一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方法
2023-12-02 04:46:36 1
專利名稱：一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方法
技術領域：
本發明涉及生物學及輻射檢測領域，具體為一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期 過程驗證實驗方法。
背景技術：
在傳統意義上，輻射效應的原理是電離輻射的能量沉積在輻射靶(如DNA、蛋白 等)中，誘發輻射損傷，進而產生後續生物效應。但是近年來研究發現，輻射效應不局限於 直接受到輻射的細胞，未受輻射的旁區細胞(Bystander)細胞也表現出與受照射細胞相似 的生物效應，即輻射誘導的旁效應(Radiation inducedbystander effect，RIBE)。自1992年輻射旁效應發現以來的16年間，輻射旁效應主要採用離體細胞研究 體系。研究體系主要分為兩種，一是共培養體系，它是指未受照射細胞與受照射細胞共 同培養(有直接的物理接觸)來研究未受輻照細胞的生物學效應。該培養方法的特點 是受照射細胞和研究旁效應的細胞間能直接進行諸如間隙連接的信號交流(GJMC，Gap JunctionMediated cell-cell Communication)，因而可用於研究細胞間隙連接通訊介導 的輻射旁效應。共培養法可以通過部分輻射體外培養長滿的單層、多層、三維組織細胞群體 或者個體部分區域實現。另外一種體系是培養基轉移法則是指用受輻射細胞的培養基(條 件培養基，ICCM，Irradiated CellConditioned Medium)處理未受輻射的細胞(受體細胞) 來研究受體細胞在條件培養基作用下的生物學反應。這類方法的特點是受照射細胞與研究 輻射旁效應細胞間沒有直接接觸，因而用於研究細胞受照射後通過培養基釋放的可溶性因 子在誘導旁效應過程中的作用。培養基轉移法可以通過分散培養的單個細胞、內外環分別 培養的細胞或者人為轉移培養基的方法實現。離體細胞體系雖然具有很多優點，但是它不具備多細胞的三維形態和通訊聯繫， 不能反映真實的活體生命狀態，在機理研究和輻射效應評估上有很大的局限性。自2005年 以來，活體水平的長程輻射旁效應逐漸成為該領域的研究熱點。2006年，Kovalchuk小組 用X射線輻照小鼠的一部分組織，發現在距離受輻照區域Icm以外的組織也被誘導發生了 高於對照的DNA損傷。2007年，Kovalchuk小組使用X射線輻照小鼠的腦組織，在距離腦 16cm的未輻照的脾上檢測到DNA甲基化水平的改變。同時，本專利發明人所在的研究小組 也首次在植物活體水平上證實了輻射誘導長程旁效應的存在，2007年，本研究小組成員楊 根等利用模式植物擬南芥作為研究對象，通過應用單粒子微束定點定位照射種胚的莖尖分 生組織(SAM)檢測發現其遠端未受輻射的根尖分生組織(RAM)的發育分化受到了顯著的抑 制。隨後又利用低能離子束注入裝置輻照了擬南芥種子的外層細胞檢測發現未受直接輻照 的莖尖和根尖分生組織的發育分化受到了顯著抑制。輻射旁效應的早期過程是旁效應機理研究中的一個重要部分，涉及到輻射旁效應 損傷信號的產生、維持、傳輸、響應的時空效應關係，是輻射旁效應的基礎。在細胞培養體系 中，研究人員通過培養基轉移和輻射後共培養實驗研究輻射旁效應的早期過程；本研究小 組成員韓偉等通過培養基轉移實驗研究了輻射損傷因子的釋放特徵以及可能的釋放方式。在活體水平的研究雖然更能反映輻射旁效應的生物學本質，然而目前尚未見到活體長程輻 射旁效應早期過程的相關研究報導。輻射旁效應早期過程研究的關鍵是受輻照細胞和要檢 測的未輻照細胞在研究體系中人為的「分離」和「組合」。這種「分離」和「組合」在細胞培養 體系中是很容易實現的，培養基轉移和輻射後共培養實驗就分別體現了這種技術特點。但 是在活體水平，特別是對於目前作為研究主體的動物模型，就很難實現輻照部分和未輻照 部分的「分離」和「組合」，例如不可能把小鼠輻照後的頭部或者肺部去掉而保持身體存活。
發明內容
本發明的目的是提一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方法，以植 物作為對象，利用植物細胞的全能性，以解決輻射旁效應的研究中活體水平難以檢測其輻 射旁效應信號轉導和機制的問題。為了達到上述目的，本發明所採用的技術方案為一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方法，其特徵在於採用模式 植物擬南薺菜的轉基因係為材料，所述轉基因係為AtRAD54Promoter-GUS轉基因系，對擬 南薺菜進行電離輻射後，進行剪切和嫁接處理，提取嫁接至受輻射的擬南薺菜根尖的新的 擬南薺菜幼苗的AtRAD54基因，以所述AtRAD54基因表達水平作為檢測終點，包括以下步 驟(1)實驗材料培養將擬南芥菜幼苗消毒後點播在MS培養基上，在光照條件下豎 直培養，擬南芥菜幼苗的根部沿培養基表面向下豎直生長；(2)輻射處理採用物理輻射手段，對擬南芥菜幼苗的根尖部位進行局部電離輻 射；(3)剪切處理用手術刀片切掉擬南芥菜幼苗的根尖部位受輻照的部分，剩餘的 植株轉移到新的MS培養基上繼續生長；(4)嫁接處理將剪切處理後的擬南芥菜幼苗受輻照的根尖部位轉移到新的MS培 養基上，根尖向下豎直放置；選擇新的擬南芥菜幼苗，剪掉相同長度的根尖後，將根向下豎 直放直，並和受輻照的南芥菜幼苗根尖部分整齊對接，新的擬南芥菜幼苗剩餘的根能向下 緩慢生長，兩部分根在交界面緊密接觸；(5)地上部分植株輻射效應的檢測在剪切和嫁接處理完成24小時後，提取未受 輻照的，並且嫁接至受輻射的擬南芥菜幼苗根尖的新的擬南芥菜幼苗的地上組織器官的 AtRAD54基因，並同源重組修復相關基因AtRAD54基因啟動子驅動的⑶S報告基因作為表 達，通過⑶S報告基因判斷所述AtRAD54基因表達是否明顯上調，作為輻射生物效應的判定 標準。2、根據權利要求1所述的一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方 法，其特徵在於所述MS培養基中含有3%的糖。3、根據權利要求1所述的一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方 法，其特徵在於所述步驟(2)中，可採用化學誘變劑、環境脅迫和生物脅迫代替物理輻射 手段。4、根據權利要求1所述的一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方 法，其特徵在於所述步驟(2)採用低穿透能力的alpha粒子對擬南芥菜幼苗的根尖部位進行局部電離輻射。與動物不同，植物細胞具有全能性，割離一些器官和組織對其他部位的影響很小， 如切除葉子、部分根，甚至重要的分生組織都不會導致剩餘部分的死亡和過多的生長發育 改變，而且離體的組織器官也很容易培養存活。另外，「嫁接」也是植物的另一個特性，其它 個體的組織器官能通過「嫁接」在另一個體上正常的生長發育。因此，在植物活體水平很容 易實現不同組織器官的「分離」和「組合」，對於研究活體水平遠程輻射旁效應的早期過程和 損傷信號的傳輸途徑方面，植物是一個很好的模型。本發明是基於AtRAD54基因表達水平是植物環境壓力反應(物理化學誘變、環 境有害物等)的一個有效遺傳學檢測終點，借鑑離體細胞輻射旁效應培養基轉移研究 方法的思想，利用高等植物細胞全能性的特點，在植物個體水平實現了受輻照組織(器 官)與未受輻照組織(器官)的「分離」與「連接」，巧妙的解決了個體水平長程輻射 效應損傷信號轉導時空關係和機制研究的難題。具體是以模式植物擬南芥菜轉基因系 (AtRAD54Promoter-GUS)為材料，同源重組修復相關基因AtRAD54的表達水平作為遠程遺 傳效應檢測終點，使用低穿透能力的alpha粒子輻照擬南芥菜的根尖部位，然後人為將受 輻照的根尖部分和未輻照的地上部分(地上部分和根部可以為不同基因型或者突變體植 株)「分離」和「連接」，根據AtRAD54表達水平(⑶S活性)的改變研究植物個體水平遠程 輻射效應的信號轉導時空關係和機制。結果顯示該體系具有動物模型無法比擬的優點，為 今後植物個體水平遠程輻射旁效應早期過程和機制的研究提供了強有力的工具。本發明是以模式植物擬南芥菜轉基因系(AtRAD54pr0m0ter-GUS)為材料，同源重 組修復相關基因AtRAD54表達水平為檢測終點研究活體水平輻射遠程信號轉導時空特性 和機制的新體系。其原理是借鑑離體細胞旁效應研究中培養基轉移體系的思想，基於植物 細胞的全能性，利用植物各組織(器官)「分離」後可以正常存活，以及嫁接後可以恢復正常 個體生理狀態的特點，對擬南芥菜根進行輻照處理後和未輻照的地上部分進行各種「分離」 和「嫁接」操作，通過檢測地上部分AtRAD54基因表達水平的變化，研究遠程輻射損傷信號 的時空特性和機制。本發明的創新之處在於利用植物細胞全能的特性導致的可以切割和嫁接的特性， 克服了動物實驗中無法實現的受輻照組織(器官)和非輻照組織(器官)的「分離」與「連 接」的局限，發明了一種可以在個體水平研究遠程輻射信號早期過程的新的方法體系，取得 了以下有益成果1、通過剪切試驗證實輻照後8小時遠程輻射信號能夠從受輻照的部分(根部)傳 到未受輻照的遠程組織(地上部分)，並引起地上部分RAD54表達水平的上調。輻照後8小 時剪掉被輻照幼苗根部，24小時檢測地上部分AtRAD54基因表達水平，結果如圖2所示，處 理組(輻照後8小時剪掉根部)與陰性對照組(無任何處理)差異明顯(0. 638 Vs 0. 235 P 0. 05)，證實輻照後8小時以內產生的信號能夠誘導遠程旁效應的產生。2、通過嫁接實驗證實遠程輻射信號的產生是延遲的。分別在輻照後0小時和2小 時時將受輻照的根部切下，並為其嫁接上一個新鮮的小苗的地上部分，均在根部受輻照的 8小時後拿下嫁接上的根部(在圖3中分別以0-8h和2-8h表示)，24小時後檢測地上部 分AtRAD54基因表達水平。結果如圖3所示，兩個處理組(0_8h和2_8h)之間無顯著差異，(0. 77 VS 0. 76，P > 0. 05)，與陽性對照(輻照後無嫁接根部操作)無顯著差異(P值分別 為0. 58和0.46，均為P> 0.05)，而與陰性對照(無任何處理)差異極顯著(P值分別為 0. 00003和0. 00002，均為P < 0. 01)，說明這種遠程損傷信號在輻照後是延遲產生的，至少 輻射後2小時以內誘導產生的信號對這種遠程旁效應的產生是無關緊要的。
圖1為本發明剪切和嫁接過程示意圖，其中圖la為剪切過程示意圖，圖lb為嫁 接過程示意圖。圖2為受輻射後8小時剪切處理後的地上部分AtRAD54基因表達水平示意圖。圖3為受輻射後0和2小時嫁接處理後地上部分AtRAD54基因表達水平示意圖
具體實施例方式本發明包括以下步驟(1)實驗材料培養AtRAD54Pr0m0ter-GUS轉基因系的擬南芥菜小苗消毒後點播 在MS培養基(3%糖)上，在合適的光照強度和周期下豎直培養，小苗的根部沿培養基表面 向下豎直生長。(2)輻射處理電離輻射對擬南芥菜幼苗根尖部進行局部輻照。(3)剪切和嫁接處理，如圖1所示A)剪切處理在特定的時間點用手術刀片切掉根受輻照的部分，剩餘的植株轉移 到新的MS培養基上繼續生長。B)嫁接處理在輻照處理後特定的時間點，有手術刀片把受輻照的根部切下，轉 移到新的MS培養基上，根尖向下豎直放置。新的擬南芥菜小苗剪掉相同長度的根後，同樣 根向下豎直放直，並和受輻照的根尖部分整齊對接。新的幼苗剩餘根的能向下緩慢生長，導 致這兩部分根在交界面緊密接觸。(4)地上部分植株輻射效應的檢測同源重組修復相關基因AtRAD54基因啟動子 驅動的⑶S報告基因作為表達，通過⑶S報告基因判斷所述AtRAD54基因表達是否明顯上 調，以剪切和嫁接處理完成24小時後未輻照的地上組織(器官)中AtRAD54基因表達是否 明顯上調作為輻射生物效應的判定標準。
權利要求
一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方法，其特徵在於採用模式植物擬南薺菜的轉基因係為材料，所述轉基因係為AtRAD54Promoter-GUS轉基因系，對擬南薺菜進行電離輻射後，進行剪切和嫁接處理，提取嫁接至受輻射的擬南薺菜根尖的新的擬南薺菜幼苗的AtRAD54基因，以所述AtRAD54基因表達水平作為檢測終點，包括以下步驟(1)實驗材料培養將擬南芥菜幼苗消毒後點播在MS培養基上，在光照條件下豎直培養，擬南芥菜幼苗的根部沿培養基表面向下豎直生長；(2)輻射處理採用物理輻射手段，對擬南芥菜幼苗的根尖部位進行局部電離輻射；(3)剪切處理用手術刀片切掉擬南芥菜幼苗的根尖部位受輻照的部分，剩餘的植株轉移到新的MS培養基上繼續生長；(4)嫁接處理將剪切處理後的擬南芥菜幼苗受輻照的根尖部位轉移到新的MS培養基上，根尖向下豎直放置；選擇新的擬南芥菜幼苗，剪掉相同長度的根尖後，將根向下豎直放直，並和受輻照的南芥菜幼苗根尖部分整齊對接，新的擬南芥菜幼苗剩餘的根能向下緩慢生長，兩部分根在交界面緊密接觸；(5)地上部分植株輻射效應的檢測在剪切和嫁接處理完成24小時後，提取未受輻照的，並且嫁接至受輻射的擬南芥菜幼苗根尖的新的擬南芥菜幼苗的地上組織器官的AtRAD54基因，並同源重組修復相關基因AtRAD54基因啟動子驅動的GUS報告基因作為表達，通過GUS報告基因判斷所述AtRAD54基因表達是否明顯上調，作為輻射生物效應的判定標準。
2.根據權利要求1所述的一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方法，其 特徵在於所述MS培養基中含有3%的糖。
3.根據權利要求1所述的一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方法，其 特徵在於所述步驟(2)中，可採用化學誘變劑、環境脅迫和生物脅迫代替物理輻射手段。
4.根據權利要求1所述的一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方法，其 特徵在於所述步驟(2)採用低穿透能力的alpha粒子對擬南芥菜幼苗的根尖部位進行局 部電離輻射。
全文摘要
本發明公開了一種基於擬南薺菜的輻射旁效應早期過程驗證實驗方法，採用模式植物擬南薺菜為材料，對擬南薺菜進行電離輻射後，進行剪切和嫁接處理，提取嫁接至受輻射的擬南薺菜根尖的新的擬南薺菜幼苗的AtRAD54基因，以AtRAD54基因表達水平作為檢測終點。本發明的創新之處在於利用植物細胞全能的特性導致的可以切割和嫁接的特性，克服了動物實驗中無法實現的受輻照組織(器官)和非輻照組織(器官)的「分離」與「連接」的局限，發明了一種可以在個體水平研究遠程輻射信號早期過程的新的方法體系。
文檔編號C12Q1/68GK101805791SQ201010132810
公開日2010年8月18日 申請日期2010年3月22日 優先權日2010年3月22日
發明者卞坡, 吳躍進, 李方華, 王婷 申請人:中國科學院等離子體物理研究所