一種新的抗腫瘤抗生素——雲南黴素的製作方法

2023-09-23 05:29:45 2

專利名稱：一種新的抗腫瘤抗生素——雲南黴素的製作方法
技術領域：
本發明屬於一個新的具有抗腫瘤作用的胞嘧啶核苷二肽抗生素。
迄今已發現的來源於微生物的抗生素已近萬餘種之多，其中許多已作為醫藥，農藥等得到了廣泛應用，但療效好、毒性低的抗腫瘤抗生素仍為數甚少。因此進一步尋找理想的抗腫瘤作用的新品種仍日趨迫切。
本發明是在從雲南放線菌篩選抗腫瘤抗生素的過程中，由鏈黴菌菌株2321的培養液中分離到具有抗腫瘤及抗菌作用的活性物質，從該物質的酸水解產物中分離得到了具有抗腫瘤作用的新抗生素2321C，定名為雲南黴素(Yunnanmycin)。(該雲南黴素的產生菌已保藏在「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，北京中關村。100050，保藏日期1995年，7月26日，編號0234)。
經光譜及質譜數據分析，確定雲南黴素具有如式(1)R＝H所示結構式，該結構式可將雲南黴素與迄今已知的胞嘧啶核苷二肽結構的所有醫用和農用抗生素如谷氏菌素(Gougerotin)、慶豐黴素(Qingfengmycin)及寧南黴素(Ningnanmycin)等相區別，故確認雲南黴素為一個新的抗生素。 式中R＝H(雲南黴素)，R可以是K，Na，NH4及CH3，C2H5等本發明的內容與要點如下一.雲南黴素的產生菌，發酵，抗菌活性及製造方法1.產生菌來源雲南關坪自然保護區土壤形態特徵孢子絲螺旋形。孢子呈多型性橢圓形、園形、瓜子形，孢子表面有刺。
培養特徵見表1表1培養基生長 產生菌絲 基內菌絲 可溶性色素Isp.1號培養基 好白色 無色微黃Isp.2號培養基 好白至褐灰 無色 無Isp.3號培養基 適度 白至褐灰 無色至微灰 無Isp.4號培養基 好白至褐灰 無色至微灰 無Isp.5號培養基 好白至褐灰 無色至乳脂 微黃Isp.6號培養基 好白色 無色 無H2SIsp.7號培養基 好淺灰 軟皮色 汙黃葡萄糖天門冬素瓊脂 適度 淺灰 無色 無蔗糖查氏瓊脂 差褐灰 無色 無葡萄糖查氏瓊脂 好褐 淺黃灰斑 淺黃甘油查氏瓊脂 好白至淺灰 淺黃褐 汙黃高氏1號瓊脂 適度 灰白至灰 無色或乳脂 無或淡黃不形成黑色素，不產生H2S。
2.發酵孢子傳代培養Isp.5號培養基，28℃10天培養。
種子培養培養基成分葡萄糖1％，澱粉1.5％，肉膏0.5％，腖(魚)0.5％，NaCl0.3％，黃豆粉1％，無鹽水，PH7.0.28℃振蕩培養48小時。
發酵培養培養基成分葡萄糖2％，澱粉1％，肉膏0.5％，酵母粉0.5％，腖(魚)0.5％，NaCl0.3％，黃豆粉1％，無鹽水，PH7.028℃振蕩培養96小時。活性檢定檢定菌大腸桿菌B培養基肉膏0.3％，腖1％，瓊脂1.6％，無鹽水，PH7.0-7.2。檢定方法紙碟法。3.抗菌活性雲南黴素只對大腸桿菌B有較弱的活性。紙碟法檢測結果見表2表2試驗菌最低抑制濃度(ug/ml)Bacillus subtilis6633 ＞500Staphylococcus aureus 229p ＞500Sarcinalutea＞500Escherichia coia B 500Escherichia coli 0111 ＞500Proteus vulgaris ox19 ＞500Pseueomonas aeruginosa11 ＞500Klebsiella pneumoniae ＞500Candida albicans ＞500Penecillium avallaneum 5404 ＞5004.製造方法鏈黴菌菌株2321的發酵培養液的濾液，用2％(克/毫升)活性炭裝柱吸附，50％丙酮洗脫，減壓濃縮除去丙酮後的水溶液，調PH3，通過強酸陽離子樹脂(NH4+型)，進行交換，用1N氨水洗脫，洗脫液對大腸桿菌顯示活性部分除去氨，冷凍乾燥，冷幹品用中性氧化鋁柱吸附層析，75％甲醇洗脫，去甲醇後水溶液冷凍乾燥，乾燥後再用葡聚糖凝膠G-10柱層析，活性部分冷凍乾燥，冷幹品加適量濃鹽酸，於室溫下水解60小時，去除過量的鹽酸氣，水溶液通過強酸陽離子樹脂(NH4+型).進行交換，0.1N氨水洗脫，冷凍乾燥，乾燥品用葡聚糖凝膠G-10柱層析分離，水擴展，活性部分再冷凍乾燥，乾燥品用矽膠薄板層析分離製備(自製矽膠GF254板，20×20cm)，60％甲醇展開，分離出活性部分的冷幹品純度達95％以上，稱雲南黴素。二.雲南黴素的結構及理化數據
雲南黴素具有如式(1)所示結構，其UV，IR，FAB-MS，分子式，1HNMR，13CNMR及13C-DEPT數據如下，(1)式是根據這些數據及1H-1H相關譜(COSY)及反相檢測遠程1H-13C異核多鍵相關譜(HMBC)的分析確定的。
UV 258nmλmnax0.1N NaOH258nmλmax0.1NHCl275nm(見附圖1)IR(KBr)3200-3400， 1640-1660，1485，1275， 1060-1080，940， 840， 780cm-1(見附圖2)FAB-MS(m/z)445(M+H)-443(M-H)-(見附圖3)分子式C16H24K5O91H-NMR(400MHz in D2O，30℃)，見表3及附圖4表31H-NMR(400 MHz in D2O，30℃)ppm multi assignment7.83 1H，d，8HzH-65.12 1H，d，8HzH-55.70 1H，m H-1′4.56 1H，t，5HzSer-α4.05 1H，m H-4′4.02 1H，d，11Hz H-5′3.98 1H，d，16Hz Gly-α3.93 1H，d，16Hz Gly-α3.87 2H，m Ser-β3.81 2H，m H-2′,3′2.77 3H，s NCH313C-NMR(100MHz in D2O，30℃)，見附圖5。13C-DEPT (100MHz in D2O，30℃)，見附圖6。1H-1H COSY見附圖7。1H-13C-HMBC 見表4及附圖8。
表413C-NMR (100MHz in D2O，30℃)ppm muiti Correlations observed in HMBC(δH)assignment176.83s4.02(H-5′)C-6′174.13s4.56(Ser-α) 3.87(Ser-β) Ser-CO169.88s4.56(Ser-α) 3.98(Gly-α) 3.93(Ser-α)Gly-CO168.89s7.83(H-6) 6.12(H-s) C-4160.69s7.83(H-6) 5.70(H-1′) C-2144.78d6.12(H-s) 5.70(H-1′) C-699.92 d7.83(H-6) C-585.92 d7.83(H-6) 3.81(H-2′or3′) C-1′80.83 d4，05(H-4′)C-5′76.65 d5.70(H-1′) 4.05(H-4′) 3.81(H-2′or3′) C-2′or3′74.66 d5.70(H-1′) 3.81(H-2′or3′) C-2′or3′64.15 t4.56(Ser-α)Ser-β58.47 d3.87(Ser-β)Ser-α56.35 d4.02(H-s′) 3.81(H-2′or3′) C-4′52.63 t2.77(NCH) Gly-α35.84 g3.98(Gly-α) 3.93(Gly-α) NNH3三.雲南黴素的抗腫瘤作用及毒性1.雲南黴素的抗腫瘤作用(1).體外抗腫瘤活性實驗使用KB細胞系(來源於人的口腔鱗癌)，用含10％小牛血清的RPMI1640培養液在含5％CO2的37℃溫箱中培養採用克隆生成測定(Clonogenic assay)判斷藥物對腫瘤細胞的殺傷作用。取對數生長期的KB細胞加入96#培養板內，每#50個細胞/0.2ml，培養24小時後加入藥物，6天後在倒置顯微鏡下計數細胞集落(含30個細胞以上者)，計算集落抑制率，結果證明，雲南黴素對KB細胞有殺傷作用，其作用強度呈濃度依賴性；雲南黴素對KB細胞的IC50(半數集落抑制濃度)為3μg/ml(見附圖9)。
(2).體內的試驗對腫瘤的療效實驗使用18-20g體重的昆明種小鼠，取小鼠肉瘤180腹水加生理鹽水(1∶3)稀釋，接種於小鼠腋部皮下，每鼠0.2ml。接種中瘤24小時後口服(po)給藥，2次(分別在1、6天給藥)或3次(分別在1、4、7天給藥)，首次給藥10天後處死動物，取腫瘤稱重量，計算腫瘤抑制率。結果表明，雲南黴素對小鼠肉瘤180(實體型)有顯著療效，使用可耐受劑量(135mg/kg，po，x2)，對腫瘤生長抑制率達87％(P＜0.01)。見表5表5.雲南黴素對小鼠肉瘤180生長的抑制作用實驗劑量給藥動物數體重瘤重(g) 抑瘤率批號 組別 (mg/kg) 次數 開始/結束 改變(g) 均數±SD (％)1對照 10/10+10.13.80±1.08雲南黴素603 10/10+5.7 2.03±0.48 47**903 10/10+4.5 1.74±0.31 54**1203 9/10 +4.3 0.84±0.24 78**II對照 10/10+7.3 2.94±0.83雲南黴素 1052 10/10+2.0 0.71±0.16 76**1202 10/10-0.3 0.55±0.24 81**1352 10/10+1.8 0.38±0.11 87**小鼠腋部皮下接種腫瘤，口服(po)給藥。
**P＜0.01(3).雲南黴素與5-氟脲嘧啶的抗腫瘤作用及毒性比較採用等毒性劑量(1/3LD50)進行比較。同二.1.(2)體內試驗方法，在小鼠腋部皮下接種肉瘤180腹水0.2ml，24小時後開始口服給藥(po)，共2次(分別在1，6天給藥)。首次給藥10天後處死動物，取腫瘤稱重量，計算腫瘤抑制率；同時取出一側股骨，檢查骨髓有核細胞數，計算骨髓細胞抑制率。實驗結果，雲南黴素的抑瘤作用比5-氟脲嘧啶強，而骨髓毒性較輕，使用相當於1/3LD50的劑量，雲南黴素(120mg/kg)和5-氟脲嘧啶(80mg/kg)的抑制率分別為81％(P＜0.01)和66％(P＜0.01)，兩者比較，P＜0.01；雲南黴素和5-氟脲嘧啶對骨髓有核細胞的抑制率分別為22％(P＜0.05)和83％(P＜0.01)，兩者比較，P＜0.01，見表6表6雲南黴素和5-氟脲嘧啶對小鼠肉瘤180的抑制作用以及對骨髓的毒性比較劑量動物數腫瘤重量(g) 骨髓有核細胞數(107/股骨)(mg/kg) 開始/結束 X±SD 抑制率(％)X±SD抑制率(％)對照 10/10 2.94±0.831.41±0.27雲南黴素 12010/10 0.55±0.24 81**1.10±0.29 22*5-氟脲嘧啶80 10/10 0.99±0.33 66**0.24±0.18 83**小鼠腋部皮下接種腫瘤，灌胃(po)給藥；使用相當於1/3LD50的劑量，共2次。
*P＜0.05，**P＜0.01，與對照組比較。
上述結果表明，使用等毒性劑量(1/3LD50，po)進行比較，雲南黴素對小鼠肉瘤180(實體型)的抑制作用比5-氟脲嘧啶強，而對骨髓毒性較輕。
2.雲南黴素的毒性(1)小鼠急性毒性口服給藥(po)的LD50為360mg/kg。
腹腔給藥(1p)的LD50為65mg/kg。
(2)使用治療劑量(120mg，po，×2，抑制率81％)，對造血系統有輕度抑制作用，(骨髓細胞抑制率22％)；病理組織學檢查，治療動物的各種器官包括心、肺、氣管、肝、食官、胃、小腸、脾、腎、腎上腺等均未見毒性病變。
四.製造方法實施例取發酵液10立升，加硅藻土過濾，棄去菌絲，濾液通過200克活性炭柱(水溼裝柱，柱5.5×55cm)，進行吸附，50％丙酮洗脫，每250毫升收集一份，1-4份活性部分合併，除去丙酮，水溶液約500毫升，調PH3.0，通過裝有50毫升001×7銨型陽離子交換樹脂柱，少量水衝洗後，用1N氨水洗脫，每100毫升收集一份，1-5份活性部分合併，去除氨氣，水溶液冷凍乾燥，全部冷幹品通過中性氧化鋁100毫升柱脫色(甲醇溼裝)，75％甲醇展層，每100毫升收一份，1-10份活性部分合併，除去甲醇後，冷凍乾燥，得2.3克乾燥品，取一克乾燥品經過葡聚糖凝膠G-10柱層析分離，(柱1.2×100cm)，水洗，每5ml毫升收集一份，7-15份活性部分合併冷凍乾燥得冷幹品0.56克，純度95％(HPLC檢測，C18Waters柱4.6×250mm，流動相為75％甲醇，流速1毫升/分鐘，檢測UV268nm，保留時間8.3分鐘)。取該95％純度的冷幹品1克，加濃鹽酸40毫升，室溫水解60小時後，去掉鹽酸氣後的殘渣，加水200毫升，通過強酸陽離子樹脂Dowex×50w×4(NH4+型)10毫升，進行交換，水洗後，用0.1N氨水洗脫，每3毫升收集一份，11-20份活性部分合併，去氨氣後冷凍乾燥得到550毫克冷幹品，取150毫克該冷幹品通過葡聚糖凝膠G-10柱(1.2×100cm)，水洗，括性部分冷凍乾燥，冷幹品用矽膠薄板層析分離(自製矽膠GF254板，20×20cm)，60％甲醇展層，分離得到活性部分的冷幹品60毫克，純度96％(HPLC檢測，C16Waters柱4.6×250mm，流動相為75％甲醇，流速1毫升/分鐘，檢測UV268nm，保留時間2.9分鐘)，稱雲南黴素。


圖1是雲南黴素的UV；圖2是雲南黴素的IR；圖3是雲南黴素的FAB-MS；圖4是雲南黴素的1H-NMR；圖5是雲南黴素的13C-NMR；圖6是雲南黴素的13C-DEPT；圖7是雲南黴素的1H-1HCOSY；圖8是雲南黴素的1H-13CHMBC圖9是雲南黴素對KB胞的殺傷作用，克隆生成測定，藥物作用時間6天。
權利要求
1.一種如下結構式的抗腫瘤抗生素 結構式中R＝H(雲南黴素)R可以是K，Na，NH4及CH3，C2H5等
2.一種如權利要求1所述結構式的抗腫瘤抗生素的製備方法，其特徵是將鏈黴菌菌株2321在葡萄糖、澱粉等培養基成份上，中性條件下振蕩培養發酵，強酸型陽離子交換樹脂提取，葡聚糖凝膠層析分離，濃鹽酸水解，純化得到成品。
3.一種如權利要求1所述結構式的化合物的抗腫瘤作用，其特徵是將腫瘤細胞(KB細胞)在體外培養，採用克隆生成測定，判斷藥物對腫瘤細胞的殺傷作用；取小鼠肉瘤180細胞接種到受試小鼠腋部皮下繁殖生長，形成實體瘤，使用雲南黴素治療，通過稱取瘤體重量，計算腫瘤抑制率。
4.按照權利要求2所述的抗腫瘤抗生素的製備方法，其特徵是鏈黴菌菌株2321孢子絲呈螺旋形，其表面有刺，不形成黑色素，不產生硫化氫，孢子傳代是在Isp5號培養基上，28℃培養10天；種子培養基成份為葡萄糖1％，肉膏0.5％，魚腖0.5％，NaCl0.3％，黃豆粉1％，無鹽水，PH7.0，28℃振蕩培養48小時；發酵培養基成份葡萄糖2％，澱粉1％，肉膏0.5％，酵母0.5％，腖0.5％，NaCl0.3％，黃豆粉1％，無鹽水，PH7.0，28℃振蕩培養96小時。
5.按照權利要求2所述的抗腫瘤抗生素的製備方法，其特徵是將鏈黴菌2321發酵液經炭吸附，含水丙酮洗脫，強酸型陽離子樹脂交換，氧化鋁脫色，葡聚糖凝膠層析分離，濃鹽酸水解，再通過強酸型陽離子交換樹脂交換，凝膠柱分離，矽膠GF254薄層層析，分離純化，冷凍乾燥即得成品。
6.按照權利要求3所述化合物的抗腫瘤作用，其特徵是雲南黴素對KB細胞的殺傷作用呈濃度依賴性，對KB細胞的IC50為3μg/ml；體內試驗對小鼠肉瘤180(實體型)有顯著療效，使用可耐受劑量(135mg/kg，po，×2)對腫瘤生長抑制率達87％(P＜0.01)。採用等毒性劑量比較，雲南黴素的抑瘤作用較5-氟脲嘧啶強，而骨髓毒性較輕。
全文摘要
本發明是從雲南鏈黴菌菌株2321的發酵液中，經離子交換樹脂提取，層析分離純化，濃鹽酸水解，再經離子交換樹脂提取，層析製備等方法，分離到胞嘧啶核苷二肽新抗生素——雲南黴素，體外對腫瘤細胞有殺傷作用，體內對小鼠肉瘤180(實體型)有顯著療效，使用可耐受劑量對腫瘤生長抑制率達87％，比等毒性劑量的5-氟脲嘧啶的抑瘤作用強，而對骨髓毒性較輕，使用治療劑量對造血系統有輕度抑制作用，病理組織學檢查，治療動物的各種主要器官均未見毒性病變。
文檔編號C07H19/06GK1124778SQ9510942
公開日1996年6月19日 申請日期1995年8月3日 優先權日1995年8月3日
發明者戚長菁, 甄永蘇, 陳文君, 胡繼蘭, 薛玉川, 張春穎 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所