八氫吲嗪二醇生物鹼滷化物鹽及使用方法

2023-12-06 10:20:01

專利名稱：：八氫吲嗪二醇生物鹼滷化物鹽及使用方法
技術領域：
：本發明涉及八氫吲嗪二醇滷化物鹽及使用該鹽的方法。
背景技術：
：八氫吲嗪二醇(SW)是可從澳大利亞Swainsonacanescens(Colegate等澳大利亞化學雜誌，322257-2264，1979)、北美Astragalus屬和Oxytropis屬植物(MolyneuxRJ和JamesLF科學，215190-191，1981)和Rhizoctonialeguminicola蕈類(Schneider等，四面體，3929-31，1983)分離出的吲嗪烷(indolizidine)生物鹼。八氫吲嗪二醇具有令人感興趣的免疫調節和抑癌活性，這歸因於它抑制α-甘露糖苷酶II活性的能力。據信八氫吲嗪二醇起酶抑制劑的作用，因為能模擬吡喃甘露糖苷(mannopyranoside)水解斷裂時產生的糖基鎓(glycosylium)陽離子中間體(Goss，P.E.等，臨床癌症研究，1935-944，1995)。八氫吲嗪二醇對α-甘露糖苷酶II的封閉阻止了分支N-連接糖類的GlcNAcβ(1-6)的表達。在小鼠器官定居和自發性轉移試驗中均發現八氫吲嗪二醇處理的鼠腫瘤細胞轉移少(DennisJ.W.，癌研究，465131-5136，1986和Humphries等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA831752-1756，1986)。八氫吲嗪二醇還顯示能阻斷腫瘤細胞體外穿過細胞外基質的侵襲作用(Yegel等，國際癌症雜誌，44685-690，1989和Seftor等，黑素瘤研究，153-54，1991)。經口或經微滲透泵給予無胸腺裸鼠八氫吲嗪二醇，可抑制人MeWo黑素瘤和HT29m大腸癌腫瘤異體移植物在小鼠身上的生長速度(Dennis等，J.Natl.CancerInst.，811028-1033，1989和Dennis等，癌研究，501867-1872，1990)。加拿大已完成八氫吲嗪二醇在轉移癌患者上的I期臨床研究(Goss等，癌研究，541450，1995和Goss等，臨床癌研究，31077，1997)。八氫吲嗪二醇具有免疫刺激效應(綜述HumphriesM.J.和OldenK.，PharmacolTher.4485-105，1989和Olden等，PharmacolTher50285-290，1991)。特別是，已證明八氫吲嗪二醇能減輕化學藥物引起的和腫瘤伴隨的免疫抑制(Hino等，J.Antibiot.(Tokyo)38926-935，1985)，提高NK細胞(Humphries等，癌研究，481410-1415，1988)和LAK細胞的活性(YagitaM.和Sakselae.，Scand.J.Immunol.31275-282，1990)，提高脾和骨髓(BM)細胞的增殖(White等，Biochem.Biophys.Res.Commun.150615-625，1988；Bowlin等，癌研究，494109-4113，1989，及White等，CancerCommun.383-91，1991)。還證明八氫吲嗪二醇具有血液修復/化學保護效應。例如，已證明八氫吲嗪二醇對各種化學治療劑的致死性有保護作用(Oredipe等，1991，Natl.CancerInst.831149-1156，1991)。在這些研究中，八氫吲嗪二醇處理小鼠存活力的提高與刺激小鼠骨髓增殖、骨髓細胞構成和移植效應相關(Oredipe等，1991；White等，1991)。美國專利No.4,857,315描述了在抑制癌轉移和細胞增殖的藥物製劑中包含SW和SW活性類似物的藥物組合物，以及與幹擾素或幹擾素誘導劑聯合使用以增強幹擾素或幹擾素誘導劑的抗增殖和抗病毒效應。發明概述本發明涉及穩定的和實質純的合成八氫吲嗪二醇滷化物鹽。滷化物鹽可能很難以穩定的形式提純，以前沒有確定八氫吲嗪二醇鹽可形成結晶，該結晶能用於X射線衍射法確定結構。具體講，本發明者能獲得穩定的和實質純的八氫吲嗪二醇結晶氯化物和溴化物，並用X射線晶體學確定其結構。本發明的八氫吲嗪二醇鹽具有體外和體內抗癌活性。本發明確定的鹽與八氫吲嗪二醇游離鹼相比穩定性明顯增加，並具有比八氫吲嗪二醇溶解快和尋靶快的性能。因此，本發明的鹽提供了改進的藥物組合物。本發明的一個方面在於獲得確定的八氫吲嗪二醇滷化物鹽，特別是獲得八氫吲嗪二醇氯化物和溴化物鹽晶體其質量足以用X射線衍射法測定此化合物的三維結構。從而本發明提供了其質量足以高分辨地測定八氫吲嗪二醇氯化物和溴化物鹽的三維結構的晶體。因此，本發明提供穩定的晶狀八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽。本發明特別涉及一種穩定的晶狀八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物，包含在一個單元晶胞(unitcell)中通過氫鍵相互作用連在一起的八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽。在一個實施例中，晶狀氯化物和溴化物鹽包含在一個單元晶胞中的四個八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽分子。較佳的為晶狀氯化物和溴化物鹽包含八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或氫溴酸鹽分子。本發明的八氫吲嗪二醇氯化物和溴化物鹽，具體講晶狀八氫吲嗪二醇氯化物和溴化物鹽，可用來製備藥物組合物。因此，本發明提供一種製備藥物組合物的方法，包括將八氫吲嗪二醇氯化物和溴化物鹽(特別是結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或氫溴酸鹽)混合到選定的藥物載體、賦形劑或稀釋劑中，可任選地加入其它治療劑。本發明還考慮到一種組合物，具體講是一種藥物組合物，它包含本發明的八氫吲嗪二醇氯化物和溴化物鹽(特別是晶狀八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或氫溴酸鹽)。在本發明的一個實施例中，提供包含晶狀八氫吲嗪二醇鹽酸鹽和氫溴酸鹽的固體形式的藥物組合物(如片劑、膠囊、粉狀物)。體外和體內研究證明，本發明的鹽(特別是本發明的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽)具有免疫調節和抑制癌的性質和血恢復/化學保護性質。例如，將本發明的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽腹腔注射或加在飲水中口服進行治療，可減慢注入免疫活性小鼠中的SP1.A3a乳腺癌細胞的生長。TGF-β1和TNFα刺激SP1A3a細胞的體外生長，這些效應被本發明的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽所抑制。此外，用本發明的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽體外處理鼠骨髓細胞，刺激了紅細胞和粒細胞—巨噬細胞集落形成單位(分別為CFU-E和CFU-GM)的增殖。因此，本發明進一步涉及刺激免疫系統、刺激造血祖細胞生長、治療增殖性疾病或微生物或寄生蟲感染、或賦予受治療者保護作用抵禦化學治療和放射治療(副作用)的方法，包括給予有效量的本發明的八氫吲嗪二醇鹽。本發明還涉及本發明的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽在製備刺激免疫系統、刺激造血祖細胞生長、或賦予受治療者對化學治療和放射治療保護作用和/或治療增殖性疾病或微生物或寄生蟲感染的藥物上的應用。關於八氫吲嗪二醇氯化物和溴化物鹽的知識可用於模擬有關化合物，即八氫吲嗪二醇類似物和衍生物及其鹽的三級結構。而且，八氫吲嗪二醇氯化物和溴化物鹽結構的知識提供了研究這些化合物體內作用機制的手段。例如，可用各種計算機模型來預測化合物抑制α-甘露糖苷酶II活性的能力。八氫吲嗪二醇氯化物和溴化物鹽的原子坐標和原子詳情知識可用於設計、計算機估算、合成和使用八氫吲嗪二醇及其類似物和衍生物的調節劑，這樣可預防和處理八氫吲嗪二醇的不良物理和藥理性質。從而，本發明的另一個方面是提供一種物質，它是合理設計模擬八氫吲嗪二醇滷化物鹽作用的藥物的起始物質。這些藥物可用作有益於治療免疫和增殖型疾病或微生物或寄生蟲感染的治療劑。參見下面的詳細描述和附圖後，本發明的這些和其它方面將變得明了。此外，本說明書列出各種出版物的出處，它們全部引入本文作為參考。附圖的簡單描述現在就附圖對本發明進行描述，其中圖1顯示八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的分子結構；圖2顯示八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽的分子結構；圖3是八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的結晶填充圖；圖4是八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽的結晶填充圖；圖5是本發明的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的質譜；圖6是本發明的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的高效液相色譜；圖7顯示八氫吲嗪二醇鹽酸鹽對SP1.A3乳腺腫瘤細胞增殖的體外效應；圖8顯示八氫吲嗪二醇鹽酸鹽通過Alzet泵給藥抑制腫瘤生長；圖9顯示口服八氫吲嗪二醇鹽酸鹽抑制腫瘤生長；圖10A、10B和10C顯示DBA/2小鼠用PolyIC處理後八氫吲嗪二醇鹽酸鹽提高脾臟STAT1活性的印跡；圖11顯示八氫吲嗪二醇鹽酸鹽在不同細胞因子存在下對鼠骨髓CFU-GM的體外效應。發明的詳細描述本發明的八氫吲嗪二醇鹽本發明提供穩定的、實質純的八氫吲嗪二醇的滷化物鹽。「滷化物鹽」是氯化物、氟化物、溴化物、碘化物鹽，較佳為氯化物或溴化物鹽。該鹽的抗衡陽離子可以是鹼金屬(如Li、Na或K)，或較佳的為氫。本發明的一個實施例中提供八氫吲嗪二醇的鹽酸鹽，它比八氫吲嗪二醇游離鹼有較大的熱穩定性(如在約105℃暴露於大氣氧或氮中約7天，它比八氫吲嗪二醇游離鹼穩定)。在另一個實施例中，本發明提供結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽。結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽可包含一個單元晶胞中通過氫鍵相互作用連在一起的八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽分子。特別是，結晶形氯化物和溴化物鹽包含一個單元晶胞中四個八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽分子。較佳的為結晶形氯化物和溴化物鹽包含一個單元晶胞中四個八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或氫溴酸鹽分子。本發明的結晶形八氫吲嗪二醇氯化物鹽可通過一個八氫吲嗪二醇氯化物鹽分子的質子化氮和羥基氧原子與其它八氫吲嗪二醇氯化物鹽分子的氯離子的氫鍵相互作用連在一起。本發明的結晶形八氫吲嗪二醇溴化物鹽可通過第一個八氫吲嗪二醇溴化物鹽的羥基氧原子與其它八氫吲嗪二醇溴化物鹽分子的溴離子的氫鍵相互作用連在一起，及通過第一個八氫吲嗪二醇溴化物鹽的質子化氮原子與第二個八氫吲嗪二醇溴化物鹽分子的氧原子的氫鍵相互作用連在一起。本發明較佳為提供結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，它包括通過一個八氫吲嗪二醇鹽酸鹽分子的質子化氮和羥基氧原子與其它八氫吲嗪二醇鹽酸鹽分子的氯離子的氫鍵相互作用連在一起的一個單元晶胞中的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽分子。另外，本發明提供結晶形八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽，它包括通過第一個八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽分子的羥基氧原子與其它八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽分子的溴離子的氫鍵相互作用以及第一個分子的質子化氮原子與第二個八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽分子的氧原子的氫鍵相互作用連在一起的一個單元晶胞中的八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽分子。根據滷化物鹽分子、氫鍵相互作用和/或晶架群(spacegroup)的類型，結晶可取任何對稱結晶形狀。這種對稱形狀定義為「單元晶胞」(單胞)，它是基本平行六面體，在每個方向上重複，形成結晶晶格。術語「晶架群」指結晶的對稱元素的排列。在本發明的一個實施例中，結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或氫溴酸鹽具有對稱P212121晶架群。在本發明的優選實施例中，結晶形八氫吲嗪二醇氯化物鹽或溴化物鹽的結晶包含正交晶系單元晶胞。從X-射線結晶圖得到的衍射數據用來計算結晶重複單元的電子密度圖。電子密度圖用來確定結晶的單元晶胞中各原子的位置。單元晶胞軸長用(abc)表示，其中a＝x軸，b＝y軸，c＝z軸。另外，(xyz)代表每個原子以坐標軸a、b或c上距離原點的距離而定的坐標。本領域技術人員都知道，X-射線結晶圖確定的一系列原子坐標不會在標準誤差之外。本發明的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽結晶的單元晶胞可具有如下單元晶胞長度a＝8.09±0.01埃，b＝9.39±0.01埃，c＝13.62±0.01埃。本發明的八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽結晶的單元晶胞可具有如下單元晶胞長度a＝8.40±0.01埃，b＝8.69±0.01埃，c＝14.12±0.01埃。在本發明的一個優選實施例中，八氫吲嗪二醇鹽酸鹽結晶的原子具有表1所示原子坐標。在本發明的另一個優選實施例中，八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽結晶的原子具有表2所示原子坐標。用x、y和z坐標表示的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽和氫溴酸鹽的三維結構分別如圖1和2所示。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽和氫溴酸鹽的結晶填充圖分別如圖3和4所示。本發明的八氫吲嗪二醇鹽的製備用酸處理八氫吲嗪二醇丙酮化合物並用結晶法提純該鹽可製備本發明的結晶形鹽。八氫吲嗪二醇丙酮化合物可如Bebbett等和Cha等(分別見J.Am.Chem.Cos.1112580-2582，1989和美國專利No.5,187,279)所述製得。該丙酮化合物可水解生成實質純的本發明的結晶形鹽。例如，可通過實施例1中所描述的將八氫吲嗪二醇丙酮化合物水解生成實質純的結晶形鹽酸鹽。在製備本發明的化合物中，可使用常規的保護基封閉活性基團。合適的封閉和去封閉流程是熟練技術人員所知道的(見T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第二版，有機合成中的保護基，JohnWileySons，紐約，1991)。一般來說，選擇特別的保護基，它們能在相繼的合成步驟中充分地保護所討論的活性基團，並在不引起所需產物降解的條件下易於除去。一些保護基在體內被裂解或經代謝而轉化成活性官能團(如經水解或氧化)。有些情況下，優選可經代謝而被裂解的保護基。可用的保護基的例子包括羥基保護基、羧基保護基和羰基保護基。可用的代表性的羥基保護基包括如下基團甲基醚包括甲氧基甲基、甲硫基甲基、叔丁基硫代甲基、(苯基二甲基二基)(phenyldimethyldiyl)甲氧基甲基、苄氧基甲基、對甲氧基苄氧基甲基、(4-甲氧基苯氧基)甲基、愈創木酚甲基、叔丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基、甲矽烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2，2，2-三氯乙氧基甲基、雙(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲矽烷基)乙氧基甲基、四氫吡喃-2-基、3-溴四氫吡喃-2-基、1-甲氧基環己基、4-甲氧基-四氫吡喃-2-基、4-甲氧基四氫噻喃-2-基、4-甲氧基四氫噻喃-2-基-S，S-二氧化物、1-〔(2-氯-4-甲基)苯基〕-4-甲氧基哌啶-4-基、1，4-二噁烷-2-基、四氫呋喃基、四氫噻吩基和2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氫-7，8，8-三甲基-4，7-亞甲基苯並呋喃-2-基。乙基醚包括1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基；2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲矽烷基乙基、2-(苯基氧硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、對氯苯基、對甲氧基苯基和2，4-二硝基苯基。苄基醚包括苄基、對甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、鄰硝基苄基、對硝基苄基、p-滷代苄基、2，6-二氯苄基、p-氰基苄基、對苯基苄基、2-和4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基-N-氧化物、二苯基甲基、p，p』-二硝基二苯甲基、5-二苯並環庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、p-甲氧基苯基二苯基甲基、二(p-甲氧基苯基)苯基甲基、三(p-甲氧基苯基)甲基、4-(4』-溴-苯甲醯甲氧基)苯基二苯基甲基、4，4』，4″-三(4，5-二氯苯二醯亞氨基苯基)甲基、4，4』，4″-三(乙醯丙醯氧基苯基)甲基、4，4』，4″-三(苯甲醯氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基甲基)雙(4』，4″-二甲氧基苯基)甲基、1，1-雙(4-甲氧基苯基)-1』-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫噸基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1，3-苯並二硫戊環-2-基和S，S-二氧化苯並異噻唑基。甲矽烷基醚包括三甲基甲矽烷基、三乙基甲矽烷基、三異丙基甲矽烷基、二甲基異丙基甲矽烷基、二乙基異丙基甲矽烷基、二甲基thexyl甲矽烷基、叔丁基二甲基甲矽烷基、叔丁基二苯基甲矽烷基、三苄基甲矽烷基、三-p-二甲苯基甲矽烷基、三苯基甲矽烷基、二苯基甲基甲矽烷基和叔丁基甲氧基苯基甲矽烷基。酯包括甲酸酯、苯甲醯基甲酸酯、乙酸酯、氯代乙酸酯、三氯乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、p-氯苯氧基乙酸酯、p-(磷酸酯)苯基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙醯丙酸酯)、4，4-(亞乙基二硫代)戊酸酯、新戊酸酯、金剛烷酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、對苯基苯甲酸酯和2，4，6-三甲基苯甲酸酯。碳酸酯包括甲基碳酸酯、9-芴基-甲基碳酸酯、乙基碳酸酯、2，2，2-三氯乙基碳酸酯、2-(三甲基甲矽烷基)乙基碳酸酯、2-(苯基-磺醯基)乙基碳酸酯、2-(三苯基膦鎓基)乙基碳酸酯、異丁基碳酸酯、乙烯基碳酸酯、烯丙基碳酸酯、對硝基苯基碳酸酯、苄基碳酸酯、對甲氧基苄基碳酸酯、3，4-二甲氧基苄基碳酸酯、鄰硝基苄基碳酸酯、對硝基苄基碳酸酯、S-苄基硫代碳酸酯、4-乙氧基-1-萘基碳酸酯和甲基二硫代碳酸酯。有輔助裂解的保護基包括2-碘代苯甲酸酯、4-疊氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、O-(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲醯基苯磺酸酯、2-(甲基硫代甲氧基)乙基碳酸酯、4-(甲基硫代甲氧基)-丁酸酯和2-(甲基硫代甲氧基甲基)苯甲酸酯。其它各種酯包括2，6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2，6-二氯-4-(1，1，3，3-四甲基-丁基)苯氧基乙酸酯、2，4-雙(1，1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯代二苯基乙酸酯、異丁酸酯、琥珀酸單酯、(E)-2-丁烯酸酯(惕各酸酯)、O-(甲氧基羰基)苯甲酸酯、對苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、烷基N，N，N』，N』-四甲基偶磷醯胺化物、N-苯基氨基甲酸酯、硼酸酯、二甲基膦基硫基(dimethylphosphinothioyl)和2，4-二硝基苯基次磺酸酯。磺酸酯包括甲磺酸酯、苯磺酸酯和甲苯磺酸酯。環醛縮醇和酮縮醇包括亞甲基、亞乙基、1-叔丁基亞乙基、1-苯基亞乙基、4-(甲氧基苯基)亞乙基、2，2，2-三氯亞乙基、丙酮化合物(亞異丙基)、亞環戊基、亞環己基、亞環庚基、亞苄基、對甲氧基亞苄基、2，4-二甲氧基亞苄基、3，4-二甲氧基亞苄基和2-、3-或4-硝基亞苄基。環原酸酯包括甲氧基亞甲基、乙氧基亞乙基、二甲氧基亞甲基、1-甲氧基亞乙基、1-乙氧基亞乙基、1，2-二甲氧基亞乙基、α-甲氧基亞苄基、1-(N，N-二甲基氨基)亞乙基衍生物，α-(N，N-二甲基氨基)亞苄基衍生物和2-氧雜亞環戊基。這些環原酸酯，象上面描述的用於鄰近成對取代基的二價有機基團的，可與非鄰近羥基反應。例如，可選擇前段中描述的二價有機基團或所述鄰近成對取代基作為同一個分子上的兩個非鄰近取代基或兩個分開的分子上的任何兩個取代基。這兩個分開的分子可以是相同或不同的，選自本說明書中所揭示的化合物。甲矽烷基衍生物包括二叔丁基亞甲矽烷基、1，3-(1，1，3，3-四異丙基亞二甲矽醚基)衍生物、四叔丁氧基二甲矽醚-1，3-亞二基衍生物、環碳酸酯、環硼酸酯、有機硼酸酯和苯基硼酸酯。兒茶酚的較佳保護基包括環狀醛縮醇和酮縮醇，如亞甲基、丙酮化合物、亞環己基和二苯基亞甲基；環酯，如環硼酸酯和環碳酸酯。本發明還包括除了用一個或多個常規保護基(如本說明書中所述的羥基保護基、羧基保護基和羰基保護基)之外與本發明的八氫吲嗪二醇鹽相同的化合物。本發明進一步包括未在上面一一列出的其它C1-10羥基保護基，它們是藥學上可接受的，並任意地可被代謝(如被裂解或被修飾)，形成本說明書中所公開的化合物之一。換言之，本發明包括具有抗癌、抗病毒或抗增殖活性的所公開的化合物的代謝前體和所公開的化合物的代謝產物。本發明還進一步包括所公開的化合物的季銨鹽和其它有機鹽，包括苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽，較佳的為甲酸鹽和乙酸鹽，或其它羧基、氨基羧基或多元羧酸鹽。本發明的結晶還可通過將八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或氫溴酸鹽溶於一種溶劑(如甲醇)、蒸發溶劑來形成。還可用標準方法擴散製得結晶。還將認識到，八氫吲嗪二醇功能衍生物的結晶形氯化物或溴化物鹽(特別是鹽酸鹽或氫溴酸鹽)可用本文所述方法進行製備，本發明研究了用這些方法製得的鹽。「八氫吲嗪二醇的功能衍生物」指具有基本上與八氫吲嗪二醇的生物活性類似的生物活性(既是功能上又是結構上)的化合物。術語「功能衍生物」意在包括「八氫吲嗪二醇」的「變體」、「類似物」或「化學衍生物」。術語「變體」是指結構和功能與八氫吲嗪二醇相似或與其一部分相似的分子。如果分子既具有基本類似的結構又具有相似的生理活性，則此分子就是與八氫吲嗪二醇「基本相似的」。術語「類似物」指功能與八氫吲嗪二醇基本相似的分子。術語「化學衍生物」描述含有通常不是鹼分子一部分的外加化學基團的分子。本發明的組合物本發明提供由本發明的八氫吲嗪二醇鹽(如八氫吲嗪二醇的氯化物或溴化物鹽，較佳為晶狀鹽酸鹽或氫溴酸鹽，最佳為正交晶系鹽酸鹽)配製的藥物組合物，本發明的八氫吲嗪二醇鹽的組合，或本發明的八氫吲嗪二醇與八氫吲嗪二醇鹽的組合。該組合物包括本發明的八氫吲嗪二醇鹽，或包括從所公開的鹽製得的八氫吲嗪二醇的一種劑型，如本領域公知的片劑、包括軟凝膠膠囊的膠囊劑、或滷化物鹽粉狀劑型或其它非腸道的、經皮的、鼻內或口服劑型。本發明的較佳組合物是固體劑型組合物，其中活性成分(如本發明的鹽)是結晶形的。例如，組合物可以是片劑、膠囊劑或粉劑。穩定性提高的本發明的一種特別好的固體劑型組合物包含本發明的晶狀鹽酸鹽。本發明的晶狀鹽使藥物組合物中能使用實質純活性成分。術語「實質純」包括純度為至少85重量％，較佳為至少97重量％(如至少99重量％至99.5重量％)。雜質包括合成或降解的副產物。實質純晶狀八氫吲嗪二醇鹽酸鹽最終是無色的，可以是稜晶形。本發明的組合物包含一種或多種藥物載體，任選地可包含一種或多種生物活性劑。例如，由本發明的八氫吲嗪二醇鹽配製的組合物可包括(a)包含本發明的八氫吲嗪二醇、藥物載體、還可包含吸收促進劑的片劑；(b)包含由本發明的八氫吲嗪二醇鹽製成的結晶形、無定形或玻璃態粉末、微球或藥丸的膠囊劑，即使在膠囊中八氫吲嗪二醇鹽並再是清晰的晶體(如稜晶)；(c)由本發明的八氫吲嗪二醇製成的軟凝膠膠囊；(d)本發明的八氫吲嗪二醇鹽的水溶液，其中溶解的八氫吲嗪二醇鹽不再是清晰的晶體，例如可能不再與氫或氯或溴締合，(e)本領域技術人員知道的其它非腸道、經皮、鼻內或口服劑型。從本發明的鹽衍生的八氫吲嗪二醇游離鹼在本發明的某些處理方法中也是有用的。但是，不考慮純八氫吲嗪二醇游離鹼本身用於本發明的組合物。給藥途徑包括口服、肺內、局部、體腔(如鼻、眼、口腔)、經皮和非腸道(如靜脈內、肌肉內和皮下)途徑。外部激活的給藥系統包括被熱、超聲、電脈衝、離子電滲法、電泳、磁調製和光激活的那些系統。製劑包括固體(片劑、軟或硬明膠膠囊)、半固體(凝膠、乳膏)或液體(溶液、膠體或乳劑)，較佳為固體。膠態載體系統包括微囊、乳劑、微球、多層囊泡、毫微囊、單層囊泡、毫微顆粒、微乳劑和低密度脂蛋白。非腸道給藥製劑系統包括脂類乳劑、脂質體、混合膠束系統、生物可降解性纖維和纖維蛋白凝膠，以及植入法用的生物可降解性聚合物。用於肺部給藥的製劑系統包括計量的劑量吸入劑、粉末吸入劑、吸入用溶液和脂質體。組合物可配製成緩釋(多劑量崩解顆粒或珠、單劑量非崩解系統)、控釋(口服滲透泵)和生物粘合劑或脂質體。控釋製劑包括間歇釋放製劑和持續釋放製劑。藥物載體包括無機物，如磷酸鈣和二氧化鈦；糖類，如乳糖一水合物和環糊精；表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉和聚羥亞烴(poloxamers)；聚合物，如澱粉、乙基纖維素、水凝膠和聚丙烯酸；脂類，如聚交酯、硬脂酸、甘油酯和磷脂；或胺基酸和肽，如亮氨酸和低密度脂蛋白。進行組合物配製以達到在生理pH下保持活性。可在pH4-7的範圍內對組合物進行配製。本發明的一個實施例中，提供口服劑型的組合物，包含本發明的八氫吲嗪二醇(較佳為結晶形鹽酸鹽或氫溴酸鹽)和非吸溼性、惰性、較佳為無水賦形劑(如乳糖或甘露糖醇)。另一個實施例中，提供軟明膠膠囊組合物，包含八氫吲嗪二醇(較佳為結晶形鹽酸鹽或氫溴酸鹽)和至少一種親水性載體(如甘油或丙二醇)和至少一種親脂性載體(如PEG400)。組合物還可包括吸收促進劑、顆粒包衣(如腸溶包衣)、潤滑劑、尋靶劑和本領域技術人員公知的其它任何物質。組合物可包含重量0.1％至90％(如約0.1-20％或約0.5-10％)的活性成分。每種藥物組合物中活性成分的百分率和用於實施本發明以治療所述疾病的活性成分的有效量取決於給藥方式、受治療者的年齡和體重和受治療者的病情，最終由主治醫師或獸醫決定。由主治醫師或獸醫確定的化合物的這種劑量在本說明書中稱作「有效量」。根據Goss等(1994年和1996年)用八氫吲嗪二醇游離鹼的研究，劑量低於300微克/公斤/天(較佳為150微克/公斤/天或更少，最佳為75微克/公斤/每天二次或更少)會被人很好地耐受。本發明的鹽作為治療劑，可單獨使用或與其它治療劑或其它治療方式(如化療或放射治療)聯合使用。例如，可將本發明的化合物與抗增殖劑、抗微生物劑、免疫刺激劑或抗炎劑聯合使用。特別是，本發明的化合物可與抗病毒和/或抗增殖劑(如Th1類細胞因子)合用，增強後者的活性。Th1類細胞因子包括白介素-2和12(IL-2、IL-12)和α、β、γ-幹擾素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)及其誘導物。本發明的化合物可與聚(I.C.)、聚(I.C.)-LC、腫瘤壞死因子(TNF)或轉化生長因子(TGF)合用。本發明的化合物可與化學治療劑(包括阿黴素、5-氟尿嘧啶、環磷醯胺和甲氨喋呤)、預防和治療外周神經病的異煙肼、預防和治療胃十二指腸潰瘍的NSAID合用。本發明的化合物可與其它治療劑或治療方法同時、分別或相繼使用。可給予本發明的組合物的對象包括動物，包括哺乳動物，特別是人。動物還包括食用或作為寵物而飼養的家養動物，包括馬、牛、羊、家禽、魚、豬、貓、狗，以及動物園動物。用常規方法可將本發明的八氫吲嗪二醇鹽轉變為藥物組合物。例如，如本說明書所述，可將本發明的結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或氫溴酸鹽混合入選擇的可接受的藥用載體、賦形劑或稀釋劑中。甘露糖苷酶抑制劑本發明的化合物，特別是由本發明的化合物製成的結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽和氫溴酸鹽，抑制高爾基體甘露糖苷酶II。本發明的化合物對甘露糖苷酶的總抑制作用可通過直接測定JackBean，高爾基體，或溶酶體α-甘露糖苷酶的抑制加以確定(見實施例18方案)。甘露糖苷酶抑制也可L-PHA毒性試驗加以測試。該試驗基於如下發現毒性植物凝聚素L-PHA與轉化的細胞株如MDAY-D2腫瘤細胞的特異性結合是抑制寡糖加工的一種特異測定。L-PHA毒性試驗中IC50的測定反映了化合物進入細胞和抑制寡糖加工的能力。這是對衡量細胞進入、靶酶抑制和所得細胞表型的細胞活性的總體篩檢。L-PHA試驗一般涉及在L-PHA和化合物存在下生長的轉化細胞；測定細胞存活力和/或細胞增殖量；及通過將細胞增殖量和/或細胞存活力與只存在P-PHA時對細胞生長觀察到的增殖量進行比較，來確定化合物抑制N-連接寡糖加工的能力。可用於本試驗的轉化細胞包括MDAY-D2、L1210、CHO、B16、黑素瘤腫瘤細胞和諸如SW480、LS174T、HT-29、WiDr、T2、MDA-231、MCF7、BT-20、Hs578T、K562、SK-BR-3、CY6T、MDA-468、H23、H157、H358、H1334、H1155、H28、H460、Hmesol、H187、H510A、N417、H146、H1092、H82等人類腫瘤細胞(RestifoNP等JExpMed177265-272.1993)。細胞增殖量可用常規方法加以測定。例如，通過測定標記胸苷的摻入可測得細胞增殖量。更具體地講，可加入放射標記胸苷約2-5小時，較佳為3-4小時，收集細胞，用閃爍計數儀計數放射活性。可用基於鹼性磷酸酶活性測定的全自動酶學方法篩選對甘露糖苷酶II的抑制。該方法基於這樣的觀察存活細胞數量和它們的鹼性磷酸酶活性密切相關。該方法採用比色法監測L-PHA處理後轉化細胞的細胞增殖。將反應混合物直接加到在培養基中生長的細胞中，無需細胞沉澱和洗滌步驟。因此，該方法可一步進行，不必除去培養基或進行細胞沉澱和洗滌，從而可用全自動程序。在一個寬的時間段(5-180分鐘)內，反應與時間呈線性關係，該酶對底物對硝基苯磷酸鹽的Km值相當低(0.81mM)。培育時間和底物濃度可以改變，以便調節反應速度及為了自動化和定時的目的而使試驗方案適合於樣本數。使用機器人平臺還可同時處理大量樣本，如36個96孔板。代表性的自動化方法包括(a)在L-PHA存在下，將本發明的化合物與轉化細胞反應，並測定鹼性磷酸酶活性；和(b)與不存在此化合物的對照相比較，其中鹼性磷酸酶活性的提高表示該化合物具有抑制N-連接的寡糖加工的能力。本發明的方法中可使用的轉化細胞包括本說明書中描述的細胞系或包含組成酶或誘導酶活性的細胞系，如成骨細胞細胞系。可將鹼性磷酸酶表達結構導入這些細胞，以擴增信號。通過測定鹼性磷酸酶活性可測定細胞增殖量。鹼性磷酸酶可用常規方法加以測定，例如用對硝基苯磷酸鹽作為底物，於405nm測定吸光度。實施本方法的條件可在考慮所用化合物和細胞性質的基礎上加以選擇。例如，若轉化細胞為MDAY-D2腫瘤細胞，可使用1-6×103個細胞的濃度，較佳為5×103個細胞。MDAY-D2細胞通常培育約10-30小時，較佳為16-20小時，接著加入濃度為5-150μg/ml(較佳為100μg/ml)的L-PHA。鹼性磷酸酶試驗混合物可包含緩衝液，如二乙醇胺緩衝液，對硝基苯磷酸鹽的濃度約為1.5-4mM，較佳為2-3mM，最佳為2.5mM。一般可用本發明的自動化方法鑑定拮抗細胞增殖抑制劑的化合物。例如，可用此方法鑑定細胞生長製劑如TGFβ或細胞凋亡劑如TNFα的拮抗劑。因此，本發明廣泛地研究這種方法，包括(a)在細胞生長抑制劑的存在下使受試化合物與轉化細胞反應；(b)測定鹼性磷酸酶的活性；和(c)與無受試化合物的對照組進行比較，其中鹼性磷酸酶活性的提高表示該化合物具有拮抗細胞生長抑制劑的能力。本發明的八氫吲嗪二醇鹽的性質本發明的鹽具有有價值的藥理性質，它們提供抗微生物、抑癌效應、恢復血象、化學保護、放射保護和免疫調節性質，特別是可刺激細胞免疫應答的Th1分枝。這些性質在下面作更詳細的討論。抑癌性質糖加工酶高爾基體α-甘露糖苷酶II的阻斷阻止了N-連接寡糖成熟為「複合型」結構(Elbein，A.D.Ann，Rev.Biochem.56497-534，1987)。已知此結構對腫瘤細胞生長和轉移速率很重要(DennuisJ.W.科學236582-585.1987)在動物和腫瘤模型中，用高爾基體甘露糖苷酶II抑制劑處理證明可抑制腫瘤生長和轉移的速率(Dennis，癌研究465131-5136，1986；Dennis，J.W.癌研究501867-1872，1990；Newton，S.A.，J.Natl.CancerInst.811024-1028，1989)。高爾基體甘露糖苷酶II抑制劑(如八氫吲嗪二醇)在各種類型腫瘤中都具有抑癌性質，包括對腫瘤細胞的直接抗轉移和抗侵襲作用和其它抗癌活性，如本說明書所述的免疫刺激效應、骨髓增殖和血液復原活性。免疫刺激性能阻斷高爾基體α-甘露糖苷酶II途徑引起了具有末端甘露糖殘基的「雜交型」糖結構的累積。暴露的甘露糖殘基是與免疫刺激直接有關的重要特徵(Sherblom，A.P.等；J.Immunol.143939-944，1989；Yagita，M.和SakselaScand.J.Immunol.31275-282，1990)。它在分子水平證明，包括幹擾素(IFN)、白介素(IL-2)和腫瘤壞死因子(TNF-α)在內的細胞因子與末端為甘露糖結構(如當高爾基體甘露糖苷酶II被阻斷時積累)的糖結合。這些糖結構發現於細胞表面，被認為能促進細胞因子結合於細胞表面糖蛋白和受體或輔助受體，這些糖蛋白和受體是將細胞因子作用轉化為細胞免疫應答所需要的。受病毒、細菌或真菌病原體感染後，宿主免疫應答涉及炎症和免疫系統的細胞和體液成分。CD4+T細胞受刺激後分化成與細胞免疫有關的Th1表型或與抗體產生有關的Th2表型的輔助T細胞(Shindler，生物化學年鑑，64621-651，1995)。Th1細胞的特徵是產生細胞因子INF-α、TNFα、IL-2、IL-12；而Th2細胞產生細胞因子IL-4和IL-10。Th1細胞因子還促進Th1反應而抑制Th2反應，相反，Th2細胞因子促進Th2反應而抑制Th1反應。Th1和Th2反應之間的平衡是感染性疾病及自身免疫和變態反應的主要決定因素。抑制小鼠和細胞培養物高爾基體α-甘露糖苷酶已證明能促進Th1依賴性細胞介導的免疫應答。這包括自然殺傷細胞(NK)和淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞的激活以及抗原和IL-2對T細胞的激活(Wall，K.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855644-5648，1988)。Golgiα-甘露糖苷酶的抑制也增強了巨噬細胞的組織壞死因子(TNFα)依賴性激活(Muchmore等，Cancerres.506285-6290，1990)和體外LAK細胞的IL-2依賴性激活(Yagita等，Scand.J.Immunol.31275-282，1990)。而且，Golgiα-甘露糖苷酶的抑制促進了對α-IFN的反應，包括抗腫瘤和抗增殖反應，及誘導2』-5』寡腺苷酸合成酶和TIMP(金屬蛋白酶組織抑制劑)基因表達(Dennis，JNCI811028-1033，1989；Korczak等，Int.J.Cancer53634-639.1993)。細胞因子結合於細胞表面受體，並通過轉錄因子轉錄(STAT)家族的信號傳遞蛋白和激活蛋白的磷酸化和二聚化，將信號傳遞到細胞核。STAT1是對α-IFN的抗病毒反應、Th1免疫反應和相關細胞因子的產生、及小鼠體內肝炎病毒清除所需要的(Durbin等，Cell84443-450，1996)。其證據由無效突變STAT1小鼠所提供，這種小鼠發育正常，對肝炎病毒感染高度敏感，對IFN無反應(Meraz，M.A.等，Cell84431-442，1996)。STAT3激活與炎症有關，值得注意的是與IL-6依賴性反應有關。STAT6是Th2應答所需要的，因為無效突變STAT1小鼠缺乏Th2(抗體依賴性)免疫應答，對線蟲感染缺乏正常的IgG應答。STAT4也是Th1應答所需要的，因為缺乏這種基因的小鼠呈現有NK細胞和LAK細胞的IL-12依賴性激活及Th1細胞因子產生缺陷(Kaplan，Nature382174-177，1996)。已證明Th1細胞免疫應答是抑制腫瘤細胞生長和轉移、清除某些病毒、細菌、真菌和寄生蟲感染及癌細胞所必需的。已證明Th1應答對以下感染是重要的慢性病毒感染，包括B型肝炎(MilichDR等，1997.JVirol7132192-2201)、C型肝炎(TsaiSL等，1997.Hepatology252449-458)、HIV(ClericiM，ShearerGM，1994.ImmunolToday1512575-581)、單純性皰疹口唇炎(SpruanceSL等，1995.AntiviralRes28139-55)；細菌感染，如大鼠囊性纖維變性模型上呼吸道的綠膿桿菌感染(JohansenHK1996.APMISSuppl635-42)；麻風分枝桿菌引起的麻風病(ModlinRL1994.JInvestDermatol1026828-832)；包括白色念珠菌的真菌感染(RomaniL等，1995.ImmunolRes142148-162)和包括利什曼原蟲屬的寄生蟲感染(KempM.1997.APMISSuppl68.1-33)和稱為血吸蟲的5種扁蟲之一引起的血吸蟲病(WynnTA等，1996.JImmunol15794068-4078)。幹擾素和幹擾素誘導劑雖具有抗癌和抗病毒活性，但它們單獨使用看來不足以刺激能消除疾病的適當的Th1應答。例如，幹擾素已在大多數類型的癌症治療臨床試驗中使用，效果各異(GoldsteinD和LasgloJ.Can.Res.464315，1986)。幹擾素也已證明在C型肝炎和B型肝炎的治療中有某些療效。對於B型肝炎，低於50％的患者出現對IFN的初始反應，對於C型肝炎，全部α-IFN治療患者的75-90％復發(HoofnagleJH等1986.NewEnglJMed，3151575-1578；DavisGL等1989.NewEnglJMed，3211501-1506)。此外，另一種Th1細胞因子，IL-2，也已證明在某些癌症、某些HIV患者和麻風病的治療上有效(CurrOpinBiotech46722-726，1993)。血液恢復性/抗放射和化學治療致死的保護作用在各種疾病的化學治療中，骨髓抑制通常是限制劑量的特徵，這些疾病包括癌症(Hoagland，癌症化療的血液學並發徵.Thechemotherapysourcebook》，PerryMC編，498-507頁，WilliamsWilkinsBaltmore1992)和後天獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)(McLeod和Hammer，Ann.Int.Med.117487，1992；Richman等NEngJMed317192，1987；Shaunak和Bartlett，LancetII91，1989；Walker等ClinRes35435A，1987)。在骨髓抑制或抗感染力降低期間支持患者是化學治療方案的一個關鍵部分。高爾基體甘露糖苷酶II抑制劑(如八氫吲嗪二醇游離鹼)已證明對各種化學治療劑的致死作用(Oredipe等，1991)和致死劑量的放射線(White等，Cancercomm383-90，1991)有保護作用。在這些研究中，八氫吲嗪二醇處理小鼠存活力的提高與其刺激小鼠骨髓增殖、骨髓細胞構成和移植效應(Oredipe等，1991；White等，1991)以及改善外周血液計數有關。用本發明的八氧吲嗪二醇鹽進行治療本發明的鹽顯然可用於阻止、治療和預防腫瘤生長和轉移的方法中。本發明的鹽和組合物在治療患者各種形式的瘤形成的方法中特別有用，這些瘤形成包括病人中的白血病、淋巴瘤、黑素瘤、腺瘤、肉瘤和實體組織癌。特別是，本發明的鹽和組合物可用於治療惡性黑素瘤、胰癌、宮頸癌、卵巢埃、腎癌(如轉移性腎細胞癌)、胃、肺、直腸、乳腺、大腸、胃、肝、甲狀腺、頭和頸癌(如不可切除的頭和頸癌)、淋巴管炎癌病(carcinamatosis)、宮頸癌、乳腺、唾液腺、腿、舌、唇、膽管、骨盆、縱隔、尿道、支氣管原、膀胱。食道和結腸、非小細胞型肺癌，及卡波西(Kaposi)肉瘤，這是一種罹患後天獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)的HIV感染患者相關的癌症。本發明的鹽和組合物可用於治療免疫抑制(immunocompromised)的患者。例如，它們可用於感染HIV或其它病毒或感染因子(包括細菌、真菌和寄生蟲)的患者、經受骨髓移植的患者及化療或腫瘤所致免疫抑制的患者。本發明的鹽和組合物可用作血液恢復劑，特別是刺激骨髓細胞增殖，特別是在化療或放療後。本發明的鹽和組合物的骨髓增殖活性可測定如下將化合物注射到小鼠體內，處死小鼠、取出骨髓細胞，通過直接計數骨髓細胞和在甲基纖維素試驗中測定促克隆形成的粗細胞來測定化合物刺激骨髓細胞增殖的能力。本發明的化合物和鹽可用作抗病毒劑，特別對於有包膜的病毒，如輪狀病毒流感病毒、巨細胞病毒和皰疹病毒。本發明的化合物和鹽還可用於治療細菌、真菌和寄生蟲感染。本發明的化合物還可用於治療炎症性疾病，如類風溼性關節炎和哮喘。本發明的化合物抑制甘露糖苷酶和使嗜中性白細胞上的糖結構不能結合於選擇蛋白。存在於損傷部位的選擇蛋白與嗜中性白細胞上的糖結構相互作用，使嗜中性白細胞沿上皮壁滾動、粘附、浸潤，引起組織損傷。本發明的鹽在手術後預防腫瘤復發上有特殊的用途，即作為輔助治療。從本發明的鹽的性質顯然可知它們還可用於增強白介素-2和聚-IC等的抗癌效應，增強自然殺傷細胞和巨噬細胞的殺腫瘤活性，誘導細胞因子合成和分泌，促進LAK和HLAI型特異抗原的表達，激活蛋白激酶C，刺激骨髓細胞增殖，包括造血祖細胞增殖，提高移植效能和集落形成單位活性，抗化療和放療的保護作用(如化療保護劑和放療保護劑)，加速骨髓細胞組成的復原，特別是與通常用於治療包括癌和獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)的人類疾病的化學藥物合用時。例如，本發明的鹽可作為化學保護劑與抗癌劑(包括阿黴素、5-氟尿嘧啶、環磷醯胺和甲氨喋呤)合用，及與異煙肼或NSAID合用。作特殊治療應用的本發明的鹽的活性可用本說明書描述的或本領域已知的各種體外和體內模型進行試驗。特別是，本發明的鹽和組合物的抗轉移效應可用肺定居試驗加以證明。例如，將用一種化合物處理的黑素瘤細胞注入小鼠體內，死後計數肺上的腫瘤結節以確定黑素瘤細胞定居小鼠肺的能力。口服或靜脈注射本發明化合物對小鼠腫瘤生長的抑制作用可測量腫瘤體積加以確定。確證本發明鹽抗癌效應的細胞模型和動物模型包括表3所示的模型。確證本發明鹽的活性的實施方案的例子包括在實施例部分。本發明的其它實施方案提供了處理所述病況的方法，包括使需要這種治療的患者接觸藥學有效量的本發明的八氫吲嗪二醇鹽、所述鹽的代謝物或前藥或其代謝物的代謝前體。在這一實施方案中，代謝物可用作例如抗C型肝炎感染的治療劑。本發明的鹽或組合物可用作疫苗佐劑，以誘導對其本身的強免疫應答和/或誘導對抗原的免疫力，特別是通常為弱免疫原的抗原。本發明的鹽或組合物可通過激活抗原呈遞細胞(如單核細胞或巨噬細胞)增強疫苗的免疫原性，以釋放可促進輔助B細胞和CTL應答的T細胞輔助細胞因子。結果，本發明的鹽或組合物可誘導更有益的高滴度抗體應答，此應答出現於免疫過程的早期，持續全程，及提高記憶反應和CD8+MHCI型限制性CTL。本發明的鹽或組合物可包含在疫苗中或可分開給予。本發明的鹽可用於增強誘導T細胞應答的抗原(如T細胞抗原)的免疫原性，特別是可用於增強癌症或感染性疾病相關糖類抗原的免疫原性。可採用本發明的鹽或組合物以增強免疫原性的疫苗的例子包括癌疫苗(如乳腺癌疫苗)和慢性感染性疾病疫苗。實施例實施例1八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的合成將八氫吲嗪二醇游離鹼(203.7mg，1.18mmol)溶於4.0ml蒸餾水。加入1M鹽酸(1.41ml，1.2當量)。冷凍乾燥後，將無定形殘渣在甲醇—乙醚或甲醇中結晶析出。將八氫吲嗪二醇鹽酸鹽(448.6mg)溶於5.0ml甲醇。過濾後，經30分鐘時間滴加6.3ml乙醚，偶爾將溶液迴蕩一下。加入0.25ml醚後開始結晶。使正在結晶的溶液室溫放置20分鐘。抽濾和用6ml甲醇∶乙醚(1∶2)洗滌後，得到無色結晶(347.1mg，得率77.4％)。本合成法無需進行色譜提純。清澈的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽結晶(稜晶)的熔點是190-191℃。室溫下八氫吲嗪二醇鹽酸鹽在蒸餾水中溶解度約為3g/ml，與八氫吲嗪二醇游離鹼的溶解度成對照，後者約為0.8g/ml(見表5)。實施例2八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的合成從1，2-O-亞異丙基八氫吲嗪二醇可合成八氫吲嗪二醇鹽酸鹽。加入等體積6M鹽酸水溶液，將1，2-O-亞異丙基八氫吲嗪二醇在四氫呋喃、甲醇、乙醇或異丙醇中的10％(w/v)溶液酸化。室溫攪拌過夜後，將溶液濃縮至幹。殘渣溶於甲醇或乙醇中，用活性炭脫色(50℃，15分鐘)。濾去活性炭，殘渣如實施例1所述結晶化。實施例3八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的穩定性將用DavidDime博士(TorontoResearchChemicals，Toronto，Ontario)和WilliamPearson博士(密西根大學，AnnArbor，Michigan)開發的合成途徑合成的八氫吲嗪二醇游離鹼樣品結晶化，得到八氫吲嗪二醇鹽酸鹽、氫溴酸鹽或游離鹼。將樣品稱重，暴露於如下所述條件。為了模擬長時間穩定性或貨架壽命，用各種條件加速分解過程。將八氫吲嗪二醇鹽酸鹽稜晶和八氫吲嗪二醇游離鹼(從八氫吲嗪二醇鹽酸鹽得到的白色、蓬鬆粉末從氯仿—甲醇—乙醚中重結晶)樣品稱重，暴露於如下所述條件(受處理樣品)。將未受處理的樣品配製成1mg/ml濃度，每個試驗作6份色譜。在指定的時間間隔後，將每個受處理樣品用移動相稀釋成與未受處理樣品同樣的濃度。根據未受處理樣品中鹽酸鹽或游離鹼的百分率計算餘下的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或八氫吲嗪二醇游離鹼的百分率。條件包括(a)UV光照7天；(b)105℃大氣氧中7天(*＝兩個樣品的平均值)；(c)105℃氮氣中7天(*＝兩個樣品的平均值)；70℃、低溼度7天；和(e)40℃、75％相對溼度7天。其它試驗包括(f)UV24小時；(g)100℃水溶液2小時；(h)酸水處理24小時；(i)鹼水處理4小時；和(j)3％過氧化氫水溶液4小時。令人驚奇的是，八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的熱穩定性大於游離鹼或氫溴酸鹽見(表4)。而且，鹽酸鹽的光化學穩定性顯著大於氫溴酸鹽(見表4)。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽與游離鹼、八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽和八氫吲嗪二醇氫氟酸鹽相比較的物理性質見表5。將八氫吲嗪二醇鹽酸鹽、氫溴酸鹽和游離鹼暴露於50℃/50％相對溼度(RH)和80℃/大氣溼度4周。在基線和以1周為間隔，用如上所述的HPLC測定受試物質的穩定性。另外，在研究開始和結束時進行顏色和水分評估，將鹼和鹽樣品稱重，也記錄顏色和水的形成。實施例4八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽的合成將八氫吲嗪二醇游離鹼(299.7mg)溶於蒸餾水(6.5ml)。加入1M氫溴酸(1.1當量)，將溶液冷凍乾燥。按實施例1中結晶鹽酸鹽同樣的方法將殘渣從甲醇—乙醚重結晶析出。得到八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽(341mg，77.6％)，為無色結晶，熔點153-154℃。實施例5八氫吲嗪二醇氫氟酸鹽的合成將八氫吲嗪二醇游離鹼(301.03mg)溶於甲醇(10ml)，加入48％氟化氫水溶液(84μl)。將溶液濃縮後，殘渣從沸騰的甲醇中結晶析出。得到無色針狀結晶(14.9mg，4.5％)。這些針狀物在152℃以上分解，不熔融。實施例6八氫吲嗪二醇鹽酸鹽和八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽的X-射線結晶學分析用常規方法進行X-射線結晶學分析。從旋進相機相片(precessioncameraphotograph)確定間隔基和晶胞參數。用12個高角度反射(40°＜2θ＜60°)衍射儀測定和應用最小二乘法得到精確的晶胞參數。結晶學數據在表1和2中給出。用銅Kα輻照和掃描速度為2°/分鐘的θ2θ掃描方式選擇結晶維(dimensions)作為數據收集。每100次反射檢測的3次標準反射表明隨機強度變異僅在5％之內。將強度校正得到Lorentz和極化因子。未採用吸收校正。通過採用諸如SHELXS-86程序或SIR-88程序等的直接方法測定晶體結構。每次E圖均揭示結構中所有非氫原子的位置。結構詳況和差異電子密度計算揭示無殘留電子密度。最終差異因子集中於R＝3.6％，2σ，≈1200密度數據(鹽酸鹽)和R＝3.8％，2σ，1002密度數據(氫溴酸鹽)。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的三維結構見圖1，八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽的三維結構見圖2。圖3和3分別是八氫吲嗪二醇鹽酸鹽和八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽的結晶填塞圖。鹽酸鹽的單胞長度是a＝8.086±0.01，b＝9.386±0.01，c＝13.621±0.01。單胞是正交晶(所有角都是90°)。晶架群是P212121。鹽的原子坐標見表1。最終差異因子(finaldiscrepancyfactor)R＝3.6％，2σ，約1200強度數據。一些扭轉角如下H7-C7-C8-H839.75±3.33；H8-C8-C9-H91-140.68°±3.10；H8-C8-C9-H92-20.90°±2.86。SW鹽酸鹽和SW二乙酸鹽的最佳最小二乘面(bestleastsquareplanes)如表6所述。從表6顯然可見，八氫吲嗪二醇二乙酸鹽中的4個原子比八氫吲嗪二醇鹽酸鹽結晶結構中的邊緣扁平。單胞中八氫吲嗪二醇鹽酸鹽分子通過一個分子中的質子化N原子和3個羥基氧原子與其它分子的氯離子之間的氫鍵相互作用連接在一起。鍵的距離如下N1-H1＝0.88，從H1至氯離子2.35；O5-H50＝0.78；從H50至氯離子2.33；O7-H70＝0.74；從H70至氯離子2.44；O8至H80＝0.67，從H80至氯離子2.50。氫溴酸鹽的單胞長度是a＝8.405±0.01，b＝8.629±0.01，c＝14.118±0.01。單胞是正交晶(所有角都是90°)。晶架群是P212121。鹽的原子坐標見表2。最終差異因子(R＝3.8％，2σ，約1200強度數據。一些扭轉角如下H7-C7-C8-H840.075±0.21；H8-C8-C9-H91-137.29°±0.09；H8-C8-C9-H92-19.96°±0.19。SW鹽酸鹽和SW二乙酸鹽的最佳最小二乘面(bestleastsquareplanes)如表6所述。單胞中八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽分子通過第一個分子中3個羥基氧原子與其它分子的溴離子及第一個分子的質子化N原子和第二個分子的氧原子之間的氫鍵相互作用連接在一起。鍵的距離如下N1-H1＝0.91，從H至氧原子O81.94；O5-H50＝0.82；從H50至溴離子2.47；O7-H70＝0.82；從H70至溴離子2.61；O8至H＝0.82，從H至溴離子2.56。鹽酸鹽和氫溴酸鹽的結晶結構之間的主要顯著差異是分子間氫鍵。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽每個Cl-離子是4個氫鍵的接受體；N-H…Cl；O5-H…Cl；O7-H…Cl；O8-H…Cl。在八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽中，Br-離子佔據八氫吲嗪二醇分子的不同部位，是3個H-鍵的接受體O5-H…Br、O7-H…Br、O8-H…Br，氮-H鍵是O8，即N-H…O8。實施例7八氫吲嗪二醇和八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的NMR譜通過比較已報告的關於八氫吲嗪二醇的數據(M.J.Schneider等，Tetrahedron3929，1983)對八氫吲嗪二醇和八氫吲嗪二醇鹽酸鹽樣品的1H和13CNMR譜進行分析。將研究中所用的化合物溶於D2O(Isotec，Inc.)。至濃度約為4.5mg/ml。表7中報告的1H化學位移用COSY和1H-13CHSQC試驗證實。通過測定鄰近偶合常數，及六元環上軸向質子相對於平伏位置質子通常是屏蔽的這一觀察，獲得六元環上軸向質子和平伏質子差異(F.A.Bovey，核磁共振光譜學，AcademicPress，NewYork，1988)。用2-DROSEY試驗將五元環C-3上的質子定為假軸向和假平伏位置(提供類似於2-DNOE譜的數據，但通過旋轉框架機制建立質子間穿透空間相互關係，A.Bax和D.G.Davies，J.Magn.Reson.63207，1985；D.Heuhaus和M.Williamson，結構和構象分析中的核Overhauser效應.VCHPublishersInc.，NewYork.1989；W.E.Hull在W.R.Croasmun和R.M.K.Carlson編的《化學家和生物化學家用的二維NMR光譜學》，第二版，VCHPublishersInc.NewYork.1994.第二章)。C-3亞甲基質子(2.754和2.420ppm)出現於H-2(4.217ppm)的ABX自旋系統的AB部分。這一指定還受到具有7.9Hz的H-2較大鄰近偶合常數的支持，因為H-2和H-3之間的雙面夾角可能小於60°。偶合常數僅報告顯示很好解析的裂分的多重譜線。因為一些小的偶合相互作用的疊加，六元環的平伏質子顯示為未解析的加寬的多重譜線。通過J-調幅自旋類型(J-modulatedspinsort)和1H-13CHSQC譜確定13化學位移(表9)。考慮六元環上的取代基效應時，C-5和C-6的化學位移與模型化合物全氫化中氮茚相符(H.O.Kalinowski，S.Berger和S.Braun，Carbon-13NMR光譜學.J.Wiley和Sons，NewYork，1988)。將同樣的過程用於指定八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的NMR譜。1HNMR譜的最初測定指出了相應於樣品SW的所有化學位移的去屏蔽(表7)。C-3、C-5和C-9上的質子受氮質子化的影響最大。用SW數據可進行八氫吲嗪二醇鹽酸鹽(SWHCl)的大多數化學位移的指定，但是，需要COSY和ROESY譜來確證這些指定，尤其是C-3質子的指定。在SWHCl樣品中，假軸向和假平伏C-3質子的化學位移的順序相反。SWHCl中，假軸向C-3質子的頻率(3.379ppm)高於假平伏C-3質子(3.306ppm)。這一指定由ROESY數據確證，其中3.379ppm多重譜線清晰地顯示解析的穿透空間與C-9(2.959ppm)和C-5(2.805ppm)軸向位置的相互關係。C-3質子和H-2之間的鄰近偶合常數支持這些指定(表8)。從J-調幅自旋類型和1H-13CHSQC譜指定碳化學位移。通過改變相對於SW的量，SWHCl的所有碳共振(除了C-5以外)均被屏蔽(表9)。當烷胺質子化時一般可見到這種情況(H.O.Kalinowski，1988，見上)。六元環碳6和8受到的屏蔽一小部分還可歸因於氮上的軸向氫的引入。軸向N-H可與C-6和C-8軸向質子建立1，3-軸向立體相互作用，導致對C-6和C-813C化學位移的γ-取代基效應(H.O.Kalinowski，1988，見上)。化學位移和ROESY數據的測定表明，在這些樣品的整體結構上不存在顯著差異。氮的質子化似乎出現於佔據軸向幾何形狀的N-H質子。但是，氮質子化似乎使環構象更剛性。並取如下所示的結構這一結論得自關於H-1和H-5e之間0.7Hz五鍵偶合的觀察。自旋去偶合試驗證明這一偶合相互作用。這一類長範圍偶合是高度立體專一的，要求偶合途徑上的所有原子是共平面鋸齒型或W型的甚至在大結構如甾體中五元環的構象通常更有撓性。因此，為了產生所觀察到的H-1和H-5e多重譜線上的自旋，質子化必須固定長範圍偶合途徑上的原子的幾何形狀。更剛性的結構也可能是SWHCl樣品中五元環鄰近偶合常數變化的原因(表8)。總之，八氫吲嗪二醇鹽酸鹽及其氮質子化類似物的1H和13C化學位移已被完全指定，關於很好解析的多重譜線，已有大多數1H-1H偶合常數被報導。兩種樣品之間最顯著的結構差異是如長範圍1H自旋偶合相互作用所示的SWHl分子的較剛性的結構。實施例8預配製研究就如下性質進行八氫吲嗪二醇鹽酸鹽、疏鬆藥物物質、連同粉末和半固體明膠膠囊的預配製吸溼性、pH、穩定性和溶解度。此化合物已發現具有高度吸溼性。在疏鬆藥物上進行的研究表明，此化合物在75％相對溼度(RH)下、在第2和第8小時分別吸收約8％(w/w)和24％(w/w)水，並轉為半固體。在20％和50％RH儲存48小時後用KarlFischer法測得，吸收1.9％和2.1％水。用粉末狀賦形劑(如乳糖酐和甘露糖醇粉末)將活性藥物配製到硬膠囊中時，水分吸收減少。此化合物在水和親水性賦形劑中高度溶解。因此，對於軟明膠膠囊製劑，以親水性賦形劑為佳。助溶劑(如甘油或丙二醇/PEG)對於液體或半固體充填是可行的。pH研究的結果證明，此化合物在pH4和7的緩衝液中在室溫和加溫(40℃和50℃)儲存條件下是穩定的。實施例9八氫吲嗪二醇鹽酸鹽批量(bulk)藥物物質的NMR已得到(-)-(1S，2S，8R，8aR)-1，2，8-三羥基八氫中氮茚鹽酸鹽(八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，白色至灰白色結晶形固體，分子量209.66，pKa7.4，熔程189-190℃)在氘代水中的質子核磁共振(NMR)和同核相關光譜學(COSY)光譜。D2O4.60ppm還用作內參考。如實施例7中所測定的峰指定基於質子NMR譜和COSY譜偶合。通過測定鄰近偶合常數和觀察到六元環軸向質子通常相對於平伏質子是屏蔽的，得到軸向和平伏質子的差異。2-DROSY試驗將C-3亞甲基質子指定為假軸向和假平伏位置。已得到(-)-(1S，2S，8R，8aR)-1，2，8-三羥基八氫中氮茚鹽酸鹽(八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，白色至灰白色結晶形固體，分子量209.66，pKa7.4，熔程189-190℃)在氘代水中的碳NMR譜、所附質子試驗(APT)和雜核自旋量子相干(HSQC)譜。基於碳NMR譜的峰指定、DEPT和HSQC譜解釋見表10。指定根據如下書籍中所見信息Nakanishi，K.，用現代脈衝技術得到一維NMR譜，大學科學書叢，日本東京，1990。實施例10定量微量分析用PerkinElmer2400燃燒分析儀對已得到的(-)-(1S，2S，8R，8aR)-1，2，8-三羥基八氫中氮茚鹽酸鹽(八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，白色至灰白色結晶形固體，分子量209.66，pKa7.4，熔程189-190℃)進行元素分析。用電勢滴定進行氯分析。結果見表11。實施例11紅外吸收光譜已得到收集在丸中的(-)-(1S，2S，8R，8aR)-1，2，8-三羥基八氫中氮茚鹽酸鹽(八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，白色至灰白色結晶形固體，分子量209.66，pKa7.4，熔點189-190℃)的傅立葉變換式紅外(FTIR)光譜。主要吸收帶與該化合物的結構相符，特徵性吸收帶的指定列於表12。這些指定見於如下文獻Silverstein，R.M.，Bassler，G.C.和Morrill，T.C.《有機化合物的光譜鑑定》，第三版，JohnWileySons，紐約，1974，第3章；光譜學導論，Pavia，D.L.，Lampman，G.M.和Kriz，G.S.，SaundersGoldenSunburstSiries第2章。實施例12紫外光譜(-)-(1S，2S，8R，8aR)-1，2，8-三羥基八氫中氮茚鹽酸鹽(八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，白色至灰白色結晶形固體，分子量209.66，pKa7.4，熔程189-190℃)的紫外吸收光譜表明，在HPLC峰純度估測中在200nm至300nm的試驗中UV區無吸收峰。實施例13質譜測定用高分辨VGZABIS雙聚焦磁象限儀(doublefocusingmagneticsectorinstrument)上的化學離子化(Cl)(甲烷)質譜鑑定(-)-(1S，2S，8R，8aR)-1，2，8-三羥基八氫中氮茚鹽酸鹽(八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，白色至灰白色結晶形固體，分子量209.66，pKa7.4，熔點範圍189-190℃)。該質譜見圖5，裂解方案見表13。實施例14供製劑用而乾燥的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的X射線粉末衍射證明八氫吲嗪二醇鹽酸鹽乾燥樣品結晶學上相似於批量藥物物質。X射線粉末衍射研究表明，使用零背景樣品固定技術得到可重複的特徵型供藥用的粉末型式。實施例15熱分析用差示掃描量熱計得到的(DSC)(-)-(1S，2S，8R，8aR)-1，2，8-三羥基八氫中氮茚鹽酸鹽(八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，白色至灰白色結晶形固體，分子量209.66，pKa7.4，熔程189-190℃)的差示熱分析圖顯示在45mL/分鐘氮氣吹掃下以5℃/分鐘的速度加熱，出現從約187.5-190.3℃的熔融吸收熱。熱重量分析法(TGA)顯示在40mL/分鐘氮氣吹掃下以5℃/分鐘的速度加熱至160℃，重量丟失約0.20％，並出現從約187.6-190.5℃的熔融吸收熱。實施例16高效液相色譜(HPLC)產生一種反向均衡高效液相色譜(HPLC)方法，用來檢測藥物物質的效能和有關物質。與該物質的外標作比較，完成藥物物質的定量。用面積百分數對有關物質進行定量。測定效能和有關物質的色譜法將藥物物質從其合成前體和潛在雜質中分離出來。HPLC的有關色譜條件為柱Prodigy5μODS-2(25cm×4.6mmID)；移動相乙腈緩衝液(10mMKH2PO4，pH＝9.0)595；流動速率1.0ml/分鐘；注射體積10μL；檢測UV，205nm；溫度常溫；樣品濃度1.0mg/ml；樣品稀釋劑移動相。代表性的色譜圖見圖6。實施例17抑制高爾基體和溶酶體甘露糖苷酶II的體外測定方法將40μM儲備液作0.4倍系列稀釋製備受試化合物八氫吲嗪二醇。每一測定液中含稀釋的受試化合物10μl、10mM對硝基苯基甘露吡喃糖苷25μl、200mM乙酸鈉(pH5.6)和15μl純化的大鼠肝臟高爾基體甘露糖苷酶II。將反應液37℃培育60分鐘後，用0.5M碳酸鈉50μl淬滅。讀取405nm處吸光度。從陽性對照和樣品減去空白後，用可變斜率、S形曲線擬合，底＝0，頂＝100，進行樣品對陽性對照平均值的標準化。信號與未受抑制的反應液中的產品量成比例。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽抑制純化的高爾基體甘露糖苷酶II的IC50計算值為0.068±0.021μM。將化合物10μl加到96孔Elisa板上，然後加入200μM乙酸鈉(pH5.0)和10mM對硝基苯基α-D-甘露吡喃糖苷25μl，測定本發明化合物對溶酶體甘露糖苷酶的作用。每個孔中加入15μl溶酶體甘露糖苷酶(約8mM/ml)，將板37℃培育60分鐘。加入0.5M碳酸鈉停止反應，用微量滴定板測定裝置(plateset)於405nm測定對硝基苯的生成量。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽抑制溶酶體甘露糖苷酶II的IC50計算值為0.045±0.010μM。實施例18A.測定細胞內甘露糖苷酶II抑制作用的L-PHA細胞試驗受試化合物八氫吲嗪二醇鹽酸鹽配製以含5％胎牛血清(FBS)的極限必需培養基(MEM)50μl將此化合物40μM的儲備液作0.5倍系列稀釋。向96孔板每孔中50μl稀釋的受試樣品加入50μl含5％FBS的MEM配製的10,000MDAY-D2腫瘤細胞。樣品在5％CO2培養箱中37℃培育過夜。準備試驗孔一式二份按25μl/孔加入5％FBS+MEM或含100μg/mlL-PHA的5％FBS+MEM。再將樣品在5％CO2培養箱中37℃培育過夜。按PromegaCellTiter96AQ試劑盒說明書上所述，用甲基硫酸吩嗪(PMS)和(3(4，5-二甲基噻唑-2-基-5-(3-羧甲基甲氧基苯基)-2，4-磺苯基)-2H四唑鎓鹽(「MTS」)測定每個孔中細胞的變異和/或增殖。讀取490nm吸光度。L-PHA毒性的喪失與藥物進入細胞抑制高爾基體甘露糖苷酶II和L-PHA結合細胞表面糖結構的喪失直接有關。B.高流通量L-PHA試驗材料和方法化學物質L-PHA、TritonX-100和對硝基苯磷酸酯購自Sigma；二乙醇胺購自Fisher。細胞DBA-2系淋巴網狀內皮細胞腫瘤MDAY-D2的起源和性質以前已有描述(Kerbel，RS等(1980)J。Natl.CancerInst.，64，1221-1230)。將細胞在含2％熱滅活胎牛血清(GibxoBRL)的α-修飾Eagle培養基中37℃在95％O2/5％CO2溼潤空氣中進行培養。鹼性磷酸酶試驗用96孔板進行測定。每孔含有維持在補加2％胎牛血清的125μl培養基中的可變量MDAY-D2細胞。加入75μl試驗混合物(1M二乙醇胺緩衝液(pH9.8)、2mMMgCl2、1％TritonX-100和2.5mM對硝基苯磷酸酯)引發鹼性磷酸酶反應，於37℃培養達90分鐘。用3.5MNaOH80μl停止反應。顯色15-30分後，用多孔掃描光度計(ThermomaxMultiplateReader，MolecularDevices)於405nm測定生色產物對硝基苯酚的吸光度。通過對無細胞單用培養基進行的試驗測定的背景值作常規減除。405m處的吸光度和對硝基苯酚濃度之間的線性關係在0-2.5範圍(ε＝17.23mM-1cm-1)。通過L-PHA試驗進行篩選用能同時處理9個96孔板的roboticworkstation(Biomek2000，Beckman)進行全自動篩選。測定在平底96孔板(每塊板為88個樣品和8個對照)上進行。每孔(1-11欄)接受10μl化合物(在2.5％DMSO中)，第12欄加入10μl的2.5％DMSO/水。所有96孔接受以補加2％FCS的90μl培養基配的5×103個MDAY-D2細胞。37℃培育16-20小時後，加25μlL-PHA(100μg/ml培養基)到11欄第一孔和第12欄的4個孔(陽性對照)中。其它4孔接受25μl含2％FCS的培養基(陰性對照)。試驗板於37℃維持30-36小時，按上述方案用1小時的培育時間測定鹼性磷酸酶活性。在整個試驗過程中細胞密度是亞鋪滿狀態。增殖指數表示為百分數，用下式計算細胞內八氫吲嗪二醇鹽酸鹽抑制高爾基體甘露糖苷酶II的IC50計算值為0.057±0.01μM。實施例19八氫吲嗪二醇鹽酸鹽對SP1.A3(一種哺乳動物腫瘤細胞)體外增殖的作用細胞因子TGFβ1和TNFα影響細胞生長、淋巴樣細胞激活、組織分化和編程性細胞死亡。然而，這些細胞因子誘導細胞生長、分化或死亡是否是高度細胞特異性的，並在正常分化過程中受到嚴密的調節。對於黑素瘤、結腸癌和卵巢癌，TGFβ和TNFα的促細胞分裂作用也有報導。細胞因子介導的增殖可直接通過其信號傳導途徑或促進其它生長因子受體的表達來引發。將SPI.A3a小鼠乳房癌細胞在含10％牛血清及有或無濃度為0.2μg/ml的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的培養基中生長24小時，以後24小時，將細胞維持在有或無八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的無血清培養基(SFM)中。然後，使細胞在無生長因子的情況下生長6小時，或接觸下面的一種生長因子TNFα(腫瘤壞死因子-α)、TGFβ1(轉移生長因子-β)、TGFα、血小板衍生的生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)。最後18小時加入含氚胸苷，用多通道細胞收集器收集細胞，在β-計數儀中測量放射性，作為細胞增殖的度量。如圖7所示，生長因子TGF-β1和TNF-α刺激SP1.A3a細胞的增殖，八氫吲嗪二醇鹽酸鹽處理抑制TGF-β1和TNF-α依賴性的生長刺激。實施例20八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的體內抗癌活性A.八氫吲嗪二醇鹽酸鹽對小鼠SPI.A3a腫瘤細胞生長的效應將小鼠乳腺癌SP1腫瘤株(A3a)的轉移亞克隆在含10％FBS的RPMI1640培養基中維持指數生長。收集細胞，以1×106/ml或1×107/ml再懸浮於PBS，將含1×105的0.1ml懸浮液給7周齡雌性CBA/J小鼠(Jackson實驗室)右腹部皮下注射。在麻醉動物的另一側腹部將Alzet微型滲透泵植入皮下。灌注該泵，輸入生理鹽水(對照)或0.5mg/kg/天八氫吲嗪二醇鹽酸鹽28天。監測小鼠可觸及腫瘤的出現，用遊標兩腳規測量其後腫瘤的生長。第42天測量腫瘤重量和肺轉移的數目。治療第32、39和42天，腫瘤平均體積對照動物(-)大於經滲透泵接受八氫吲嗪二醇鹽酸鹽28天的小鼠(+)(圖8)。治療第32、39和42天，對照組和八氫吲嗪二醇鹽酸鹽治療組之間的腫瘤平均體積差分別為35％、27％和32％。對照組中5隻動物在第42天處死時測得的腫瘤平均重量大於八氫吲嗪二醇鹽酸鹽組的4隻動物，分別為7.35g和4.87g。對照組有一個很大的腫瘤。第42天處死時，對照組小鼠肺轉移的發生率為平均1.8個結節/小鼠，八氫吲嗪二醇治療小鼠為平均0.25個結節/小鼠。本實驗證實了八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的抗腫瘤活性。事實上，所用劑量比起初用八氫吲嗪二醇游離鹼進行的實驗所用劑量低8倍。B.飲水中的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽對小鼠SPI.A3a腫瘤細胞生長的效應重複了飲水中給予八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的實驗。使SP1.A3a小鼠乳腺癌在含10％FBS的RPMI1640培養基中維持指數生長。收集細胞，以3×105/ml再懸浮於PBS，將含3×104個細胞的0.1ml懸浮液給7周齡雌性CBA/J小鼠(Jackson實驗室)(n＝25)右腹部皮下注射。以後給小鼠供應單純的飲水(n＝13)或含10μg/ml八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的飲水(n＝12)(相當於2mg/kg/天劑量)。一旦有明顯的可觸及腫瘤，則每周兩次用遊標兩腳規測量腫瘤大小。治療結束時，剪下腫瘤、稱重。給以含10μg/ml八氫吲嗪二醇鹽酸鹽飲水的荷瘤小鼠比只用水治療的對照組小鼠腫瘤生長得慢。結果見圖9。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽治療小鼠(+)的中等大小腫瘤比生理鹽水治療小鼠(-)小得多。在所顯示的時間點這些差異具有統計學意義。第31天，治療組的腫瘤平均重量為1.79g，未治療組為3.33g。總之，實驗證明八氫吲嗪二醇鹽酸鹽具有體外和體內抗癌活性。而且，用比以前所報告的八氫吲嗪二醇游離鹼低得多的劑量證明了此抗癌活性。實施例21八氫吲嗪二醇鹽酸鹽和八氫吲嗪二醇對鼠骨髓祖細胞(CFU-E和CFU-GM)的體外效應材料和方法動物使用得自Jackson實驗室的無病原體C57BL/6雌性小鼠(8-9周齡)。控制室內環境和光周期24℃；溼度50±20°；12小時光照和12小時黑暗。每籠圈養一隻小鼠，自由接近標準市售實驗室丸狀食物和(高壓)滅菌自來水。材料八氫吲嗪二醇鹽酸鹽購自Seres實驗室，CA、FBS和甲基纖維素(MethoCultM3330)購自StemCellTechnologies，Inc.(Vancouver，BC)。用CibcoBRL的粉狀培養基、去離子水和過濾器滅菌，製備Iscove的改良Dulbecco培養基。培養基補充2％FBS和50μMβ-巰基乙醇(稱作IMDM/FBS)，用於細胞處置。細胞收集將健康和GD0039處理的小鼠用CO2窒息處死。在滅菌條件下採用26#針頭用IMDM/FBS衝洗股骨和脛骨，製備骨髓(BM)細胞懸液。在血細胞計數器上作一式三份計數，測定每個懸液中有核細胞的濃度。一部份細胞在接種作祖細胞試驗前進一步用培養基稀釋至適當的濃度。祖細胞試驗用甲基纖維素法估測集落形成單位(CFU)。將1毫升懸浮液(0.1mlIMDM和0.9mlMethoCult(M3330)中含2×105個有核BM細胞)作一式三份接種35mm組織培養皿。將八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或八氫吲嗪二醇(在0.1mlIMDM中，濃度30μg/ml和3μg/ml)加到某些板上，最終濃度為3μg/ml。MethoCultm3330含有30％FBS和10ng/ml促紅細胞生成素，設計用於早期紅細胞系祖細胞(CFU-E)的生長，在含5％CO2的溼潤空氣中37℃培育3天後計數。對於粒細胞—巨噬細胞系祖細胞(DFU-GM)，MethoCultM3330含有30％FBS，不含任何外加的生長因子，支持CFU-GM的生長，在含5％CO2的溼潤空氣中37℃培育7天後計數。向一些板上加SCF和/或GM-CSF(在0.1mlIMDM中)，得到最終濃度SCF為50ng/ml或5ng/ml(ED50)，GM-CSF為0.25μg/ml或1.7μg/ml。用明視野光學系統倒置顯微鏡(放大40或100倍)對含20個細胞以上的集落進行計數。結果在用M3330甲基纖維素作的CFU試驗中對健康小鼠和給予20μg/天八氫吲嗪二醇鹽酸鹽共4天的小鼠的BM細胞進行了分析。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽和八氫吲嗪二醇體外加到甲基纖維素中時，第3天早期CFU-E的數目均明顯增加(表14)。將高(3g/ml)和低(0.3μg/ml)濃度八氫吲嗪二醇鹽酸鹽和八氫吲嗪二醇加到對照組(未治療)小鼠的BM細胞中，刺激了同樣種程度的CFU-E數。用來自八氫吲嗪二醇鹽酸鹽體內治療小鼠的BM時，刺激的CFU-E數呈課題依賴性效應。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽和八氫吲嗪二醇二者以大約相同的速度體外刺激了紅細胞系祖細胞。濃度從0.03μg/ml至10μg/ml時，引起早期CFU-E的數目呈三倍增加。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽和八氫吲嗪二醇二者也能體外刺激粒細胞—巨噬細胞祖細胞(圖11健康C57BL/6小鼠的BM細胞以1.0ml懸液接種，該懸液得自0.8ml甲基纖維素M3230、0.1ml細胞懸液、0.1mlSWNCl和0.1ml細胞因子的混合物1-SCF50ng/ml；2-SCF5ng/ml；3-GM-CSF1.7μg/ml；4-GM-CSF0.25μg/ml；5-SCF50ng/ml+GM-CSF0.25μg/ml；6-無細胞因子)。在缺乏特異性刺激因子時，八氫吲嗪二醇鹽酸鹽顯示CFU-GM四倍增加。實施例22毒理學和藥物動力學研究用八氫吲嗪二醇鹽酸鹽進行了藥理學和毒理學研究。具體講，研究了如下內容(a)化合物在大鼠和猴身上的藥物動力學；(b)擬用於人的劑量顯著擴大倍數的急性毒性；(c)化合物的毒性特徵與文獻上八氫吲嗪二醇游離鹼的特徵比較；(d)潛在的基因毒性；(e)組織中寡糖積聚的時程、劑量依賴性、組織敏感性和可逆性；和(f)血清AST及與肝組織學的關係。研究表明，八氫吲嗪二醇急性毒性僅出現於很高劑量時，即13,000倍於擬用於人的劑量。慢性研究表明，在擬用於人的劑量下，甲狀腺、可能還有腎臟，可能是寡甘露糖苷酶可逆性積聚於溶酶體中的部位。實施例23體內和體外實驗方案的代表例A.給予八氫吲嗪二醇鹽酸鹽以抑制肺轉移將B16F10黑素瘤腫瘤細胞在有或無八氫吲嗪二醇鹽酸鹽(0.36μg/ml)存在下培養48小時，然後注射105個細胞到C57BL小鼠的尾側靜脈。如Dennis，JW.CancerRes.465131-5136，1986所述，在注射腫瘤細胞後第24天計數肺結節。C.八氫吲嗪二醇鹽酸鹽用於抑制腫瘤細胞的肺定居在尾側靜脈注射腫瘤細胞前，給小鼠飲用有或無50μg/ml八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的飲用水，並連續給八氫吲嗪二醇鹽酸鹽1-17天。注射腫瘤細胞後第24天計數肺結節。C.抑制人腫瘤在小鼠體內的生長將皮下注射人黑素瘤腫瘤細胞株MeWo的無胸腺小鼠每天一次腹腔注射滅菌生理鹽水或以滅菌生理鹽水配製的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，每鼠20μg。按照Dennis，JW(CancerRes.501867-1872，1990)的方法，注射腫瘤後每周兩次用兩腳規測量腫瘤大小，4周後測量腫瘤重量。D.八氫吲嗪二醇鹽酸鹽與幹擾素誘導劑Poly(I.C.)抑制實體腫瘤生長協同作用的測定注射105MDAY-D2腫瘤細胞前2天，給小鼠供應有或無八氫吲嗪二醇鹽酸鹽(3.0μg/ml)的飲用水。每周兩次用兩腳規測量腫瘤直徑，然後在注射腫瘤細胞後第15天剪下腫瘤、稱重。按照Dennis，JW(CancerRes.465131-5136，1986)所述方法，在第15天對給予添加八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的飲用水和/或腹腔注射Poly(I.C.)的小鼠腫瘤生長速率和腫瘤重量進行比較。E.八氫吲嗪二醇鹽酸鹽促進幹擾素體外抗增殖效應在有或無八氫吲嗪二醇鹽酸鹽(1.2μg/ml)及有或無1000IU/ml人α-2幹擾素(內含子A，Schering-Plough)的存在下，將HT29m，SN12C11人癌細胞或MeWo黑素瘤細胞以103個/ml種入含5％FBS的MEM組織培養基。細胞於37℃、5％CO2氛圍中進行培養，第5天，測量細胞數。方法如Dennis，JW.JNCI811028-1033，1989所述。F.體外祖細胞試驗在0.7-5.0μg/ml八氫吲嗪二醇鹽酸鹽治療後的特定時間，將對照組和治療組小鼠頸椎脫臼處死。按照GIBCO-BRL小鼠骨髓幹細胞增殖藥盒(Cat.#3827SA，GrandIsland，NY)的方法處理取自每個小鼠的骨髓(BM)和脾細胞。在半固體培養基中形成的潛在集落是CFU-GEMM、CFU-GM和BFU。將培養板在37℃、溼潤的5％CO2和95％空氣氛圍中進行培養，用倒置顯微鏡(放大20倍)對至少含40個細胞的集落進行計數，以證實對造血祖細胞生長的刺激。G.骨髓增殖試驗用八氫吲嗪二醇鹽酸鹽治療小鼠飲用水中含3μg/ml，或每天注射20mg/鼠，共2-6天。增殖的評估於37℃，將〔3H〕-胸苷摻入完全培養基中含有等量新鮮分離的BM細胞培養物中。藉助細胞收集器將放射標記的細胞收集到玻璃濾膜上，用液體閃爍計數儀測定放射活性。在BM細胞從脛骨和股骨衝洗下來後，用Coulter計數器直接計數，測定骨髓的細胞組成。H.體內祖細胞試驗脾集落形成試驗將小鼠(10-14周齡)整個身體暴露於700cGY進行X射線照射。使受照射的小鼠接受約3μg/ml的無菌飲用水，給予抗生素使感染死亡率達到最小。用Till和McCulloch的方法估測BM幹細胞的數目，該方法依據於先前暴露於致死劑量全身輻照的受者小鼠靜脈注射的祖始幹細胞在其脾臟中形成集落的能力。CFU的數目與存在於造血移植物中的多功能造血幹細胞數目成比例。移植後10天，將受者小鼠處死，取出其脾臟，固定在Bouin氏液中，計數肉眼可見的集落。I.骨髓移植和群體再形成如White等(Cancercommunications383，1991)和Oredipe等(JNCI831149，1991)所述，在移植骨髓細胞前，小鼠以致死劑量的化學治療劑或致死劑量的X射線照射作預處理。小鼠10-14周齡，用PhillipsRT250X射線儀進行輻照(兩個相對的250KvpX射線治療儀，235KV，15mA，過濾0.25銅和0.55鋁，半層0.99mm銅)。輻照劑量速率為126cGY/分鐘(63cGY/分鐘×2)，5分鐘33秒，全身暴露於700cGY。此輻照暴露水平對於小鼠來說在所述致死範圍內。X輻照後，給動物輸注來自對照組或八氫吲嗪二醇鹽酸鹽處理組供體的新鮮製備的骨髓細胞。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽處理的供體小鼠接受約20μg/ml八氫吲嗪二醇鹽酸鹽6天。監測存活超過30-50天的受者小鼠。J.Th1免疫反應自然殺傷細胞(NK)和淋巴因子激活的殺傷(LAK)細胞試驗用標準方法(Rees等，J.ImmunolMeths.，6279-85，1983；或Sedman等，Br.J.Surg.75976-981，1988)從全血分離人外周血單個核細胞(PBMC)。將PBMC種入6孔板，在5ml培養基中，濃度為每毫升1.5×106個細胞，只有培養基(對照)或有各種濃度的八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，以及1000國際單位(IU)/ml的IL-2，培養3天用於LAK試驗或1000IU/mlα-幹擾素，培養過夜，用於NK試驗。用K562細胞株(NK細胞敏感性)作靶細胞，在Cr51釋放試驗中測定培養的PBMC的NK細胞活性。用Cr51標記Daudi細胞株(NK細胞抗性)作靶細胞，測定LAK細胞活性。K.測量STAT水平和激活作為區別Th1/Th2免疫應答的方法為了測定STAT的水平和激活，用20μg/鼠/天八氫吲嗪二醇鹽酸鹽將DBA/2小鼠處理6-9天，然後一次腹腔注射滅菌生理鹽水或用滅菌生理鹽水配製的100μgpolyIC(即dsRNA，一種病毒替代物)。在STAT激活的最適時間2小時後，將小鼠脾臟勻漿化，製備胞質和細胞核提取物。用Western印跡分析測定胞質和和核組分的STAT蛋白水平。在用抗磷酸酪氨酸抗體作免疫沉澱後測定STAT磷酸化(即激活)。腹腔注射八氫吲嗪二醇鹽酸鹽20μg/天的小鼠STAT1胞質蛋白水平升高而STAT3保持不變(圖10A-10C)。下面是圖10A-圖10C的詳細描述圖10A表示SW鹽酸鹽提高了用polyIC處理後DBA/2小鼠脾臟STAT1的活性。DBA/2小鼠每天接受腹腔注射SW鹽酸鹽(20μg/天)，共10天。第11天，小鼠在處死前2小時注射PolyIC(100μg/鼠)或等體積PBS。收集脾臟和肝臟組織，立即在液氮中冷凍。製備核提取物，用免疫印跡法以指定的抗體進行分析(8μg)。在肝臟上觀察到類似的結果(資料未顯示)。圖10B製備胞質提取物，用免疫印跡法以指定的抗體進行分析。製備脾臟的核提取物並以免疫印跡法以抗磷酸酪氨酸抗體進行分析(8μg)。圖10C對I型IFN誘導劑polyIC的反應中，快速出現STAT激活和激活的STAT的轉化。DBA/2小鼠接受單劑PolIC(100μg/鼠)腹腔注射，在指定時間處死。或者，可採用ELISA或類ELISA試驗檢測人外周血中的STAT水平和激活。用偶聯於鹼性磷酸酶(或其它合適的標記物)的抗STAT抗體檢測結合於已附著在塑料微量滴定板上的DNA啟動子共有序列的STAT二聚物。用本領域已知的方法，將人外周血淋巴細胞溶解，製備細胞提取物。在結合的STAT蛋白與合適的檢測物(例如，若使用鹼性磷酸酶偶聯抗體，可使用與鹼性磷酸鹽反應顯色的底物進行檢測)反應後，對結合的、激活STAT蛋白水平進行定量測定。L.在小鼠肝炎模型上的活性用小鼠C型肝炎病毒(MHV-3)感染小鼠，可測定藥物抗病毒性肝炎的活性。以前用MHV-3的研究集中於發生暴發性肝炎的小鼠系(Balb/cJ)或對MHV-3顯示抗性的小鼠系(A/J)(Yuwaraj等，1996)。對MHV-3感染應答產生慢性肝炎的CH3/HeJ小鼠系單用生理鹽水或單用八氫吲嗪二醇鹽酸鹽(20μg/鼠/天)或合用IFN治療。治療前後測定STAT水平和激活狀況(如「K」中所述)及血清細胞因子水平、病毒負荷和存活率。M.在慢性C型肝炎患者中的活性可通過治療中(如3、6和12個月)測定病毒負荷和血清肝丙氨酸轉氨酶(ALT)的降低來監測慢性C型肝炎患者對八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或八氫吲嗪二醇鹽酸鹽加α-幹擾素治療的反應。用治療前後的活檢也可評估肝組織學改善。八氫吲嗪二醇鹽酸鹽口服給藥，每天兩次，劑量在50-200μg/kg之間，單獨給藥或與α-幹擾素合用，後者劑量為1-3MU，每周三次。在此期間，八氫吲嗪二醇鹽酸鹽可連續給藥或間斷給藥(如給2周，停1周)。將接受八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的患者的反應與接受安慰劑或α-幹擾素的患者相比。通過逆轉錄酶—聚合酶聯反應(RT-PCR)法，用對高度保守的5』-非翻譯區(UTR)特異性的引物作定性檢測，或用合適的內部對照RNA作定量檢測，檢測血清、肝臟和外周血單個核細胞中的C型肝炎病毒RNA。第二種方法是信號擴增或支鏈DNA(bDNA)試驗。將病毒核酸與微量滴定板雜交，與病毒特異性延伸探針反應、再用bDNA聚合物反應。對於肝臟組織學的改善，根據Knodell等開發的計分系統(Hepatology1981，1431-435)的組織學活性指標分成四級門靜脈周圍壞死、小葉間壞死、肝門炎症和纖維變性。或者，可採用基於肝臟炎症反應分級(0-4)和纖維變性分期(0-4)的系統(ScheuerPJ，J.Hepatol1991；13372-374)。N.血液修復/化學保護Oredipe等(1991，同上)和White等(1991，同上)描述了血液修復/化學保護的細胞和動物模型。本發明參照目前認為是較佳的實施例進行描述，應理解，本發明並不限於所公開的實施例。相反，本發明應覆蓋包括在所附權利要求書的精神和範圍內的各種修改和等價排列。所有出版物、專利和專利申請均全文納入本說明書作為參考，其程度仿佛每一出版物、專利和專利申請均具體地、個別地以全文納入本文作為參考一樣。表1八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的原子坐標(×104)和等價同位素替代參數(A2×103).U(eq)定義為正交晶Uij張量痕量的1/3XYZU(eq)N(1)8032(3)9646(3)6106(2)33(1)C(2)6986(5)9036(4)6905(3)48(1)C(3)5928(4)10205(5)7343(3)55(1)C(4)6957(5)11498(5)7671(3)48(1)C(5)8049(4)12062(3)6834(2)38(1)C(5)9065(4)13168(3)7207(2)51(1)C(6)9129(3)10845(3)6465(2)31(1)C(7)10278(3)11045(3)5593(2)33(1)C(7)9428(3)11616(3)4776(2)42(1)C(8)10742(4)9476(3)5379(2)36(1)C(8)11297(3)9197(3)4412(2)47(1)C(9)9150(4)8634(3)5574(3)39(1)Cl5025(1)10142(1)4668(1)48(1)八氫吲嗪二醇的鍵長[A]和鍵角[deg]N(1)-C(2)1.493(4)N(1)-C(9)1.498(4)N(1)-C(6)1.514(4)C(2)-C(3)1.513(6)C(3)-C(4)1.538(6)C(4)-C(5)1.537(5)C(5)-C(5)1.418(4)C(5)-C(6)1.523(4)C(6)-C(7)1.520(4)C(7)-C(7)1.413(4)C(7)-C(8)1.548(4)C(8)-C(8)1.416(4)C(8)-C(9)1.534(4)C(2)-N(1)-C(9)116.8(3)C(2)-N(1)-C(6)112.4(2)C(9)-N(1)-C(6)105.9(2)N(1)-C(2)-C(3)109.3(3)C(2)-C(3)-C(4)112.4(3)C(5)-C(4)-C(3)111.5(3)O(5)-C(5)-C(6)109.6(3)O(5)-C(5)-C(4)108.6(3)C(6)-C(5)-C(4)108.4(3)N(1)-C(6)-C(5)109.2(2)N(1)-C(6)-C(7)101.4(2)C(5)-C(6)-C(7)121.0(3)O(7)-C(7)-C(6)111.4(2)O(7)-C(7)-C(8)109.3(2)C(6)-C(7)-C(8)100.2(2)O(8)-C(8)-C(9)109.4(3)O(8)-C(8)-C(7)115.3(3)C(9)-C(8)-C(7)104.7(2)N(1)-C(9)-C(8)105.3(2)八氫吲嗪二醇氫原子坐標(×104)和同位素替代參數(A2×103)XYZU(eq)H(1)7389(48)10037(38)5663(27)33(8)H(5)7411(49)12410(39)6262(28)47(10)H(6)9704(49)10480(41)7048(28)37(9)H(7)11252(47)11628(39)5760(27)37(9)H(8)11572(42)9195(36)5839(25)28(8)H(21)6370(46)8215(38)6605(27)37(9)H(22)7652(62)8686(47)7342(30)49(12)H(31)5052(63)10540(54)6823(39)68(14)H(32)5321(69)9843(51)7905(37)72(15)H(41)6173(68)12259(51)7869(34)70(15)H(42)7587(69)11289(56)8201(38)71(15)H(91)8558(49)8330(37)4953(28)40(10)H(92)9352(46)7757(36)5942(23)31(8)H(50)9343(70)13606(56)6751(38)65(16)H(70)9520(65)12384(60)4878(40)59(14)H(80)12087(62)9412(51)4425(36)54(14)表2八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽的原子坐標(×104)和等價同位素替代參數(A2×103)。U(eq)定義為正交晶Uij張量痕量的1/3。XYZU(eq)N(1)2781(6)4325(5)3064(3)28(1)C(2)992(6)4319(8)3007(4)38(2)C(3)391(7)5620(9)3648(4)47(2)C(4)981(7)5479(8)4654(4)39(2)C(5)2802(7)5331(8)4707(4)33(1)O(5)3193(5)4981(7)5655(3)53(1)C(6)3322(6)3995(6)4075(4)25(1)C(7)5074(7)3656(6)3922(3)30(1)O(7)5942(4)4996(4)3674(3)34(1)C(8)5017(7)2545(6)3067(4)32(1)O(8)6469(6)2363(5)2578(3)40(1)C(9)3627(9)3153(8)2464(4)41(2)Br2065(1)-250(1)4058(1)42(1)八氫吲嗪二醇的鍵長[A]和鍵角[deg]N(1)-C(9)1.498(7)N(1)-C(2)1.506(7)N(1)-C(6)1.525(6)C(2)-C(3)1.528(9)C(3)-C(4)1.509(8)C(4)-C(5)1.538(8)C(5)-O(5)1.410(6)C(5)-C(6)1.522(8)C(6)-C(7)1.517(7)C(7)-O(7)1.411(6)C(7)-C(8)1.542(7)C(8)-O(8)1.411(7)C(8)-C(9)1.538(8)C(9)-N(1)-C(2)116.2(5)C(9)-N(1)-C(6)105.2(4)C(2)-N(1)-C(6)110.3(4)N(1)-C(2)-C(3)107.2(5)C(4)-C(3)-C(2)113.0(6)C(3)-C(4)-C(5)112.3(5)O(5)-C(5)-C(6)109.1(5)O(5)-C(5)-C(4)107.2(5)C(6)-C(5)-C(4)108.6(5)C(7)-C(6)-C(5)120.6(4)C(7)-C(6)-N(1)101.1(4)C(5)-C(6)-N(1)108.8(4)C(7)-C(7)-N(6)112.3(4)O(7)-C(7)-C(8)109.4(4)C(6)-C(7)-C(8)101.6(5)O(8)-C(8)-C(9)115.1(4)O(8)-C(8)-C(7)115.2(5)C(9)-C(8)-C(7)104.2(4)N(1)-C(9)-C(8)106.1(4)八氫吲嗪二醇氫原子坐標(×104)和同位素替代參數(A2×103)XYZU(eq)H(1)3134(6)5285(5)2897(3)47(5)H(21)576(6)3329(8)3217(4)47(5)H(22)649(6)4493(8)2359(4)47(5)H(31)734(7)6607(9)3391(4)47(5)H(32)-763(7)5610(9)3650(4)47(5)H(41)500(7)4576(8)4946(4)47(5)H(42)649(7)6384(8)5010(4)47(5)H(5)3314(7)6299(8)4509(4)47(5)H(50)4162(6)4997(78)5719(12)53(12)H(6)2800(6)3046(6)4295(4)47(5)H(7)5539(7)3146(6)4477(3)47(5)H(70)6500(64)5262(47)4122(18)53(12)H(8)4709(7)1523(6)3307(4)47(5)H(80)6686(42)3168(27)2298(40)53(12)H(91)4020(9)3629(8)1887(4)47(5)H(92)2914(9)2313(8)2295(4)47(5)表3表4SW鹽酸鹽、SW游離鹼和SW氫溴酸鹽的穩定性條件SW-HCLSW氫溴酸鹽(a)99.4％99.3％71.1％(b)100.9％20.0％*88.3％(c)101.2％9.7％*92.1％(d)103.2％98.5％95.5％(e)101.9％102.5％91.4％表5八氫吲嗪二醇鹽酸鹽(SW＝八氫吲嗪二醇)的其它物理性質表6最佳方形平面八氫吲嗪二醇鹽酸鹽(由N1，C9，C8，C7所界定的平面)從平面的原子衍射N10.052C9-0.079Rms0.066C80.078C7-0.050C6超出上述平面0.0671八氫吲嗪二醇二乙酸鹽從平面的原子衍射N10.023C9-0.034Rms0.029C80.034C7-0.022C6超出上述平面0.644八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽從平面的原子衍射N10.042C9-0.064Rms0.053C80.062C7-0.040C6超出上述平面0.673表7SW和SWHCl樣品在D2O中的1H化學位移質子化學位移(ppm)SWSWHCl14.1254.36824.2174.5093a2.7543.3063』a2.4203.3795eb2.7753.4175a1.8262.8056e1.5871.9046a1.3841.6397e1.9272.0887a1.1051.38783.6683.93191.7852.959a.五元環中，質子3和3』分別對應於假平狀和假軸向位。b.估算出的因SW中H-3和SWHCl中H-3』重疊而致化學位移。表8SW和SWHCl樣品在D2O中選擇的1H-1H偶聯常數質子偶聯常數(Hz)SWSWHCl3J1，25.94.71，93.72.62，32.54.62，3』7.99.05a，6e2.93.45a，6a11.512.58，7e4.74.58，7a9.510.78，911.110.22J3，3』-11.0-12.75e，5a-12.5-12.83J1，5e0.7表9SW和SWHCl樣品在D2O中的13C化學位移碳化學位移(ppm)SWSWHCl169.468.1268.768.1360.358.1551.351.3622.921.1732.230.6866.063.7972.572.0表10碳NMR和APT譜帶指定簡表化學位移碳原APT試探性(δ)(ppm)子數C-型指定21.141CH2630.601CH2751.291CH2558.141CH2363.671CH868.052CH1，271.951CH9表11定量微量分析結果簡表八氫吲嗪二醇鹽酸鹽C8H16CINO3SCR理論值實測值碳(％)145.8345.89氫(％)17.697.88氮(％)16.686.73氯(％)216.9117.21氧(％)322.8922.29水分(％)40.000.21剩留溶劑(％)5異丙醇(％)0.0000.203乙醇(％)0.000ND四氫呋喃(％)0.000ND甲苯(％)0.000ND灰分(％)(6)0.000.02(1)由燃燒分析測得(TP10812)(2)由電勢滴定分析測得(TP10812)(3)從差值計算得出(4)在Phoenix實驗室用庫侖費歇爾滴定法測得(5)用HeadspaceGC分析法測得(Phoenix實驗室測試共16種有機溶劑)，ND＝未測(6)根據美國藥典281測得，灼燒殘渣(TP18038)表12紅外光譜帶指定簡表頻率(cm-1)試探性指定3300-3500-O-H伸展(醇)3150-3300-N-H伸展(胺)2800-3050-C-H伸展(脂族)3007-C-H不對稱伸展(亞甲基)2850-C-H對稱伸展(亞甲基)2769-N-H伸展(叔胺鹽)1646-N-H不對稱形變(胺鹽)1462-C-H對稱彎曲(環己烷)1442-C-H對稱彎曲(環戊烷)1412-O-H平面彎曲(醇)1354-O-H平面彎曲(醇)1308-N-H對稱形變(胺鹽)1000-1250-C-C和-C-N伸展1090-C-O伸展(仲胺)894-C-H巖石848-N-Hwag749-C-C骨架振動表13質譜裂解圖概要CI(CH4)可能的指定174M+1(母核，游離鹼)156M-18(失去一分子水)138M-36(失去二分子水)120M-54(失去三分子水)113M-61(失去C2H5N+H2O)表14SW或SWHCI對來自2×105個有核BM細胞的早期紅細胞集落生長的影響>*數據是一式三份計數的平均CFU-E±SD。**P，用雙尾Studentt檢驗測得與對照組的差異。權利要求1.穩定的結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽。2.如權利要求1所述的結晶形八氫吲嗪二醇氯化物鹽，包含通過氫鍵相互作用連接在一起的八氫吲嗪二醇氯化物鹽分子。3.如權利要求1所述的結晶形八氫吲嗪二醇溴化物鹽，包含通過氫鍵相互作用連接在一起的八氫吲嗪二醇溴化物鹽分子。4.如權利要求1所述的結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽，所述鹽在一個單胞中包含4個八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽分子。5.如權利要求1所述的結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽，所述鹽包含八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或氫溴酸鹽分子。6.如權利要求5所述的結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，其中八氫吲嗪二醇鹽酸鹽分子通過第一個八氫吲嗪二醇鹽酸鹽分子的氮原子和氧原子與其它八氫吲嗪二醇鹽酸鹽分子的氯離子之間的氫鍵相互作用而連接在一起。7.如權利要求5所述的結晶形八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽，其中八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽分子通過第一個八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽分子的氧原子與其它八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽分子的溴離子之間的氫鍵相互作用及第一個分子的氮原子與第二個八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽分子的氧原子之間的氫鍵相互作用連接在一起。8.如權利要求1所述的結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽，所述鹽具有對稱P212121晶架群。9.如權利要求5所述的結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或氫溴酸鹽，所述鹽具有對稱P212121晶架群。10.如權利要求9所述的結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽或氫溴酸鹽，其中單胞為正交晶系。11.如權利要求10所述的結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，其中單胞長度a＝8.09±0.01，b＝9.39±0.01，c＝13.621±0.01。12.如權利要求10所述的結晶形八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽，其中單胞長度a＝8.40±0.01，b＝8.63±0.01，c＝14.12±0.01。13.如權利要求11所述的結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽，所述鹽具有如表1所示的原子坐標。14.如權利要求12所述的結晶形八氫吲嗪二醇氫溴酸鹽，所述鹽具有如表2所示的原子坐標。15.一種組合物，包含穩定的結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽。16.如權利要求15所述的組合物，其中氯化物或溴化物鹽為鹽酸鹽或氫溴酸鹽。17.製備如權利要求5所述結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽的方法，其特徵包括用鹽酸處理八氫吲嗪二醇丙酮化合物，用結晶法提純滷化物鹽，而不作色譜分離，得到結晶形八氫吲嗪二醇鹽酸鹽。18.在受治療者身上刺激免疫系統、治療增殖性疾病或微生物或寄生蟲感染的方法，其特徵包括給予受治療者有效量的權利要求15所述的組合物。19.治療癌症的方法，其特徵包括給予受治療者有效量的權利要求15所述的組合物。20.如權利要求19所述的方法，其中治療包括抑制轉移或新生物生長。21.刺激造血祖細胞生長的方法，其特徵包括給予受治療者有效量的權利要求15所述的組合物。22.如權利要求21所述的方法，其中患者已給予骨髓抑制劑或是骨髓移植的接受者。23.在受治療者身上治療病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染的方法，其中病原體的清除需要Th1應答，該方法的特徵包括給予受治療者有效量的權利要求15所述的組合物。24.治療C型肝炎的方法，其特徵包括給予受治療者有效量的從八氫吲嗪二醇游離鹼、八氫吲嗪二醇滷化物鹽或其混合物配製而成的組合物。25.增強疫苗免疫原性的方法，其特徵包括給予權利要求1所述的穩定的結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽。26.用純化的權利要求1所述結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽或其一部分的原子坐標估算高爾基體α-甘露糖苷酶II抑制的化學本質的方法。27.純化的權利要求1所述結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽在製備用於刺激免疫系統、治療增殖性疾病或微生物或寄生蟲感染的藥物組合物上的應用。28.純化的權利要求1所述結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽在製備用於治療癌症的藥物組合物上的應用。29.純化的權利要求1所述結晶形八氫吲嗪二醇氯化物或溴化物鹽在製備疫苗上的應用。全文摘要結晶形八氫吲嗪二醇鹽及使用該鹽的方法。文檔編號A61K31/437GK1260796SQ98806196公開日2000年7月19日申請日期1998年4月15日優先權日1997年4月15日發明者J·W·丹尼斯,R·N·沙阿,L·齊斯爾申請人:格力可設計股份有限公司