人卵巢癌細胞系uacc-1598中雙微體序列測定方法
2023-11-03 02:08:07 1
專利名稱：人卵巢癌細胞系uacc-1598中雙微體序列測定方法
技術領域：
本發明涉及ー種人卵巣癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，屬於雙微體序列測定技術領域。
背景技術：
雙微體(double minute chromosomes，DMs)是腫瘤細胞內成對存在、不含著絲粒、 可自主複製的環狀染色小體，是腫瘤細胞基因擴增的主要表現形式之一。雙微體存在於腫瘤細胞和某些經過化療藥物作用的細胞，在正常細胞中未見雙微體檢出。雙微體自1962年首次在人結腸癌細胞中發現以來，在絕大多數實體瘤和血液系統腫瘤中皆檢測到雙微體的存在。臨床標本檢測結果顯示，18%的乳腺癌、的卵巢癌、44%的結腸癌、20% -30%的小細胞肺癌和12. 5%的血液系統腫瘤中存在著雙微體。同吋，雙微體的存在與腫瘤的惡性程度的增高和腫瘤耐藥性的產生密切相關。研究顯示，通過雙微體擴增的基因主要包括為細胞提供生存優勢的癌基因和耐藥表型的耐藥基因。這些基因有的是ー個完整的基因，而另外ー些則是由兩個不同基因形成的融合基因。這些基因在腫瘤演進和耐藥性形成過程中發揮重要作用，因此對雙微體上這些基因的確認也就顯的格外重要。現有研究雙微體的結構主要採用細胞遺傳學手段，應用光學顯微鏡、電子顯微鏡、 原子力顯微鏡和螢光原位雜交(FISH)等對雙微體結構進行檢測。這些方法都是從宏觀上也就是染色體水平對雙微體進行描述，不能提供雙微體的微觀信息(即DNA的序列特點)。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有研究雙微體的結構主要採用細胞遺傳學手段，應用光學顯微鏡、電子顯微鏡、原子力顯微鏡和螢光原位雜交等對雙微體結構進行檢測。這些方法都是從宏觀上也就是染色體水平對雙微體進行描述，不能提供雙微體的微觀信息的問題，進而提供ー種人卵巣癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法。本發明ー種人卵巣癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法步驟如下一、人卵巣癌細胞UACC-1598的培養及細胞完整雙微體的脈衝場凝膠電泳分離；1、樣品製備人卵巢癌細胞UACC-1598在含10% FBS的RPMI-1640培養基中，於5% CO2,37°C 條件下進行培養；收集對數生長期、匯合率為70% 80%的人卵巣癌細胞UACC-1598，計數後重懸於PBS，使細胞密度為1 2 X IO8細胞/mL，並在37°C水浴中孵育；加入等體積37°C 的1. 4%低熔點瓊脂糖，迅速混勻後倒入潔淨模具中，4°C放置10 15min使其凝固；將膠塊從模具中取出後置於3 5倍體積的細胞裂解液中於37°C水浴中震蕩孵育約90min至膠塊透明；棄細胞裂解液並用洗液(Washing buffer)反覆洗膠塊3次後置於3 5倍體積的蛋白酶K溶液，37°C水浴中震蕩孵育6 12小時；Washing buffer洗滌三次後，置於貯存液中4°C保存；2、脈衝場凝膠電泳
將製備好的膠塊置於0. 5%瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用相同濃度的瓊脂糖封閉加樣孔；在10°c的0. 5X TBE電泳緩衝液中適宜電泳條件下先進行第一向FIGE模式電泳，電泳條件為正向電壓梯度(Forward Voltage Gradient) :3 5V/cm，起始轉換時間(Int. Sw. Time) :50 70seconds，終止轉換時間(Fin. Sw. Time) :220 260seconds ；負向電壓梯度(Rev. Voltage Gradient) :2 4V/cm，負向起始轉換時間(Rev. Int. Sw. Time) :15 30seconds，負向終止轉換時間(Rev. Fin. Sw. Time) :50 70seconds ；總電泳時間(Total Run Time) :36 45hours.隨後調整方向進行第二向CHEF模式電泳，分離大片段DNA分子； 電泳條件為電壓梯度(Gradient) :3 6V/cm，脈衝角度(Included angle) :120，起始轉換時間 Gnt. Sw. Tm) 100 130seconds，終止轉換時間(Fin. Sw. Tm) :270 320seconds， 電泳時間(Run time) :25 30hours.以商品化的H. wingi和S. cerevisiae染色體為分子重標尺；3、瓊脂糖酶法回收DMs DNA對電泳凝膠中的垂直DNA條帶進行切膠回收，切取含有目的DNA片段的低熔點瓊脂糖凝膠，切成細塊並稱重，加入1/10體積(按凝膠重量Img = 1 μ L計算)的10 X瓊脂糖酶緩衝液用於平衡反應體系；於70°C熔化低熔點瓊脂糖凝膠後，冷卻至60°C並靜置5min， 加入瓊脂糖酶60°C消化1小時，冰上放置15min後12000r/min離心15min，取上清液並加入 1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液和1倍體積的異丙醇，混勻後_20°C冷卻6 12小吋，12000r/ min離心15min，棄上清用70%的冷異丙醇清洗沉澱兩次，乾燥後加入TE溶解DNA沉澱，用 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收所得DNA片段大小；ニ、將獲得的卵巢癌細胞系UACC-1598的雙微體，應用Roche公司4M技術對人卵巢癌細胞系UACC-1598中雙微體序列進行測定；1、待測DNA文庫的構建把待測DNA用噴霧法(nebulization)打斷成300_800bp 的小片段並在小片段兩端加上不同的接頭，或將待測序列變性後用雜交引物進行PCR擴増，連接載體，構建單鏈DNA(ssDNA)文庫；2,Emulsion PCR 將這些ssDNA與水油包被的直徑大約觀μ m的磁珠在一起孵育、 退火，由於磁珠表面含有與接頭互補的寡核苷酸序列，因此ssDNA會連接到磁珠上；同時孵育體系中含有PCR反應試劑，因此可以保證每ー個與磁珠結合的小片段都會在各自的孵育體系內獨立擴增，擴增產物仍可以結合到磁珠上；反應完成後，富集帶有DNA的磁珠；經過擴增反應，每ー個小片段都將被擴增大約100萬倍，從而達到下一步測序反應所需的模板
裡；3、測序測序反應採用焦磷酸測序法，以磁珠上大量擴增的ssDNA為模板，毎次反應加入ー種dNTP進行合成反應；如果這種dNTP能與待測序列配對，則會在合成後釋放焦磷酸基團，釋放的焦磷酸基團會與反應體系中的ATP硫酸化酶反應形成ATP，生成的ATP和螢光素酶共同氧化反應體系中的螢光素分子並發出螢光，測序反應產生的螢光信號由CCD照相機記錄，再經過計算機分析轉換為測序結果；由於每種dNTP在反應中產生的螢光顏色不同，因此可以根據螢光的顏色來確定被測分子的序列；反應結束後，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，導致螢光淬滅，從而使反應體系再生；測序反應共獲得巧4，294條序列，平均長度42^p，說明測序反應成功，效果較好。所述的細胞裂解液由0. 01mol/L Tris-HCl pH8. 0,0. 05mol/L NaCl、l%十二烷基肌氨酸鈉、0. lmol/L EDTA和0. 2% SDS製成。所述的Washing buffer 由 0. 01mol/L Tris-HCl 和 0. lmol/L EDTA 製成。所述的蛋白酶K溶液由0. lmol/L EDTA、1 %十二烷基肌氨酸鈉、0. 2% SDS和Img/ HiL蛋白酶K製成。所述的C存液由0. 001mol/L Tris-HCl 和 0. 01mol/L EDTA 製成。所述的脈衝場凝膠電泳條件為0. 5%瓊脂糖凝膠、10°C的0. 5XTBE電泳緩衝液。本發明的有益效果本發明脈衝分離出來的高純度DMs很大程度上保證了實驗對象的完整性，由於雙微體序列的異質性的存在，同時重複性較高，並且總大小只有幾十兆鹼基的特點，更適合採用Roche的妨4高通量測序技術進行分析，從而實現對其序列全貌及特徵的全面認識，很大程度上保證了所得序列的真實性。本發明首次利用第二代測序技術對人卵巣癌細胞系UACC-1598中雙微體序列進行測定，從中發現了 157條不同染色體起源的序列。這說明這些序列是腫瘤細胞所特有的、 全新的、未被報導的序列。這些序列可能是卵巢癌或含雙微體腫瘤所特有的，具有成為卵巢癌和含雙微體腫瘤臨床診斷標記物的潛能。這些序列中所包含的融合基因從序列到功能均未見報導，很有可能參與卵巣癌和含雙微體腫瘤的形成與發展。通過對其功能的研究將會為這些腫瘤的研究提供新的方向。
圖1是雙向脈衝場凝膠電泳分離DMs圖(圖中A:分子標尺S. cerevisiae和 H. wingei示意圖；B 第一、ニ加樣孔中為分子量標尺S. cerevisiae和H. wingei僅進行縱向FIGE電泳，第三個加樣孔中為UACC-1598進行縱向FIGE和橫向CHEF兩向電泳；C UACC-1598的雙向電泳，其中第一向縱向延長時間的FIGE電泳；第二向橫向延長時間的 CHEF電泳；D =UACC-1598的雙向電泳，其中第一向縱向FIGE電泳進ー步延長時間；第二向橫向CHEF電泳時間同C)；圖2是切膠回收DMs DNA瓊脂糖電泳檢測圖；圖3是人卵巢癌細胞UACC-1598中期染色體(X 1000)圖；圖4是雙向脈衝場凝膠電泳分離所得DNA的FISH驗證圖(圖中A =Cy3標記DMs DNA為探針；B =DAPI染核；C 圖A，B的融合)；圖5是DMs染色體起源的FISH分析圖(圖中A，B，C和D，E，F分別為兩個細胞不同顏色螢光信號圖；A和D中紅色信號代表分離所得DMs DNA ；B和E中細胞核應用藍色 DAPI復染；C和F兩圖分別為A，B和D，E的融合)；
具體實施例方式參見圖1 圖6，本實施方式ー種人卵巢癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法的技術方案是這樣實現的一、人卵巣癌細胞UACC-1598的培養及細胞完整雙微體的脈衝場凝膠電泳分離1、樣品製備人卵巢癌細胞UACC-1598在含10% FBS的RPMI-1640培養基中，於5% CO2,37°C 條件下進行培養。收集對數生長期、匯合率為70% 80%的人卵巣癌細胞UACC-1598，計數後重懸於適量的PBS，使細胞密度約為1 2 X IO8細胞/mL，並在37°C水浴中孵育。加入等體積37°C的1. 4%低熔點瓊脂糖，混勻後倒入潔淨模具中，4°C放置10 15min使其凝固。 將膠塊從模具中取出後置於3 5倍體積的細胞裂解液中(O.Olmol/L Tris-HCl pH8. 0， 0. 05mol/LNaCl，l%十二烷基肌氨酸鈉，0. lmol/L EDTA,0. 2% SDS)於 37°C水浴中震蕩孵育約90min至膠塊透明。棄細胞裂解液並用Washing buffer(0. 01mol/L Tris_HCl，0. Imo 1/ LEDTA)反覆洗膠塊3次後置於3 5倍體積的蛋白酶K溶液(0. lmol/L EDTA，十二烷基肌氨酸鈉，0. 2% SDS，lmg/mL蛋白酶K)，37°C水浴中震蕩孵育過夜。Washing buffer洗滌三次後，置於貯存液(0. 001mol/L Tris-HCl,0. 01mol/L EDTA)中 4°C保存。2、脈衝場凝膠電泳將製備好的膠塊置於0. 5%瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用相同濃度的瓊脂糖封閉加樣孔。在10°C的0.5XTBE電泳緩衝液中適宜電泳條件下先進行第一向FIGE模式電泳，隨後調整方向進行第二向CHEF模式電泳，分離大片段DNA分子。以H. wingi和S. cerevisiae 為分子量標尺。如果要進行後續切膠回收DNA，則需要在預期電泳條帶所到位置換上濃度稍高(0. 8% )的低熔點瓊脂糖凝膠。完整未經線性化的人卵巣癌細胞中全基因組DNA經雙向電泳分離後，呈現為兩個不同形狀的DNA集聚區域(如圖1B、C、D)，其中之ー為垂直的條帶，而另ー DNA集聚條帶呈拋物線狀。並且兩條電泳條帶的分布特徵提示兩區域所含DNA具有不同的超微結構。由於線性DNA分子在雙向電泳中多呈斜線狀，因此我們認為垂直條帶為雙微體DNA成分稱之為 DMs DNA，通過與脈衝場電泳分子量標尺比較可見其大小分布從1Mb到大於3Mb的範圍，具有明顯的異質性(圖1A、B)。3、瓊脂糖酶法回收DMs DNA對電泳凝膠中的垂直DNA條帶進行切膠回收，切取含有目的DNA片段的低熔點瓊脂糖凝膠，切成細塊並稱重，按說明書所示加入1/10體積(按凝膠重量Img = 1 μ L計算) 的10Χ瓊脂糖酶緩衝液用於平衡反應體系。於70°C熔化低熔點瓊脂糖凝膠後，冷卻至60°C 並靜置5min。加入適量的瓊脂糖酶60°C消化1小時，冰上放置15min後12000r/min離心15min。取上清液並加入1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液和1倍體積的異丙醇，充分混勻後-20°C冷卻過夜。12000r/min離心15min，棄上清用70%的冷異丙醇清洗沉澱兩次，乾燥後加入適量的TE溶解DNA沉澱。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收所得DNA片段大小。可見回收DNA片段大小約為15Kb (圖2)。驗證分離所得DMs DNA純度及染色體起源1、FISH 驗證為進ー步驗證分離所得的DNA條帶為雙微體特異條帯，我們將分離所得的DNA標記為FISH探針與UACC-1598細胞中期染色體雜交，結果顯示紅色的探針信號可特異地覆蓋中期標本中幾乎所有的DMs。同時，應用DMs邊界序列特異引物來驗證DMs的特異性，結果顯示邊界內引物可擴增出產物，邊界外引物無擴增產物或有少量擴增產物，提示我們分離所得DMs具有較好的純度。FISH探針製備以分離所得DMs DNA為模板通過DOP-PCR標記FISH探針，反應體系如下表所示， 反應條件為94°C 5min ；94°C lmin，56°C lmin，72°C 1. 5min, 30cycles ；72°C 5min。1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物片段大小後_20°C保存。
PCR reagentVolume(^L)
DMs DNA2μΙ
IOxPCR buffer5μΙ dNTP5ML
1 ΟΟμπιοΙ/L Biotin-16-dUTP1 μ
Ampli Taq LD1 U
Add H2O to5C^L卵巣癌細胞UACC-1598細胞染色體中期核型製備對人卵巣癌細胞UACC-1598進行染色體分析可見細胞中期分裂相中存在大量 DMs (染色體之間成對或單個出現的點狀物，圖3)，並且這些DMs大小各異。FISH雜交及圖像採集將已製備好的中期染色體標本放入65°C預熱的70%甲醯胺QXSSC配製)中， 1. 5 aiiin後取出轉入預冷的70%乙醇中退火2min，隨後在70%、90%、100%系列乙醇中分別脫水anin，空氣乾燥。同吋，取10 μ L探針放於0. 5mL的離心管中，混勻、短暫離心後放於PCR儀中，先 750C，IOmin,再37°C，至少30min退火後備用。將變性好的探針加到已變性的中期分裂相玻片上，蓋上22mmX22mm的蓋玻片，用橡膠水封片，然後放於ー溼盒中，並放在37°C的溫箱中雜交1 3天。雜交結束，撕掉橡膠泥後將玻片放入45 0C預熱的2 X SSC中5min脫蓋玻片，之後放入45 °C預熱的50%甲醯胺O X SSC配製)中洗兩次，每次5min ；隨後在2 X SSC中洗兩次， 每次5min。取出玻片置於溼盒中，迅速加入10(^し的0丫3-3バ肚11抗體，用？3儀打1111蓋片並放入37°C孵育20min後取出，揭掉ParafiIm膜，放入4XTGXSSC，0. 02% Tween-20)中洗三次，毎次5min。用加了 DAPI的封片液封片，蓋上蓋玻片後用指甲油封片。用安裝有CCD 攝像頭的ZEISS Axioskop螢光顯微鏡觀察螢光信號，通過Cyto Vision System軟體控制圖像拍攝並進行圖像分析。應用雙向脈衝場凝膠電泳技術從人卵巢癌細胞UACC-1598中分離出DMs，並經瓊脂糖酶切膠回收後，將分離所得DMs DNA標記為FISH探針。將標記好的DMs特異性探針與 UACC-1598中期分裂相雜交，結果顯示分離所得DNA特異性的與細胞中的DMs雜交(圖4)， 表明分離所得DNA確實為DMs。應用DMs DNA標記探針與正常淋巴細胞中期染色體分裂相雜交可見UACC-1598中 DMs的起源比較複雜。提示雙微體基因組成和排列的複雜性。ニ、將獲得的高純度卵巢癌細胞系UACC-1598的雙微體，應用Roche公司妨4技術對人卵巣癌細胞系UACC-1598中雙微體序列進行測定。1、待測DNA文庫的構建。把待測DNA用噴霧法(nebulization)打斷成300_800bp的小片段並在小片段兩端加上不同的接頭，或將待測序列變性後用雜交引物進行PCR擴 ±曾，連接載體，構建單鏈DNA(ssDNA)文庫。2、Emulsion PCR。將這些ssDNA與水油包被的直徑大約28 μ m的磁珠在一起孵育、退火，由於磁珠表面含有與接頭互補的寡核苷酸序列，因此ssDNA會連接到磁珠上。同時孵育體系中含有PCR反應試劑，因此可以保證每一個與磁珠結合的小片段都會在各自的孵育體系內獨立擴增，擴增產物仍可以結合到磁珠上。反應完成後，富集帶有DNA的磁珠。 經過擴增反應，每一個小片段都將被擴增大約100萬倍，從而達到下一步測序反應所需的模板量。3、測序。測序反應採用焦磷酸測序法，以磁珠上大量擴增的ssDNA為模板，每次反應加入一種dNTP進行合成反應。如果這種dNTP能與待測序列配對，則會在合成後釋放焦磷酸基團。釋放的焦磷酸基團會與反應體系中的ATP硫酸化酶反應形成ATP。生成的ATP和螢光素酶共同氧化反應體系中的螢光素分子並發出螢光。測序反應產生的螢光信號由CCD 照相機記錄，再經過計算機分析轉換為測序結果。由於每種dNTP在反應中產生的螢光顏色不同，因此可以根據螢光的顏色來確定被測分子的序列。反應結束後，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，導致螢光淬滅，從而使反應體系再生。測序反應共獲得154，294 條序列，平均長度425bp，說明測序反應成功，效果較好。三、UACC-1598細胞中雙微體序列的特徵分析。應用NextGene軟體對所獲得的序列進行起源分析，發現序列主要來自4個不同的染色體位置，它們分別是lq212，2p24. 3，3q262和6p22. 3。進一步利用Blast工具與人基因組序列比對，發現157條不同染色體起源的序列。以下是157條不同染色體起源的序列見附件I
權利要求
1. ー種人卵巣癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，其特徵在幹，步驟如下一、人卵巣癌細胞UACC-1598的培養及細胞完整雙微體的脈衝場凝膠電泳分離；1、樣品製備人卵巢癌細胞UACC-1598在含10% FBS的RPMI-1640培養基中，於5% C02、37°C條件下進行培養；收集對數生長期、匯合率為70% 80%的人卵巣癌細胞UACC-1598，計數後重懸於PBS，使細胞密度為1 2X IO8細胞/mL，並在37°C水浴中孵育；加入等體積37°C的 1.4%低熔點瓊脂糖，迅速混勻後倒入潔淨模具中，4°C放置10 15min使其凝固；將膠塊從模具中取出後置於3 5倍體積的細胞裂解液中於37°C水浴中震蕩孵育約90min至膠塊透明；棄細胞裂解液並用洗液反覆洗膠塊3次後置於3 5倍體積的蛋白酶K溶液，37°C水浴中震蕩孵育6 12小時；洗滌三次後，置於貯存液中4°C保存；2、脈衝場凝膠電泳將製備好的膠塊置於0. 5%瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用相同濃度的瓊脂糖封閉加樣孔； 在10°C的0. 5XTBE電泳緩衝液中適宜電泳條件下先進行第一向FIGE模式電泳，電泳條件為正向電壓梯度3 5V/cm，起始轉換時間50 70seconds，終止轉換時間220 260seconds ；負向電壓梯度；2 4V/cm，負向起始轉換時間15 30seconds，負向終止轉換時間50 70seconds ；總電泳時間36 45hours，隨後調整方向進行第二向CHEF模式電泳，分離大片段DNA分子；電泳條件為電壓梯度3 6V/cm，脈衝角度120，起始轉換時間100 130seconds，終止轉換時間:270 320seconds,電泳時間25 30hours,以商品化的H. wingi和S. cerevisiae染色體為分子量標尺；3、瓊脂糖酶法回收DMsDNA對電泳凝膠中的垂直DNA條帶進行切膠回收，切取含有目的DNA片段的低熔點瓊脂糖凝膠，切成細塊並稱重，加入1/10體積的IOX瓊脂糖酶緩衝液用於平衡反應體系；於 70°C IOmin熔化低熔點瓊脂糖凝膠後，冷卻至60°C並靜置5min，加入瓊脂糖酶於60°C消化 1小時，冰上放置15min後12000r/min離心15min，取上清液並加入1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液和1倍體積的異丙醇，混勻後_20°C冷卻6 12小時，12000r/min離心15min，棄上清用70%的冷異丙醇清洗沉澱兩次，乾燥後加入TE溶解DNA沉澱，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收所得DNA片段大小；ニ、將獲得的卵巣癌細胞系UACC-1598的雙微體，應用Roche公司4M技術對人卵巣癌細胞系UACC-1598中雙微體序列進行測定；1、待測DNA文庫的構建把待測DNA用噴霧法打斷成300-800bp的小片段並在小片段兩端加上不同的接頭，或將待測序列變性後用雜交引物進行PCR擴增，連接載體，構建單鏈 DNA文庫； 2、EmulsionPCR 將這些ssDNA與水油包被的直徑^ym的磁珠在一起孵育、退火，磁珠表面含有與接頭互補的寡核苷酸序列，ssDNA會連接到磁珠上；同時孵育體系中含有PCR 反應試劑，反應完成後，富集帶有DNA的磁珠；經過擴增反應，每ー個小片段都將被擴增100 萬倍，從而達到下一步測序反應所需的模板量； 3、測序測序反應採用焦磷酸測序法，以磁珠上大量擴增的ssDNA為模板，毎次反應加入ー種dNTP進行合成反應；dNTP能與待測序列配對，會在合成後釋放焦磷酸基團，釋放的焦磷酸基團會與反應體系中的ATP硫酸化酶反應形成ATP，生成的ATP和螢光素酶共同氧化反應體系中的螢光素分子並發出螢光，測序反應產生的螢光信號由CCD照相機記錄，再經過計算機分析轉換為測序結果；由於每種dNTP在反應中產生的螢光顏色不同，根據螢光的顏色來確定被測分子的序列；反應結束後，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，導致螢光淬滅，從而使反應體系再生；測序反應共獲得巧4，294條序列，平均長度425bp，測序反應即告成功。
2.根據權利要求1所述的人卵巣癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，其特徵在於，所述的細胞裂解液由0. 01mol/L Tris-HCl pH8. 0、0. 05mol/L NaCl、l%十二烷基肌氨酸鈉、0. lmol/L EDTA 和 0. 2% SDS 製成。
3.根據權利要求2所述的人卵巣癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，其特徵在於，所述的 Washing buffer 由 0. 01mol/L Tris-HCl 和 0. lmol/L EDTA 製成。
4.根據權利要求3所述的人卵巣癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，其特徵在幹，所述的蛋白酶K溶液由0. lmol/L EDTA、1%十二烷基肌氨酸鈉、0. 2% SDS和lmg/mL 蛋白酶K製成。
5.根據權利要求4所述的人卵巣癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，其特徵在於，所述的貯存液由0. 001mol/L Tris-HCl和0. 01mol/L EDTA製成。
6.根據權利要求5所述的卵巣癌細胞中雙微體的脈衝場凝膠電泳分離純化方法，其特徵在幹，所述的電泳條件為0. 5%瓊脂糖凝膠、10°C的0. 5XTBE電泳緩衝液。
全文摘要
本發明提供了一種人卵巢癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，一、人卵巢癌細胞UACC-1598的培養及細胞完整雙微體的脈衝場凝膠電泳分離；二、將獲得的卵巢癌細胞系UACC-1598的雙微體，應用Roche公司454技術對人卵巢癌細胞系UACC-1598中雙微體序列進行測定。本發明脈衝分離出來的高純度DMs很大程度上保證了實驗對象的完整性，由於雙微體序列的異質性的存在，同時重複性較高，並且總大小只有幾十兆鹼基的特點，更適合採用Roche的454高通量測序技術進行分析，從而實現對其序列全貌及特徵的全面認識，很大程度上保證了所得序列的真實性。
文檔編號C12Q1/68GK102586414SQ20111034084
公開日2012年7月18日 申請日期2011年11月2日 優先權日2011年11月2日
發明者於暘, 傅松濱, 孫文靖, 孟祥寧, 張春玉, 朱靜 申請人:哈爾濱醫科大學