番茄花粉管導入技術的製作方法
2023-10-10 02:23:09 2
專利名稱：番茄花粉管導入技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種番茄花粉管導入技術，用於番茄、茄子、辣椒等茄果類新品種培育，屬於農作物育種技術領域。
外源DNA導入方法首先用刀片平行截取2/3花柱，然後用100μl微量注射器吸取10μl(濃度為0.615～0.799μg/μl)供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處，輕輕將注射器往上提一提，接著小心注入供體DNA。並以TE緩衝液作對照。
本發明利用總DNA和帶有耐鹽目的基因的質粒作為供體，通過巧妙的設計使既能用傳統的葉色遺傳規律，又能用現代的PCR及PCR-southern技術證實花粉管通道技術在番茄育種上的有效性。
本發明的受體材料為擬改良品種「鮮豐」以及帶有特殊葉色基因(雙陰性黃化基因)的品種「矮黃」。選用的供體材料為野生耐鹽的秘魯番茄Lycopersicon peruvianum、奇士曼尼番茄L.cheesmanii LA166、潘那利番茄L.pennellii LA716、醋慄番茄L.pimpinellifolium LA2184及帶有耐鹽目的基因HVA1的pBY520質粒。
研究表明，在常溫下番茄授粉後24～48小時內開始受精，形成的花粉管一珠心組織通道，是導入外源DNA的現成途徑。導入時間過晚，胚胎已形成，珠心組織呈封閉狀，外源DNA就很難滲入。因此，本發明在導入時間上選擇24～48小時。
本發明採用的供體材料4份野生種葉色均為綠色，2份受體材料中鮮豐的葉色為綠色，而矮黃的葉色則為黃色。在番茄的葉色遺傳上，綠色對黃色為顯性，且為單基因遺傳，在實際生產上正是利用這一特性，以矮黃為母本進行不去雄授粉，在F1代的苗期就把假雜種拔除。故可以用傳統的葉色遺傳規律來檢測花粉管技術在番茄上的可行性和有效性。通過對導入HVA1目的基因的植株進行現代分子生物學技術PCR及PCR-southern檢測，同樣證明花粉管導入技術在番茄上的可行性。
本發明的花粉管導入技術與其它幾類基因導入技術相比，有一定優勢利用整體植株的卵細胞、受精卵或早期胚細胞轉化DNA，無需組織培養和誘導再生植株等一整套人工培養過程；方法簡便，一般常規育種工作者易於掌握；只有部分外源DNA片段進入受體基因組，避免了供體基因與受體基因組全面重組，因而易於穩定，大大縮短了育種時間；可以任意選擇生產上的當家品種進行外源DNA的導入，達到目的基因的轉移。可保留受體的優良性狀。可以直接獲得種子，對其後代的生產價值進行考察，可避免一般生物技術的實驗室研究與大田要求脫節的問題。
將導入外緣DNA的果實，單果留種。次年分別播種，對具有四片葉子的幼苗(用TG1表示)，用150mM NaCl進行灌溉，灌溉的頻率為每周3次，連續4周。將耐鹽性強的植株定植於大田，得到3株正常結實的植株。接著進行PCR檢測，證明3株植株中均存在HVA1基因的515bp的特徵條帶，證明外緣DNA確實存在於受體中。
對TG1代種子發芽的鹽脅研究表明在NaCl 60mmol/L和80mmol/L脅迫下，TG1代種子的相對發芽勢均高於受體品種「鮮豐」(對照)的相對發芽勢。NaCl 60mmol/L時，TG1代種子的發芽勢可達對照的4.16倍；80mmol/L時，TG1代種子的發芽勢可達對照的7.10倍。
對上述3植株所結種子以及受體品種「鮮豐」的種子同時播種，並在定植以後的整個生長期，對植株(用TG2表示)進行海水灌溉(海水∶淡水＝1∶1)，結果表明TG2的成活率可達63％，並能正常結果，產量可達淡水灌溉下的67％-85％。而對照「鮮豐」在上述海水灌溉下則全部死亡。對成活植株進行PCR-southem檢測，同樣證實HVA1基因的存在，這充分證明花粉管導入技術在番茄上的可行性。
實施例2受體為栽培種「矮黃」，供體為潘那利番茄L.pennellii LA716。選取處於喇叭口期的花蕾，隔離套袋，次日進行人工授粉。授粉後24小時，用刀片平行截取2/3花柱，然後用100μl微量注射器吸取10μl濃度為0.667/μl的供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處，輕輕將注射器往上提一提，接著小心注入供體DNA。
在編號為324的群體中，發現了一株葉色為綠色，生長緩慢的植株。這說明傳統的葉色遺傳規律也證明了花粉管技術在番茄上的可行性和有效性。
實施例3栽培種為「鮮豐」，供體為潘那利番茄L.pennelliiLA716。選取處於喇叭口期的花蕾，隔離套袋，次日進行人工授粉。授粉後48小時，用刀片平行截取2/3花柱，然後用100μl微量注射器吸取10μl濃度為0.715/μl的供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處，輕輕將注射器往上提一提，接著小心注入供體DNA。
由於導入的為總DNA，導入的群體較大，後代選擇群體也大，故我們利用TG1代植株的一級側枝進行鹽池(基質栽培條件下，用150mMNaCl脅迫)扦插，選留耐鹽性強的側枝對應的植株。
對TG2代植株以及受體品種「鮮豐」，在定植以後的整個生長期進行海水灌溉(海水∶淡水＝1∶1)，結果表明TG2的成活率可達71％，並能正常結果，而對照「鮮豐」則全部死亡。
實施例4受體為栽培種「鮮豐」，供體為秘魯番茄Lycopersicon peruvianum。選取處於喇叭口期的花蕾，隔離套袋，次日進行人工授粉。授粉後24小時，用刀片平行截取2/3花柱，然後用100μl微量注射器吸取10μl濃度為0.779/μl的供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處，輕輕將注射器往上提一提，接著小心注入供體DNA。
由於導入的為總DNA，導入的群體較大，後代選擇群體也大，故我們利用TG1代植株的一級側枝進行鹽池(基質栽培條件下，用150mMNaCl脅迫)扦插，選留耐鹽性強的側枝對應的植株。
對TG2代以及對照品種「鮮豐」，在定植以後的整個生長期進行海水灌溉(海水∶淡水＝1∶1)，結果表明TG2的成活率可達35％，而對照「鮮豐」則全部死亡。
實施例5栽培種為「鮮豐」，供體為奇士曼尼番茄L.cheesmanii LA166。選取處於喇叭口期的花蕾，隔離套袋，次日進行人工授粉。授粉後48小時，用刀片平行截取2/3花柱，然後用100μl微量注射器吸取10μl濃度為0.695/μl的供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處，輕輕將注射器往上提一提，接著小心注入供體DNA。
由於導入的為總DNA，導入的群體較大，後代選擇群體也大，故我們利用TG1代植株的一級側枝進行鹽池(基質栽培條件下，用150mM NaCl脅迫)扦插，選留耐鹽性強的側枝對應的植株。
對TG2代以及對照品種「鮮豐」，在定植以後的整個生長期進行海水灌溉(海水∶淡水＝1∶1)，結果表明TG2的成活率可達56％，而對照「鮮豐」則全部死亡。
權利要求
1.一種番茄花粉管導入技術，其特徵在於選擇處於喇叭口期的花蕾，於前一天隔離套袋，次日進行人工授粉，授粉後24～48小時，利用自然花粉管通道，將外源基因導入到擬改良受體品種，供體外源DNA導入方法首先用刀片對受體材料平行截取2/3花柱，然後用100μl微量注射器吸取10μl濃度為0.615～0.799μg/μl的供體DNA，沿花柱慢慢插入子房，深及子房的1/2處後小心注入供體DNA。
2.如權利要求1所說的番茄花粉管導入技術，其特徵在於供體外源基因選用野生耐鹽的秘魯番茄Lycopersicon peruvianum、奇士曼尼番茄L.cheesmanii LA166、潘那利番茄L.pennellii LA716、醋慄番茄L.pimpinellifoliumLA2184或帶有耐鹽目的基因HVA1的Pby520質粒。
3.如權利要求1所說的番茄花粉管導入技術，其特徵在於受體材料為擬改良品種「鮮豐」或帶有特殊葉色雙陰性黃化基因的品種「矮黃」。
全文摘要
一種番茄花粉管導入技術,選擇處於喇叭口期的花蕾隔離套袋,人工授粉後24～48小時,利用自然花粉管通道,將外源基因導入到擬改良受體品種。導入時先用刀片對受體材料平行截取2/3花柱,然後用微量注射器吸取10μl濃度為0.615～0.799μg/μl的供體DNA,沿花柱慢慢插入子房,深及子房的1/2處後小心注入供體DNA。本發明方法簡便,易於掌握,可以任意選擇生產上的當家品種進行外源DNA的導入,達到目的基因的轉移,並可保留受體的優良性狀。
文檔編號A01H1/02GK1342400SQ01132000
公開日2002年4月3日 申請日期2001年10月25日 優先權日2001年10月25日
發明者陳火英, 張建華, 陳雲鵬, 莊天明 申請人:上海交通大學