用於診斷和預測移植物排斥的生物標誌物板的製作方法

2023-11-30 23:49:06

專利名稱：用於診斷和預測移植物排斥的生物標誌物板的製作方法
用於診斷和預測移植物排斥的生物標誌物板政府權利本發明是根據美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)資助的合同(R01 AI 61739-01)。政府享有本發明的某些權利。移植器官或組織從供體至宿主患者的移植是某些醫學程序和治療方案的特徵。雖然努力通過宿主-供體組織配型來避免移植物排斥，但是在供體器官被導入宿主的移植程序中，通常需要免疫遏制療法以維持供體器官在宿主中的活力。然而儘管廣泛使用了免疫遏制療法，器官移植排斥仍可發生。同種異體移植物組織的急性移植物排斥(AR)是涉及同種異體移植物中同種抗原的T-細胞識別、共刺激信號、活化T細胞對效應分子的加工和移植物內的炎性反應的複雜免疫反應。循環白細胞的活化和向同種異體移植物的募集是這一過程的關鍵特徵。AR的早期檢測是移植受體(包括腎移植受體)護理中的主要臨床問題之一。腎功能障礙發作之前的AR檢測允許用積極的免疫遏制成功治療這一病症。在不具有AR的患者中降低免疫遏制以使藥物毒性最小化也同樣重要。因此，監測移植物受體中的AR反應，包括預測、診斷和表徵AR，是本領域中關注的。本發明滿足了這些和其它需要。發明概述提供了用於監測具有移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應，例如以預測、診斷和/或表徵AR反應，包括受治療者中的移植物存活的方法。在實踐該主題方法時，評估來自所述受治療者的樣品例如血液或活檢樣品中至少一種基因的表達水平以監測受治療者， 例如在核酸和/或蛋白水平進行評估。還提供了可用於實踐該主題方法的組合物、系統、試劑盒和電腦程式產品。所述方法和組合物可用於多種應用。本發明的方面包括監測已接受移植物(如同種異體移植物)的受治療者的急性排斥(AR)反應的方法，所述方法包括(a)評估來自所述受治療者的樣品中至少一種基因的表達水平以獲得基因表達結果，其中所述至少一種基因選自由以下組成的組NKTR、MAPK9、 DUSPl、PBEF1(也稱為NAMPT)和PSEm ；和(b)採用所述基因表達結果來在所述受治療者中預測AR反應的發作、診斷AR反應、和/或表徵AR反應，由此監測所述受治療者的AR反應。 在某些實施方式中，評估上述5種基因的組的所有基因的表達水平。在某些實施方式中，評估步驟還包括評估選自以下的一種或多種的另外的基因的表達水平CFLAR、RNF-130、IFNGRl、ITGAX和RYBP。在某些實施方式中，評估以上所列的全部10種基因的表達水平。在某些實施方式中，評估步驟包括測定所述樣品的所述至少一種基因的表達產物。在某些實施方式中，所述表達產物是核酸轉錄物，而在其 它實施方式中， 所述表達產物是蛋白。在某些實施方式中，評估步驟包括RT-PCR測定。在某些實施方式中， 所述RT-PCR測定是定量RT-PCR測定。在某些實施方式中，所述樣品是血液樣品。在某些實施方式中，所述同種異體移植物是腎同種異體移植物。在某些實施方式中，採用所述基因表達結果來提前6到3個月預測AR反應的發生。在某些實施方式中，採用所述基因表達結果來將AR反應表徵為類固醇抗性AR反應。本發明的方面包括用於確定AR反應中被排斥的組織的身份的方法，所述方法包括評估來自所述受治療者的樣品中選自以下的一種或多種的至少一種基因的表達水平 NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1 (也稱為 NAMPT)、PSEN1、CFLAR、RNF_130、IFNGR1、ITGAX 和 RYBP， 以獲得基因表達結果，並採用該基因表達結果來確定被排斥的組織的身份。這一測試不僅僅適用於許多組織的移植排斥，包括腎、心臟、肝、肺和腸移植物。本發明的方面包括用於 為已接受移植物的受治療者確定免疫遏制方案的方法，所述方法包括(a)評估來自所述受治療者的樣品中至少一種基因的表達水平以獲得基因表達結果，其中所述至少一種基因選自由以下組成的組NKTR、MAPK9、DUSPl、PBEFl (也稱為 NAMPT)和PSEm ；和(b)採用所述基因表達結果以為所述受治療者確定免疫遏制方案。在某些實施方式中，評估上述5種基因的組的所有基因的表達水平。在某些實施方式中，評估步驟還包括評估選自以下的一種或多種的另外的基因的表達水平CFLAR、RNF-130、IFNGRU ITGAX和RYBP。在某些實施方式中，評估以上所列的全部10種基因的表達水平。本發明的方面包括用於監測已接受同種異體移植物的受治療者的急性排斥(AR) 反應的系統，所述系統包括(a)基因表達評估元件，該基因表達評估元件配置為用於評估來自所述受治療者的樣品中至少一種基因的表達水平以獲得基因表達結果，其中所述至少一種基因選自由以下組成的組NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1 (也稱為NAMPT)和PSEm ；和(b) 表型確定元件，該表型確定元件採用所述基因表達結果來在所述受治療者中預測AR反應的發作、診斷AR反應、和/或表徵AR反應，由此監測所述受治療者的AR反應。在某些實施方式中，評估上述5種基因的組的所有基因的表達水平。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件包括用於測定樣品的所述至少一種基因的表達產物的至少一種試劑。在某些實施方式中，所述至少一種基因的表達產物是核酸轉錄物，而在其它實施方式中，所述表達產物是蛋白。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件包括所述至少一種基因特異性的PCR 引物。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件還配置為用於評估選自以下的一種或多種的另外的基因的表達水平CFLAR、RNF-130、IFNGRl、ITGAX和RYBP。在某些實施方式中， 評估以上所列的全部10種基因的表達水平。在某些實施方式中，所述表型確定元件包括包括所述至少一種基因的參考表達值。本發明的方面包括用於監測已接受同種異體移植物的受治療者的急性排斥(AR) 反應的試劑盒，所述試劑盒包括(a)基因表達評估元件，該基因表達評估元件用於評估樣品中至少一種基因的表達以獲得基因表達結果，其中所述至少一種基因選自由以下組成的組NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1(也稱為NAMPT)和PSEm ；和(b)表型確定元件，該表型確定元件採用所述基因表達結果來在所述受治療者中預測AR反應的發作、診斷AR反應、和/或表徵AR反應，由此監測所述受治療者的AR反應。在某些實施方式中，評估上述5種基因的組的所有基因的表達水平。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件還配置為用於評估選自以下的一種或多種的另外的基因的表達水平CFLAR、RNF-130、IFNGRl、ITGAX和RYBP。 在某些實施方式中，評估以上所列的全部10種基因的表達水平。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件包括對以上所述的一種或多種基因特異的PCR引物對(如用於RT-PCR 測定基因表達)。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件包括對所述5種基因的組的全部5種基因特異的PCR引物對，而在其它實施方式中，所述基因表達評估元件包括對以上所列的全部10種基因特異的PCR引物對。本發明的方面包括用於監測已接受同種異體移植物的受治療者的急性排斥(AR) 反應的電腦程式產品，其中當裝載於計算機上時，所述電腦程式產品配置為採用來自從所述受治療者獲得的樣品的基因表達結果來確定AR監測結果，和以用戶可讀格式向用戶提供所述AR監測結果，其中所述AR監測結果選自在所述受治療者中預測AR反應的發作、診斷AR反應、和/或表徵AR反應，其中所述基因表達結果包括選自以下的一種或多種的表達數據NKTR、MAPK9、DUSPl、PBEFl和PSENl。在某些實施方式中，所述表達結果包括來自所述5種基因的組的全部基因的表達數據。在某些實施方式中，所述表達結果包括選自以下的一種或多種的另外的基因的表達數據CFLAR、RNF-130、IFNGRl、ITGAX和RYBP。在某些實施方式中，所述表達結果包括以上所列的全部10種基因的表達數據。定義為了方便，將說明書、實施例和所附權利要求書中採用的某些術語集於此處。「急性排斥或AR」是當移植的組織為免疫學上外源時，組織移植受體的免疫系統的排斥。急性排斥的特徵為移植的組織被受體的免疫細胞浸潤，所述免疫細胞執行其效應功能並破壞移植的組織。急性排斥的發作是迅速的，並且在人類中通常發生於移植手術後幾周內。一般而言，可用免疫遏制藥物抑制或遏制急性排斥，所述免疫遏制藥物諸如雷帕黴素、環孢菌素A、抗-CD40L單克隆抗體和類似藥物。「慢性移植排斥或CR」在人類中一般發生於移植物移入後數月至數年，甚至發生於存在急性排斥的成功免疫遏制時。纖維化是所有器官移植物類型的慢性排斥中常見的因素。慢性排斥典型地可通過特定器官特徵性的一系列具體疾患來描述。例如，在肺移植物中，此類疾患包括氣道的纖維增生性破壞(閉塞性細支氣管炎)；在心臟移植物或心臟組織的移植物中，諸如瓣膜換置術中，此類疾患包括纖維變性動脈粥樣硬化；在腎移植物中，此類疾患包括梗阻性腎病、腎硬化(nephrosclerorsis)、腎小管間質性腎病變；和在肝移植物中，此類疾患包括消失型膽管症候群。慢性排斥的特徵還在於局部缺血性損傷、移植的組織的去神經、高脂血症和與免疫遏制藥物相關的高血壓。術語「移植物排斥」涵蓋急性和慢性移植物排斥二者。如本文所用的術語「嚴格測定條件」指適於產生具有充分互補性的核酸例如表面結合的核酸和溶液相核酸的結合對來提供測定中期望的特異性水平，而較不適於在不具有充足的互補性的結合成員之間形成結合對來提供期望的特異性的條件。嚴格測定條件是雜交和洗滌條件二者的總和或組合(總體)。在核酸雜交(如陣列雜交、DNA印跡雜交或RNA印跡雜交中)上下文中，「嚴格雜交條件」和「嚴格雜交洗滌條件」是序列依賴性的，並且在不同的實驗參數下是不同的。可用於鑑定本發明範圍內的核酸的嚴格雜交條件可包括，例如，在包括50%甲醯胺、5XSSC和 1% SDS的緩衝液中在42°C下的雜交，或在包括5 X SSC和SDS的緩衝液中在65°C下的雜交，二者均以0. 2XSSC和0. 1% SDS在65°C下洗滌。示例性嚴格雜交條件還可包括雜在 40%甲醯胺、IM NaCl和SDS的緩衝液中在37°C下雜交和在IXSSC中在45°C下洗滌。 可選地，可採用與過濾器結合的DNA在0.5M NaHP04、7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、lmM EDTA 在65°C下的雜交和在0. 1XSSC/0. 1% SDS中在68°C下的洗滌。另外的嚴格雜交條件包括在60 0C或更高和3 X SSC (450mM氯化鈉/45mM檸檬酸鈉)下的雜交或在42 °C下在含有30 %甲醯胺、IM NaCl、0. 5%肌氨酸鈉、50mM MES、pH 6. 5的溶液中的孵育。技術人員將容易理解，可利用替代但相當的雜交和洗滌條件來提供相似嚴格性的條件在某些實施方式中，洗滌條件的嚴格性列出了決定核酸是否與表面結合的核酸特異性雜交的條件。用於鑑定核酸的洗滌條件可包括，例如約PH 7下約0. 02M的鹽濃度和至少約50°C或約55°C至約60°C的溫度；或，約0. 15M NaCl的鹽濃度，72°C，約15分鐘；或， 約0. 2XSSC的鹽濃度，至少約50°C或約55°C至約60°C的溫度，約15至約20分鐘；或，用含0. SDS的約2X SSC的鹽濃度的溶液在室溫下洗滌雜交複合體兩次，每次15分鐘，然後用含0. 1% SDS的0. IX SSC在68°C下洗滌兩次，每次15分鐘；或等同條件。用於洗滌的嚴格條件還可以是，例如，0. 2XSSC/0. 1% SDS, 420C ο嚴格測定條件的一個具體實例是在65°C下在總單價陽離子濃度為1. 5M的基於鹽的雜交緩衝液中旋轉雜交(如2000年9月5號提交的美國專利申請第09/655，482號中所述，該專利申請的公開內容通過引用併入本文)，然後在室溫下在0. 5 X SSC和0. 1 X SSC下洗滌。嚴格測定條件是至少與以上代表性條件同樣嚴格的雜交條件，其中如果與以上具體條件相比，在給定的條件集下大致上沒有另外的缺乏提供期望特異性的足夠互補性的結合複合體產生，則認為該給定的條件集是至少同樣嚴格的，其中「大致上不多於」意指少於約5倍多、一般少於約3倍多。其它嚴格雜交條件是本領域已知的，並且在適當時也可採用。如本文所用，術語「基因」或「重組基因」指包括編碼多肽的開放可讀框的核酸，包括外顯子和(任選地)內含子序列。術語「內含子」指給定基因中存在的不被翻譯成蛋白質的DNA序列，並且一般發現於DNA分子的外顯子之間。此外，基因可任選地包括其天然啟動子(即，非重組細胞即天然存在的細胞中基因的外顯子和內顯子與其可操作地連接的啟動子)和相關的調控序列，並可具有或不具有AUG起始位點上遊的序列，並且可包括或不包括非翻譯的先導序列、信號序列、下遊非翻譯序列、轉錄起始和終止序列、多腺苷酸化信號、 翻譯起始和終止序列、核糖體結合位點以及類似序列。「蛋白編碼序列」或「編碼」特定多肽或肽的序列是當置於適當的調控序列的控制下時，在體外或體內轉錄(在DNA的情況下)和翻譯(在mRNA的情況下)成多肽的核酸序列。編碼序列的邊界由5'(氨基)末端的起始密碼子和3'(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可包括但不限於，來自病毒、原核生物或真核生物mRNA的cDNA、來自病毒、原核生物或真核生物DNA的基因組DNA序列，和甚至合成的DNA序列。轉錄終止序列可位於編碼序列的3'。術語「參考」和「對照」可互換地使用以指觀察值可與之比較的已知值或已知值集。 如本文所用的，已知意指該值代表已被理解的參數，例如，移植物存活或損失表型中標誌物基因的表達水平。術語「核酸」包括DNA、RNA (雙鏈或單鏈)、其類似物(如PNA或LNA分子)和衍生物。如本文所用的術語「核糖核酸」和「RNA」意指主要由核糖核苷酸組成的聚合物。如本文所用的術語「脫氧核糖核酸」和「DNA」意指主要由脫氧核糖核苷酸組成的聚合物。術語 「mRNA」意指信使RNA。「寡核苷酸」一般指約10個至100個核苷酸長度的核苷酸多聚物，而 「多核苷酸」包括具有任何數量的核苷酸的核苷酸多聚物。 本申請中使用的術語「蛋白」和「多肽，，是可互換的。「多肽，，指胺基酸的聚合物(胺基酸序列)，而不涉及該分子的具體長度。因此，多肽的定義中包括肽和寡肽。該術語也不涉及或包括多肽的翻譯後修飾，例如，糖基化、乙醯化、磷酸化和類似修飾。包括在該定義中的有，例如，含有一個或多個胺基酸類似物的多肽、具有置換的連接的多肽、以及本領域中已知的其它修飾，包括天然存在的和非天然存在的修飾二者。術語「評價」和「評估」可互換地使用以指 測量的任何形式，並包括確定元件是否存在。術語「確定」、「測量」、「評價」和「測定」可互換地使用，並包括定量和定性確定二者。 評價可以是相對的或絕對的。「評價…的存在」包括確定存在的某物的量以及確定該物是否存在。本申請中採用的某些縮寫包括以下AR 急性排斥；AZA 硫唑嘌呤；BKV =BK病毒；CMV 巨細胞病毒；CSA 環孢菌素A ； DSA 供體特異性抗體；EBV 埃巴病毒；FDR 假髮現率；FK :FK506 ；HCT 血細胞比容；LRD 活體親屬供體；MMF 麥考酚酸嗎乙酯；PBL 外周血白細胞；PAM 微陣列預測分析；PRA 板反應性抗體；Q-PCR 定量實時聚合酶鏈反應；ROC 接收器工作特性；SAM 微陣列顯著性分析；STA 穩定的；SNS :NIH-CCTPT UOl資助的隨機化多中心兒科腎移植物的患者的基於類固醇對比無類固醇的移植研究(SNSOl) ；WBC:白細胞。附圖簡述

圖1.研究設計概述。本研究劃分為2個具體部分在研究的部分1中我們在3 種不同的微陣列平臺，即Affymetrix、Agilent和cDNA陣列上進行了外周血樣品的代表性微陣列分析。通過將轉錄物定位至人類基因組織(HUGO)基因名稱比較從3種平臺產生的陣列數據。使用共同的顯著性閾值(FDR < 10% )，對每個數據集進行適當的標準化程序， 然後進行SAM分析以鑑定AR中顯著調節的基因。525種基因是跨3種平臺差異表達的AR 特異性基因中共同的。選擇32基因-集用於選自用於微陣列的樣品中的34種樣品的初步驗證(驗證集)。在測試的32種基因中，10種最顯著的基因(ρ <0.03)在42個獨立的樣品(確認集1)中進行進一步確認。使用來自確認集1的5種最顯著的基因的表達產生回歸模型。然後將這一模型應用於64個樣品的第二獨立集(確認集2)用於真實的AR分類。 在該研究的部分2中，我們對AR之前(preAR ；η = 27)和AR之後(postAR ；η = 30)收集的配對血液樣品進行縱向5-基因Q-PCR分析，其中將回歸模型應用於57個系列AR樣品。圖2. 5基因-集的基因表達的驗證和確認。外周血樣品陣列跨共同的525基因-集的聚類顯示樣品按診斷表型聚類。這裡顯示了在Affymetrix陣列上運行的59個樣品的聚類(圖2A)；跨在所有3種陣列平臺上差異表達的525種重疊基因觀察到樣品按表型聚類 (參見圖5)，而與樣品採集、加工或多個臨床混淆因素無關。樣品跨525的基因按表型(AR 或STA)聚類。這裡僅顯示了在Affymetrix陣列上運行的樣品的代表性聚類數據。顯示了選擇的10基因-集的總結表達，如在其中一種陣列平臺(Affymetrix)上測量的(圖2B)。 顯示了全血樣品中的Affymetrix微陣列數據的SAM分析的倍數變化和q評分。顯示了表達Q-PCR樣品的驗證集的同樣10個基因的表達(圖2C)。Q-PCR的倍數變化是AR和STA 樣品之間的平均差異；Q-PCR表達差異的顯著性通過T檢驗確定，其中ρ < 0. 05視為顯著的。在血液樣品的獨立確認集(確認集1)中，顯示了最顯著的5個基因的表達。未在陣列分析中使用的新的血液樣品同樣通過跨5種基因的表型(AR或STA)分離(圖2D)。確認集 1中使用的樣品的5種基因的倍數變化和ρ值顯示於圖2E。
圖3.接收器工作特性(ROC)曲線。使用邏輯回歸模型分析，從獨立樣品(確認集 1)的5基因Q-PCR表達數據產生預測模型。通過ROC評分=95. 2%顯示該模型的特異性和靈敏度。將回歸模型應用於獨立樣品集(確認集2)，其中5基因的表達明顯地將AR與 STA分離(非監督聚類)，並且當與STA比較時，差異表達的5基因在AR中是顯著不同的(ρ < 0. 02).圖4.在臨床移植物功能障礙之前通過5基因_集血液採樣預測急性排斥。將回歸模型應用於移植後前兩年的不同時間在STA樣品集的患者中順序採集的樣品(圖4Α)， 以評估在移植後不同時間預測為AR的概率。STA樣品分組為在移植後0至3個月內、3至 6個月內、6至12個月內和12至24個月內採集的樣品。每個血液樣品具有配對的活檢以證實血液樣品採集時移植物中AR的不存在。使用腎移植後不同時間的5基因-集的協調表達計算所有STA樣品的AR概率的平均值和標準偏差。如所見的，任何STA樣品在移植後任何時間被預測為AR的可能性少於50%。存在2個錯誤分類的STA樣品(具有58%的AR 概率評分的S99，和具有72%的AR預測評分的S88 ；參見圖9)。具有錯誤分類的STA樣品的兩個患者在血液採樣6個月內顯示發展活檢證明的AR。在右圖(圖4Β)中，顯示了活檢證明AR時採集的血液樣品、以及在AR樣品之前(preAR) 1-3個月內和3_6個月內採集的樣品(作為協議樣品採集的一部分)的AR概率的平均值和標準偏差。如所見的，血液樣品分類為AR的概率(一般為75-100% )與AR的活檢診斷強烈一致。根據AR診斷強化免疫遏制(類固醇脈衝或抗體)後，AR預測概率下降，證明5基因-集特徵的AR預測概率通過增強的免疫遏制降低。AR集中所有樣品的AR預測概率在所有preAR、AR和postAR樣品中顯著高於任何STA樣品(ρ < 0. 001)，表明發展AR的患者可比移植後從未發展AR的患者具有更高的免疫活化閾值。

圖5提供了顯示跨樣品製備㈧或跨不同的微陣列平臺⑶的每個發現平臺內的 AR顯著基因和如通過SAM(q < 10% )確認的重疊顯著基因的Verm圖。重疊的525基因 (標雙下劃線的)與STA樣品相比在AR中受到統計學顯著的(超幾何檢驗；p<0. 001)調節，並且是AR共有的，不管與不同陣列平臺的雜交是否使用採集外周血的不同方法。圖6A顯示了基因列表和使用Q-PCR測定的基因的ABI探針ID。圖6B顯示了跨驗證集(17AR、17STA)中的34個血液樣品通過Q-PCR測定的10-基因的標準化表達值。圖7是參考文獻中指明在AR中差異表達的3個基因的跨驗證集的34個樣品的陣列和Q-PCR的基因表達值的總結。圖8顯示了通過Q-PCR的跨確認集1中的42個獨立血液樣品(21AR和21STA)的 10基因的標準化表達值。圖9顯示了通過Q-PCR的跨確認集2的64個獨立血液樣品(32AR和32STA)的5 基因的標準化表達值。圖10比較了跨10基因集(上圖)和5基因集(下圖)的AR的不同分類模型。圖11顯示了對所有Q-PCR實驗檢查的18個人口統計學和臨床混淆因素。圖12顯示了確定圖11中的18個參數作為5_基因集表達的潛在混淆因素的任何影響的Pearson關聯和t_檢驗(如果需要)的結果。圖13是圖12中的結果的圖形表示。圖14顯示了活檢Banff等級、小管周C4d陽性和體液與細胞AR和AR預測概率之間的關聯。 圖15.圖A顯示AR發作之前和之後6個月內採集的配對樣品的AR預測概率。圖 B顯示比較AR時的AR預測評分對比preAR和postAR評分的ρ值。圖C是圖A中的數據的圖形表示。圖D是顯示STA樣品中的AR概率的圖。圖E顯示圖D所示的圖中使用的數據。圖16顯示使用Ingenuity系統(IPA ；2008)的跨3個陣列平臺的重疊525基因的生物學相關性分析。圖17是圖16中顯示的信息的圖形表示。圖18顯示交叉引用進行的樣品和測定的表格。
具體實施方式
描述提供了監測具有移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應，例如以預測、診斷、和/ 或表徵AR反應的方法。在實踐該主題方法中，評估至少一種基因在來自受治療者的樣品例如血液或活檢樣品中的表達水平，例如核酸和/或蛋白水平，以監測該受治療者。還提供了在實踐該主題方法中有用的組合物、系統、試劑盒和電腦程式產品。所述方法和組合物可用於多種應用。在更詳細地描述本發明之前，應理解本發明不限於所描述的具體實施方式
，因為這些實施方式當然可以變化。還應理解，本文使用的術語僅是出於描述特定實施方式目的， 而不意圖限制，因為本發明的範圍將僅受所附權利要求的限制。當提供值的範圍時，應理解該範圍的上限和下限之間的每個中間值(除非上下文另外清楚指明，至下限單位的十分之一)和在所稱範圍內的其它聲稱值或中間值涵蓋在本發明內。這些更小範圍的上限和下限可獨立地包括在更小的範圍內，並且也涵蓋在本發明內，符合所稱範圍內任何特別排除的限值。當所稱範圍包括一個或兩個限值時，排除所包括的限值中的任一個或兩個的範圍也包括在本發明中。某些範圍在本文中呈現時數值前有術語「約」。術語「約，，在本文用於提供對其前的準確數字、以及接近或近似於該術語前的數字的數字的文字支持。在確定數字是否接近或近似於具體陳述的數字時，接近或近似的未陳述的數字可以是在其所呈現的上下文中， 提供所述具體陳述的數字的實質等同的數字。除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員理解的含義相同的含義。雖然與本文所描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料也可用於實踐或測試本發明，但是現在描述了代表性的示例方法和材料。本說明書中引用的所有出版物和專利通過引用併入本文，如同具體和單獨地指明每個單獨的出版物或專利通過引用併入，並通過引用併入本文以結合所引用的出版物公開和描述所述方法和/或材料。任何出版物的引用是因為其在申請日之前公開，而不應解釋為承認本發明沒有資格因為先前的發明而早於這樣的出版物。另外，所提供的出版日期可能與實際出版日期不同，這可能需要獨立地確認。應注意，如本文和所附權利要求中所用的，除非上下文另外清楚指明，單數形式 「一個」、「一種」和「該」包括複數指代物。還應注意的是，權利要求可撰寫為排除任何任選的要素。因此，此聲明意圖充當結合引用權利要求要素使用諸如「僅僅」、「僅」和類似術語的排除性術語、或使用「負」限制的先行基礎。如本領域技術人員閱讀本公開後將明白的，本文描述和例證的每個單獨實施方式具有離散的組件和特徵，這些組件和特徵可容易地與其它多種實施方式的任何實施方式的特徵分離或組合，而不背離本發明的範圍或精神。任何所述方法可按所述的事件順序或以邏輯上可行的任何其它順序進行。如上所概括的，本發明涉及在受治療者中監測AR反應的方法、以及用於實踐該主題方法的試劑和試劑盒。在進一步描述本發明時，首先描述了該主題方法，然後綜述了用於實踐該主題方法的試劑和試劑盒。監測急性排斥反應的方法 如以上所綜述的，本發明提供用於監測已接受移植物的受治療者的AR反應的方法。在某些實施方式中，監測受治療者以預測是否將發生AR反應，其中所述方法可在AR反應發生前6到3個月預測AR。在某些實施方式中，監測受治療者以確定是否存在持續的AR 反應。在某些實施方式中，監測受治療者以表徵發生或已發生的AR反應，例如來確定先前的AR反應的嚴重度和/或類別，例如AR反應是否為/曾為類固醇抗性AR反應。在某些實施方式中，本發明包括確定AR反應中被排斥組織的身份的方法。本發明的方面還包括用於確定已接受移植物例如同種異體移植物的受治療者的免疫遏制方案的方法。因此，本發明的某些實施方式提供評估，例如以預測的方式，包括移植物的受治療者中的移植物存活的方法。例如，主題方法可用於確定受治療者是否將發動針對移植物的 AR反應，在缺乏有效的免疫遏制幹預下，該AR反應將造成移植物組織的喪失。因此，本發明提供評估移植患者或受治療者中的移植物是將存活或將喪失的方法。在某些實施方式中， 所述方法可被視為確定移植受治療者是否具有移植物存活表型即其中移植物將存活的表型的方法。移植物存活表型是特徵為長期移植物存活的存在的表型。「長期」移植物存活意指在當前取樣之外移植物存活至少約5年，儘管發生AR的一次或多次先前發作。在某些實施方式中，確定已發生至少一次急性排斥(AR)發作的患者的移植物存活。因此，這些實施方式是確定或預測AR後的移植物存活的方法。在移植療法例如免疫遏制療法上下文的某些實施方式中，確定或預測移植物存活，其中免疫遏制療法是本領域已知的。在又其它的實施方式中，提供了確定急性排斥的類別和/或嚴重度(而不僅是其存在)的方法。如移植領域已知的，移植物器官、組織或細胞可以是同種的或異種的，以致移植物可以是同種異體移植物或異種移植物。感興趣的器官和組織包括但不限於皮膚、心臟、腎、 肝、骨髓和其它器官。在實踐主題方法中，測定受治療者或患者樣品，例如細胞或其集合，例如，組織，以監測宿主的AR反應。因此，主題方法的第一步是從感興趣的患者，即受治療者或患者具有至少一種移植物例如同種異體移植物的患者，獲得合適的樣品。樣品來源於任何初始的合適來源，其中感興趣的樣品來源包括但不限於許多不同的生理來源，例如腦脊液(CSF)、尿、唾液、淚液、組織來源樣品例如勻漿物(諸如移植的組織或器官的活檢樣品(包括但不限於腎、心臟、肺活檢))，和血液或其衍生物。在某些實施方式中，患者樣品的合適的初始來源是血液樣品。因此，這些實施方式的主題測定中採用的樣品一般是血液來源樣品。血液來源樣品可來自全血或其級分，例如血清、血漿、細胞級分等，其中在某些實施方式中樣品來源於從全血收穫的血液細胞。作為樣品來源特別受關注的是外周血單核細胞/淋巴細胞(PBMC/PBL)。可採用獲得此類樣品的任何方便方案，其中合適的方案是本領域熟知的(如全血樣品的密度梯度分級分離)，並且代表性方案報導於下面的實驗部分。在實踐主題方法中，測定樣品以獲得選自表1的一種或多種基因的表達水平評估，例如表達譜，其中術語表達譜用於廣泛地包括基因組表達譜，例如感興趣的一種或多種基因的核酸轉錄物例如mRNA的表達譜，或蛋白質組表達譜，例如一種或多種蛋白的表達譜，其中蛋白/多肽是所述感興趣的一種或多種基因的表達產物。因此，在某些實施方式中，僅評估表1中的1種基因的表達水平。在又其它實施方式中，評估表1中的兩種或更多種基因例如表1中的3、4或全部5種基因的表達水平。在某些實施方式中，還評估表1中列出的那些之外的一種或多種另外的基因的表達水平，其中在某些實施方式中，所述另外的基因選自表2中列出的那些。這裡應注意的是，包括評估表1和2中的基因的任何組合的表達水平的表達譜可用於監測在移入的組織中已發展或易發展AR反應的受治療者，包括評估表1和2中列出的全部10種基因的表達。表1.表達水平可用於監測具有同種異體移植物的受治療者中的AR的5種基因
權利要求
1.一種監測已接受同種異體移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應的方法，所述方法包括(a)評估來自所述受治療者的樣品中至少一種基因的表達水平以獲得基因表達結果， 其中所述至少一種基因選自由以下組成的組NKTR、MAPK9、DUSPl、PBEFl和PSEm ；和(b)採用所述基因表達結果來在所述受治療者中預測AR反應的發作、診斷AR反應、和 /或表徵AR反應，由此監測所述受治療者的AR反應。
2.根據權利要求1所述的方法，其中評估NKTR、MAPK9、DUSPUPBEFl和PSEm的表達水平。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述評估步驟還包括評估以下的一種或多種的表達水平CFLAR、RNF-130, IFNGRl、ITGAX 和 RYBP。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述評估步驟包括測定所述樣品的所述至少一種基因的表達產物。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述表達產物是核酸轉錄物。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述評估步驟包括RT-PCR測定。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述RT-PCR測定是定量RT-PCR測定。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品是血液樣品。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述同種異體移植物是腎同種異體移植物。
10.根據權利要求1所述的方法，其中採用所述基因表達結果來提前6到3個月預測 AR反應的發生。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述方法還包括評估來自所述受治療者的所述樣品中選自表3或4的至少一種基因的表達水平，以獲得第二基因表達結果，以及採用所述第二基因表達結果來確定所述受治療者是否具有移植物耐受表型。
12.一種用於監測已接受同種異體移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應的系統，所述系統包括(a)基因表達評估元件，該基因表達評估元件配置為用於評估來自所述受治療者的樣品中至少一種基因的表達水平以獲得基因表達結果，其中所述至少一種基因選自由以下組成的組NKTR、MAPK9、DUSPl、PBEFl 和 PSENl ；禾口(b)表型確定元件，該表型確定元件採用所述基因表達結果來在所述受治療者中預測 AR反應的發作、診斷AR反應、和/或表徵AR反應，由此監測所述受治療者的AR反應。
13.根據權利要求12所述的系統，其中所述基因表達評估元件包括用於測定樣品的所述至少一種基因的表達產物的至少一種試劑。
14.根據權利要求13所述的系統，其中所述至少一種基因的所述表達產物是核酸轉錄物。
15.根據權利要求14所述的系統，其中所述基因表達評估元件包括對所述至少一種基因特異的PCR引物。
16.根據權利要求12所述的系統，其中評估全部NKTR、MAPK9、DUSPl、PBEFl和PSEm 的表達水平。
17.根據權利要求12所述的系統，其中所述基因表達評估元件還配置為用於評估以下的一種或多種的表達水平CFLAR、RNF-130, IFNGRU ITGAX和RYBP。
18.根據權利要求12所述的系統，其中所述表型確定元件包括所述至少一種基因的參考表達值。
19.一種用於監測已接受同種異體移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應的試劑盒， 所述試劑盒包括(a)基因表達評估元件，該基因表達評估元件用於評估樣品中至少一種基因的表達以獲得基因表達結果，其中所述至少一種基因選自由以下組成的組NKTR、MAPK9、DUSPU PBEFl 禾口 PSENl ；禾口(b)表型確定元件，該表型確定元件採用所述基因表達結果來在所述受治療者中預測 AR反應的發作、診斷AR反應、和/或表徵AR反應，由此監測所述受治療者的AR反應。
20.一種用於監測已接受同種異體移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應的電腦程式產品，其中當裝載於計算機上時，所述電腦程式產品配置為採用來自從所述受治療者獲得的樣品的基因表達結果來確定AR監測結果，和以用戶可讀格式向用戶提供所述AR 監測結果，其中所述AR監測結果選自在所述受治療者中預測AR反應的發作、診斷AR反應、 和/或表徵AR反應，其中所述基因表達結果包括選自以下的一種或多種的表達數據NKTR、 MAPK9、DUSP1、PBEFl 禾口 PSENl。
全文摘要
提供了監測具有移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應，例如以預測、診斷、和/或表徵AR反應的方法。在實踐該主題方法中，評估至少一種基因在來自受治療者的樣品例如血液或活檢樣品中的表達水平，例如核酸和/或蛋白水平，以監測該受治療者。還提供了在實踐該主題方法中有用的組合物、系統、試劑盒和電腦程式產品。
文檔編號C12Q1/68GK102439172SQ201080012756
公開日2012年5月2日 申請日期2010年1月11日 優先權日2009年1月15日
發明者M·M·薩爾沃 申請人:利蘭·斯坦福青年大學託管委員會