一種撿測發酵液中重組人白細胞介素-29的間接elisa方法

2023-10-11 11:36:44 7

一種撿測發酵液中重組人白細胞介素-29的間接elisa方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測發酵液中重組人白細胞介素-29活性的間接ELISA方法，用於基因工程菌株發酵條件優化過程中簡便、快速檢測發酵液中表達產物rhIL-29的活性。檢測方法包括以下步驟：將表達rhIL-29的基因工程菌株的發酵液上清用包被液稀釋後，直接包被酶標反應板，經37℃孵育3h、4℃過夜；洗板三次，加入封閉液37℃孵育3h：洗板三次，加入羊抗人IL-29抗體37℃孵育30min；洗板三次，加入HRP標記的兔抗羊IgG，37℃孵育30min；洗板三次，加入TMB底物，37℃顯色10min；加終止液終止反應，在A450波長測定OD值。本發明的檢測方法適用於基因工程菌株發酵條件優化過程中檢測發酵液中表達產物的活性，根據不同發酵條件下測得的發酵液OD450值，可判定該基因工程菌株的最佳發酵條件。
【專利說明】—種撿測發酵液中重組人白細胞介素-29的間接ELISA方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於生物技術檢測領域，涉及一種檢測發酵液中重組人白細胞介素-29 (rhIL-29)的間接ELISA方法。

【背景技術】
[0002]人白細胞介素-29 (interleukin 29，IL-29)是2003年新發現的一種新的細胞因子，其結構和功能與I型幹擾素(interferon，IFN)相似，因此又稱為IFN-λ I。
[0003]人IL-29主要由上皮細胞和肝細胞合成並分泌到細胞外作用於靶細胞。研究發現，人體不同組織器官的IL-29受體分布具有明顯差異，在胃腸、呼吸系統、心臟和一些腺體細胞中高水平表達，而在大腦中表達水平最低，表明IL-29作用的靶細胞比I型IFN的更局限。這種IL-29受體分布的組織器官差異，使IL-29引起發熱、寒冷、噁心和關節痛等效應比I型IFN的更小。因此，IL-29作為新型的幹擾素類，其臨床副作用可能比I型IFN的更小，具有潛在的臨床應用價值。
[0004]IL-29作為一種細胞因子，其在人體內的產生特點與其它細胞因子類似，具有多源性和自限性，作用特點具有多效型、時效性和重疊性。因此，人IL-29的製備只能通過基因克隆、構建重組表達載體、構建重組基因工程菌株、發酵表達、從發酵液分離和純化表達產物的一系列生物技術,才能獲得大量的重組人IL-29 (rhIL-29)產物。
[0005]在對表達rhIL-29的重組畢赤酵母工程菌株進行發酵的過程中，既要提高目的基因hIL-29的表達量又要保持表達產物rhIL-29的生物學活性。因此，需要對基因工程菌株的發酵條件進行全面優化。IL-29是一種細胞因子，其生物學活性廣泛，各種動物體內實驗方法由於操作複雜和費時較長，不適用於發酵條件優化過程中檢測表達產物rhIL-29的活性，而檢測發酵液中的蛋白質表達量又不能反映出表達產物rhIL-29的活性。因此，在發酵條件優化過程中，對發酵液中表達產物rhIL-29的活性和表達量的檢測至關重要。
[0006]本發明是在對表達rhIL-29的基因工程菌株進行發酵條件優化的過程中，通過大量實驗而建立的一種適用於檢測發酵液中rhIL-29活性的間接ELISA方法。


【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種檢測發酵液中重組人白細胞介素-29活性的間接ELISA方法，用於基因工程菌株發酵條件優化過程中簡便、快速檢測發酵液中表達產物rhIL-29的活性。
[0008]本發明提供的檢測方法如下:
[0009]I)酶標反應板的包被:取基因工程菌株的發酵液上清200 μ L，加800 μ L包被液，混勻後包被96孔酶標板，100 μ L/孔；同時設置陰性對照孔和空白孔，取空載體轉化表達菌的發酵液上清200 μ L，加800 μ L包被液，混勻後包被陰性對照孔，100 μ L/孔；空白孔只加包被液，100 μ L/孔，置37°C孵育3h，4°C過夜;
[0010]2)酶標反應板的封閉:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，每孔加封閉液200 μ L，37°C 孵育 3h ；
[0011]3)加一抗:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，加1: 200稀釋的羊抗人IL-29抗體，100 μ L/ 孔，置 37°C孵育 30min ；
[0012]4)加二抗:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，加1: 2500稀釋的HRP標記兔抗羊IgG,100yL/ 孔，置 37°C孵育 30min ；
[0013]5)加底物顯色:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，加TMB顯色液，100 μ L/孔，置37°C反應 15min ；
[0014]6)終止反應:加入終止液(lmol/L的H2804)，50 μ L/孔;
[0015]7)0D值的測定:用酶標儀測定，以空白孔調零，在A45(l波長測定樣品和陰性對照的0D值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1誘導畢赤酵母工程菌株表達rhIL-29的誘導劑甲醇的最佳添加量
[0017]圖2誘導畢赤酵母工程菌株表達rhIL-29的最佳培養溫度
[0018]具體實施方法
[0019]以下結合對誘導畢赤酵母工程菌株表達rhIL-29的誘導劑甲醇的添加量和誘導表達溫度進行優化過程中，檢測發酵液中rhIL-29活性的實施例具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。
[0020]實施例1誘導畢赤酵母工程菌株表達rhIL-29的誘導劑甲醇添加量的優化過程中檢測發酵液中rhIL-29的活性
[0021]1、從保存的畢赤酵母工程菌種管取菌種劃線接種YPD平板，活化菌株後，從YPD平板上挑取單菌落接種於YPD液體培養基；於30°C、220rpm/min，振蕩培養24h，作為發酵優化的一級種子。
[0022]2、按4%的接種量，取畢赤酵母工程菌的一級種子接種BMGY液體培養基中，於30°C、220rpm/min，振蕩培養至0D_ = 2-6(16-18小時)，作為發酵優化的二級種子。
[0023]3、將二級種子室溫靜置lh，倒去上清，用25mL BMMY重懸細胞，於30°C、220rpm/min 繼續培養；在 0h、24h、48h 時，分別添加 0.5 %、1.0 %、1.5 %、2.0 %、2.5 %、3.0 % 的甲醇，誘導培養72h，分別取500 μ L發酵液檢測rhIL-29的活性。
[0024]4、間接ELISA檢測發酵液中rhIL_29的活性
[0025]1)包被酶標反應板:取發酵液上清200 μ L，加800 μ L包被液，混勻後包被96孔酶標板，100 μ L/孔；同時設置陰性對照孔和空白孔，取空載體轉化表達菌的發酵液上清200 μ L，加800 μ L包被液，混勻後包被陰性對照孔，100 μ L/孔；空白孔只加包被液，100 μ L/孔，置37°C孵育3h，4°C過夜；
[0026]2)封閉酶標反應板:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，每孔加封閉液200 μ L，37°C孵育3h ；
[0027]3)加一抗:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，加1: 200稀釋的羊抗人IL-29抗體，100 μ L/ 孔，置 37°C孵育 30min ；
[0028]4)加二抗:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，加1: 2500稀釋的HRP標記兔抗羊IgG, 100 μ L/ 孔，置 37°C孵育 30min ；
[0029]5)加底物顯色:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，加TMB顯色液，100 μ L/孔，置37°C反應 15min ；
[0030]6)終止反應:加入終止液(lmol/L的H2SO4)，50 μ L/孔；
[0031]7)0D值的測定:用酶標儀測定，以空白孔調零，在A45tl波長測定樣品和陰性對照的OD值。
[0032]5、發酵過程中誘導劑甲醇的最佳添加量的確定
[0033]以甲醇添加量為橫坐標、在A45tl波長測定的發酵液OD值為縱坐標繪製曲線，根據曲線即可確定畢赤酵母工程菌發酵過程中誘導劑甲醇的最佳添加量，在本例中甲醇的最佳添加量為1.5%,如圖1所示。
[0034]實施例2誘導畢赤酵母工程菌株表達rhIL-29的培養溫度的優化過程中檢測發酵液中rhIL-29的活性
[0035]1、從保存的畢赤酵母工程菌種管取菌種劃線接種YPD平板，活化菌株後，從YPD平板上挑取單菌落接種於YPD液體培養基；於30°C、220rpm/min，振蕩培養24h，作為發酵優化的一級種子。
[0036]2、按4%的接種量，取畢赤酵母工程菌的一級種子接種BMGY液體培養基中，於30°C、220rpm/min，振蕩培養至0D_ = 2-6(16-18小時)，作為發酵優化的二級種子。
[0037]3、將二級種子室溫靜置lh，倒去上清，用25mL BMMY重懸細胞，分別在22°C、24°C、26°C、28°C、30°CT，220rpm/min繼續培養；在0h、24h、48h時，添加1.5%的甲醇，誘導培養72h,分別取500 μ L發酵液檢測rhIL-29的活性。
[0038]4、間接ELISA檢測發酵液中rhIL_29的活性
[0039]I)包被酶標反應板:取發酵液上清200 μ L，加800 μ L包被液，混勻後包被96孔酶標板，100 μ L/孔；同時設置陰性對照孔和空白孔，取空載體轉化表達菌的發酵液上清200 μ L，加800 μ L包被液，混勻後包被陰性對照孔，100 μ L/孔；空白孔只加包被液，100 μ L/孔，置37°C孵育3h，4°C過夜；
[0040]2)封閉酶標反應板:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，每孔加封閉液200 μ L，37°C孵育3h ；
[0041]3)加一抗:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，加1: 200稀釋的羊抗人IL-29抗體，100 μ L/ 孔，置 37°C孵育 30min ；
[0042]4)加二抗:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，加1: 2500稀釋的HRP標記兔抗羊IgGaOOyL/ 孔，置 37°C孵育 30min ；
[0043]5)加底物顯色:用洗滌液洗滌酶標板3次，拍幹，加TMB顯色液，100 μ L/孔，置37°C反應 15min ；
[0044]6)終止反應:加入終止液(lmol/L的H2SO4)，50 μ L/孔；
[0045]7)0D值的測定:用酶標儀測定，以空白孔調零，在A45tl波長測定樣品和陰性對照的OD值。
[0046]5、發酵過程中最佳培養溫度的確定
[0047]以培養溫度為橫坐標、在A45tl波長測定的發酵液OD值為縱坐標繪製曲線，根據曲線即可確定畢赤酵母工程菌發酵過程中的最佳培養溫度，在本例中的最佳培養溫度為 26°C，如圖2所示。
【權利要求】
1.一種撿測發酵液中重組人白細胞介素-29(rhIL-29)的間接ELISA方法，其特徵在於:所述的間接ELISA方法，用於對表達rhIL-29的畢赤酵母工程菌發酵條件優化過程中檢測發酵液中rhIL-29的活性。
2.根據權利要求1所述的撿測發酵液中rhIL-29的間接ELISA方法，其特徵在於:該方法包括以下步驟: (1)用表達rhIL-29的畢赤酵母工程菌株的發酵液上清包被酶標反應板，包被條件為37°C孵育3h，4°C過夜，洗板三次； (2)用封閉液封閉酶標反應板，封閉條件為37°C孵育3h，洗板三次； (3)加1: 200稀釋的羊抗人IL-29抗體，37°C孵育反應30min，洗板三次； (4)加1: 2500稀釋的HRP標記兔抗羊IgG，37°C孵育反應30min，洗板三次；
(5)加TMB 底物，37°C 顯色 15min ； (6)加終止液終止反應，檢測OD45tl值
3.根據權利要求2所述的撿測發酵液中rhIL-29的間接ELISA方法，其特徵在於:所述的檢測步驟中包括以下試劑: (1)包被液為0.05mol/L的碳酸鹽緩衝液，pH 9.6 ； (2)封閉液為0.85%的NaCl溶液，含1% BSA ；
(3)洗滌液為1mmoI/L 的 PBS, pH 7.4，含 0.15% 的 Tween-20 ；
(4)抗體稀釋液為15mmol/L 的 PBS, pH 7.4，含 0.4%的 Tween-20 ； (5)底物溶液:A液:磷酸-檸檬酸緩衝液，pH5.0，量取24.311^ 0.1M的檸檬酸和25.7mL0.2M的磷酸氫二鈉，用去離子水定容至100mL，4°C保存；B液:TMB溶液，稱取1mgTMB溶解於ImL的二甲基甲醯胺中，4°C避光保存；臨用前取50yL的B液，加入到1mL的A液，再加入10 μ L 30 %的H2O2,混勻即成底物溶液；
(6)終止液為lmol/L 的 H2SO415
【文檔編號】G01N33/543GK104407129SQ201410756205
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月12日 優先權日:2014年12月12日
【發明者】陳偉, 鄭海軍, 陸源, 李利雲, 鄔敏辰, 吳靜 申請人:江南大學