小麥籽粒質地編碼基因的核酸序列、表達載體和應用的製作方法

2023-12-01 19:20:26

專利名稱:小麥籽粒質地編碼基因的核酸序列、表達載體和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物基因工程技術領域：
，具體涉及小麥(Triticum aestivum L.)籽粒質地編碼基因的核酸序列，表達載體和應用。
背景技術：
普通小麥(Triticum aestivum L.)籽粒質地(硬度)可分為硬質、軟質和中間型三類。籽粒硬度直接影響小麥的磨粉、烘烤品質，最終決定麵粉的用途。軟質麥通常用於製作糕點、甜餅或蛋糕，硬質麥適於烘烤麵包(Henry RJ，Kettlewell PS，eds.，Cereal grain quality.Chapman and Hall，New York，1996，pp3-54.)。因此，研究小麥籽粒硬度是我國小麥品質遺傳改良的重要切入點，對發展優質專用小麥，改變我國糧食結構性過剩的局面，提高市場競爭能力等具有重要意義。
小麥籽粒硬度的遺傳比較簡單，受1個主效基因(Ha)及1或多個微效基因控制(Anjum，F.M.and Walker，C.E.，J.Sci.Food Agric.，1991，561-13.)。控制籽粒硬度的主效基因Ha位於5D染色體的短臂上。最近的研究結果表明，Ha位點的功能是由2種蛋白質puroindolines A和puroindolines B決定的，而puroindolines A和puroindolines B能夠直接影響籽粒質地。編碼puroindolines A和puroindolines B的基因由Gautier等(Gautier，M.F.et al，Plant Mol.Biol.，2543-57，1994.)首次從麵包小麥「Capitole」種子中克隆到。Giroux和Morris(1997、1998)發現puroindolines B基因的第46位胺基酸由甘氨酸(GGC)突變為絲氨酸(AGC)以後，其籽粒的質地將由軟變為硬(Giroux，M.J.and Morris，C.F.，Theor.Appl.Genet.，95857-864，1997；.Giroux，M.J.and Morris，C.F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，956262-6266，1998)。最近在北歐小麥中發現puroindolines B基因的第44位胺基酸由亮氨酸(CTG)突變為脯氨酸(CCG)，或第44位胺基酸由色氨酸(TGG)突變為精氨酸(AGG)以後，其籽粒的質地將由軟變為硬。Puroindolines為小麥族植物所特有，具有很高的保守性，它廣泛存在於小麥近緣物種(大麥、燕麥、黑麥)中(Gautier，M.F.et al，Plant Science，15381-91，2000)。puroindolines有別於其它植物蛋白質的特徵，即具有富含半胱氨酸和色氨酸的疏水區(該區對脂類有很強的親和性)，還具有較強的抗微生物特性(Dubreil，L.et al.，Plant Science，138121-135，1998)。另外還能影響麵團的流變特性及麵包的質地(Dubreil，L.et al.，J.Agri.Food Chem.，45108-116，1997)。因此，該基因不僅在籽粒品質改良，而且在提高植物抗真菌病害方面均具有較大的潛在利用價值。
長期以來，我國小麥品種改良比較注重產量性狀的提高，而品質性狀研究的技術和手段相對滯後。近年來隨著農業結構調整及我國加入WTO，對小麥品質的研究越來越受到重視。有關小麥籽粒硬度的研究大多集中於籽粒質地、形態及其對磨粉、加工性能的影響，基於分子水平的研究尚未見報導。我國具有豐富的小麥資源(野生種、地方種、栽培種等)，同時小麥育種工作者也已培育出來了大量的品種(系)(金善寶，中國小麥學。北京農業出版社，1996)，但對這些材料籽粒硬度的遺傳控制尚不十分明確，為了更好地開發和利用這些資源，有必要對其籽粒硬度進行系統的分子生物學研究。因此，分離鑑定控制籽粒硬度的基因並通過條交或轉基因技術將其導入現有的小麥品種中，對於進一步改良小麥的烘烤品質具有重要的作用。

發明內容本發明的目的是提供一種可安全食用並能改善麵粉加工品質的蛋白質，它是小麥(Triticum aestivum L.)籽粒質地編碼基因編碼的產物，並且提供編碼這種蛋白質的核酸序列及其功能上等價的胺基酸序列。
本發明的另一個目的是提供能表達該蛋白質的表達載體、微生物和真核生物，它們能大量生產出該蛋白質，將其作為添加劑加入麵粉，以改善麵粉的加工品質。
還有．本發明公布的小麥(Triticum aestivum L.)籽粒質地編碼基因的胺基酸序列及編碼這種蛋白質的核酸序列為將編碼這種蛋白質的核酸導入植物並培育出良好加工品質的轉基因植物奠定基礎。
本發明通過PCR技術，從小麥(Triticum aestivum L.)中擴增得到籽粒質地的編碼基因，並克隆到一種載體上，並進行測序。通過對測序結果分析，表明獲得了一種編碼小麥籽粒質地的基因序列，它不同於所有已知的小麥籽粒質地的編碼基因的序列，是一種新的小麥籽粒質地的編碼基因。
該基因的核酸序列為SEQ ID NO.1相應的蛋白質序列為SEQ ID NO.2。
利用上述蛋白質的胺基酸序列可以通過常規方法輕而易舉地設計出可以編碼這種蛋白質的其它核酸序列。
本發明利用PCR方法從小麥中擴增得到編碼小麥籽粒質地的基因，其設計的引物序列分別為SEQ IDNO.3(primer 1)和SEQ ID NO.4(primer 2)。
本發明還提供了可以克隆含小麥籽粒質地編碼基因的DNA分子的表達載體。該表達載體可以是基因工程領域常用的載體。比如質粒、病毒、噬藺體、粘粒等，最優選為質拉。細菌質粒是一種雙鏈，閉環的DNA分子，是獨立於細菌染色體之外進行複製和遺傳的輔助性遺傳單位。通常用於構建表達載體的質粒包含一個抗性篩選基因、一個啟動子，一個終止子.一個位於啟動子和終上子之間多克隆位點和一個複製起點。多克隆位點通常由一系列相鄰的限制性酶切位點構成。通過特定的限制性內切酶酶切質粒和目的片段就可以獲得具有相同粘性末端的開環質粒分子和目的片段，再利用連接酶對兩者進行連接就可以獲得含有目的片段的表達載體。其中最常用的連接酶是T4 DNA連接酶。
本發明還將構建的表達載體導入用於表達蛋白質的微生物與真核生物，其中這兩類生物是任何可以表達蛋白質的生物，例如細菌、酵母等，其最優選為常見的大腸桿菌與釀酒酵母，例如，大腸桿菌BL21(DE3)及其變種或突變株。導入微生物的方法有電轉化、氯化鈣法等。其中氯化鈣法是一種方便且高效的轉化方法從而被廣泛應用在該領域。氯化鈣法是利用冰預冷的氧化鈣溶液處理細菌可以使受體菌處於一種感受態狀態，然後通過短暫的熱激過程使得外源質粒導入受體菌中。通常微生物中表達外源蛋白質會受到本身負反饋而限制表達蛋白質的量，因此在微生物細胞表達外源蛋白質時，通常要利用lacZ作為啟動子，並利用IPTG作為誘導劑，來提高蛋白質的表達量。
本發明還將經過分離提純的蛋白質作為添加劑添加入麵粉，用於改善麵粉的烘烤品質。分離提純蛋白質的方法在本領域有很多，有利用蛋白質等點電性質分離的pH梯度電泳等，有利用蛋白質分子量性質的分子篩、超粒性等，有利用親和性的親和層析等等。現有的常用表達載體通常已經在N端加入了用於親和純化的胺基酸序列，例如His-Tag，Z Tag等等，對於特定的表達載體，利用相對應的親和純化柱就可以方便的從菌液中大量提取外源表達蛋白質。
WesternBlot是一種利用抗原抗體免疫反應鑑定蛋白的方法，也是目前鑑定蛋白最常用的方法。這種技術把經電泳分離的各蛋白組分從凝膠轉移到一種固相支持體，通常是硝酸纖維膜。並利用針對特定胺基酸序列的特異性抗體作為探針檢測特定的蛋白。通常Western Blot，步驟包括轉膜，封閉，結合一抗，結合二抗，和最後的顯影定影。其中一抗是能特異與目的蛋白結合的探針，通常將目的蛋白作為抗原打八實驗動物如小鼠，兔子等，並利用免疫反應在實驗動物中產生相應的抗體。
具體實施方式實施例1、小麥籽粒質地編碼基因的克隆和測序按本發明的技術方案，選取含有小麥籽粒質地編碼基因的小麥(Triticum aestivum L.)材科，參照《分子克隆》(Sambrook and Russell，科學出版社，2002)，用CTAB法提取總DNA，然後採用PCR方法利用以下引物擴增出完整的編碼小麥籽粒質地的基因，引物序列為P15′-ATG AAG ACC TTA TTC CTC CTA GCT-3′P25′-TCA CCA GTA ATA GCC ACT AGG GAA-3′PCR反應體系為100ul，其中含有1×PCR緩衝液，dNTPs各0.2mM，引物各250ng，1個單位Ex-Taq酶(Takara Inc產品)。
PCR擴增條件為94℃變性4min，再94℃變性1min，65℃復性55s，72℃延伸1min，循環35次，最後72℃延伸10min。
PCR擴增條帶用瓊脂糖凝膠分離，回收並克隆到pGEM-T Vector(Promega Co.產品)載體上，利用限制性內切酶(HindIII+EcoRI)酶切確認所獲得的克隆後進行測序。序列分析由DNA自動序列分析儀(ABI Prism377，USA)測序儀完成，核酸序列為SEQIDNO.1，對應的蛋白質序列為SEQ IDNO.2。
將分析所得到的DNA序列輸入計算機，利用Primer5軟體包(Promie Primer5 Software，USA)進行分析。
實施例2、含有小麥籽粒質地編碼基因的表達載體的構建按本發明的技術方案，選取實施例1中含有編碼小麥籽粒質地完整基因的質粒載體，利用以下引物通過PCR擴增出加上酶切接頭的小麥籽粒質地的完整編碼基因，引物序列為
P35』-AAT GAA TTC ATG AAG ACC TTA TTC CTC CTA-3』P45』-ATA GTC GAC TCA CCA GTA ATA GCC ACT AGG-3』PCR反應體系為100uL，其中含有1×PCR緩衝液，dNTPs各0.2mM，引物各250ng，1個單位Ex-Taq酶(Takara Inc產品)。
PCR擴增條件為94℃變性4min，再94℃變性1min，65℃復性55s，72℃延伸1min，循環35次，最後72℃延伸7min。
PCR擴增條帶用1.5％瓊脂糖凝膠分離並回收。純化後的擴增條帶和pET32表達載體均用EcoRI+SaII雙酶切。酶切體系為50uL，其中含有1×buffer，各10單位內切酶和適量的質粒DNA。酶切條件為37℃過夜。
將酶切後的擴增條帶和pET32(Novagen Inc產品)表達載體均用1.5％瓊脂糖凝膠分離，回收，並用T4DNA連接酶16℃連接過夜。連接體系1uLpET31載體，7ul擴增條帶，1ul 10×連接緩衝液，和1ulT4DNA連接酶。
利用氯化鈣法將連接產物轉化入大腸桿菌中，構建重組質粒pGEb。挑取陽性克隆並利用EcoRI+sall雙酶切鑑定(參照附圖)，經鑑定，結果呈陽性，含有外源插入片段。
實施例3.含有小麥籽粒質地編碼基因表達載體的微生物獲得以及小麥籽粒質地編碼基因的表達按本發明的技術方案，將實施例2中獲得的含有小麥籽粒質地完整編碼基因表達pGEb通過氯化鈣法轉化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)(Novagen Inc)37℃LB培養液培養至OD值為0.8，加入誘導劑IPTG至終濃度0.5mM，37℃繼續培養5小時(陰性對照不加IPTG，其餘條件均相同)。
分別取1ml經IPTG誘導表達的菌液及陰性對照菌液，8000rpm離心2min，棄上清，用1mlPBS清洗兩次以除去雜質蛋白質。然後加入100uL提取緩衝液，室溫裂解2min後沸水浴3min。
分別取10ul經IPTG誘導表達的大腸桿菌蛋白質提取液及對照未經IPTG誘導表達的大腸桿菌蛋白質提取液，進行SDS-PAGE電泳，其分離膠濃度為8％，濃縮膠的濃度為3％。電泳條件為10mA，14小時，電泳完畢以後，將PAGE膠用含有0.5％的考馬斯亮藍，10％醋酸和45％甲醇的染色液染色5小時，然後用含有10％醋酸和35％甲醇的脫色液脫色過夜。蛋白質電泳顯示實施例2中獲得的含有小麥籽粒質地編碼基因的表達載體pGEb可以在大腸桿菌中表達小麥籽粒質地完整編碼基因。
實施例4、含有小麥籽粒質地編碼基因表達載體pGcb的微生物表達蛋白的Western Blot分析將實施例3中獲得的含有編碼小麥籽粒質地基因表達載體pGEb的大腸桿菌BL21(DE3)經IPTG誘導表達以後，按實施例3中的方法提取蛋白並按以下方法進行Western Blot分析。
首先對蛋白提取液進行SDS-PAGE電泳(8％)，然後用轉膜緩衝腋平衡凝膠，然後將凝膠與硝酸纖維膜按上轉移槽，180mA轉移1小時。轉膜以後用去離子水漂洗印跡膜，開用阻斷緩衝液阻斷非特異性結合點(1小時)。然後用TTBS漂洗印跡膜10分鐘，重複三次，加一抗結合1小時，再用TTBS漂洗印跡膜10分鐘，重複三次，加二抗結合1小付，再用TTBS漂洗印跡膜10分鐘，重複二次。隨後對印跡膜進行顯色，顯影和定影。
其中所用試劑為硝酸纖維膜PROTRAN.Nitrocellulose Transfer Membrane，Pore size 0.2um，購自Schleicher Schllell公司。
Towbin轉移緩衝液25mmol/L，Tris，192mmol/L，甘氨酸pH8.3，20％乙醇。
TBS20mmol/L Tris-Cl，50mmol/L，NaCl，PH7.5。
Tween-20 TBSTBS中含0.05％Tween-20。
阻斷緩衝液；TTBS中含5％脫脂幹奶粉。
一抗6His-Tag的抗體。使用時稀釋比例1∶1500二抗Goat anti-MouseIgG，F(ab)Fragment Speific，Peroxidase conjugate購自ImmuClub，使用時稀釋比例1∶800。
顯色液；Super Signal West Pico。
膠片Kodak 5』×3』X光片。
顯影液高反差顯影液。
定影液快速定影液。
WesternBlot分析顯示利用抗6His-Tag的抗體可以與實施例3中含有編碼小麥籽粒質地基因與6His Tag基因表達載體pGEb的大腸桿菌BL21(DE3)的表達蛋白進行免疫結合，因此證明實施例3中從含有編碼小麥籽粒質地編碼基因表達載體pGEb的人腸桿菌BL21(DE3)中表達的外源蛋白確實是要表達的小麥籽粒質地的蛋白質。
實施例5、利用表達載體pGEb表達的小麥籽粒質地相關蛋白質改良麵粉的品質。
將實施例3中獲得的含有編碼小麥籽粒質地基因表達載體pGEb的大腸桿菌BL21(DE3)經IPTG誘導表達後，用His-Tag親和柱層析提純。將提純後的小麥籽粒質地相關蛋白質按一定比例添加入現有麵粉中，一般加入量為麵粉重量的1％左右，並進行品質分析。品質分析結果表明，添加有小麥籽粒質地相關蛋白質的麵粉比原有麵粉的品質(如SDSS、麵粉團流變性質等)均有較大的改善。
DNA與胺基酸序列表SEQ ID NO.1(Gcb基因的核酸序列)1 ATGAAGACCT TATTCCTCCT AGCTCTCCTT GCTCTTGTAG CGAGCACAAC 5051 CTTCGCGCAA TACTCAGAAG TTGGCGGCTG GTACAATGAA GTTGGCGGAG 100101 GAGGTGGTTC TCAACAATGT CCGCAGGAGC GGCCGAAGCT AAGCTCTTGC 150151 AAGGATTACG TGATGGAGCG ATGTTTCACA ATGAAGGATT TTCCAGTCAC 200201 CTGGCCCACA AAATGGTGGG AGGGCGGCTG TGAGCATGAG GTTCGGGAGA 250251 AGTGCTGCAA GCAGCTGAGC CAGATAGCAC CACAATGTCG CTGTGATTCT 300301 ATCCGGCGAG TGATCCAAGG CAGGCTCGGT GGCTTCTTGG GCATTTGGCG 350351 AGGTGAGGTA TTCAAACAAC TTCAGAGGGC CCAGAGCCTC CCCTCAAAGT 400401 GCAACATGGG CGCCGACTGC AAGTTCCCTA GTGGCTATTA CTGGTGAATC 450SEQ ID NO.2(Gcb基因相應的蛋白質序列)1 MKTLF LLALL ALVAS TTFAQ YSEVG 2526 GWYNE VGGGG GSQQC PQERP KLSSC 5051 KDYVM ERCFT MKDFP VTWPT KWWEG 7576 GCEHE VREKC CKQLS QIAPQ CRCDS 100101 IRRVI QGRLG GFLGI WRGEV FKQLQ 125126 RAQSL PSKCN MGADC KFPSG YYWMK 150SEQ ID NO.3(primer 1)P15′-ATG AAG ACC TTA TTC CTC CTA GCT-3′SEQ ID NO.4(primer 2)P25′-TCA CCA GTA ATA GCC ACT AGG GAA-3′
權利要求
1.一種蛋白質，其特徵在於所述的蛋白質具有SEQ ID NO.1的胺基酸序列。
2.一種編碼權利要求
1所述的蛋白質的核酸，其特徵在於該核酸具有SEQ ID NO.1的序列或與SEQ IDNO.1中描述的胺基酸序列有至少95％同源性的功能上等價的胺基酸序列。
3.一種包含權利要求
2所述的核酸的表達載體，其特徵在於該載體是質粒、病毒、噬菌體、粘粒、或酵母。
4.根據權利要求
3所述的表達載體，其特徵在於該載體是質粒pET32或pYP。
5.一種表達權利要求
1所述蛋白質的微生物與真核生物，其特徵在於該微生物是大腸桿菌，真核生物是酵母。
6.根據權利要求
5所述的微生物與真核生物，其特徵在於該微生物與真核生物分別是大腸桿菌BL21(DE3)和酵母Y10及其變種或突變株。
7.根據權利要求
6所述的微生物與真核生物的表達載體。其特徵在於所述大腸桿菌和酵母轉化有權利要求
3或4的表達載體。
8.一種構建包含權利要求
2所述核酸的表達載體的方法，其特徵在於把權利要求
2的核酸克隆到載體。
9.一種生產權利要求
1所述蛋白質的方法，其特徵在於利用權利要求
5所述的微生物和酵母表達蛋白質，然後分離提純蛋白質。
10.一種提高麵粉加工品質的方法，其特徵在於利用權利要求
2所述核酸構建表達載體，表達蛋白質，分離提純後添加到麵粉中。
專利摘要
本發明公開了一種來源於小麥的籽粒質地基因的核酸序列全長和對應的蛋白質序列，以及該蛋白質在微生物中大量表達的方法。本發明所涉及的籽粒質地的編碼基因是一種與小麥加工品質密切相關的基因。目前，該基因被認為可以用於改良小麥的加工品質。根據該基因DNA的序列全長已構建相應的微生物表達載體，並利用它們能大量生產出該蛋白質，將其作為添加劑可以改善小麥的加工品質的、可安全食用的麵粉。另外，本發明公布的籽粒質地基因的胺基酸序列及其核酸序列將為該基因導入麥類、玉米、高粱及水稻等作物品種並改良其加工品質奠定了基礎。
文檔編號C12N15/81GK1990866SQ200510135333
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月30日
發明者潘照明 申請人:潘照明導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan