一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法與流程

2023-12-05 01:29:06 8

本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種鞘氨醇單胞菌，以及一種通過電擊對鞘氨醇單胞菌進行遺傳轉化的方法。

背景技術：

鞘氨醇單胞菌是一類豐富的新型微生物資源，其在地球上分布極其廣泛，在各種水體，土壤，大氣以及極端環境都有它存在的蹤影。鞘氨醇單胞菌從屬與a‐變形菌綱，鞘氨醇單胞菌目，鞘氨醇單胞菌科。該屬菌株為革蘭氏陰性菌，無孢子，以單側生極性鞭毛運動，多呈黃色，專性需氧且能產生過氧化氫酶。鞘氨醇單胞菌自身具有很強的代謝能力，可以降解芳香族化合物，對於保護環境具有潛在應用價值；該屬某些菌株胞外能夠合成有價值的胞外生物高聚物，具有很高的經濟利用價值；同時該屬某些菌株胞內可以合成多種具較強抗氧化能力的類胡蘿蔔素，在工業生產上具有很高的應用價值。因此，鞘氨醇單胞菌目前受到了廣泛的重視與研究。通過dna重組技術向其導入外源dna片段以研究鞘氨醇單胞菌降解芳香族化合物相關基因已成為研究其降解機制的重要手段，同時，根據應用微生物學，為提高生物高聚物，類胡蘿蔔素產量，將外源限速酶基因導入其體內也是一個重要應用手段。

常見對鞘氨醇單胞菌的基因轉化，是通過三親結合的方法將外源基因導入菌體內，但該方法存在周期長，操作複雜，轉化效率低，可重複性差等缺點。通過電穿孔轉化方案，即利用脈衝電場造成細胞壁的改變從而將外源dna導入細胞內，可以克服三親結合轉化法帶來的困難。但由於常用質粒的複製子在鞘氨醇單胞菌中都無法複製的原因，無法實現將質粒或攜帶外源基因的質粒導入鞘氨醇單胞菌並使其在體內複製。因此，尋找鞘氨醇單胞菌兼容性複製子是基因轉化的關鍵。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種鞘氨醇單胞菌，以及利用電擊法將外源基因轉化到鞘氨醇單胞菌體內的新方法。

為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：

一種鞘氨醇單胞菌，保藏號為cgmccno.12394。

一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，包括以下步驟：

(1)構建電擊轉化鞘氨醇單胞菌所需質粒；

(2)製備鞘氨醇單胞菌感受態細胞；

(3)電擊轉化鞘氨醇單胞菌感受態細胞，轉化後培養；

(4)轉化用於遺傳改造效果的驗證。

根據所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其中步驟(1)中所述電擊轉化鞘氨醇單胞菌所需質粒是由將鞘氨醇單胞菌內源質粒複製子與phsg398質粒連接所構成。

根據所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其中所述步驟(1)中電擊轉化鞘氨醇單胞菌所需質粒是由將鞘氨醇單胞菌內源質粒或內源質粒上任何長度帶有複製子的dna片段或基本上同源的一段dna序列與phsg398質粒連接所構成。

根據所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其中所述步驟(2)製備鞘氨醇單胞菌感受態細胞是將鞘氨醇單胞菌接種至lb培養基內，於28℃搖床孵育至吸光度od600nm＝0.6-0.9，離心收集，使用預冷的10％甘油洗兩遍，於-80℃凍存。

根據所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其中所述步驟(3)電擊轉化鞘氨醇單胞菌感受態細胞，採用電擊條件為2.0kv-2.5kv，脈衝時間為4.5-5.5ms。

根據所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其中所述步驟(3)轉化後培養是向電擊後的鞘氨醇單胞菌感受態細胞加入tb培養基，震蕩培養2-6小時。

根據所述的一種鞘氨醇單胞菌在對鞘氨醇單胞菌的遺傳改造中的應用，是將由鞘氨醇單胞菌內源質粒上任意片段或基本同源的一段dna序列組成的質粒，用於對鞘氨醇單胞菌的遺傳改造。

根據所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，該方法包括下述步驟：

(一)構建轉化所必須的質粒：

1、鞘氨醇單胞菌內源質粒的提取由常用質粒抽提試劑盒實現，將獲得的內源質粒分別用限制性內切酶bamhⅰ，ecorⅰ，salⅰ進行消化，分別獲得長度為6kb，5kb，3kb的dna片段，其三者共同特徵是都含有內源質粒的複製子；

2、將帶氯黴素抗性的質粒phsg398分別用限制性內切酶bamhⅰ，ecorⅰ，salⅰ進行消化，與(1)獲得的三種不同大小的dna片段進行連接，構建得到三種不同大小的的質粒phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps；

(二)製備感受態細胞：

1、從4℃冰箱中取出保藏的鞘氨醇單胞菌kib,挑取至lb液體培養基中，於28℃,220rpm過夜培養15-18小時，活化菌體；

2、用移液槍吸取2.5ml步驟1的培養物在無菌超淨臺接種於50mltb培養基中，28℃，220rpm振蕩培養至od600nm＝0.8；

3、將步驟2的菌液冰浴10min後，放入離心管中，4℃/5000rpm離心5min，棄上清，收集細胞；

4、在無菌超淨臺上用4℃預冷的20ml的10％甘油通過移液槍吹懸步驟3得到的細胞，4℃、5000rpm離心5min，棄上清，收集細胞，漂洗2次；

5、在無菌超淨臺上用2ml10％甘油吹懸步驟4得到的細胞，分裝於離心管中，-80℃保存；

(三)電擊轉化

1、取100ng步驟一所構建的三種不同大小的質粒phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps，分別加入到步驟二製備的感受態細胞中，在冰上通過移液槍輕微吐吸使所述質粒dna和感受態細胞充分混勻，冰浴2min；

2、將完成步驟1的體系轉移至0℃預冷的1mm電擊杯中，用電轉儀進行電擊，電壓25kv/cm，時間常數＝5ms；

3、完成步驟2後，立即向電擊杯中加入1mltb培養基，混勻；

4、完成步驟3後，將電擊杯中的菌液全部吸出至離心管中，28℃,220rpm振蕩培養2-6小時；

5、將完成步驟4的培養體系塗布於含有終濃度為15μg/ml氯黴素的lb固體培養基平板，28℃培養48小時；

6、隨機挑取生長出來的單克隆，提取質粒瓊脂糖凝膠電泳，驗證轉化結果；

(四)轉化用於遺傳改造效果驗證

1、將步驟一構建得到的phsg398‐reps質粒，用smaⅰ酶切，回收得到的片段與從衣藻中克隆的酮化酶基因bkt連接，得到phsg398‐reps‐bkt質粒；

2、將phsg398‐reps‐bkt質粒，按步驟三電擊轉化鞘氨醇單胞菌，bkt基因在鞘氨醇單胞菌中表達，鞘氨醇單胞菌由原來的黃色變成了紅色，超高效液相色譜分析，類胡蘿蔔素上的紫羅酮環上都加上了羰基，證明鞘氨醇單胞菌轉化系統構建成功。

根據所述的一種鞘氨醇單胞菌遺傳轉化的方法，其中所述轉化內源質粒複製子dna在3233bp‐4641bp之間；鞘氨醇單胞菌轉化後回復時間為2‐6小時。

本發明針對三親結合轉化方法用於鞘氨醇單胞菌時存在的操作繁瑣、成功率低、周期長、轉化效率低等問題，提供了一種簡便易行的鞘氨醇單胞菌快速轉化新方法，該方法依託質粒複製的常規原理，思路清晰，操作簡便，轉化效果好，為菌株進行遺傳操作打下了基礎。本發明可在鞘氨醇單胞菌菌株改造上應用，如降解芳香族化合物機理，工業化生產結冷膠與類胡蘿蔔素，前景十分廣闊。

附圖說明：

圖1為質粒phsg398圖譜。

圖2表示四種質粒phsg398，phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps分別轉化鞘氨醇單胞菌的生長狀況。

圖3表示轉化系統建立成功，質粒phsg398‐reps‐bkt的轉入使鞘氨醇單胞菌由黃色變成紅色。

圖4表示轉入質粒phsg398‐reps‐bkt的鞘氨醇單胞菌轉化子，高效液相色譜分析色素圖譜。

圖5表示鞘氨醇單胞菌內源質粒複製子確定在3233bp‐4641bp之間。

具體實施方法：

下面結合附圖，用本發明的實施例來進一步更好的說明和理解本發明，但並不限定本發明。

下述實施例的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。

下述實施例用到的儀器或設備：

普通分光光度計購自：美國thermoscientific公司，biomate3s

高速離心機購自：德國eppendorf公司，5804r

電泳儀購自：美國bio-rad公司，powerpac

凝膠自動成像儀購自：美國labnet公司，uvpec3-310

超高效液相色譜購自：美國安捷倫科技有限公司，1290infinity

色譜柱購自：美國安捷倫科技有限公司，eclipseplusc18rrhd1.8μm

pcr儀購自：美國abi公司，veriti

電擊轉化儀購自：美國bio-rad公司，genepulserxcell

超淨工作檯購自：北京恆奧生物科技有限公司，9sw-cj-1f

ph計購自：丹佛儀器(北京)有限公司，ub-7

恆溫搖床購自：上海比朗生物科技有限公司，bilon-cos-211b

高壓滅菌器購自：上海博迅實業有限公司，yxq-ls-50s

恆溫水浴鍋購自：常州國宇儀器製造有限公司，hh

下述實施例的培養基或菌種：

鞘氨醇單胞菌kib：由本實驗室分離，是在培養海洋微藻aurantiochytriumsp.sk4時，平板培養基上的汙染物，平板培養基配方為：將5g葡萄糖、2g酵母提取物、50％人工海水、8g瓊脂粉和蒸餾水充分混勻並用蒸餾水定容至1l；121攝氏度高溫滅菌20min；人工海水培養為：30gnacl、0.7gkcl、10.8gmgcl2·6h2o、2.638gmgso4、0.756gcacl2和蒸餾水充分混勻並用蒸餾水定容至1l。該菌顏色鮮豔，菌落光滑圓潤，挑取單克隆於lb培養液中，28攝氏度，220rpm培養。「鞘氨醇菌(sphingobiumsp.)」於2016年4月25日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編：100101，電話：010-64807355，傳真：010-64807288，電子郵件：[email protected]，網址：http://www.im.ac.cn)，保藏號為cgmccno.12394。分類命名為：sphingobiumsp.該生物材料(株)的存活性經中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏中心於2016.04.25檢測為「存活」。

大腸桿菌jm109，購買於takara公司。

lb液體培養基(ph7.0)的製備方法：將10g氯化鈉、10g胰蛋白腖、5g酵母提取物和蒸餾水充分混勻並用蒸餾水定容至1l；121攝氏度高溫滅菌20min。

lb固體培養基(ph7.0)的製備方法：將10g氯化鈉、10g胰蛋白腖、5g酵母提取物、10g瓊脂粉和蒸餾水充分混勻並用蒸餾水定容至1l；121攝氏度高溫滅菌20min。

tb液體培養基(ph6.5)的製備方法：將12g蛋白腖，24g酵母粉，4g甘油，2.312g磷酸二氫鉀，16.416g三水磷酸氫二鉀和蒸餾水充分混勻，並用蒸餾水定容至1l；121攝氏度高溫滅菌20min。

10％甘油溶液的製備方法：將10g甘油用雙蒸水溶解並定容至100ml；121攝氏度高溫滅菌20min。

實施例1

本發明提供的一種電擊轉化鞘氨醇單胞菌的方法，包括構建轉化所必須的質粒和製備感受態細胞、電擊轉化、轉化後效果驗證四個步驟；其中，所述構建轉化所必須的質粒依次包括如下步驟：鞘氨醇單胞菌內源質粒的提取由常用質粒抽提試劑盒實現，將帶有內源質粒複製子的dna片段與質粒phsg398連接，構建得到可在鞘氨醇單胞菌體內複製的質粒；所述製備感受態細胞包括如下步驟：將鞘氨醇單胞菌在lb培養基中活化，將活化後的鞘氨醇單胞菌接種於tb培養基中，振蕩培養，培養至od600nm＝0.8；所述tb培養基的製備方法為：將12g蛋白腖，24g酵母粉，4g甘油，2.312g磷酸二氫鉀，16.416g三水磷酸氫二鉀和蒸餾水充分混勻，並用蒸餾水定容至1l，ph調至6.5；所述電擊轉化包括如下步驟：將所述構建的質粒與所述感受態細胞混勻並冰浴，進行電擊，得到導入所述構建質粒的重組鞘氨醇單胞菌。所述電擊轉化中，電擊的電壓為2.5kv。所述電擊轉化中，脈衝時間為4.5‐5.5ms。所述電擊轉化還包括在所述電擊後進行如下處理步驟：向電擊杯中加入1mltb培養基並混勻，振蕩培養2h。

本發明提供的一種電擊轉化鞘氨醇單胞菌的方法，通過一系列改良實驗條件來提高鞘氨醇單胞菌的轉化效率。具體實驗過程如下：

電擊轉化鞘氨醇單胞菌的方法：

(一)構建轉化所必須的質粒：

1、鞘氨醇單胞菌內源質粒的提取由常用質粒抽提試劑盒實現，將獲得的內源質粒分別用限制性內切酶bamhⅰ，ecorⅰ，salⅰ進行消化，分別獲得長度為6kb，5kb，3kb的dna片段，其三者共同特徵是都含有內源質粒的複製子。

2、將帶氯黴素抗性的質粒phsg398分別用限制性內切酶bamhⅰ，ecorⅰ，salⅰ進行消化，與上述獲得的三種不同大小的dna片段進行連接。構建得到三種不同大小的的質粒phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps。

(二)製備感受態細胞：

1、取出從4℃冰箱中保藏的鞘氨醇單胞菌kib,挑取至lb液體培養基中，於28℃,220rpm過夜培養15-18小時，活化菌體；

2、用移液槍吸取2.5ml步驟1的培養物在無菌超淨臺接種於50mltb培養基中，28℃，220rpm振蕩培養至od600nm＝0.8；

3、將步驟2的菌液冰浴10min後，放入離心管中，4℃/5000rpm離心5min，棄上清，收集細胞；

4、在無菌超淨臺上用4℃預冷的20ml的10％甘油通過移液槍吹懸步驟3得到的細胞，4℃、5000rpm離心5min，棄上清，收集細胞，漂洗2次；

5、在無菌超淨臺上用2ml10％甘油吹懸步驟4得到的細胞，分裝於離心管(100μl/管)中，-80℃保存。

(三)電擊轉化

1、取100ng步驟一所構建的三種不同大小的質粒phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps，分別加入到1管步驟二製備的感受態細胞中，在冰上通過移液槍輕微吐吸使所述質粒dna和感受態細胞充分混勻，冰浴2min；

2、將完成步驟1的體系轉移至0℃預冷的電擊杯(1mm)中，用電轉儀進行電擊(電壓25kv/cm，時間常數＝5ms)；

3、完成步驟2後，立即向電擊杯中加入1mltb培養基，混勻；

4、完成步驟3後，將電擊杯中的菌液全部吸出至離心管中，28℃,220rpm振蕩培養2小時。

5、將完成步驟4的培養體系塗布於含有終濃度為15μg/ml氯黴素的lb固體培養基平板，28℃培養48小時。

6、隨機挑取生長出來的單克隆，提取質粒瓊脂糖凝膠電泳，驗證是否轉化成功。

經反覆實驗，空載體phsg398的轉入，並不能長出任何克隆，而分別轉入質粒phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps的鞘氨醇單胞菌均可長出一定數量的陽性克隆，並且上述實驗轉化效率與插入dna片段長短成反比，如圖2。

(四)轉化用於遺傳改造效果驗證

1、將步驟一構建得到的phsg398‐reps質粒，用smaⅰ酶切，回收得到的片段與從衣藻中克隆的酮化酶基因bkt連接，得到phsg398‐reps‐bkt質粒。

2、將phsg398‐reps‐bkt質粒，按步驟三電擊轉化鞘氨醇單胞菌。bkt基因在鞘氨醇單胞菌中表達，鞘氨醇單胞菌由原來的黃色變成了紅色(圖3)，超高效液相色譜分析，類胡蘿蔔素上的紫羅酮環上都加上了羰基(圖4)。可以說明鞘氨醇單胞菌轉化系統構建成功，並十分可靠，可以應用於對鞘氨醇單胞菌的遺傳改造。

本發明還在以上實驗的基礎上進行優化，具體優化條件如下：

一、鞘氨醇單胞菌轉化所需內源質粒複製子長度優化

在上述實驗基礎上，以質粒phsg398‐reps為模板，以phsgf1240/repr1728為引物，擴增後自連得到質粒phsg398‐repdel‐1。再以phsg398‐repdel‐1為模板，分別以phsgr1222/repf288，phsgr1222/repf488，phsgr1222/repf688為引物，擴增後自連得到質粒phsg398‐repdel‐2，phsg398‐repdel‐3，phsg398‐repdel‐4。如圖5所示，最終將轉化所需最短內源質粒複製子dna確定在3233bp‐4641bp之間。

二、鞘氨醇單胞菌轉化後回復時間優化

鞘氨醇單胞菌轉化後回復時間由2小時增加至6小時後，效果更佳。

實施例2：

鞘氨醇單胞菌的電擊轉化：

一、鞘氨醇單胞菌kib(保藏號為cgmccno.12394)轉化所必須質粒的構建：

質粒phsg398(圖譜見圖1)：購自takara公司；

穿梭質粒phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps是在phsg398質粒基礎上改造得到的，製備方法如下：

1、鞘氨醇單胞菌內源質粒的提取由常用質粒抽提試劑盒實現，將獲得的內源質粒分別用限制性內切酶bamhⅰ，ecorⅰ，salⅰ進行消化，分別獲得長度為6kb，5kb，3kb的含內源質粒複製子的dna片段。

2、將帶氯黴素抗性的質粒phsg398分別用限制性內切酶bamhⅰ，ecorⅰ，salⅰ進行消化，與上述獲得的三種不同大小的含內源質粒複製子的dna片段進行連接。構建得到三種不同大小的質粒phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps。

酶切和連接反應的步驟如下所示：

酶切：

總反應體積20μl，在37℃溫浴兩小時，瓊脂糖凝膠電泳回收相應dna片段。

連接反應體系

總反應體積為10μl，16℃過夜連接。將連接產物轉化至大腸桿菌jm109，隨機挑取單克隆於搖菌管中，37℃過夜培養，取2ml培養物提取質粒，酶切檢測，確認構建成功後分別得到重組質粒phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps。

質粒phsg398‐reps‐bkt的製備方法如下：

1.將質粒phsg398‐reps用限制性內切酶smaⅰ消化，回收dna片段。

酶切及去磷酸化反應的步驟如下所示：

總反應體積20μl，在25℃溫浴兩小時，瓊脂糖凝膠電泳回收相應dna片段。回收所得片段去磷酸化，步驟如下：

總反應體積50μl，在37℃溫浴30min，過回收柱終止反應。

2.以衣藻基因組為模板，以bktf和bktr分別為上下遊引物，擴增酮化酶bkt基因。pcr體系和步驟如下：

總反應體積20μl，98℃預變性1min，98℃變性10s，60℃退火5s，72℃延伸30s，35個循環，72℃延伸5min。將擴增得到的dna片段，膠回收後末端磷酸化，磷酸化反應步驟如下所示：

總反應體積25μl，37℃溫浴30min，過回收柱終止反應。

3.連接步驟1,2所得到的dna片，得到質粒phsg398‐reps‐bkt，步驟如下：

phsg398-reps片段2μl

bkt片段6μl

ligase1μl

10xligasebuffer1μl。

總反應體積為10μl，16℃過夜連接。將連接產物轉化至大腸桿菌jm109，隨機挑取單克隆於搖菌管中，37℃過夜培養，取2ml培養物提取質粒，pcr檢測，確認構建成功後得到重組質粒phsg398‐reps‐bkt。

二.感受態細胞的製備

1、取出從4℃冰箱中保藏的鞘氨醇單胞菌kib,挑取至lb液體培養基中，於28℃,220rpm過夜培養15-18小時，活化菌體；

2、用移液槍吸取2.5ml步驟1的培養物在無菌超淨臺接種於50mltb培養基中，28℃，220rpm振蕩培養至od600nm＝0.8；

3、將步驟2的菌液冰浴10min後，放入離心管中，4℃/5000rpm離心5min，棄上清，收集細胞；

4、在無菌超淨臺上用4℃預冷的20ml的10％甘油通過移液槍吹懸步驟3得到的細胞，4℃、5000rpm離心5min，棄上清，收集細胞，漂洗2次；

5、在無菌超淨臺上用2ml10％甘油吹懸步驟4得到的細胞，分裝於離心管(100μl/管)中，-80℃保存。

三、電擊轉化

1、取100ng步驟一所構建的三種不同大小的質粒phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps，分別加入到1管步驟二製備的感受態細胞中，在冰上通過移液槍輕微吐吸使所述質粒dna和感受態細胞充分混勻，冰浴2min；

2、將完成步驟1的體系轉移至0℃預冷的電擊杯(1mm)中，用電轉儀進行電擊(電壓25kv/cm，時間常數＝5ms)；

3、完成步驟2後，立即向電擊杯中加入1mltb培養基，混勻；

4、完成步驟3後，將電擊杯中的菌液全部吸出至離心管中，28℃,220rpm振蕩培養2小時。

5、將完成步驟4的培養體系塗布於含有終濃度為15μg/ml氯黴素的lb固體培養基平板，28℃培養48小時。

6、隨機挑取生長出來的單克隆，提取質粒，分別用限制性內切酶bamhⅰ，ecorⅰ，salⅰ酶切檢測，瓊脂糖凝膠電泳，驗證是否轉化成功。經反覆實驗，空質粒phsg389的轉入並不能長出任何克隆，而轉入質粒phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps均可長出相應數量的克隆，並且長出的克隆數與插入dna片段長短成反比(如圖2)。質粒phsg398‐repb，phsg398‐repe，phsg398‐reps的共有特點是，插入的dna片段都包含鞘氨醇單胞菌內源質粒上的質粒複製子repa，而repa的插入使質粒phsg398獲得了可以在鞘氨醇單胞菌中複製的能力。

四、轉化用於遺傳改造效果驗證

1、取100ng步驟一所構建的質粒phsg398‐reps‐bkt，按步驟三所述的電擊轉化方法轉入步驟二製備的感受態中。

2、長出的菌落由野生型的黃色變成了紅色，如圖3。其本質是基因bkt在鞘氨醇單胞菌中表達，使鞘氨醇單胞菌體內的色素發生改變，高效液相色譜分析如圖4，紅色峰為野生型鞘氨醇單胞菌，藍色峰為轉化株，所有類胡蘿蔔素的紫羅酮環上都引入了羰基。說明鞘氨醇單胞菌可以用這種簡便的轉化方法對其進行遺傳改造。

3、該轉化方法的建立意義重大，是對鞘氨醇單胞菌進行基因轉化研究的有效手段，為鞘氨醇單胞菌的基因工程育種、遺傳學及分子生物學研究提供了方便、快速和高效的基因導入方法，可用於對鞘氨醇單胞菌降解芳香族化合物、胞外生產冷凝膠及胞內生產類胡蘿蔔素等機制的研究與工業化應用。

實施例3

為了進一步確定鞘氨醇單胞菌轉化所需的最短有效片段，提高轉化效率，本發明同時進行了如下試驗，並得出結果：

1、質粒phsg398‐repd‐1，phsg398‐repd‐2，phsg398‐repd‐3，phsg398‐repd‐4是在phsg398‐reps質粒基礎上改造得到的，製備方法如下：

以穿梭質粒phsg398‐reps為模板，以phsgf1240tggcactggccgtcgttttacaac和repr1728caagcttgcgcctgttcgcgtccagtcct為上下遊引物，擴增後自連得到質粒phsg398‐repd‐1。pcr體系和步驟如下：

總反應體積20μl，98℃預變性1min，98℃變性10s，60℃退火5s，72℃延伸150s，35個循環，72℃延伸5min。將擴增得到的dna片段膠回收後末端磷酸化，磷酸化反應步驟如下所示：

總反應體積25μl，37℃溫浴30min，過回收柱終止反應，將產物自連，自連反應步驟如下：

dna8ul

ligase1μl

10xligasebuffer1μl。

總反應體積為10μl，16℃過夜連接。將連接產物轉化至大腸桿菌jm109，隨機挑取單克隆於搖菌管中，37℃過夜培養，取2ml培養物提取質粒，酶切檢測，確認構建成功後得到重組質粒phsg398‐rep‐1。

再以穿梭質粒phsg398‐repd‐1為模板，以phsgr1222gacgtcgactctagaggatccccgggta和repf288cgcccccttcttgttctaagcagatcc分別為上下遊引物，phsgr1222和repf488gtgttacctacggagtaagttacgcggctc分別為上下遊引物，phsgr1222和repf688atgagcctgcttccagatcggcacc分別為下上遊引物，擴增後自連得到質粒phsg398‐repd‐2，phsg398‐repd‐3，phsg398‐repd‐4。pcr體系和步驟如下：

總反應體積20μl，98℃預變性1min，98℃變性10s，62℃退火5s，72℃延伸150s，35個循環，72℃延伸5min。

總反應體積20μl，98℃預變性1min，98℃變性10s，62℃退火5s，72℃延伸150s，35個循環，72℃延伸5min。

總反應體積20μl，98℃預變性1min，98℃變性10s，62℃退火5s，72℃延伸150s，35個循環，72℃延伸5min。

將擴增得到的dna片段分別膠回收後末端磷酸化，磷酸化反應步驟如下所示：

總反應體積25μl，37℃溫浴30min，過回收柱終止反應，將產物自連，自連反應步驟如下：

dna8ul

ligase1μl

10xligasebuffer1μl。

總反應體積為10μl，16℃過夜連接。將連接產物轉化至大腸桿菌jm109，隨機挑取單克隆於搖菌管中，37℃過夜培養，取2ml培養物提取質粒，酶切檢測，確認構建成功後分別得到重組質粒phsg398‐repdel‐2，phsg398‐repdel‐3，phsg398‐repdel‐4。phsg398‐reps，phsg398‐repd‐1，phsg398‐repd‐2，phsg398‐repd‐3，phsg398‐repd‐4的關係如圖5。

2.將獲得的質粒phsg398‐reps，phsg398‐repd‐1，phsg398‐repd‐2，phsg398‐repd‐3，phsg398‐repd‐4分別轉化鞘氨醇單胞菌。感受態製備方法如實施例1的步驟二，電擊轉化方法如實施例1的步驟三。轉入質粒phsg398‐reps，phsg398‐repd‐1，phsg398‐repd‐2，phsg398‐repd‐3的鞘氨醇單胞菌均有陽性克隆長出，而轉入質粒phsg398‐repd‐4的鞘氨醇單胞菌沒有長出任何克隆，與轉入空載體phsg398的現象一致，經分析，質粒phsg398‐reps，phsg398‐repd‐1，phsg398‐repd‐2，phsg398‐repd‐3均含有完整的鞘氨醇單胞菌內源質粒複製子，可以使重組質粒在鞘氨醇單胞菌內複製，最終將鞘氨醇單胞菌內源質粒複製子確定在3233bp‐4641bp之間。

最後應說明的是：以上實施例僅為本發明的優選實施例，並不能用於限制本發明，本領域的普通技術人員都會理解，在本發明的保護範圍內，對於上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發明的保護範圍。