苯扎氯銨溶液微生物限度檢查方法與流程

2023-12-06 10:31:01

本發明涉及酶或微生物的測定或檢驗方法，具體是一種苯扎氯銨溶液微生物限度檢查方法。

背景技術：

苯扎氯銨溶液為氯化二甲基苄基氫胺的混合物，無色或淡黃色的澄清液體，氣芳香，味極苦，振搖時能產生大量泡沫，用於手術前皮膚消毒，黏膜和傷口消毒。

苯扎氯銨為陽離子表面活性劑，廣譜殺菌劑，對革蘭氏陽性細菌作用較強，在製藥工程中作為防腐劑使用。由於苯扎氯銨原料抑菌作用大，在設計微生物限度檢查方法上存在極大的困難。

技術實現要素：

本發明就是為了解決苯扎氯銨原料抑菌作用大，微生物限度檢查困難的問題，所提出的一種苯扎氯銨溶液微生物限度檢查方法。

本發明是按照以下技術方案實現的。

一種苯扎氯銨溶液微生物限度檢查方法，包括以下步驟：

ⅰ.取苯扎氯銨溶液，加入稀釋液，製成1:10供試液；

ⅱ.用無菌吸頭吸取1份供試液，加入到50份稀釋液中，混勻；

ⅲ.先用少量衝洗液潤洗低吸附性濾膜，再採用薄膜過濾法將稀釋後供試液全量過濾，用衝洗液分次衝洗濾膜，每次的衝洗量為總衝洗量的1/16；

ⅳ.同法製備兩張濾膜，分別貼於兩種不同的培養基上，適宜條件培養後，點計菌落數；

ⅴ.陰性對照：採用薄膜過濾法將稀釋液進行過濾，菌面朝上貼於培養基上培養。

所述稀釋液和衝洗液的成分為蛋白腖乾粉和吐溫-80，二者的質量份數比為1:1。

所述稀釋液和衝洗液的製備方法為：稱蛋白腖乾粉5份、吐溫-805份，溶於1000份水中，調ph使滅菌後的ph值為7.1±0.2，115-121℃高壓滅菌15-30分鐘。

所述總衝洗量為800ml。

所述培養基為胰酪大豆腖瓊脂培養基和沙氏葡萄糖瓊脂培養基；胰酪大豆腖瓊脂培養基於30-35℃培養3天，沙氏葡萄糖瓊脂培養基於20-25℃培養5天。

所述陰性對照稀釋液過濾後，菌面朝上貼於胰酪大豆腖瓊脂培養基上，30-35℃培養3天。

本發明獲得了如下的有益效果。

本發明有效的解決了苯扎氯銨原料抑菌作用大，微生物限度檢查困難的問題。本發明通過前期大量計數方法適用性初篩試驗，確定了稀釋液、衝洗液以及稀釋液、衝洗液的量，且試驗結果以「cfu/ml」計算，提高了檢測結果的準確性。本發明的試驗方法科學，試驗結果準確，填補了苯扎氯銨原料微生物限度檢查方法的空白，具有廣闊的應用前景。

具體實施方式

一、試驗準備：

1．供試品：苯扎氯銨溶液（10%）

2.菌種：

金黃色葡萄球菌（cmcc（b）26003）

銅綠假單胞菌（cmcc（b）10104）

枯草芽孢桿菌（cmcc（b）63501）

白色念珠菌（cmcc（f）98001）

黑麴黴菌（cmcc（f）98003）

以上標準菌株均購自中國藥品生物製品檢定所或天津市藥品檢驗所。

3．培養基（詳見表1）

4．培養基、衝洗液、中和劑配製方法（詳見表2）

5．試驗儀器（詳見表3）

6.菌懸液的製備：

a.增菌：分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌於胰酪大豆腖瓊脂培養基平板上，30-35℃恆溫箱培養18-24小時；接種白色念珠菌、黑麴黴菌於沙氏葡萄糖瓊脂培養基中，20-25℃恆溫箱培養，白色念珠菌培養24-48小時，黑麴黴菌5-7天，用3-5ml含0.05%吐溫80的0.9%無菌nacl溶液將黑麴黴孢子洗脫，用管口帶有無菌脫脂棉的毛細管收集孢子懸液於無菌試管中保存，備用。

b.菌液稀釋：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑麴黴菌的新鮮培養物用0.9%無菌nacl溶液按10倍稀釋，製成試驗菌液；試驗菌液每毫升含菌量小於100cfu。

c.新製備的菌懸液在室溫條件下應在2小時內使用，2-8℃冷藏可保存24小時。

二、試驗方法的建立

《中國藥典》規定：供試品的微生物計數方法應進行方法適用性試驗，以確認所採用的方法適合於該產品的微生物計數。

方法適用性試驗需要證明稀釋液、衝洗液本身對試驗菌的生長無影響，並且能夠明顯降低抑菌成分，故需要考察稀釋液、衝洗液的毒性和效力。由於季銨鹽類的苯扎氯銨溶液對革蘭氏陽性菌的殺菌效果明顯，對革蘭氏陰性菌殺傷力較差，且不能殺滅細菌芽孢和真菌孢子，因此選擇金黃色葡萄球菌作為供試液對照組試驗菌株。

1.供試液製備

取苯扎氯銨溶液（10%）10ml，用含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白腖水溶液作為稀釋劑，製成1:10供試液。

2.試驗操作

2.1試驗組

取製備好的供試液10ml加入到500ml含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白腖水溶液中，混勻，加入小於100cfu的菌液。用含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白腖水溶液潤洗濾膜後，將加入菌液的供試液全量過濾，用800ml同一衝洗液分次衝洗，每次50ml/膜。每一試驗菌同法操作。

取下濾膜。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的膜分別貼於胰酪大豆腖瓊脂培養基上，胰酪大豆腖瓊脂培養基30-35℃培養3天；白色念珠菌、黑麴黴菌的膜各製備2份，分別貼於胰酪大豆腖瓊脂和沙氏葡萄糖瓊脂培養基上。胰酪大豆腖瓊脂培養基30-35℃培養5天，沙氏葡萄糖瓊脂培養基20-25℃培養5天（以下培養條件相同）。

2.2供試液對照組

以製備菌液用的稀釋液代替試驗菌液，同試驗組操作，製備兩膜，分別貼於胰酪腖大豆瓊脂培養基（tsa）和沙氏葡萄糖瓊脂培養基（sda）上，相應溫度培養，測定其本底菌數。

2.3菌液對照組

取10ml不含吐溫-80的0.5%蛋白腖水溶液代替供試液，加到500ml稀釋液中，加入小於100cfu試驗菌液，全量過濾，以測定所加菌懸液生菌數。每一試驗菌同法操作。

2.4中和劑組

取10ml含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白腖水溶液代替供試液，同試驗組操作，每一試驗菌同法操作，以確認其有效性和對微生物的無毒性。

3.方法適用性試驗結果（詳見表4）

4.結論

以上適用性試驗結果表明:各試驗組菌落數回收率（即（試驗組-供試品對照組）菌落數/菌液組菌落數）在0.5-2範圍內；中和劑對照組菌數回收率（中和劑對照組菌落數/菌液組菌落數）在0.5-2範圍內。所以該試驗方法可以用於該供試品的微生物限度檢查。

5.日常微生物限度檢查方法確立

取苯扎氯銨溶液（10%）10ml，加入含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白腖水溶液，製成1:10供試液。用無菌吸頭吸取10ml（相當於供試品1ml苯扎氯銨溶液），加入到500ml含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白腖水溶液中，混勻。先用少量含0.5%吐溫-80的0.5%蛋白腖水溶液衝洗液潤洗濾膜，再採用薄膜過濾法將供試液全量過濾，用800ml衝洗液分次衝洗，每次50ml。同法製備兩張濾膜，分別貼於胰酪大豆腖瓊脂培養基中和沙氏葡萄糖瓊脂培養基平皿上，胰酪大豆腖瓊脂皿30-35℃3天培養；沙氏葡萄糖瓊脂皿20-25℃5天培養，點計菌落數。

陰性對照：取稀釋液50ml，過濾，菌面朝上貼於胰酪大豆腖瓊脂培養皿上，30-35℃培養3天，不得有菌生長。