腫瘤壞死因子拮抗劑及其在子宮內膜異位症上的應用的製作方法

2023-12-05 17:49:51

專利名稱：腫瘤壞死因子拮抗劑及其在子宮內膜異位症上的應用的製作方法
技術領域：
以腫瘤壞死因子拮抗劑的治療有效量給藥治療和/或預防子宮內膜異位。本發明的拮抗劑一般在多種分子中選擇。但優選的是可溶性TNF受體。該類拮抗劑對子宮內膜異位損害的退化有用。如與其他活性成分合用可使相關的疾病如不育症得以改善。
背景技術：
子宮內膜異位是婦女生殖系疾病，其特點為由於子宮內膜腺和子宮內膜腔外基質以及子宮肌肉系統的存在。最常受影響的解剖學部位為卵巢、子宮骶骨的韌帶、骨盆的腹膜、直腸陰道隔、子宮頸、陰道、輸卵管及外陰。一般子宮內膜異位似從直腸陰道隔較深地浸潤下面組織而表面看不到，有時子宮內膜異位的病灶能出現於卵巢外的部位，如肺、膀胱、皮膚、胸膜及淋巴結。子宮內膜異位是進行性的在開始時看到為透明的囊泡，然後在數年內變成紅色並進展為黑色的纖維化損害(MacSwee，1993)。
子宮內膜異位被認為是良性疾病，但子宮內膜的損害有時會變惡性，與其他惡性疾病一樣，由子宮內膜異位衍生的腫瘤是由於並發活動包括生長因子和/或致癌基因調節的變化而發生的。
子宮內膜異位是屬於流行於育齡婦女中最常見的婦科疾病，此病見於育齡婦女的約5-10％(Barbieri，1988)。子宮內膜組織完全依靠雌激素而繼續生長，在異位部位也是如此。因而，子宮內膜異位在婦女缺少雌激素的月經初期前和絕經期後罕見，子宮內膜的激素敏感是某些常見症狀如骨盆疼痛和痛經的基礎。
子宮內膜異位源自於子宮內膜細胞，從子宮播散到其他的能生存細胞可移植和生長的部位。初始細胞的散布曾有二種可能性機制解釋。逆行月經為在有月經周期婦女的普通現象，可使分離的子宮內膜碎片通過月經回流液到達生殖器附近的結構，或者，子宮內膜細胞可以通過子宮靜脈播散並經過淋巴系統擴展(血行或淋巴播散)，以解釋生殖器結構部位外子宮內膜異位的發生。婦科手術也能發生這些播散(MacSween，1993)。
除了子宮內膜細胞播散外，其他因素諸如遺傳體質(Malinak等，1980)，以及免疫學上的變化(Ho等，1997)可決定婦女對子宮內膜異位的易感性。由於子宮內膜細胞在所有婦女的月經期的腹膜液中常能見到，因此，哺乳動物應能以與免疫系統有關的方法防止子宮內膜異位的發生。一般，逃避宿主免疫反應並有足夠雌激素刺激的子宮內膜細胞可以增生，形成大的、肉眼可見的病灶，子宮內膜異位因而被認為是一種動態過程，存在的損害可生長或被宿主的免疫反應消滅，而新的病灶不斷地形成。
通常與子宮內膜異位相伴隨的炎症反應，因其增加了腹膜液的容量及腹膜巨噬細胞的數量和活力而改變腹膜的環境。因此，有人提出單核細胞/巨噬細胞系統在子宮內膜異位的發生中起關鍵作用。巨噬細胞的分泌產物包括RANTES(Hornung等，1997)、白介素-6(Harada等，1997)、白介素-8(Arici等，1996a)、α-腫瘤壞死因子(Overton等，1996)、單核細胞趨化性蛋白-1(Arici等，1997)在患有這種疾病的婦女的腹膜液中被發現存在的濃度較高。患有子宮內膜異位症的婦女的免疫變化已有闡述，但它們是子宮內膜異位的起因還是子宮內膜異位所致炎症的結果則未闡明(Rana等，1996)。
關子宮內膜異位及其與其他疾病相關性的知識至今有限，甚至診斷水平亦如此。雖然子宮內膜異位被認為是不育症的主要病因，但對該疾病的病理生理學研究是矛盾的且未確定的。由於早期的損害代謝活躍，疼痛或不育症的程度與疾病的嚴重程度間的相關性不大。不育率高於正常群體，並在家兔研究中表明手術誘發子宮內膜異位後使生育力從75％下降至25％(Hahn等，1986)。現今發現患有骨盆疼痛的病人有71％有內膜異位，而84％的骨盆痛及不育症的患者診斷患有子宮內膜異位(Koninckx等，1991)。通常當子宮內膜異位擴展到正常的陰道結構被破壞時可發生不育症，同時當子宮內膜異位在最低限度時妊娠率正常。
子宮內膜異位影響生育也有不同途徑。如白介素-6、幹擾素和腫瘤壞死因子等白細胞信使都增加，反過來影響卵母細胞-精子的相互作用。從子宮內膜異位的婦女取得的血清樣品在小鼠胚胎模型上發現有胚胎毒性，並在體外能抑止精子的移動(Halme，1991)，當加入重組α-腫瘤壞死因子後效力增強(Eisermann，1989)。但是，這些研究並未說明細胞因子如何影響子宮內膜異位的進展而僅顯示了這些分子對精子活力和胚胎細胞的影響。
激素療法和手術是當今用於治療子宮內膜異位的兩種治療方式，對子宮內膜異位的現代藥理學治療需要抑制雌激素的產生，使低激素環境阻斷異位組織的生長。關於對子宮內膜異位相關的不育症的治療，激素療法對最輕病症未證實其益處，而其他研究顯示它可提高妊娠率(Arici等，1996b)。
激素療法包括高劑量的孕激素、雌激素與孕酮的混合物(在一個「假妊娠」的治療方案中採用高劑量口服避孕藥丸劑或OCP)、達那唑(Danazol)(一種炔孕酮的雄激素衍生物)和最近的GnRH激動劑。這些激素治療對骨盆疼痛有效並導致病灶實質性退化，但有一些凹痕。雌激素可刺激及造成子宮內膜異位組織的增生，可能由於其對孕酮不能反應，甚至在高劑量亦然，因此OCP可對有限的病人提供部分的緩解(Dawood，1993)，促孕劑可引起不規則出血(50％)伴有抑鬱、體重增加及液體滯留。達那唑抑制子宮內膜異位引起的多種反應，包括在血清中可溶性α-腫瘤壞死因子、白介素-1β和CD8水平的降低(Matalliotakis，1997；Mori，1990)，甾體重新生成的抑制和從其受體上取代雌二醇。達那唑能在近66-100％的疼痛患者中改善症狀，但4年後自然復發率約為40-50％。達那唑治療的其他缺點為體重增加和雄激素類副反應，可使多達80％的患者放棄這種治療(Barbieri，1988)。GnRH類似物較天然GnRH更為有效和長效，其作用為去除使所有雌激素敏感組織生長的雌激素刺激物。GnRH類似物的副反應主要繼發於深度血雌激素過少，如骨密度下降，五年後的復發率高達50％(Waller和Shaw，1993)。
根據病情，如希望生育，外科手術可以保守性，嚴重病例可切除子宮、輸卵管和卵巢。在任何情況下，即使有限的外科治療也可導致生育率顯著下降。手術後妊娠率一般為35～65％，因此患者需要排卵誘導和子宮內受精以達到正常受孕(Koninckx和Martin，1994)。臨床報告表明在剖腹術和子宮內膜增生切除後，多達40％的患者在五年內需再手術。甚至在過分的外科手術後，子宮內膜異位引起的疼痛復發始終是一個顯著的問題。外科治療失敗的一些原因可能包括病灶的切除不完全，或未認識到或完全遺漏。許多病灶是顯微的，即使用腹腔鏡放大後肉眼也不能看見。因此，單用手術不能期望能治癒該疾病(Revelli等，1995)。
由於許多子宮內膜異位症患者受患於傳統治療的缺點(包括激素不平衡的後果、高復發率及不育症)，因此致力於提供子宮內膜異位的其他治療。一種可能的治療方法為以使用免疫調節分子為代表，它能改善子宮內膜異位損害和免疫狀況。該方法對治療一般症狀被認為是適宜的(Rana等，1996)，但無實驗證據表明在子宮內膜異位後表達水平改變的一些細胞因子中何種為優選的治療介入的目標。
如前所述，子宮內膜異位炎症反應中涉及一些巨噬細胞分泌產物之一為腫瘤壞死因子(以後簡稱TNF)。TNF也定義為惡液質素，是一種由活性T細胞和巨噬細胞釋放的多效性細胞因子。TNF是幹擾素、白介素和集落刺激因子細胞因子網絡中的一員，通過誘導很多炎症前變化，包括其他細胞因子和粘著分子的產生，而在與許多感染和炎症的發病機理有關的信號系統中，TNF起著關鍵作用(Fiers，1991)。
為了方便起見，在本發明申請的全文中，術語TNF表示來自動物或人的α或β-腫瘤壞死因子，及其天然存在的α-TNF等位基因的集合(Pennica等，1984)。β-TNF也名淋巴毒素，具有同樣的活性，但由不同類型細胞(淋巴細胞及天然殺傷細胞)在對抗原性或促有絲分裂的刺激發生應答時產生(Gray等，1984)。
TNF作為成熟的17KDa蛋白被表達，以三聚物的形式起作用。該複合物集合細胞表面的受體而發揮其生物活性，這些受體在不同的器官及組織介導特定的效應。在子宮內膜，TNF表達是在位的和月經周期依賴性的(Hunt等，1992)，並在實驗動物的子宮內膜中導致細胞調亡(Shalaby等，1989)。用TNF預處理間皮細胞後，子宮內膜基質細胞與間皮細胞的粘連顯著地增加(Zhang等，1993)，由此支持了TNF可能對子宮內膜異位的發生和/或發展起作用的觀點。
TNF通過結合一類膜結合受體分子，包括文獻中定義為TNF-RI的p55TNF受體I，和文獻中定義為TNF-RII的p75 TNF受體，以發揮其正常發育及免疫系統功能所需的活性(Bazzoni和Beatler，1996)。TNF-RI轉導TNF信號的優勢被假定為激動對受體特異的抗體以模擬大部分TNF誘導的反應的能力(Shalaby等，1990)。TNF結合到其膜結合受體後經過諸如TRADD和TRAP-1(TNF-RI)或TRAF-1和TRAF-2(TNF-RII)的胞漿調節劑觸發信號通道，導致不同的細胞反應，如T細胞增殖、體外腫瘤細胞溶解、皮膚壞死、胰島素抗性和細胞調亡。兩種TNF受體的細胞外部分均可脫落，這些可溶性受體保持結合TNF的能力，與TNF形成高親和力的複合物使TNF失活，從而減少TNF對靶細胞膜受體的結合(Nophar等，1990)。
小鼠在給予雌二醇和/或黃體酮後，在子宮內膜，膜結合TNF受體水平受影響，造成暫時的和細胞類型特異性TNF-RI的表達(Roby等，1996)。但是，這些研究與涉及子宮內膜異位的各種模型上進行的其他研究一樣，在子宮內膜異位病灶的發展過程中，對TNF和TNF-RI的真正體內效應，不論是膜一結合或可溶性，都沒有給出任何提示，僅對子宮內膜異位有關的免疫學異常作了敘述。
發明概述本專利申請基於這樣的假定，即TNF拮抗劑可以通過隔絕循環TNF，阻斷子宮內膜異位損害的進展。該假定由實施例中研究報告所確證，該報告表明在大鼠實驗模型中TNF拮抗劑明顯地減小子宮內膜異位樣病灶。作為申請者的研究結果，在此提供了在個體治療和/或預防子宮內膜異位的方法，包括給予治療有效量的TNF拮抗劑。
在第二個實施方案中，本發明涉及在個體中治療和/或預防與子宮內膜異位相關的不育症的方法，包括以TNF拮抗劑治療有效量與其他藥物組合的給藥。
本發明的另一個目的是將TNF拮抗劑與藥學上可接受的載體用於製備治療子宮內膜異位的藥物組合物。
在本發明中，TNF拮抗劑的給藥可以是非胃腸道或其他有效的配方。非胃腸道給藥的任何方式包括靜脈內、肌內和皮下給藥都合適。除了藥學上可接受的載體外。本發明的組合物還可含有少量的添加劑，諸如穩定劑、賦形劑、緩衝劑和防腐劑。
在本發明方法中有用的TNF拮抗劑包括可溶性TNF受體分子、抗-TNF抗體和預防和/或抑制TNF受體發出信號的化合物。可以單獨使用TNF拮抗劑或與其他TNF拮抗劑配合使用。與一種或多種藥學活性產品配合也可以，特別用以改善子宮內膜異位相關的不育症患者的狀況。
發明的描述本發明在此清楚地顯示在大鼠實驗模型中用TNF拮抗劑隔絕(sequestering)TNF(此為患子宮內膜異位症後的腹膜液內幾種細胞因子中唯一的其表達水平增加者)減輕子宮內膜異位樣病灶，得到意想不到的結果。這個模型還證明了在不明顯影響激素平衡和自然殺傷細胞活力的情況下獲得此效果。用TNF拮抗劑減輕子宮內膜異位損傷且還能改善生育率，因為生殖結構的正常化在植入率上有積極的效果。
因此，本發明的主要目的是提供在個體中給予治療有效量的TNF拮抗劑以治療和/或預子宮內膜異位的方法。
在第二個實施方案中，本發明涉及在個體中給予治療有效量的TNF拮擠劑與其他藥物的組合以治療與子宮內膜異位相關的不育症狀況的方法。
本發明的另一個目的是用TNF拮抗劑配以藥學上可接受的載體用於製備治療和/或預防子宮內膜異位的藥物組合物。用這種方法製備藥物組合物也是本發明的另一個目的。
本申請要求保護的組合物的活性成分為TNF拮抗劑。要求保護的TNF拮抗劑以一種或兩種方式發揮其作用。第一，拮抗劑以其足夠的親和力及特異性自身結合於或隔絕TNF分子以實質地中和負責TNF受體結合的TNF表位(以後稱為「隔絕拮抗劑」)。此外，TNF拮抗劑可以抑制在TNF結合後由細胞表面受體活化的TNF信號通道(以後稱為「信號拮抗劑」)。按照本發明，在治療子宮內膜異位上此兩種拮抗劑不論單獨或一起使用都是有用的。
TNF拮抗劑可用常規從待選物中篩選出其在體外易感細胞系(例如人類B細胞，TNF可使增殖並分泌Ig)上對天然TNF的活性，容易地鑑別和評定其效果。測定包括不同稀釋程度的待選拮抗劑的TNF製劑，例如，在測定中所用的TNF摩爾量的0.1至100倍，對照組不加TNF或僅加拮抗劑(Tucci等，1992)。
隔絕拮抗劑是本發明的優選TNF拮抗劑。在隔絕拮抗劑中以高親和力結合TNF和低免疫原性的多肽為優選。可溶性TNF受體分子和TNF中和抗體為特別優選。可溶性TNF受體分子和中和TNF抗體為特別優選。例如，TNF-RI和TNF-RII在本發明中有用。按照本發明，這些受體的截短形含有受體的細胞外結構或其功能部位的為特別優選的拮抗劑。TNF受體的截短形為可溶性的且在尿和血清中檢出為30kDa和40kDa TNF抑制結合蛋白，原名分別為TBPI和TBPII(Engelmann等，1990)。受體分子的衍生物、片斷、區域和生物活性部分功能性地組成了能用於本發明的受體分子。受體分子的一些生物活性等同物或衍生物指所述多肽的部分，或編碼受體分子的序列，其具有足夠的大小，並能與TNF結合，其親和力使與膜結合TNF受體的相互作用受抑制或阻斷。在一個優選的實施方案中，人可溶性TNF-RI是對患者投藥的TNF拮抗劑。天然的和重組的可溶性TNF受體分子及其製備方法在歐洲專利申請EP308,378，EP98,327和EP433,900中已有闡述。
本發明方法中有用的受體分子的另一些例子是TNF受體多亞基(multimeric)分子和TNF免疫受體融合分子。本發明中有用的TNF受體多亞基分子包括通過一個或多個多肽連接物連接的兩個或多個TNF受體的細胞外結構的全部或一個功能部分。多亞基分子還可包括一個分泌性蛋白的信號肽以直接表達多亞基分子。這些多亞基分子及其產生方法已在歐洲專利申請EP526,905中敘述。
本發明方法中有用的TNF免疫受體融合分子含有一個或多個免疫球蛋白分子的至少一部分及一個或多個TNF受體的全部或功能性部分。這些免疫受體融合分子可以裝配成單體或異多亞基或同多亞基。免疫受體融合分子亦可為單價或多價。TNF免疫受體融合分子及其產生方法曾在歐洲專利申請EP620,739，相應於PCT專利申請WO94/06476中敘述。
本發明方法中有用的另一類隔絕拮抗劑以抗TNF抗體為代表，包括單克隆、嵌合人源化和重組抗體及其片斷，其特徵為在體內高親和力地與TNF結合和低毒性。可用於本發明的抗體其特徵是對患者進行足夠時間的治療使子宮內膜異位的損害退化有效至良效，減輕症狀和低毒性。中和抗體可由TNF免疫兔或小鼠等動物而容易地產生。免疫小鼠特別有用於提供B細胞的來源，用於製造雜交瘤，再經培養產生大量的抗TNF單克隆抗體。嵌合抗體為免疫球蛋白分子，其特徵為具有二個或多個來自不同動物種族的片段或部分。通常嵌合抗體的可變區來自非人類的哺乳動物抗體如鼠單克隆抗體，免疫球蛋白恆定區來自人的免疫球蛋白分子。優選地，二個區域及其組合具有常規測定的低免疫原性(Elliott等，1994)。人源化抗體是由基因工程技術製造的免疫球蛋白分子，其中鼠恆定區用人的對應部分替代而保留鼠的抗原結合區域。生成的鼠—人嵌合抗體對人類有降低免疫原性及改善藥代動力學(Knight等，1993)。在本發明方法中有用的優選的高親和力單克隆抗體及其嵌合衍生物的例子在歐洲專利申請EP186,833和PCT專利申請WO92/16553中敘述。
TNF拮抗劑可由多種途徑對個體給藥。給藥途徑包括皮內、經皮(例如，在緩釋製劑中)，肌內、腹腔內、靜脈、皮下、口服、硬膜外、局部及鼻腔內途徑。任何其他治療有效的給藥途徑均可應用，例如通過上皮或內皮組織吸收或通過基因治療，其中，將編碼TNF拮抗劑的DNA分子對患者投藥(如通過載體)使TNF拮抗劑在體內表達和分泌。此外，TNF拮抗劑可與其他生物活性劑如藥學上可接受的表面活性劑、賦形劑、稀釋劑或任何其他載體一起給藥。
「藥學上可接受」的定義指包括任何不影響活性成分生物活性的有效性和對服藥的宿主無毒性的載體。例如，TNF拮抗劑可在諸如鹽水、右旋糖溶液、血清白蛋白及林格氏液中配製成單劑量注射劑型供非胃腸道給藥。
TNF拮抗劑可與藥學上可接受的非胃腸道用載體(如水、鹽水、右旋糖溶液)和維持等滲的添加劑(如甘露醇)或化學穩定劑(如防腐劑和緩衝劑)一起配伍成溶液、混懸劑、乳劑或凍乾粉，供非胃腸道(如靜脈、皮下、肌內)給藥。製劑用常用技術滅菌。
可用接合方法使在人體內的半衰期增加而改善TNF拮抗劑的生物利用度，例如在PCT專利申請WO92/13095所述將此分子與聚乙二醇結合。
TNF拮抗劑的治療有效量是許多變量的函數，包括拮抗劑的類型、拮抗劑對TNF的親和力、拮抗劑顯示的任何殘留細胞毒性、給藥途徑、患者的臨床狀況(包括維持內源性TNF活性的無毒性水平的需要性)、隔絕劑中多個TNF結合部位的存在，如抗體。
「治療有效量」為注射後該TNF拮抗劑引起TNF生物活性抑制的劑量。給予個體單劑或多劑量時，給藥劑量根據多種因素而不同，包括TNF拮抗劑的藥代動力學性質、給藥途徑、患者狀況和特性(性別、年齡、體重、健康狀況、體型)、症狀程度、並存的治療、治療頻率和期望的效果。已建立的劑量範圍的調節和操作是在本領域技術人員的能力之內及測定個體TNF抑制的體外和體內方法範圍內的。
由於在人臨床試驗中TNF最大耐受劑量範圍達約25微克/米2體表面/24小時，拮抗劑的給藥劑量通常不需要超過中和該TNF量計算所得的劑量。因而TNF拮抗劑的摩爾劑量可以變化約從0.001至10倍於TNF最大耐受摩爾劑量，儘管如上所述它在很大程度上受治療離散性的影響。
此外，在臨床研究中所得的數據，其中罹患子宮內膜異位婦女的腹膜液中TNF濃度的增加已用多種方案證明(Eisermann等，1988；Halme，1991；Overton等，1996)，也可用於對擬給藥的TNF拮抗劑有效劑量的測定。
通常活性成分的每日劑量可為每公斤體重約0.01至100毫克。一般每日每公斤體重1-40毫克，分次或以緩釋劑型給藥，可有效地得到期望的結果。對個體的第二次或以後的給藥可以用相同的、少於或大於開始劑量或以前的劑量。第二次或以後的給藥可以在子宮內膜異位或有關症狀復發前給藥。術語「復發」或「再出現」定義為包括子宮內膜異位症狀的一次或更多次的出現。
TNF拮抗劑可以對個體在以其他治療方案或製劑(如多種藥物治療方案)治療之前、同時或相繼以治療有效量進行預防或治療，特別對不育症的治療。TNF拮抗劑在與其他治療劑同時給藥時可以同一組合物或不同的組合物給藥。特別在希望治癒子宮內膜異位伴有的不育症時，可以給予生物活性人絨毛膜促性腺激素(hCG)、黃體化激素(LH)或卵泡刺激素(FSH)，以天然的高度純化形式或以重組形式給藥。這些分子及其製備方法曾在歐洲專利申請EP160,699，EP211,894和EP322,438中敘述。
本發明現在可用實施例說明，該實施例並不企圖以任何方式限制本發明，並參照附圖進行說明。


圖1表示抗排卵肽(2毫克/公斤，每3日皮下給予)，重組可溶性TNF-RI(10毫克/公斤，一星期內分二個日劑量皮下給予)對實驗性子宮內膜異位大鼠在最後一次治療後2天及9天的移植物大小的治療效果。這些數據得自每組6個動物的第一次處死時間點和每組5個動物的第二次處死時間點，代表平均抑制百分率±SEM。
圖2表示重組可溶性TNF-RI(10毫克/公斤皮下注射，一周內分二次每日劑量給藥)和抗排卵肽(2毫克/公斤皮下注射，每三日給藥一次)在最後治療後二天(組A)和9天(組B)大鼠脾細胞對YAC細胞的大鼠NK活性(釋放51Cr)的效應。數據代表平均溶解百分率±SEM。
圖3表示與對照組及抗排卵肽(2毫克/公斤皮下注射，每3天給藥一次)相比，重組可溶性TNF-RI(10毫克/公斤皮下注射在一周內分二個日劑量給予)對大鼠實驗性子宮內膜異位的17β-雌二醇血清水平的影響。數據代表17β-雌二醇的平均濃度±SEM。
實施例材料及方法動物雌性Sprague-Dawley大鼠(250-275克)購自義大利Charles River(Calco，Lecco，義大利)。動物在如下環境中飼養溫度22±2℃，相對溼度55±10％，通過HEPA99.997％過濾器以每小時15±3次換氣通風，用24小時周期內12小時(700-1900)進行人工照明。實驗前動物在該環境中適應至少一周。動物用標準粒狀飼料任意進食飼養。
研究藥物抗排卵肽由Bachem(加州，美國)製備和提供，實施例中所用的人重組可溶性TNF-RI分子具有相當於人TNF-RI片段20-180的序列(Nophar等，1990)，在CHO細胞中製備並由Interpharm Laboratories Ltd.(以色列)以r-hTBP-1的名稱提供。
材料通用細胞培養材料系購自Gibco BRL，Life Technologies(Paisley，英國)。17β-雌二醇RIA藥盒購自DPC(Los Angeles CA，美國)。Inoketam購自Virbac(Carros，法國)。[51Cr]鉻酸鈉購自NEN Dupont(Boston，MA，美國)。Rompun購自Bayer AG(Leverkusen，德國)。絲縫線7.0購自Ethicon(Pomezia，義大利)。
大鼠子宮內膜異位實驗模型用以前曾敘述過的實驗模型(Jones，1987)經過稍許改良以探查重組可溶性TNF-RI在子宮內膜異位中的作用。在Inoketam/Rompun的麻醉下，從右子宮角切下自體子宮內膜組織片段(長1公分)放入37℃的PBS中。縱向切開子宮部分，不除去子宮肌層而將5×5釐米的切片四角用非吸收性絲縫線移植至腹壁內表面上。
子宮內膜異位實驗模型中研究藥物效果的探察術如上所述，在麻醉大鼠上手術引發實驗性子宮內膜異位。此外，另一組大鼠從一個子宮角同樣移除一個片段，但植入5×5釐米見方的子宮周圍的脂肪(假手術組)。另一組大鼠不經任何手術作為正常對照組。在引發子宮內膜異位後三個星期，動物接受第二次剖腹(治療前剖腹)以評價異位子宮內膜組織的大小和存活力。用卡尺測量並記錄表面積(長×寬)。移植物存活的動物如表1中所示歸納入指定的治療組，由此在實驗結束時得到第一次處死時間點每組六個動物及第二次處死時間點每組五個動物。治療在一周的恢復期後開始進行。對照組單給鹽水，另一組用以前提出的給藥方案每三天接受皮下注射抗排卵肽2毫克/公斤共三次，以抑制卵巢和下丘腦的活性(Sharpe等，1990)。另外一組在一星期內接受10毫克/公斤重組可溶性TNF-RI，分成兩個日劑量給藥。
表1

(1)從手術移植之日起(第1天)在指定的處死時間點(末次治療後的第2和第9天，即手術移植後的36和43天)，將動物麻醉，從腹主動脈採集血樣，分離出血清貯於-20℃直至測定雌二醇-17β水平。切下脾臟，用於測量自然殺傷細胞(NK)活性。在每個處死時間點測定子宮內膜異位樣病灶的表面積。為了使數據標準化，對治療前剖腹值的變化百分率由下式計算X-XoXo100]]>式中Xo為治療前剖腹時的大小，X是處死時的大小，然後計算每組中變化百分率的平均值。
NK活性測定用51Cr-釋放試驗測定NK活性程度。在對數生長期收集小鼠淋巴瘤YAC-1細胞，用培養基(RPMI1640，含青黴素/鏈黴素、L-穀氨醯胺和10％熱滅活的胎牛血清)洗滌一次。細胞小粒用100微居裡的[51Cr]-鉻酸鈉於37℃、5％CO2中培養2小時。然後用10ml的試驗培養基將細胞洗滌三次，再以合適的濃度重新懸浮並在大鼠脾細胞存在下加至測定平板中。在加入51Cr-標記靶細胞前將其以合適濃度(2×106毫升)再懸浮在試驗培養基中，在U形底的96孔平板中以一式三份用試驗培養基進行系列稀釋。測定板每個孔中加入51Cr-標記的靶細胞(5×103)。每個樣品以三種效應物靶比例(200∶1，100∶1和50∶1)進行測定，含效應物靶細胞混合物的板以200×g離心4分鐘後在37℃、5％CO2中培養4小時。再將板在200×g離心4分鐘後，從每個孔中取出20微升上清液移至玻璃纖維濾器中，用β-計數器估測其相應的放射性。
按下式計算溶解百分率 此處cpm樣品＝有效應細胞存在下的51Cr釋放平均值cpmspont＝在培養基存在下的51Cr釋放平均值cpm總＝有1％Triton-X100存在下靶細胞的51Cr釋放平均值17β-雌二醇的測定用市售藥盒測定血清17β-雌二醇濃度可不經提取步驟以定量血清中的雌二醇(DPC，Los Angeles，CA，美國)。簡言之，125I-標記的雌二醇與血清樣品中的雌二醇競爭抗體位置。培養後用傾出法從游離的雌二醇中隔絕出結合的雌二醇。試管在伽碼計數器(LKB-Pharmacia Wallak)中計數，計數值與血清樣品中存在的雌二醇量呈逆相關。將計數值與校正曲線比較，測得樣品中雌二醇的量。抗血清對雌二醇高度特異，較其他天然來源的甾體有相對低的交叉反應性。從同一實驗活動中來的樣品在一次免疫測定中進行分析。
統計分析用Statgraphics Plus軟體(1.4版)中的ANOVA對治療組中觀察到的差異進行統計學顯著性評價，進行Tukey’s多重範圍試驗(p＜0.05)。
結果實驗性子宮內膜異位中重組可溶性TNF-RI作用的探察大鼠手術移植子宮內膜異位組織的成功生長和發育提供了研究模型用於研究不能在人類中恰當研究的子宮內膜異位的某些方面(Dudley等，1992)。以前的大鼠實驗性子宮內膜異位研究表明抗排卵肽可以恰當地用作陽性對照(Sharpe等，1990)。在本實施例中，將抗排卵肽的效果與用重組可溶性TNF-RI所得的治療前後移植物尺寸大小進行比較。結果總結於表II。
表II

圖1中的結果表示為移植的子宮內膜片段的平均抑制百分率(計算如上述)。
抗排卵肽在縮小子宮內膜樣病灶上有效(圖1)，在停止治療後於二個觀察時間點均能導致幾乎完全的(與原來尺寸相比分別為94％和88％)以及統計學顯著性(p＜0.05，ANOVA和Tukey’s試驗)的緩解。用人重組可溶性TNF-RI(10毫克/公斤，二個日劑量)治療一星期，結果在二種觀察時間點時子宮內膜異位樣病灶的大小均有明顯減縮(與原來相比分別為33％和64％)。但僅在第9天有統計學顯著意義(P＜0.05，ANOVA和Tukey’s試驗)。在假手術動物中任何時候均未觀察到移植物。
NK細胞活力評價用脾細胞對YAC細胞的體外試驗評測NK細胞活力，各組間沒有顯示任何差異(圖2)。與在狒狒上觀察到的相同，在有或無子宮內膜異位的狒狒上未見抗子宮內膜細胞毒性和NK細胞活力的差異(D』Hooghe等，1995)。這個發現與人的數據相反，曾有報導子宮內膜異位患者的NK活性抑制，腹膜NK活力的降低與子宮內膜異位的嚴重程度顯著相關(Oosterlynck等，1992)。
血清17β-雌二醇的評價在兩個觀察時間點均用放射免疫法測定血清17β-雌二醇濃度。在第二個觀察時間點抗排卵肽治療組與未治療的對照組有明顯差異，而重組可溶性TNF-RI與對照組比較無統計學顯著差別(圖3；p＜0.05，ANOVA和Turkey試驗)。
結論在子宮內膜異位的大鼠實驗模型中，給予TNF拮抗劑，即可溶性TNF-RI，首次對這種病理學狀況提供了以細胞因子為基礎的、非激素相關性治療潛在有效性的證據。因此TNF拮抗劑在降低副反應方面作為現有醫學治療的一個替代物。這些結果評估了TNF拮抗劑在治療子宮內膜異位相關性不育症上的應用。
本技術領域的熟練人員將知道或能肯定，此處用不多於常規的實驗敘述了許多相當於本發明的具體實施方案，這些和所有其他的相當部分均包含在以下權利要求中。
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權利要求
1.TNF拮抗劑與一種藥學上可接受的載體在製備治療和/或預防子宮內膜異位的藥物組合物上的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其中所述的TNF拮抗劑是一種可與TNF特異性表位結合的多肽，其結合方式使TNF不能再與膜結合的TNF受體相結合。
3.如權利要求2所述的應用，其中TNF拮抗劑是結合於TNF的一種受體分子、其衍生物或其片段。
4.如權利要求3所述的應用，其中受體分子選自包括TNF-RI和TNF-RII的一組。
5.如權利要求3所述的應用，其中受體分子是TNF-RI的細胞外結構。
6.如權利要求3所述的應用，其中受體分子是人可溶性重組TNF-RI。
7.如權利要求3所述的應用，其中受體分子是TNF受體多亞基分子或其功能部分。
8.如權利要求7所述的應用，其中TNF受體多亞基分子包含通過1個或多個多肽連接物連接的2個或更多個TNF受體細胞外結構的全部或一個功能部分。
9.如權利要求3所述的應用，其中受體分子是一種免疫受體融合分子或其功能部分。
10.如權利要求9所述的應用，其中所述免疫受體融合分子包含TNF受體的全部或功能部分和一個免疫球蛋白鏈。
11.如權利要求1所述的應用，其中TNF拮抗劑是一個抗TNF抗體或其片段。
12.如權利要求11所述的應用，其中單克隆抗體選自嵌合的單克隆抗體、人源化單克隆抗體或其片段。
13.如權利要求1所述的應用，其中TNF拮抗劑預防或抑制TNF受體信號。
14.TNF拮抗劑與藥學上可接受的載體在製備用於治療和/或預防子宮內膜異位相關的不育症的藥物組合物上的應用。
15.治療和/或預防子宮內膜異位的方法，該方法包括給予患者治療有效劑量的TNF拮抗劑。
16.治療和/或預防子宮內膜異位的藥物組合物，含有TNF拮抗劑與藥學上可接受的載體。
17.治療和/或預防子宮內膜異位相關的不育症的藥物組合物，含有TNF拮抗劑與藥學上可接受的載體。
18.如權利要求16或17所述的藥物組合物，其中TNF拮抗劑具有 1-13之一所述的特徵。
全文摘要
腫瘤壞死因子拮抗劑以治療有效劑量給藥以治療和/或預防子宮內膜異位。本發明的拮抗劑一般選自各類分子但優選的為可溶性TNF受體。該拮抗劑對子宮內膜異位損害的消退有用,如與其他活性成分合用可改善相關的疾患,例如不育症。
文檔編號C07K14/715GK1337883SQ00803030
公開日2002年2月27日 申請日期2000年1月19日 優先權日1999年1月22日
發明者F·博雷利列, M·德安東尼奧, F·馬爾泰利 申請人:應用研究系統Ars股份公司