提取隱藏嗜酸菌胞內聚-β-羥基丁酸酯的方法
2023-10-17 03:33:34 1
專利名稱：提取隱藏嗜酸菌胞內聚-β-羥基丁酸酯的方法
技術領域：
本發明涉及一種從隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)提取聚-β-羥基丁酸酯(PHB)的方法。
背景技術：
聚-β-羥基丁酸(poly-β-hydroxybutyrate，簡稱PHB)是細菌細胞內積累的一種高分子聚合物，是生物降解塑料的重要原料。由於它在具有一般化學合成塑料特性的同時，還具有生物可降解性、生物相容性和利用再生資源進行生物合成的特性，得到國際生物工程界的廣泛重視。PHB的提取成本是影響其大規模工業化生產的一個重要因素，因此研究和探索PHB的提取方法，是當前迫切需要解決的問題。沈忠耀等報導目前PHB的提取方法，主要包括次化學試劑、有機溶劑法、機械破碎法以及酶法等。其中機械破碎法和酶法的提取率比較低，一般低於30％。前兩種提取方法用的比較多，而化學試劑法中的次氯酸鈉法是目前最常用的方法，其優點是簡單、快速，但易引起PHB分子的嚴重降解。Hahn等對次氯酸鈉法進行了改良，用分散的次氯酸鈉溶液/氯仿從菌體中提取PHB，發現PHB提取率有明顯提高而且摩爾質量的下降程度明顯減弱。目前PHB提取方法研究的對象一般是真氧產鹼桿菌。
發明內容
為了提高隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)胞內聚-β-羥基丁酸酯的提取效率，本發明做了一系列的研究工作，提供了一個有效提取該屬菌的PHB方法。
自然界中的隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)一般存在於酸性礦坑水中，與生物浸礦密切相關。該菌的16S rRNA基因序列己登錄於Genbank，登錄號為DQ168464。其保藏號為CCTCC NOM 208056。該菌既可以氧化低價態硫獲取能量進行自養生長，又可以利用有機質進行異養生長。同時，發現該菌異養生長時，不僅生長迅速，而且胞內能產生大量聚合物顆粒，該聚合物經紅外和紫外光譜檢測證實為PHB，具有進一步開發成PHB新型生產菌的潛力。然而，提取隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)胞內聚-β-羥基丁酸酯(PHB)的方法的研究工作開展的較少，因此要實現隱藏嗜酸菌生產PHB的工業化，對其提取工藝進行研究是必不可少的。
隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)胞內聚-β-羥基丁酸酯的提取方法，首先對隱藏嗜酸菌進行超聲破碎，超聲破碎工作2s，間隔4s，工作10～30次，再用pH為10、體積比為2∶1～1∶2的次氯酸鈉溶液/氯仿抽提，最後在4℃加入乙醇，得沉澱即PHB。
本發明採用超聲/次氯酸/氯仿提取PHB，胞內PHB提取率可以達到88％。
具體實施例方式 實施例1 1.菌種的培養與收集 將Acidiphilium cryptum菌DX1-1菌株培養至對數生長中期，10000r/min離心10min收集菌體，用無菌水(pH3.0)清洗菌體2次。將沉澱菌泥用20mL無菌水重懸。
2.超聲破碎 將裝有菌液的離心管，放在預先放有冰塊的燒杯裡，按如下程序超聲破碎工作2s，間隔4s，工作10～30次。
3.分散的次氯酸鈉溶液/氯仿提取PHB 超聲破碎後的液體中加入80mL體積比為2∶1～1∶2的次氯酸鈉溶液(pH10)/氯仿，30℃搖床震蕩60min後，8000r/m離心分為三層上層次氯酸鈉溶液，中層未破壁細胞以及非PHB細胞物質，下層PHB氯仿溶液。抽取氯仿相緩慢加入50mL乙醇，4℃放置30min使充分沉澱。10000r/m離心，棄上清，沉澱乙醇洗滌兩次，60℃乾燥。
4.提取結果的驗證 不同提取方法提取隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)菌DX1-1胞內PHB的效率 不同方法提取PHB效果驗證
超聲/次氯酸納/氯仿提取隱藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)菌DX1-1胞內PHB效果驗證 超聲/次氯酸納/氯仿提取PHB效果驗證
其中先用超聲破碎(工作2s，間隔4s，工作20次)，再用體積比為1∶1的次氯酸鈉溶液(pH10)/氯仿抽提，最後用乙醇(4℃)沉澱的提取方法最適合Acidiphilium cryptum菌胞內PHB的提取。
權利要求
1.隱藏嗜酸菌胞內聚-β-羥基丁酸酯的提取方法，其特徵在於首先對隱藏嗜酸菌進行超聲破碎，超聲破碎工作2s，間隔4s，工作10～30次，再用pH為10、體積比為2∶1～1∶2的次氯酸鈉溶液/氯仿抽提，最後在4℃加入乙醇，得沉澱即PHB。
全文摘要
提取隱藏嗜酸菌胞內聚-β-羥基丁酸酯的方法。本發明主要包括收集菌體、超聲破碎、氯仿/次氯酸鈉提取、加入乙醇離心得沉澱和乾燥。採用本發明，隱藏嗜酸菌菌胞內PHB提取率可以達到88％，比單獨次氯酸鈉氯仿提取的方法提高了12％。
文檔編號C08G63/89GK101343355SQ20081003148
公開日2009年1月14日 申請日期2008年6月16日 優先權日2008年6月16日
發明者邱冠周, 徐愛玲, 夏金蘭, 宇 楊, 帥 張, 李家洛, 張燕飛, 麗 歷 申請人:中南大學