皮膚反應，尤其是在第四周(在開始應用半抗原後3周)後(附圖11B-D)。例如，在第四至第六周(在開始應用半抗原3周，和其後)中，在半抗原應用後1、6、24和48小時，50mg/ml的化合物35顯著抑制耳部增厚(p＜0.05，Dunett’s檢驗)。在第五周後的應用後1-48小時(開始應用半抗原後四周，和其後)，50mg/ml的化合物34也顯著抑制皮膚反應；並且甚至10mg/kg量的化合物34在第五周後的1、24和48小時(第五次應用半抗原後)以及第六周後的1小時(第六次應用半抗原後)也表現出明顯抑制作用。另外，50mg/kg的化合物18明顯抑制第四周和第五周應用後1-24小時(第四周應用和第五周應用半抗原後)以及第六周1-48小時(第六次應用半抗原後)的反應，並且甚至10mg/kg的化合物34在第六周(第六次應用半抗原後)應用後1-48小時也表現出明顯作用。
這些結果顯示胃促胰酶抑制劑抑制重複應用半抗原誘發的小鼠皮炎模型的水腫。
實施例11在重複應用半抗原誘發的小鼠皮炎模型中胃促胰酶抑制劑對皮膚中嗜酸性粒細胞增多的作用研究胃促胰酶對實施例10試驗中的皮膚的嗜酸性粒細胞浸潤的影響。即，在第六次應用半抗原後48小時，按常規方法用福馬林固定小鼠的耳部並製備石蠟切片。用已知特異性染色嗜酸性粒細胞的(CurrentProtocol in Immunology，Wiley Interscience)堅牢綠(Fluka)染色切片。即，將除去石蠟的切片用100％甲醇固定1分鐘，然後用溶於70％乙醇的0.2％牢固綠染色30分鐘。在顯微鏡(X400)下，隨機選擇10個視野並用目測網格計數每個視面的細胞數量以測量嗜酸性粒細胞。用化合物18和化合物34作為胃促胰酶抑制劑並通過實施例10描述的方法施用。另外，以用不含DNFB的丙酮/橄欖油(3∶1)處理的組為非誘發性對照組，以用DNFB處理的並且施以HPC/鹽水代替試驗物質的組為施用胃促胰酶抑制劑組的對照組。
如附圖12所示，重複應用半抗原導致嗜酸性粒細胞數量顯著增加(約是對照組的22倍，p＜0.01，學生t檢驗)。施用胃促胰酶抑制劑(化合物18)的結果是以劑量依賴性方式明顯抑制嗜酸性粒細胞的增多。即，在10 mg/kg和50 mg/kg下的抑制率分別為37.1％和60.5％。對於化合物34，認為沒有統計學顯著性差異，也顯示了依賴於劑量的抑制趨勢。這些結果表明胃促胰酶抑制劑抑制重複應用半抗原誘發的小鼠皮炎模型中皮膚的嗜酸性粒細胞的增多。
實施例12在重複應用半抗原誘發的小鼠皮炎模型中胃促胰酶抑制劑對皮膚中肥大細胞數量增加的作用研究胃促胰酶抑制劑對實施例10的試驗中皮膚肥大細胞增多的影響。以與實施例11相同的方式，在第六次應用半抗原後48小時，按常規方法用福馬林固定小鼠耳部並製備石蠟切片。通過甲苯胺藍方法對肥大細胞切片染色，然後在顯微鏡(X400)下，對每個切片的10個視野計數肥大細胞的數量。按照Kitagaki等的方法(J.Invest.Dermatol.105，749，1995)，測定皮膚中肥大細胞的密度。用化合物18和化合物34作為胃促胰酶抑制劑。按照實施例10描述的方法施用。另外，以用不含DNFB的丙酮/橄欖油(3∶1)處理的組為非誘發性對照組，以用DNFB處理的並且施以HPC/鹽水代替試驗物質的組為施用胃促胰酶抑制劑組的對照組。
如附圖13所示，應用半抗原顯著增高皮膚中肥大細胞的密度(約是非誘發組的2.5倍)，但施用胃促胰酶抑制劑(化合物18和化合物34)的結果是，肥大細胞密度的增高被所有劑量的兩種化合物顯著抑制。化合物18在10mg/kg時的抑制率為約57％，在50mg/kg時的抑制率為約64％，化合物34在10mg/kg時的抑制率為約37％，在50mg/kg時的抑制率為約51％。附圖14顯示了代表性顯微圖。附圖14A顯示了非誘發性小鼠的耳部，附圖14B顯示了用DNFB處理的並施以HPC/鹽水(在第六次應用DNFB後48小時)小鼠的耳部，附圖14C顯示了用DNFB處理的並且施以化合物34(在第六次應用DNFB後48小時)的小鼠的耳部。這些結果表明在重複應用半抗原誘發的小鼠皮炎模型中，胃促胰酶抑制劑抑制皮膚中肥大細胞數量的增加。
實施例13重複施用人胃促胰酶誘發皮炎的能力通過對小鼠耳部重複皮內施用人胃促胰酶研究胃促胰酶在與抗原重複接觸誘發的皮炎中的作用。按照實施例4中描述的方法，每周施用一次人胃促胰酶(2.0μg/耳/每次注射)。在每次臨施用胃促胰酶之前和施用後1、6、24和48小時用測微計(Digimatic Indicator，Mitsutoyo Co.)測量耳部厚度，以得出與第一次施用胃促胰酶之前相比耳部厚度的增加。另外，採用實施例5中描述的方法製備熱處理過的胃促胰酶，並研究其作用。
對小鼠耳部皮內施用人胃促胰酶誘發暫時性皮膚反應。在第一次到第三次施用胃促胰酶期間，對胃促胰酶的反應性大致相同，但在第四次至第五次施用期間產生了放大反應(附圖15)。當重複施用失活的胃促胰酶時，沒有觀察到暫時性反應。另外，當重複施用該失活的胃促胰酶時，竟然沒有觀察到任何皮膚反應(附圖15)。這顯示了觀察到的皮膚反應是由於胃促胰酶的酶活性，當施用四-五次胃促胰酶時觀察到的放大皮膚反應並不是因為對小鼠施用了外源性蛋白。
實施例14重複施用人胃促胰酶對皮膚中嗜酸性粒細胞數量的影響對小鼠耳部重複施用人胃促胰酶以觀察皮膚中嗜酸性粒細胞數量的變化。按照實施例13中描述的方法，對小鼠耳部重複施用人胃促胰酶。採用實施例11中描述的方法測定皮膚中嗜酸性粒細胞的數量。另外，以重複施用鹽水的耳部組織作為對照。
如附圖16所示，與施用鹽水的耳部相比，在單次施用2.0μg人胃促胰酶後24小時時，耳中嗜酸性粒細胞的數量增加了約7.6倍(p＜0.01，學生t檢驗)。當以1周間隔施用人胃促胰酶，總共施用四次時，在每次施用後一周時測定嗜酸性粒細胞的數量，嗜酸性粒細胞的數量也增加到鹽水施用組的約21倍(p＜0.01，學生t檢驗)。這些結果表明了胃促胰酶提高嗜酸性粒細胞數量以及該增多率取決於與胃促胰酶接觸的頻率的可能性。
實施例15重複施用人胃促胰酶對皮膚中肥大細胞數量的影響對小鼠耳部重皮內施用人胃促胰酶以觀察皮膚中肥大細胞數量的變化。按照實施例13描述的方法重複施用人胃促胰酶，採用實施例12描述的方法或者測定皮膚中組胺含量的方法，研究施用胃促胰酶後1周的皮膚中肥大細胞的變化。如下測定皮膚組胺含量割下耳部，在20mMTris-HCl緩衝液(pH7.5)中勻化，離心提取物(10,000rpm，10分鐘)，然後用ELISA檢測盒(Medical Biological Laboratories)分析上清液中的組胺量。另外，用重複施用鹽水的耳部組織作為對照。
按照實施例12中描述的方法觀察皮膚中肥大細胞數量的變化，看到了施用人胃促胰酶導致肥大細胞數量增加的趨勢。但是，該細胞數量的增加不顯著。為更客觀或者定量地評價皮膚肥大細胞數量的增加，測定皮膚中作為組織中肥大細胞數量的指示劑的組胺含量。結果，如附圖17所示，在第四次施用人胃促胰酶後一周時，皮膚的組胺含量明顯高於施用鹽水的組。由這些結果，提示存在這樣一種機制由肥大細胞產生的胃促胰酶以正反饋方式作用於肥大細胞。
實施例16人胃促胰酶的施用對幹細胞因子(SCF)的影響為搞清施用人胃促胰酶時肥大細胞數量增加的作用機制，採用免疫組織化學方法分析表達的幹細胞因子(SCF)，該因子已知是一種負責肥大細胞分化和增殖的因子(Blood 90，1345，1997)。採用實施例4的方法對小鼠耳部施用人胃促胰酶(2.0μg/耳)。在1、6和24小時後，收穫耳組織並採用常規方法製備5μm的冷凍組織切片。用正常小鼠的耳部作為對照。在免疫組織化學分析中，用抗小鼠SCF山羊IgG(由RD Systems製備)作為用於PAP試劑盒(DAKO Co.)測定的初級抗體。需要說明的是，用正常山羊IgG(Vector Laboratories Co.)代替SCF抗體作為陰性對照。另外，在免疫染色後，按照常規方法(Sensyokuho no Subete(Everything About Dyeing)，Ishiyaku Shuppan)用甲基綠(Wako PureChemicals)染色細胞核。
在正常小鼠耳部，在表皮的角質層(corneal layer)周圍觀察到強烈的免疫染色(附圖18A)。另一方面，當使用正常山羊IgG代替抗SCF抗體作為初級抗體時，沒有觀察到絲毫的免疫染色。這表明角質層的免疫染色是特異性的。另一方面，在使用胃促胰酶的小鼠耳部，角質層周圍的染色以時間依賴方式變弱。24小時後，耳部幾乎觀察不到形成的顏色(附圖18B)。
實施例17人胃促胰酶對人角質細胞中SCF表達的影響研究人胃促胰酶在體外對人正常角質細胞中SCF的表達的影響。從Cell Applications Co.獲得人的正常角質細胞。用不含酶的細胞分離緩衝液(GIBCO BRL Co.)收穫培養的角質細胞，用PBS洗滌三次，然後將細胞濃度調整到106/50μl，加入人胃促胰酶並使其在37℃反應10分鐘。加入終濃度為10％的胎牛血清(FCS)使胃促胰酶反應停止，然後離心除去細胞。用ELISA試劑盒(PeproTech Co.)分析上清液中的SCF。用細胞毒性測定試劑盒(Roche Molecular Biochemicals Co.製備)作為乳酸脫氫酶(LDH)的指示劑，研究胃促胰酶對角質細胞的細胞毒性。
如附圖19所示，在人胃促胰酶的存在下將角質細胞保溫10分鐘，SCF的釋放以劑量依賴方式得到促進。當在沒有人胃促胰酶的存在下，將其培養10分鐘時，SCF的釋放量與不進行培養時的釋放量大致相同。另一方面，在各種情況下，上清液中釋放的LDH沒有變化。這證實了因為人胃促胰酶的SCF的釋放不是因為細胞的損害。綜上所述，體外表明人胃促胰酶作用於人角質細胞的膜結合的SCF並引起游離SCF的釋放。
SCF由因不同結合產生的兩類分子SCF248和SCF220組成(Blood 90，1345，1997)。SCF248首先以細胞膜蛋白形式被合成，然後在數種蛋白酶的作用下成為游離的SCF，而後該SCF由細胞釋放。另一方面，SCF220不具有任何被酶消化的位點，因此僅具有膜蛋白功能(Blood 90，1345，1997)。Longley等提供的數據表明，健康者皮膚SCF主要在表皮角質細胞的細胞膜上表達，但是在伴隨皮膚肥大細胞增多的皮炎情況下，不再能觀察到細胞上SCF的表達，在真皮和角質細胞的細胞間檢測到了SCF(N.Engl.J.Med.328，1302，1993)。再者，在用於過度表達220SCF和248SCF的轉基因小鼠中，觀察到皮膚肥大細胞數量的增加，但在僅過度表達SCF220中的轉基因小鼠中並未觀察到該現象(J.Exp.Med.187，1565，1998)。這些發現提示我們，膜結合型和游離型SCF的病生理作用不同，特別是游離SCF與皮膚肥大細胞數量的增加密切相關。事實上，人們已經已知向人皮膚施用游離SCF導致皮膚中肥大細胞數量的增加(J.Exp.Med.183，2681，1996)。
Longley等還報導，人胃促胰酶裂解膜結合的SCF並將其轉化為游離SCF(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，9017，1997)。實施例16的體內發現完全是一種新發現，它證實了Longley等的報導。實施例17的發現顯示了使用人細胞的初始數據。另外也可以說，實施例16和17的發現數據解釋了實施例15所示施用胃促胰酶引發的皮膚肥大細胞增多以及實施例12中所示的胃促胰酶抑制劑抑制皮膚肥大細胞增多作用的機制。
通過人工施用因抗原刺激導致肥大細胞釋放的外部胃促胰酶引發的皮膚反應隨重複施用次數增加而放大的事實(實施例13)，清楚地表明胃促胰酶在與抗原重複接觸引發的皮炎中起著重要作用。再者，由胃促胰酶抑制劑抑制重複應用半抗原誘發的皮炎中皮膚中嗜酸性粒細胞或肥大細胞增多(實施例11和12)以及施用胃促胰酶導致嗜酸性粒細胞或肥大細胞增多(實施例14-15)的事實，清楚地說明胃促胰酶控制在變態反應中起重要作用的嗜酸性粒細胞或肥大細胞的數量。此外，還顯示胃促胰酶抑制劑改善由重複應用半抗原誘發的皮炎中皮炎的症狀，所述模型是一種通過與抗原重複接觸誘發的皮炎模型(實施例9和10)。
接下來，顯示胃促胰酶抑制劑對作為第二種通過與抗原重複接觸誘發的皮炎模型的自然發生皮炎(NC/Nga)的小鼠的作用。
實施例18胃促胰酶抑制劑對自然發生皮炎(NC/Nga)小鼠的作用按照先前報導中描述的方法(Progress in Medicine 19，1201，1999)餵養NC/Nga小鼠。具體地說是，將從日本Charles River得到的並在沒有特定病原體(SPF)的環境下飼養的5周齡大NC/Nga小鼠，從6周齡開始與Hiroshima University的應用生物科學系飼養的NC/Nga小鼠混合併在正常的非SPF環境中餵養至15周齡，然後用於試驗。試驗在非SPF的常規環境中進行。將試驗物質(化合物18)與飲用水混合併以150mg/kg/天(n＝7)的劑量連續施用35天，然後按照先前報導中描述的方法(Progress in Medicine 19，1201，1999)進行評價。即，首先，在開始施用35天後，對五項指標進行0-2級的評分(1)搔癢行為，(2)水腫，(3)紅斑和出血，(4)脫毛和潰瘍，及(5)乾燥，用以評價皮膚外觀。然後，用福馬林固定耳部和背部的皮膚，包埋在石蠟中，採用蘇木精和曙紅法、甲苯胺藍法或剛果紅法(Stain Technol.56，323，1981)對耳部染色並且採用甲苯胺藍法或剛果紅法對背部皮膚染色後進行組織學分析。通過對三項指標進行0-3級評分(1)表皮厚度，(2)真皮厚度，和(3)細胞浸潤，判斷組織變化來評價用蘇木精和曙紅染色的耳部切片並以總評分來表示。此外，使用以甲苯胺藍和剛果紅染色的樣品計數肥大細胞和嗜酸性粒細胞的數量。具體地說，在X400顯微鏡視野下計數背部皮膚的嗜酸性粒細胞，另一種細胞在總共五個X200倍視野下計數並以總數表示。
如附圖20A和20B所示，在試驗開始(15周齡)時，觀察到對照組與胃促胰酶抑制劑(化合物18)施用組之間的皮膚症狀評分沒有差異(附圖20A)，但施用胃促胰酶抑制劑35天後，與對照組相比，皮炎評分明顯降低(p＜0.05，Mann-Whitney檢驗)(附圖20B)。同樣，通過施用胃促胰酶抑制劑，耳部的組織學評分也顯著降低(附圖21，p＜0.05，Mann-Whitney檢驗)。另一方面，計數耳部皮膚(附圖22A)和背部皮膚(附圖22B)的肥大細胞。結果，對兩種樣本施用胃促胰酶抑制劑都觀察到了明顯的抑制作用。此外還表明，胃促胰酶抑制劑還顯著抑制耳部皮膚(附圖23A)和背部皮膚(附圖23B)的嗜酸性粒細胞數量。
綜上所述，在自然發生的特異性皮炎模型中，其中這種發作被認為是由於與非SPF環境下空氣中的抗原重複接觸導致的，胃促胰酶抑制劑改善皮膚外觀和皮膚的組織學變化並抑制肥大細胞的增多和嗜酸性粒細胞的浸潤，由此證明，胃促胰酶抑制劑可用於對抗與抗原重複接觸引發的皮炎。
製劑實施例1片劑的製備將100.0g化合物1與22.5g微晶纖維素和2.5g硬脂酸鎂混合，然後用直接壓片機壓片，製備直徑為9mm的含200mg化合物1的片劑，每片重250mg。
製劑實施例2顆粒劑的製備將30g化合物1與265g乳糖和5g硬脂酸鎂混合。將該混合文壓模後粉碎，制粒並過篩得到10％的20-50目顆粒。
製劑實施例3直腸栓劑的製備將Vitepsol H-15(Dynamite Nobel Co.)溫熱融化。往其中加入化合物1使其達到12.5mg/ml的濃度。將其均勻混合後，加到2ml直腸栓劑模型中並使其冷卻，得到含25mg化合物1的直腸栓劑。
工業實用性依據本發明，胃促胰酶抑制劑緩解雙相皮膚炎症反應或者其晚期反應，可有效對抗由於重複應用半抗原誘發的皮炎(特異性皮炎的動物疾病模型之一)的皮膚增厚，因此可有效預防和/或治療表現出雙相炎症反應的皮炎或者由於與抗原重複接觸引發的皮炎適應症。
權利要求
1.一種預防或治療表現出雙相皮膚反應的皮炎的藥物，該藥物含有胃促胰酶抑制劑作為有效成分。
2.權利要求1的預防或治療性藥物，其中表現出雙相皮膚反應的皮炎是特應性皮炎。
3.權利要求1或2的預防或治療性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式(I)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，A環表示芳基；R1表示羥基、氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基氨基、可被羧酸基取代的C7-C10低級芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基或者可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基；R2和R3可以相同或不同，並且表示氫原子、未取代的或取代的C1-C4低級烷基、滷原子、羥基、C1-C4低級烷氧基、氨基、未取代的或取代的C1-C4低級烷基氨基、未取代的或取代的C7-C10芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基，或者羧酸基，或者當A環是苯環時，R1和R2可與該取代的苯環一起形成可被羧酸取代的稠合雜環，其中環中的碳原子可形成羰基並且R3定義如上；並且X表示氫原子、C1-C4低級烷基、C1-C4低級烷氧基、滷原子、羥基、氨基或硝基。
4.權利要求1或2的預防或治療性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式(II)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，其中B環表示苯環、吡啶環、吡咯環或吡唑環，m表示0、1或2，Y表示羥基、硝基、氯原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基、可被滷原子取代的C1-C4低級烷氧基或C7-C12芳烷氧基，或者Y表示與所示被所述Y取代的苯環一起形成萘環或喹啉環，R5和R6可以相同或不同，並且表示氫原子、滷原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基、硝基、氰基、吡唑基、四唑基、可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基或者可被一個或多個選自下列的取代基取代的C1-C4低級烷氧基滷原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基；或者當B環表示苯環時，R5和R6代表與所示被所述R5和R6取代的苯環一起形成萘環或喹啉環的基團，並且Z表示氫原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基，C2-C5鏈烯基，未取代的或取代的芳烷基，未取代的或取代的芳香雜環烷基，可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧甲基，被伯胺、仲胺或環狀胺醯胺化的甲醯甲基，未取代的或取代芳甲醯甲基，或者未取代的或取代的芳烷氧基甲基。
5.一種緩解表現出雙相皮膚反應的皮炎的晚期反應的藥物，它含有胃促胰酶抑制劑作為有效成分。
6.權利要求5的緩解性藥物，其中表現出雙相皮膚反應的皮炎是特應性皮炎。
7.權利要求5或6的緩解性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式I的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，A環表示芳基；R1表示羥基、氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基氨基、可被羧酸基取代的C7-C10低級芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基或者可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基；R2和R3可以相同或不同，並且表示氫原子、未取代的或取代的C1-C4低級烷基、滷原子、羥基、C1-C4低級烷氧基、氨基、未取代的或取代的C1-C4低級烷基氨基、未取代的或取代的C7-C10芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基，或者羧酸基，或者當A環是苯環時，R1和R2可與該取代的苯環一起形成可被羧酸取代的稠合雜環，其中環中的碳原子可形成羰基並且R3定義如上；並且X表示氫原子、C1-C4低級烷基、C1-C4低級烷氧基、滷原子、羥基、氨基或硝基。
8.權利要求5或6的緩解性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式(II)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，其中B環表示苯環、吡啶環、吡咯環或吡唑環，m表示0、1或2，Y表示羥基、硝基、氯原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基、可被滷原子取代的C1-C4低級烷氧基或C7-C12芳烷氧基，或者Y表示與所示被所述Y取代的苯環一起形成萘環或喹啉環，R5和R6可以相同或不同，並且表示氫原子、滷原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基、硝基、氰基、吡唑基、四唑基、可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基或者可被一個或多個選自下列的取代基取代的C1-C4低級烷氧基滷原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基；或者當B環表示苯環時，R5和R6代表與所示被所述R5和R6取代的苯環一起形成萘環或喹啉環的基團，並且Z表示氫原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基，C2-C5鏈烯基，未取代的或取代的芳烷基，未取代的或取代的芳香雜環烷基，可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧甲基，被伯胺、仲胺或環狀胺醯胺化的甲醯甲基，未取代的或取代芳甲醯甲基，或者未取代的或取代的芳烷氧基甲基。
9.一種預防或治療與抗原重複接觸引發的皮炎的藥物，該藥物含有胃促胰酶抑制劑作為有效成分。
10.權利要求7的預防或治療性藥物，其中與抗原重複接觸引發的皮炎是特應性皮炎。
11.權利要求7或8的預防或治療性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式I的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，A環表示芳基；R1表示羥基、氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基氨基、可被羧酸基取代的C7-C10低級芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基或者可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基；R2和R3可以相同或不同，並且表示氫原子、未取代的或取代的C1-C4低級烷基、滷原子、羥基、C1-C4低級烷氧基、氨基、未取代的或取代的C1-C4低級烷基氨基、未取代的或取代的C7-C10芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基，或者羧酸基，或者當A環是苯環時，R1和R2可與該取代的苯環一起形成可被羧酸取代的稠合雜環，其中環中的碳原子可形成羰基並且R3定義如上；並且X表示氫原子、C1-C4低級烷基、C1-C4低級烷氧基、滷原子、羥基、氨基或硝基。
12.權利要求9或10的預防或治療性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式(II)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，其中B環表示苯環、吡啶環、吡咯環或吡唑環，m表示0、1或2，Y表示羥基、硝基、氯原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基、可被滷原子取代的C1-C4低級烷氧基或C7-C12芳烷氧基，或者Y表示與所示被所述Y取代的苯環一起形成萘環或喹啉環，R5和R6可以相同或不同，並且表示氫原子、滷原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基、硝基、氰基、吡唑基、四唑基、可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基或者可被一個或多個選自下列的取代基取代的C1-C4低級烷氧基滷原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基；或者當B環表示苯環時，R5和R6代表與所示被所述R5和R6取代的苯環一起形成萘環或喹啉環的基團，並且Z表示氫原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基，C2-C5鏈烯基，未取代的或取代的芳烷基，未取代的或取代的芳香雜環烷基，可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧甲基，被伯胺、仲胺或環狀胺醯胺化的甲醯甲基，未取代的或取代芳甲醯甲基，或者未取代的或取代的芳烷氧基甲基。
13.一種預防或治療表現出雙相皮膚反應的皮炎的藥物組合物，該組合物含有緩解晚期反應量的胃促胰酶抑制劑和藥用賦形劑。
14.權利要求13的預防或治療性藥物組合物，其中表現出雙相皮膚反應的皮炎是特應性皮炎。
15.權利要求13或14的預防或治療性藥物組合物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式I的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，A環表示芳基；R1表示羥基、氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基氨基、可被羧酸基取代的C7-C10低級芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級烷基或者可被羧酸基取代的C2-C4鏈烯基；R2和R3可以相同或不同，並且表示氫原子、未取代的或取代的C1-C4低級烷基、滷原子、羥基、C1-C4低級烷氧基、氨基、未取代的或取代的C1-C4低級烷基氨基、未取代的或取代的C7-C10芳烷基氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級脂肪酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環羧酸醯化的氨基、可被羧酸基取代的C1-C4低級鏈烷磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的芳環磺酸磺醯化的氨基、可被羧酸基取代的雜芳環磺酸磺醯化的氨基，或者羧酸基，或者當A環是苯環時，R1和R2可與該取代的苯環一起形成可被羧酸取代的稠合雜環，其中環中的碳原子可形成羰基並且R3定義如上；並且X表示氫原子、C1-C4低級烷基、C1-C4低級烷氧基、滷原子、羥基、氨基或硝基。
16.權利要求13或14的預防或治療性藥物，其中的胃促胰酶抑制劑是下式(II)的喹唑啉衍生物及其可藥用鹽 其中，其中B環表示苯環、吡啶環、吡咯環或吡唑環，m表示0、1或2，Y表示羥基、硝基、氯原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基、可被滷原子取代的C1-C4低級烷氧基或C7-C12芳烷氧基，或者Y表示與所示被所述Y取代的苯環一起形成萘環或喹啉環，R5和R6可以相同或不同，並且表示氫原子、滷原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基、硝基、氰基、吡唑基、四唑基、可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基或者可被一個或多個選自下列的取代基取代的C1-C4低級烷氧基滷原子、嗎啉代、苯基哌嗪基和可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧基；或者當B環表示苯環時，R5和R6代表與所示被所述R5和R6取代的苯環一起形成萘環或喹啉環的基團，並且Z表示氫原子、可被滷原子取代的C1-C4低級烷基，C2-C5鏈烯基，未取代的或取代的芳烷基，未取代的或取代的芳香雜環烷基，可被C1-C4低級烷基或烯丙基酯化的羧甲基，被伯胺、仲胺或環狀胺醯胺化的甲醯甲基，未取代的或取代芳甲醯甲基，或者未取代的或取代的芳烷氧基甲基。
全文摘要
用於伴有二態炎症反應的皮炎和與抗原反覆接觸引發的皮炎的預防或治療藥物,其抑制該皮炎的發展且由於無副作用,是如此的安全,從而可提高患者的每日生活質量。具體地,上述皮炎的藥物含有胃促胰酶抑制劑作為活性成分,其中的胃促胰酶抑制劑是式(I)或(II)的喹唑啉衍生物或其藥用鹽。
文檔編號A61P17/04GK1366460SQ01800793
公開日2002年8月28日 申請日期2001年2月22日 優先權日2000年2月22日
發明者深見治一, 富森嘉晃, 福田好晃, 渡邊直熙 申請人:三得利株式會社