用於前列腺癌進展預後的檢測試劑及試劑盒的製作方法

2023-12-04 19:28:41 1

本發明屬於生物技術領域，具體來說涉及的是一種用於前列腺癌進展預後的檢測試劑以及相關試劑盒。

背景技術：

北美地區男性惡性腫瘤中，前列腺癌(pca)依舊是發病率最高的腫瘤，死亡率僅次於肺癌。而我國男性前列腺癌發病率呈明顯上升趨勢，在男性泌尿生殖系統位居第二位，僅次於膀胱腫瘤。臨床治療前列腺癌有激素、手術、放射等有效治療方法，但是，仍有許多前列腺癌患者最終都由於前列腺的進展(生化復發、腫瘤轉移)而死亡，因此臨床醫生迫切需要尋找更好的臨床進展預後標記物來篩出需要進一步幹預治療的患者，並依此制定出更合適的治療方案。

轉錄因子12(transcriptionfactor12，tcf12)是helix-loop-helix蛋白家族的一份子，其功能多樣化，能在多種組織中表達。能形成二聚體和異二聚體，影響細胞發生發展和分化。在膽管癌、乳腺癌、直腸癌中均有研究表明會影響腫瘤的惡性進展和不良預後，可作為腫瘤的進展及預後的預測因子之一。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種用於前列腺癌進展預後的檢測試劑，它能通過檢測tcf12在前列腺癌臨床樣本中的表達狀態而預測前列腺癌進展，可以區分臨床前列腺癌患者的不同疾病進展及預後。

本發明所述的用於前列腺癌進展預後的檢測試劑，按照每張臨床樣本組織切片的劑量，所述檢測試劑包括：內源性過氧化物酶阻斷劑50ul；動物非免疫血清50ul；一抗為兔源抗tcf12多克隆抗體1ul；生物素標記的二抗50ul；鏈黴菌抗生物素蛋白-過氧化物酶50ul；dab顯色試劑100ul；磷酸緩衝鹽溶液(pbs緩衝液)200ul。

本發明的另一目的在於提供前列腺癌進展預後的檢測試劑盒，可用於前列腺癌生化復發、腫瘤轉移等預後診斷。

本發明所述的用於前列腺癌進展預後的檢測試劑盒，包括本發明所述的檢測試劑。

本發明所述的用於前列腺癌進展預後的檢測試劑及試劑盒具有以下優點：第一次闡述tcf12的表達水平跟前列腺癌患者術後psa生化復發、腫瘤轉移和gleason(gs)評分存在關係，能為前列腺癌患者的疾病診治提供了可靠的方法，並且操作簡單、快速，無需其他特殊儀器，可應用於一般醫院實驗室或者病理室，有望成為前列腺癌疾病診斷的新技術。

具體實施方式

以下通過前列腺癌患者臨床晶片樣本進行tcf12的多克隆抗體染色試驗，並結合臨床樣本數據來進一步證明本發明對預測前列腺癌術後psa生化復發、腫瘤轉移和gleason評分(gs)的有利效果，證明本發明能有效預測前列腺癌患者的疾病進展。

實驗步驟：

1)將臨床組織從液氮中取出，將該組織裝入包埋盒中保存；

2)用自來水連續衝洗5小時；

3)放入leica自動脫水機中進行組織脫水；

4)進行石蠟包埋組織；

5)將包埋好的石蠟組織塊進行連續切片，厚度約為4μm；

6)將切好的片子在60℃的恆溫烤箱中放置約2個小時；

7)放入leica自動脫蠟機中進行組織切片脫蠟(包括二甲苯和梯度酒精脫蠟)；

8)蒸餾水衝洗一下，將切片置於枸櫞酸抗原修復液中(注意過程中液體量足夠以免微波爐加熱時燒乾)進行抗原修復，微波爐加熱3min，拿出來涼一下，再加熱1min，再拿出來室溫冷卻一下，再加熱1min，冷卻至室溫；

9)用阻水筆把切片組織圈住，用pbs浸泡；

10)每張切片加50ul過氧化酶阻斷溶液，以便滅活組織內源性過氧化物酶，室溫孵育15分鐘；

11)pbs衝洗或浸泡3×3min；

12)甩去pbs液，每張組織切片加50ul的非免疫性動物血清封閉非特異性結合，室溫下孵育10-15分鐘；

13)甩幹血清，每張切片加200ulpbs稀釋好的第一抗體(兔源抗tcf12多克隆抗體1ul：pbs緩衝液200ul)；

14)置於孵育盒內，4℃恆溫下過夜；

15)第二天將過夜的切片進行室溫下復溫約30min；

16)pbs衝洗或浸泡3×10min；

17)甩去pbs液，每張切片加50ul生物素標記第二抗體，室溫下孵育30min；

18)pbs衝洗或浸泡3×10min；

19)甩去pbs液，每張切片加50ul鏈黴菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育15min；

20)pbs衝洗或浸泡3×3min；

21)甩去pbs液，每張切片加100ul新鮮配製的二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,dab)顯色液，顯微鏡下觀察，看到黃染之後立即將切片浸入蒸餾水中中止染色；

22)將切片放入leica自動病理機上進行蘇木素復染及封片(乙醇、二甲苯)；

23)晾乾，放置leica光鏡下觀察；

24)免疫組織化學檢測結果判斷。

結果判定：leica螢光顯微鏡下，每張切片隨機選取五個高倍鏡視野觀察細胞，細胞漿和(或)細胞核出現棕黃或棕褐色顆粒為陽性細胞，根據陽性細胞染色強度以及陽性細胞在總細胞中所佔數量比例判定實驗結果。

先按染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；然後按陽性細胞率評分：腫瘤細胞內無陽性染色者為0分，陽性細胞率≤10％為1分，11％～50％為2分，51％～75％為3分，＞75％為4分。

針對tcf12評分採用定量的方法，即兩者評分相加作為最後的染色評分結果，範圍0～7分。

結果顯示，在50例接受前列腺癌根治術的患者的標本製成的組織晶片的tcf12免疫評分上，tcf12的蛋白主要在前列腺癌細胞的細胞漿和細胞核中著色，並且與患者的gs評分相關。結合前列腺癌資料庫(taylordataset)分析，前列腺癌組織標本的tcf12免疫評分低表達與患者高gs評分、腫瘤轉移和psa生化和不良生化復發生存期相關(所有p值均<0.05)。

將全部患者中tcf12免疫評分分數根據中位數平均分為兩組，分別設定為高表達組和低表達組，kaplan–meier和logrank方法分析結果顯示tcf12的低表達與患者總體無生化復發生存率有關(p＝0.004)。cox回歸模型單因素分析方法分析結果提示，tcf12低表達(p＝0.006)、gleason高評分(p<0.001)和腫瘤病理高分期(p＝0.0001)可作為預測因子評估前列腺癌患者術後無生化復發生存率；此外，cox回歸模型多因素分析結果顯示，tcf12低表達(p＝0.046)、gleason高評分(p<0.001)和腫瘤病理高分期(p＝0.012)同時也是患者術後無生化復發生存率的預測因子，其他指標在模型中均不能成為獨立的預後因子。

上述臨床驗證的結果進一步表明：該試劑和試劑盒可以顯示作為判斷前列腺癌進展及預後的分子標記物tcf12的表達水平。運用本發明提供的試劑盒，檢測人體前列腺組織tcf12的表達水平，根據其表達水平可以方便快捷地為臨床前列腺癌患者的腫瘤的惡性進展和預後程度判斷提供幫助，並對疾病治療選擇提供幫助。