丁醯膽鹼酯酶兩性離子聚合物綴合物的製作方法

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背景技術：
：1.生物清除劑有機磷化合物(op)對人體具有高毒性。二十世紀三十年代op被首次研製為殺蟲劑，op對人類的極端毒性最終導致其被研製為用於戰爭的神經毒劑。現今，雖然op被國際法普遍禁止，但op被當成不斷增加的軍事和民事威脅。1995年，東京地鐵系統遭到沙林襲擊，造成十幾名乘客死亡，其他數十人受傷。據報導，沙林氣體近來已在敘利亞衝突中用於地地飛彈，具有致命的效果。諸如沙林的op神經毒劑是乙醯膽鹼酯酶的有效抑制劑。在脊椎動物中，乙醯膽鹼是用於將信號從神經系統傳遞到肌肉纖維的神經遞質。通常，從神經元釋放乙醯膽鹼以刺激肌肉。刺激後，乙醯膽鹼酯酶代謝乙醯膽鹼，使肌肉放鬆。然而，諸如沙林的op不可逆地抑制乙醯膽鹼酯酶，抑制乙醯膽鹼的降解。通常非常小劑量的op神經毒劑即可致死，對象通常死於某種類型的窒息。接受致死劑量op的對象可能會發生永久性神經損傷。另外，op農藥還在廣泛使用。雖然op農藥的毒性遠遠低於神經毒劑，但op農藥對人類的毒性仍然令人擔憂。解毒劑和對op中毒的治療非常有限。對於op中毒症狀(例如震顫)存在小分子療法。然而，總的來說，這些療法的益處非常有限。可施用阿託品用於毒蕈鹼ach受體阻斷，施用地西泮用於抽搐的症狀管理。leee.c.(2003)clinicalmanifestationsofsarinnervegasexposure.j.am.med.assoc.290:659–662。另外，使用2-磷定(2-pam)的肟療法可以有效地重新激活一些op-ache加合物，但不是所有op-ache加合物。cannard,k.(2006)theacutetreatmentofnerveagentexposure.jneurolsci249:86–94。儘管這些療法可以在毒性較小的op(如殺蟲劑或非常低劑量的神經毒劑)的情況下降低死亡率，但臨床醫生通常認為它們對暴露於可能的戰場水平的op神經毒劑高度無效。對於預防性抗op治療，已經發現某些酶通過作為生物清除劑來解除諸如沙林的op的毒性。當預防性施用乙醯膽鹼酯酶(ache)(來源於胎牛血清)，即op不可逆滅活的相同的酶時，能夠保護恆河猴免受甲氟膦酸3,3-二甲基-2-丁基酯(梭曼)的ld50的二倍到五倍的攻擊，梭曼是化學戰爭中設計的高毒性op神經毒劑。wolfe,a.d.等人,(1992)useofcholinesterasesaspretreatmentdrugsfortheprotectionofrhesusmonkeysagainstsomantoxicity.toxicol.applpharmacol.117:189-193。ache是羧酸酯酶/膽鹼酯酶(ce/che)的成員，ce/che是水解多種羧酸酯的酶的多基因家族。家族成員包括ache、人羧酸酯酶1(hce1)和2(hce2)以及丁醯膽鹼酯酶(buche)。其中，人們對buche作為生物清除劑產生了最大的興趣。buche是人血清中主要的膽鹼酯酶。雖然充分描述了密切相關的酶ache作為膽鹼能傳遞的主要突觸調節劑，但buche的確定的生理作用尚未得到證實。buche是催化混雜的，不僅水解乙醯膽鹼(ach)，而且還水解更長鏈的膽鹼酯(例如丁醯膽鹼(其優選的底物)和琥珀醯膽鹼)和各種非膽鹼酯，例如乙醯水楊酸(阿司匹林)和古柯鹼。此外，buche結合大多數環境中存在的che抑制劑以及人造op農藥和神經毒劑。然而，天然buche的生理可用水平太低，無法針對op給予任何有意義的保護。已使用從人血清純化的buche來治療人類。患者成功接受了部分純化的人buche以抵消肌肉鬆弛劑和op農藥中毒的作用。cascio,c.等人(1988)theuseofserumcholinesteraseinseverephosphorouspoisoning.minervaanestesiol(italian)54:337-345。然而，由於汙染的威脅，非常不希望使用從人血清純化的產品，該未知血源性病原體當然是不能測試的。在這方面，例如，現今通過重組dna技術生產了用於治療血友病的fviii，並且在70年代末和80年代初數千名患者感染hiv病毒之後，不再從人血清中純化fviii。此外，血清純化的buche的生產受到可用血清體積的限制。lockridge,o.等人，(2005)j.med.chem.biol.radiol.def.3:nimhs5095。為了避免使用血清純化的buche，在大腸桿菌中生產重組buche(rbuche)。masson,p.(1992)inmultidisciplinaryapproachestocholinesterasefunctions,edsshafferman,a.,velan,b.(plenum，紐約)pp49-52。然而，產生的蛋白是無功能的。也可以在哺乳動物293t(altamirano，c.v.和lockridge，o.(1999)chem.biol.interact.119-120:53-60)和cho(millard，c.b.,lockridge，o.，和broomfield，c.a.(1995)biochemistry34:15925-15933)中生產rbuche。然而，哺乳動物表達系統不能產生足夠量的蛋白，使得可以消除對血漿純化的buche的需要。鑑於哺乳動物細胞表達系統遇到的困難，產生轉基因山羊，其具有在山羊β-酪蛋白啟動子控制下的人buche基因，從而可以從山羊乳中純化產生的rbuche。huang,y.j.等人，(2007)recombinanthumanbutyrylcholinesterasefrommilkoftransgenicanimalstoprotectagainstorganophosphatepoisoning.proc.nat.acad.sci.104(34):13603-13608。然而，當在動物中測試轉基因山羊rbuche時，酶本身以及與peg綴合的酶的pk和生物利用度結果非常令人失望。轉基因山羊中產生的rbuche並不明顯具有與從血漿純化的天然人buche相似的停留時間以使其可以被研製為預防op中毒的藥劑。因此，仍然需要可以被大量生產並具有良好的pk性質的buche重組形式和相關生物清除劑。2.碘乙醯胺綴合由於第一種重組胰島素產品在1982年被批准，蛋白治療劑和肽治療劑已被成功地用作治療各種病理生理學疾病的非常有效的藥物。這些藥物的發展受到過去幾十年重組dna技術的進步的推動。蛋白治療劑通常分為兩類：(1)模擬天然蛋白並用作替代物的生物藥物，例如胰島素，和(2)用作各種途徑的激動劑或拮抗劑的單克隆抗體，例如雖然蛋白治療劑在疾病改善和銷售方面都取得了巨大的成功，但已觀察到許多治療劑具有次優的物理化學性質和藥代動力學性質。蛋白治療劑的主要缺點是物理化學不穩定性、溶解度有限、蛋白水解不穩定、消除半衰期短、免疫原性和毒性。提高蛋白治療劑的藥代動力學性質的一種方法是蛋白與生物聚合物的綴合。在這方面，迄今為止已經批准了十幾種聚乙二醇(peg)綴合物，例如已觀察到蛋白聚乙二醇化的各種益處，包括：改善藥物溶解度、降低劑量頻率而不降低功效且可能降低毒性、延長循環壽命、增加的藥物穩定性以及對蛋白水解降解的抗性更高。還觀察到聚乙二醇化的商業利益，包括新的遞送形式和給藥方案的機會。此外，由於聚乙二醇化產生新的化學實體，因此存在更多專利保護的機會。歷史上，已經開發了大多數peg化試劑以利用蛋白上易於獲得的胺官能團。根據定義氨基存在於所有蛋白質中(即氨基末端)，並且在絕大多數蛋白中存在多於一個氨基，例如lys貢獻的氨基。胺綴合的peg蛋白已獲得監管部門的批准。alconel,s.n.s.,baas,a.s.和maynard,h.d.(2011)fda-approvedpoly(ethyleneglycol)-proteinconjugatedrugs.polym.chem.2(7),1442。至少兩種胺peg蛋白綴合物是一線療法。foster,g.r.(2010)pegylatedinterferonsforthetreatmentofchronichepatitisc:pharmacologicalandclinicaldifferencesbetweenpeginterferon-2aandpeginterferon-2b.drugs70(2),147-165；piedmonte,d.m.和treuheit,m.j.(2008)formulationofneulasta(pegfilgrastim).adv.drugdeliveryrev.60,50-58。然而，存在與胺共軛相關的許多問題。特定的與胺綴合的試劑通常是低效的，這是由於試劑(例如peg-n-羥基琥珀醯亞胺酯)的競爭水解反應或亞胺形成過程中的不利平衡，而亞胺形成是還原胺化綴合所必需的。wang,x.,kumar,s.和singh,s.(2011)disulfidescramblinginigg2monoclonalantibodies:insightsfrommoleculardynamicssimulations.pharm.res.28,3128-3143。此外，大多數蛋白具有可用於反應的幾個胺殘基。因此，胺peg綴合物往往不是位點特異性的，導致最終產物為不同peg-蛋白綴合物的非均勻混合物。veronese,f.(2001)peptideandproteinpegylationareviewofproblemsandsolutions.biomaterials22(5),405-17；luxon,b.a.,grace,m.,brassard,d.,和bordens,r.(2002)pegylatedinterferonsforthetreatmentofchronichepatitiscinfection.clin.ther.24(9)1363-1383。與通過蛋白質氨基的peg綴合相關的各種缺點導致開發通過半胱氨酸將蛋白peg化的方法。實際上，通過cys的聚合物綴合是今天研究人員採用的主要方法之一。roberts,m.j.和harris,b.j.m.(2002)chemistryforpeptideandproteinpegylation.adv.drugdel.rev.54,459-576；stenzel,m.h.(2012)bioconjugationusingthiols:oldchemistryrediscoveredtoconnectpolymerswithnature’sbuildingblocks.acsmacroletters2,14-18。蛋白質表面游離半胱氨酸的數量遠低於賴氨酸。如果缺乏游離半胱氨酸，則可以通過基因工程添加一個或多個游離半胱氨酸。goodson,r.j.和katre,n.v.(1990)site-directedpegylationofrecombinantinterleukin-2atitsglycosylationsite.biotechnology8,343-46。已經開發了各種化學物質用於通過半胱氨酸將聚合物與蛋白綴合，包括烷基滷化物、酯丙烯酸酯和乙烯基碸試劑。但最常見的共軛基團是馬來醯亞胺。roberts,m.j.,bentley,m.d.和harris,j.m.(2002)chemistryforpeptideandproteinpegylation.adv.drugdel.rev.54,459。馬來醯亞胺試劑與硫醇基團有效反應以在中性ph下提供綴合物，降低與蛋白變性相關的風險。馬來醯亞胺綴合已用於臨床批准的peg藥物。goel,n.和stephens,s.(2010)certolizumabpegol.mabs2(2),137-47。馬來醯亞胺也被用於一些批准的非peg綴合物中。參見例如gualberto,a.(2012)brentuximabvedotin(sgn-35),anantibody-drugconjugateforthetreatmentofcd30-positivemalignancies.expertopin.invest.drugs21(2),205-16。雖然已經批准了幾種基於馬來醯亞胺的產物，但已知一些馬來醯亞胺-硫醇綴合物是不穩定的。在這方面，已觀察到基於馬來醯亞胺的綴合物可以進行交換反應。baldwin,a.d.和kiick,k.l.(2011)tunabledegradationofmaleimide-thioladductsinreducingenvironments.bioconjugatechem.22(10),1946-53；baldwin,a.d.和kiick,k.l.(2012)reversiblemaleimide-thioladductsyieldglutathione-sensitivepoly(ethyleneglycol)-heparinhydrogels.polym.chem.4(1),133。此外，已經檢測到有關內源性蛋白的交換產品。alley,s.c.,benjamin,d.r.,jeffrey,s.c.,okeley,n.m.,meyer,d.l.,sanderson,r.j.和senter,p.d.(2008)contributionoflinkerstabilitytotheactivitiesofanticancerimmunoconjugates.bioconjugatechem.19,759-65；shen,b.q.等人，(2012)conjugationsitemodulatestheinvivostabilityandtherapeuticactivityofantibody-drugconjugates.naturebiotechnol.30(2),184-89。由於已知馬來醯亞胺綴合物在某些情況下是不穩定的，所以採用了替代綴合策略。roberts,m.j.和harris,b.j.m.(2002)chemistryforpeptideandproteinpegylation.adv.drugdel.rev.54,459-576。這些替代方法之一是使用以下所示的基於碘乙醯胺的綴合劑：peg-碘乙醯胺通過親核取代與游離硫醇反應，產生穩定的硫醚鍵。硫醚連接比使用馬來醯亞胺化學製備的相應結構更穩定。碘乙醯胺與硫醇的反應對ph具有依賴性。硫醇通常僅以硫醇鹽陰離子形式烷基化。lindley,h.(1960)astudyofthekineticsofthereactionbetweenthiolcompoundsandchloroacetamide.biochem.j.74,577-84。cys中硫醇的pk值一般在8.5+/-0.5左右，但是當硫醇與碘乙醯胺部分綴合時，該pk值取決於天然蛋白中cys的環境。kallis,g.和holmgren,a.(1980)differentialreactivityofthefunctionalsulfhydrylgroupsofcysteine-32andcysteine-35presentinthereducedformofthioredoxinfromescherichiacoli.j.bio.chem.255(21)10261-10266。kallis和holmgren觀察到具有約8.5的正常pk的cys殘基不容易用碘乙醯胺醯化或在中性ph下不容易用碘乙酸烷基化。僅在升高的ph值下觀察到這些正常硫醇的快速反應。本領域公知將蛋白暴露於高ph值通常導致蛋白變性。暴露於鹼性或高ph值的蛋白的變性是高度蛋白依賴性的。幾種蛋白可以暴露於高ph下而不變性。然而，許多是永久變性的，從而導致活性和/或結合能力的喪失。因此，仍然需要在生理ph值下使用碘乙醯胺綴合將聚合物與蛋白綴合的方法。技術實現要素：本發明提供了綴合物，其包含選自化學計量的有機磷(op)生物清除劑和與兩性離子聚合物共價結合的催化op生物清除劑的有機磷生物清除劑，其中所述聚合物包含一種或多種類型的單體單元，並且其中至少一種類型的單體單元包含兩性離子基團。任選地，op生物清除劑為選自芳基二烷基磷酸酶、有機磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶(triesterase)、磷酸三酯酶、芳基酯酶、對氧磷酶(pon)、有機磷酸酐酶和二異丙基氟磷酸酶(dfpases)的催化生物清除劑。任選地，op生物清除劑為包含選自乙醯膽鹼酯酶(ache)和丁醯膽鹼酯酶(bche)的膽鹼酯酶的化學計量的op生物清除劑。任選地，膽鹼酯酶由血漿純化而來。任選地，膽鹼酯酶通過重組dna技術製備。任選地，膽鹼酯酶為丁醯膽鹼酯酶。任選地，丁醯膽鹼酯酶與非丁醯膽鹼酯酶蛋白融合為融合蛋白。任選地，非丁醯膽鹼酯酶蛋白包含免疫球蛋白(ig)結構域。任選地，ig結構域選自igg-fc、igg-ch和igg-cl。任選地，igg為igg1。任選地，ig結構域為igg-fc(seqidno.8)。任選地，fc結構域在選自e233、l234、l235、g236、g237、a327、a330和p331的一個或多個位置處具有胺基酸取代。任選地，fc結構域具有以下取代：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。任選地，fc結構域還具有以下取代中的一種：q347c或l443c。任選地，取代為q347c。任選地，融合蛋白還包含丁醯膽鹼酯酶和非丁醯膽鹼酯酶蛋白之間的接頭。任選地，接頭選自g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)，以及上述接頭的低聚物。任選地，接頭選自gggsgggsgggs(seqidno.21)和ggsgggsgggs(seqidno.25)。任選地，丁醯膽鹼酯酶為羧基截短物。任選地，丁醯膽鹼酯酶包含seqidno.1的胺基酸29-561或由其組成。任選地，丁醯膽鹼酯酶包含seqidno.1的胺基酸29-562或由其組成。任選地，丁醯膽鹼酯酶具有突變，其中seqidno.1的殘基94的c為y。任選地，丁醯膽鹼酯酶融合物具有seqidno.2所示的胺基酸序列。在任何上述綴合物中，兩性離子基團可以包含磷酸膽鹼。任選地，至少一種類型的單體單元包含2-(丙烯醯氧基乙基)-2'-(三甲基銨乙基)磷酸酯。任選地，至少一種類型的單體單元包含2-(甲基丙烯醯氧基乙基)-2'-(三甲基銨乙基)磷酸酯(hema-pc)。任選地，聚合物具有3個或更多個臂。任選地，聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個臂。任選地，聚合物具有3、6或9個臂。任選地，綴合物的聚合物部分具有300,000-1,750,000道爾頓的峰值分子量。任選地，綴合物的聚合物部分具有500,000-1,000,000道爾頓的峰值分子量。任選地，綴合物的聚合物部分具有600,000-800,000道爾頓的峰值分子量。任選地，聚合物共價鍵合到所述膽鹼酯酶的氨基、羥基、巰基和羧基中的至少一個。任選地，巰基來自膽鹼酯酶中的半胱氨酸殘基。任選地，半胱氨酸殘基位於膽鹼酯酶中天然無半胱氨酸存在的位置。任選地，膽鹼酯酶為對應於seqidno.2的丁醯膽鹼酯酶融合物，半胱氨酸殘基為胺基酸672處的半胱氨酸殘基。任選地，丁醯膽鹼酯酶包含seqidno.1的胺基酸29-562或由其組成。任選地，殘基94為酪氨酸。任選地，丁醯膽鹼酯酶還包含通過重組dna工程引入的半胱氨酸殘基。任選地，根據權利要求41的丁醯膽鹼酯酶包含seqidno.13。本發明還提供了包含丁醯膽鹼酯酶和非丁醯膽鹼酯酶蛋白的丁醯膽鹼酯酶融合蛋白。任選地，非丁醯膽鹼酯酶蛋白包含免疫球蛋白(ig)結構域。任選地，ig結構域選自igg-fc、igg-ch和igg-cl。任選地，igg為igg1。任選地，igg1結構域為igg1-fc(seqidno.8)。任選地，fc結構域在選自e233、l234、l235、g236、g237、a327、a330和p331的一個或多個位置具有胺基酸取代。任選地，fc結構域具有以下取代：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。任選地，fc結構域還具有以下取代之一：q347c或l443c。任選地，取代為q347c。任選地，融合蛋白需要丁醯膽鹼酯酶和非丁醯膽鹼酯酶蛋白之間的接頭。任選地，接頭選自g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)以及上述接頭的低聚物。任選地，接頭選自gggsgggsgggs(seqidno.21)和ggsgggsgggs(seqidno.25)。任選地，丁醯膽鹼酯酶為羧基截短物。任選地，丁醯膽鹼酯酶包含seqidno.1的胺基酸29-561或由其組成。任選地，丁醯膽鹼酯酶包含seqidno.1的胺基酸29-562或由其組成。任選地，丁醯膽鹼酯酶具有突變，其中seqidno.1的殘基94處的c為y。任選地，融合蛋白具有seqidno.2所示的胺基酸序列。本發明還提供了治療或預防op中毒的方法，其包括向患者施用有效量的任一項前述權利要求中的任何綴合物或融合蛋白。任選地，綴合物通過靜脈內給藥、皮下給藥、肌內給藥、病灶內給藥或皮內給藥來施用。任選地，綴合物通過肌內給藥施用。本發明還提供了一種針對op中毒進行長期預防的方法，其包括在預期暴露於op化合物前至少7天施用綴合物，所述綴合物包含選自化學計量的有機磷(op)生物清除劑和與兩性離子聚合物共價結合的催化op生物清除劑的有機磷生物清除劑，其中所述聚合物包含一種或多種類型的單體單元，並且其中至少一種類型的單體單元包含兩性離子基團。任選地，op化合物為op農藥或op神經毒劑。任選地，綴合物在預期暴露於op神經毒劑之前至少14天施用。任選地，綴合物在預期暴露於op神經毒劑之前至少21天施用。任選地，綴合物在預期暴露於op神經毒劑之前至少30天施用。本發明還提供了一種用於快速預防op中毒的方法，其包括在預期暴露於op化合物之前至少12小時施用綴合物，所述綴合物包含選自化學計量的有機磷(op)生物清除劑和與兩性離子聚合物共價結合的催化op生物清除劑的有機磷生物清除劑，其中所述聚合物包含一種或多種類型的單體單元，並且其中至少一種類型的單體單元包含兩性離子基團。任選地，op化合物為op農藥或op神經毒劑。任選地，綴合物在預期暴露於op神經毒劑之前至少24小時施用。任何上述方法可以包括施用選自氨基甲酸酯、抗毒蕈鹼、膽鹼酯酶再激活劑和抗驚厥藥物的另一種藥劑。本發明還提供了一種用於聚合物合成的引發劑，其包含其中l1為第一接頭，l2為第二接頭，l3為第三接頭，其中l1、l2和l3相同或不同，並且各自選自-c1-c12烷基-、-c3-c12環烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12環烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12環烷基)-、-(c3-c12環烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12環烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-、鍵以及以上的任意組合；r1和r2相同或不同，並且選自h(條件為r1和r2不都是h)和一個或多個鹼性基團，其中鹼性基團選自其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，並且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，並且選自鍵、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，並且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一個或多個精氨酸殘基；且r3、r4和r5相同或不同，並且選自：其中y為ncs、f、cl、br或i。任選地，y為br。任選地，r3、r4和r5各自為任選地，r3、r4和r5各自為任選地，r4、r5和r6各自為任選地，l3為鍵，r2為h，r1為任選地，l2為-(ch2)1-6-。任選地，l2為-(ch2)3-。本發明還提供了一種聚合方法，其包括：在存在以下物質的條件下聚合一種或多種可自由基聚合的單體：包含可被自由基可轉移原子或基團均勻裂解的鍵的引發劑；過渡金屬化合物；和選自以下物質的配體：其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，並且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，並且選自鍵、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，並且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一個或多個精氨酸殘基；其中所述配體與所述過渡金屬化合物配位，並且其中所述過渡金屬化合物和所述配體匹配以引發和促進(propagate)所述單體的聚合。任選地，配體與引發劑共價連接以形成單分子引發劑配體。任選地，所述單分子引發劑配體具有以下結構：其中l1為第一接頭，l2為第二接頭，l3為第三接頭，其中l1、l2和l3相同或不同，並且各自選自-c1-c12烷基-、-c3-c12環烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12環烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12環烷基)-、-(c3-c12環烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12環烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-，鍵以及以上的任意組合；r1和r2相同或不同，並且選自h(條件為r1和r2不都是h)和一個或多個鹼性基團，其中鹼性基團選自其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，並且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，並且選自鍵、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，並且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一個或多個精氨酸殘基；且r3、r4和r5相同或不同，並且選自：其中y為ncs、f、cl、br或i。任選地，y為br。任選地，r3、r4和r5各自為任選地，r3、r4和r5各自為任選地，r4、r5和r6各自為任選地，l3為鍵，r2為h，r1為任選地，l2為-(ch2)1-6-或-(ch2)3-。任選地，可自由基聚合的單體為烯屬不飽和單體。任選地，不飽和單體包括hema-pc。任選地，過渡金屬為低價態過渡金屬或與至少一種不帶電配位配體配位的過渡金屬中的一種，並且其中過渡金屬包含抗衡離子。任選地，過渡金屬選自銅、鐵、鎳或釕。附圖說明圖1顯示來源於血漿的hbuche的隨時間變化的活性與儲存在食蟹猴血漿中的下述物質隨著時間變化的活性的對比：來自轉基因山羊乳的全長rhbuche、rbuche534ggc(c66y)和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)。圖2描繪了活性-時間曲線，其中在食蟹猴血漿中在4℃和37℃的條件下將與9臂750kdahema-pc聚合物綴合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)與來源於人血漿的buche進行對比。圖3顯示未綴合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)、與3臂500kdampc聚合物綴合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)、與9臂750kdampc聚合物綴合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)以及來源於血漿的hbuche在注入小鼠後隨時間(小時)變化的歸一化活性(個位×106)。圖4顯示了通過碘乙醯胺和馬來醯亞胺與mpc聚合物綴合的來自轉基因山羊乳的全長rhbuche的穩定性曲線。圖5顯示了具有改性(r1)碘乙醯胺部分的3臂250kdampc聚合物。詳細描述i.綜述本發明提供具有親水基團或兩性離子的高分子量(mw)聚合物，例如磷酸膽鹼。本發明還提供了用於製備高分子量聚合物的方法和新的起始物料。本發明還提供了高分子量聚合物和膽鹼酯酶的綴合物。wo2011/130694和wo/2007/100902通過引用併入本文用於所有目的。ii.定義「膽鹼酯酶」(che)是指參與神經脈衝傳遞的一系列酶。膽鹼酯酶催化乙醯膽鹼在膽鹼能突觸的水解。膽鹼酯酶包括但不限於乙醯膽鹼酯酶和丁醯膽鹼酯酶。提及的膽鹼酯酶(包括乙醯膽鹼酯酶和丁醯膽鹼酯酶)包括前體膽鹼酯酶和成熟膽鹼酯酶(例如其中信號序列已被除去的膽鹼酯酶)，其具有活性的截短形式，並且包括等位基因變體和物種變體、由剪接變體編碼的變體和其他變體，包括與引用的seqidno所示的多肽具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的或更高的序列同一性的多肽。變體表現出op滅活活性。膽鹼酯酶還包括含有化學修飾或轉錄後修飾的膽鹼酯酶，以及不含化學修飾或轉錄後修飾的膽鹼酯酶。這些修飾包括但不限於聚乙二醇化、聚(hema-pc)的添加、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化、羧化、羥基化、磷酸化和本領域已知的其他多肽修飾。截短的膽鹼酯酶是其任何n-或c-末端縮短形式，特別是被截短並具有op失活活性的形式。「乙醯膽鹼酯酶」(ache)是指能夠水解乙醯酯(包括乙醯膽鹼)並且其催化活性被化學抑制劑bw284c51抑制的酶或多肽。乙醯膽鹼酯酶包括但不限於來源於血漿的乙醯膽鹼酯酶或重組乙醯膽鹼酯酶。乙醯膽鹼酯酶包括人乙醯膽鹼酯酶和任何非人來源的乙醯膽鹼酯酶，包括但不限於大鼠乙醯膽鹼酯酶、小鼠乙醯膽鹼酯酶、貓乙醯膽鹼酯酶、雞乙醯膽鹼酯酶、兔乙醯膽鹼酯酶和牛乙醯膽鹼酯酶。示例性人乙醯膽鹼酯酶包括seqidno.3所示的人ache。乙醯膽鹼酯酶可以是任何形式，包括但不限於單體、二聚體和四聚體形式。「丁醯膽鹼酯酶」(buche)是指能夠水解乙醯膽鹼和丁醯膽鹼並且其催化活性被化學抑制劑四異丙基焦磷醯胺(iso-ompa)抑制的酶或多肽。丁醯膽鹼酯酶包括但不限於來源於血漿的丁醯膽鹼酯酶或重組丁醯膽鹼酯酶。丁醯膽鹼酯酶包括任何非人類來源的丁醯膽鹼酯酶，其來源包括但不限於大鼠、小鼠、貓、馬、雞、豬、兔和牛。丁醯膽鹼酯酶還包括人源的丁醯膽鹼酯酶。示例性的人丁醯膽鹼酯酶包括seqidno.1所示的人buche。丁醯膽鹼酯酶可以是任何形式，包括但不限於單體、二聚體和四聚體形式。在本文中可互換使用的「有機磷化合物」、「有機磷酸酯化合物」、「op化合物」和「op」是指含有磷醯中心並且還含有一個或多個酯鍵的化合物。在一些方面，磷醯中心處的磷酸酯鍵和/或其他共價鍵的類型將有機磷化合物分類。有機磷化合物包括有機磷農藥和有機磷神經毒劑。「有機磷神經毒劑」、「有機磷酸酯神經毒劑」或「op神經毒劑」是指例如通過抑制乙醯膽鹼酯酶的作用破壞生物體神經系統功能的化合物。神經毒劑通常通過化學合成製備，且如果被吸入、吸收、攝入或以其他方式遭遇，神經毒劑具有高毒性，神經毒劑可以是任何有機磷化合物，包括但不限於g型神經毒劑和v型神經毒劑。示範性有機磷神經毒劑包括塔崩(ga)、沙林(gb)、梭曼(gd)、環沙林(gf)、vx、俄羅斯vx(vr)和分類的非傳統神經毒劑(nta)。「有機磷農藥」、「有機磷酸酯農藥」或「op農藥」是指可以用作農藥或殺蟲劑來消滅害蟲和昆蟲的有機磷化合物。有機磷農藥可以是任何有機磷農藥，包括但不限於乙醯甲胺磷、甲基谷硫磷、地散磷、硫線磷、氯氧磷(chlorethoxyfos)、毒死蜱、甲基毒死蜱、蟲蟎磷、蠅毒磷、氯亞胺硫磷(dialifor)、二嗪磷(diazinon)、敵敵畏(ddvp)、百治磷(dierotophos)、樂果(dimethoate)、敵殺磷(dioxathion)、乙拌磷(disulfoton)、乙硫磷、滅克磷(ethoprop)、乙基對硫磷(ethylparathion)、克線磷(fenamiphos)、殺螟硫磷(fenitrothion)、倍硫磷(fenthion)、地蟲磷(fonofos)、甲基氯唑磷(isazophosmethyl)、異硫磷(isofenphos)、馬拉硫磷(malathion)、甲胺磷(methamidophos),殺撲磷(methidathion)、甲基對硫磷(methylparathion)、速滅磷(mevinphos)、久效磷(monocrotophos)、二溴磷(naled)、碸吸磷(oxydemetonmethyl)、甲拌磷(phorate)、伏殺磷(phosalone)、亞胺硫磷(phosmet)、磷胺(phosphamidon)、phostebupirim、安定磷(pirimiphosmethyl)、丙溴磷(profenofos)、烯蟲磷(propetamphos)、硫特普(sulfotepp)、硫丙磷(sulprofos)、雙硫磷(temephos)、特丁磷(terbufos)、殺蟲畏(tetraehlorvinphos)、脫葉磷(tribufos,jdef)和敵百蟲(trichlorfon)。「有機磷中毒」或「op中毒」是指對暴露於有機磷化合物(例如有機磷神經毒劑或有機磷農藥)的生物的有害或不良影響。「膽鹼能毒性」是指通過神經毒劑對乙醯膽鹼酯酶的抑制、神經遞質乙醯膽鹼的積累以及對副交感神經、交感神經、運動系統和中樞神經系統的伴隨作用而實現的毒性。膽鹼能毒性可導致肌病、精神病、一般麻痺和死亡。暴露症狀包括抽搐、顫抖、分泌過多、呼吸癱瘓、驚厥、最終死亡。可以通過測量血漿中的循環(活性)膽鹼酯酶水平來監測膽鹼能毒性。通常只有當由於神經毒劑的結合，膽鹼酯酶活性低於正常水平的20％時，才會發生致死。「有機磷暴露相關損傷」是指例如由於膽鹼能毒性對生理功能(如運動功能和認知功能)造成的短期(例如，暴露後幾分鐘至數小時)和長期(例如，暴露後一周至幾年)損傷。有機磷暴露相關損傷可以由以下臨床症狀體現，臨床症狀包括但不限於頭痛、瀰漫性肌肉絞痛、虛弱、分泌過多、噁心、嘔吐和腹瀉。病情可能發展為癲癇發作、昏迷、麻痺、呼吸衰竭、遲發性神經病、肌肉無力、震顫、驚厥，永久性腦部畸形、社會/行為缺陷和一般膽鹼能危象(例如可以通過加重炎症和低血細胞計數體現)。極端情況可導致中毒患者死亡。「有機磷生物清除劑」或「有機磷酸酯生物清除劑」或「op生物清除劑」是能夠結合或水解有機磷化合物的酶，包括有機磷農藥和有機磷神經毒劑。有機磷生物清除劑包括但不限於膽鹼酯酶、芳基二烷基磷酸酶、有機磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶、磷酸三酯酶、芳基酯酶、對氧磷酶(pon)、有機磷酸酶和二異丙基氟磷酸酶(dfpases)。有機磷生物清除劑可以是化學計量的有機磷生物清除劑或催化有機磷生物清除劑。「化學計量的有機磷生物清除劑」或「化學計量的op生物清除劑」是指下述的酶：該酶每個活性位點以1:1的化學計量比與有機磷化合物結合。化學計量的op生物清除劑包括但不限於膽鹼酯酶，如乙醯膽鹼酯酶和丁醯膽鹼酯酶。「催化有機磷生物清除劑」或「催化op生物清除劑」是指水解有機磷化合物的酶。催化op生物清除劑包括但不限於芳基二烷基磷酸酶、有機磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶、磷酸三酯酶、芳基酯酶、對氧磷酶(pon)、有機磷酸酐和二異丙基磷酸酶(dfpases)，上述酶包括引入其中的重組突變以增加其水解op化合物的能力。「芳基二烷基磷酸酶」是指使有機磷化合物失活或水解的天然存在的酶或重組酶。芳基二烷基磷酸酶(ec3.1.8.1)是一類能夠水解寬範圍的有機磷化合物的金屬依賴性op水解酶。芳基二烷基磷酸酶需要二價金屬離子(如zn2+、mn2+、co2+或cd2+)來實現其酶活性。芳基二烷基磷酸酶包括但不限於磷酸三酯酶或op水解酶(pte或oph)、對氧磷水解酶或對氧磷酶、對硫磷水解酶(ph)、opda、羧酸酯酶、三酯酶、磷酸三酯酶和芳基酯酶。芳基二烷基磷酸酶包括但不限於來自缺陷假單胞菌(pseudomonasdiminuata)mg、黃桿菌屬(flavobacteriumsp.)、鄰單胞菌屬(plesiomonassp.)菌株m6、變鉛鏈黴菌(streptomyceslividans)和放射性土壤桿菌(agrobacteriumradiobacter)的有機磷酸水解酶；來自伯克霍爾德氏桿菌屬jba3、缺陷假單胞菌mg、缺陷短波單胞菌(brevundiomonasdiminuta)、黃桿菌屬菌株atcc27552和嗜酸熱硫化葉菌(sulfolobusacidocaldarius)的對硫磷水解酶；和來自枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)wb800以及鄰單胞菌屬菌株m6的甲基對硫磷水解酶(mph)。示例性的芳基二烷基磷酸酶包括但不限於seqidno.5所示的芳基二烷基磷酸酶。提及的芳基二烷基磷酸酶包括芳基二烷基磷酸酶的具有活性的截短形式，並且包括等位基因變體和物種變體、由剪接變體編碼的變體和其他變體，其他變體包括與上述多肽和seqidno.5所示的多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽。變異體顯示op滅活活性。對氧磷酶是指使有機磷化合物失活或水解的天然存在的酶或重組磷酶。對氧磷酶包括但不限於天然或重組對氧磷酶。非人對氧磷酶包括但不限於來自兔、小鼠、大鼠、豬、牛、雞、火雞和狗的對氧磷酶。示例性對氧磷酶包括但不限於人對氧磷酶，包括pon1(seqidno.6)。提及的對氧磷酶包括其具有活性的截短形式，並且包括等位變體和物種變體、由剪接變體編碼的變體和其他變體，其他變體包括與seqidno.6所示的多肽具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的多肽。變體表現出op滅活活性。對氧磷酶還包括那些含有化學修飾或翻譯後修飾的對氧磷酶和那些不含化學修飾或翻譯後修飾的對氧磷酶。這樣的修飾包括但不限於聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羥基化、磷酸化和本領域已知的其他多肽修飾。「二異丙基氟磷酸酶」是指使有機磷化合物失活或水解的天然存在的酶或重組酶。二異丙基氟磷酸酶包括但不限於從來自歐洲烏賊(loligovulgaris)、交替單胞菌屬(alteromonassp.)、遊海假交替單胞菌(pseudoalteromonashaloplanktis)、地中海海單胞菌(marinomonasmediterranea)、加州海兔(aplysiacalifornica)、歐洲章魚(octopusvulgaris)和大鼠衰老標記蛋白30的二異丙基氟磷酸酶；和來自分枝桿菌屬(streptomycessp)、地中海擬無枝酸菌(amycolatopsismediterranei)、天藍色鏈黴菌(streptomycescoelicolor)、鏈黴菌屬(streptomycessp)aa4)、sividus鏈黴菌(streptomycessividus)tk24、sviceus鏈黴菌(streptomycessviceus)和灰黴鏈黴菌(streptomycesgriseoalthiacus)m045的有機磷酸酐水解酶。示例性的二異丙基氟磷酸酶和有機磷酸酐水解酶包括但不限於來自歐洲烏賊的二異丙基氟磷酸酶，其示於seqidno.7。提及的二異丙基氟磷酸酶包括其具有活性的截短形式，並且包括等位變體和物種變體、由剪接變體編碼的變體和其他變體，其他變體包括與seqidno.7所示的多肽具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的多肽。變體表現出op滅活活性。「氨基甲酸酯」是指作為膽鹼酯酶的氨基甲酸酯抑制劑的任何化合物。示例性氨基甲酸酯為溴化吡啶斯的明。「抗毒蕈鹼」是指作為毒蕈鹼受體的競爭性拮抗劑的任何化合物，包括毒蕈鹼型乙醯膽鹼受體。示例性的抗毒蕈鹼素是阿託品。「膽鹼酯酶再活化劑」是指從膽鹼酯酶釋放結合的有機磷化合物的任何化合物。膽鹼酯酶再活化劑包括膽鹼再活化肟，包括吡啶鎓和雙吡啶鎓乙醛肟，包括但不限於磷定、雙解磷(trimedoxime)、雙復磷(obidoxime)和hi-6、甲肟和地西泮。「抗驚厥」是指防止或逆轉癲癇的任何化合物。「綴合物」是指直接或間接連接至一個或多個化學部分(如聚合物)的多肽。「融合蛋白」是指由包含來自一個核酸分子的編碼序列和來自另一核酸分子的編碼序列的核酸序列編碼的多肽，其中編碼序列在相同的閱讀框中，使得當融合構建體在宿主細胞中轉錄並翻譯時，產生含有兩種蛋白質的蛋白質。兩個分子可以在構建體中相鄰或由包含1、2、3或更多但通常少於25、20、15、10、9、8、7或6個胺基酸的接頭多肽分離。由融合構建體編碼的蛋白質產物稱為融合多肽或蛋白質。融合蛋白可以具有在兩種蛋白質之間連接的肽或蛋白質。「半衰期」或「消除半衰期」或「t1/2」是指任何指定的性質或活性減少一半所需的時間。例如，半衰期是指物質(例如有機磷生物清除劑)失去其原始水平的活性的一半所花費的時間。因此，可以通過測量血漿中物質的活性來確定半衰期，或者可以通過測量血漿中物質的血漿水平來確定半衰期。例如，半衰期可以被確定為通過各種身體過程將藥物減少到身體內原始水平的一半所需的時間。半衰期越長，物質或藥物從身體中清除的時間越長。半衰期的單位通常為時間單位，如小時、分鐘或天。「吸收」是指藥物進入血流中的運動。「生物利用度」是指達到體循環的藥物的給藥劑量的分數。生物利用度是藥物吸收到血流中的函數。「劑量」是指出於治療或預防目的向個體施用的藥物的量或數量。「核酸」包括dna、rna及其類似物，包括肽核酸(pna)及其混合物。核酸可以是單鏈或雙鏈的。當涉及任選地標記的探針或引物(例如具有可檢測標記，例如螢光或放射性標記)時，可考慮單鏈分子。這樣的分子通常具有這樣的長度，使得它們的靶標在統計學上是唯一的或具有低拷貝數(通常小於5，一般小於3)以探測或引發文庫。通常，探針或引物含有與感興趣的基因互補或相同的序列的至少14、16或30個連續核苷酸。探針和引物的長度可以為10、20、30、50、100或更多的核酸。「多肽接頭」或「接頭」是包含通過肽鍵連接的兩個或多個胺基酸殘基的多肽，其用於連接兩個多肽(例如，vh和vl結構域或vh結構域和細胞外陷阱區段)。這樣的接頭多肽的實例是本領域公知的(參見例如holliger等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448；poljak等人(1994)structure2:1121-1123)。示例性的接頭包括g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)和這些接頭的寡聚體(例如，ggggsggggs(seqidno.4)和ggggsggggsggggsggggsg(seqidno.26))。「聚合物」是指連接在一起的一系列單體基團。高分子量聚合物由包括但不限於丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺、苯乙烯、乙烯基吡啶、乙烯基吡咯烷酮和乙烯基酯(如乙酸乙烯酯)的單體製備。其他的單體可用於本發明的高分子量聚合物。當使用兩種不同的單體類型時，兩種單體類稱型為「共聚單體」，這意味著不同單體類型共聚形成單一聚合物。聚合物可以是直鏈或支鏈的。當聚合物為支鏈聚合物時，每個聚合物鏈被稱為「聚合物臂」。與引發劑部分連接的聚合物臂的末端是近端，聚合物臂的生長鏈末端是遠端。在聚合物臂的生長鏈端上，聚合物臂端基可以是自由基清除劑或另一種基團。「引發劑」是指能夠引發使用單體或共聚單體的聚合反應的化合物。聚合可以是常規的自由基聚合或優選的受控/「活性(living)」自由基聚合，例如原子轉移自由基聚合(atrp)、可逆加成斷裂終止(raft)聚合或硝基氧介導聚合(nmp)。聚合可以是「假」受控聚合，例如退化轉移。當引發劑適用於atrp時，其包含可以被均一裂解以形成引發劑片段i和自由基清除劑i'的不穩定鍵，i是能夠引發自由基聚合的自由基，i'與生長的聚合物鏈的自由基反應從而可逆地終止聚合。自由基清除劑i'通常是滷素，但也可以是有機部分，例如腈。「接頭」是指將兩個基團連接在一起的化學部分。接頭可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接頭可以是可水解接頭、可酶促裂解接頭、ph敏感接頭、光不穩定接頭或二硫化物接頭等。其他接頭包括同雙功能和異雙功能接頭。「連接基團」是能夠與生物活性劑形成由一個或多個鍵組成的共價連接的官能團。非限制性實例包括表1中所示的那些。本文所用的術語「反應性基團」是指能夠與另一個化學基團反應形成共價鍵的基團，即在合適的反應條件下具有共價反應性，通常代表與另一種物質的連接點。反應性基團是本發明化合物上的部分，例如馬來醯亞胺或琥珀醯亞胺酯，其能夠與不同化合物上的官能團進行化學反應以形成共價鍵。反應性基團通常包括親核體、親電體和可光活化基團。「功能劑」被定義為包括生物活性劑或診斷劑。「生物活性劑」被定義為包括靶向特定生物學位置(靶向劑)和/或提供可在體內或體外證明的一些局部或全身生理或藥理作用的任何藥劑、藥物、化合物或其混合物。非限制性實例包括藥物、疫苗、抗體、抗體片段、scfv、雙抗體、高親和性多聚體(avimers)、維生素和輔因子、多糖、碳水化合物、類固醇、脂質、脂肪、蛋白質、肽、多肽、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和核酸(例如mrna、trna、snrna、rnai、dna、cdna、反義構建體、核酶等)。「診斷劑」被定義為包括能夠檢測或成像組織或疾病的任何試劑。診斷劑的實例包括但不限於放射性標記、螢光團和染料。「治療性蛋白質」是指包括其全部或部分構成藥物的胺基酸序列並可用於人或動物藥物應用的肽或蛋白質，而不管長度如何。許多治療性蛋白質是已知的，包括但不限於本文公開的那些。「磷醯膽鹼」也稱為「pc」，是指以下結構：其中*表示連接點。「含磷醯膽鹼的聚合物」是含有磷醯膽鹼的聚合物。「含兩性離子的聚合物」是指含有兩性離子的聚合物。含有聚(丙烯醯氧基乙基磷醯膽鹼)的聚合物是指含有2-(丙烯醯氧基)乙基-2-(三甲基銨)乙基磷酸酯作為單體的聚合物。含有聚(甲基丙烯醯氧基乙基磷醯膽鹼)的聚合物是指含有2-(甲基丙烯醯氧基)乙基-2-(三甲基銨)乙基磷酸酯作為單體的聚合物。通過引用特定單體類型定義的聚合物可以是均聚物，即僅存在指定類型的單體，或共聚物，在這種情況下，指定類型的單體與其他單體類型一起存在。如果優選共聚物，至少50％、75％或90％的單體分子為所述指定類型的。聚合物上下文中的「分子量」可以表示為數均分子量或重均分子量或峰值分子量。除非另有說明，本文中所有提到的分子量都是指峰值分子量。可以使用尺寸排阻色譜法或其他液相色譜技術測定這些分子量，即數均分子量(mn)、重均分子量(mw)和峰值(mp)分子量。還可以使用其他測量分子量值的方法，例如使用端基分析或測定依數性性質(如凝固點下降、沸點升高或滲透壓)以確定數均分子量，或使用光散射技術、超速離心或粘度測定來確定重均分子量。在本發明的優選實施方案中，通過sec-mals(尺寸排阻色譜法-多角度光散射)測量分子量。本發明的聚合物試劑通常是多分散的(即聚合物的數均分子量和重均分子量不相等)，優選具有例如按照凝膠滲透色譜法測定的小於約1.5的低多分散指數(pdi)值。在其他實施方案中，多分散性更優選約1.4至約1.2，更優選小於約1.15，更加優選小於約1.10，還更優選小於約1.05，最優選地小於1.03。本文所用的短語「一種(「a」或「an」)」實體是指一種或多種那個實體；例如，一種化合物是指一種或多種化合物或至少一種化合物。因此，術語一種(「a」或「an」)、「一種或多種」和「至少一種」在本文中可以互換使用。本文所用的「約」是指在使用不同儀器、樣品和樣品製備進行的測量中可能看到的變化。「被保護的」、「被保護的形式」、「保護基團」和「保護性基團」是指存在防止或阻止分子中特定的化學反應性官能團在某些反應條件下反應的基團(即，保護基團)。保護基團根據被保護的化學反應性基團的類型以及將要使用的反應條件和分子中存在其他的反應性或保護基團而變化(如果存在的話)。合適的保護基團包括諸如greene等人,「protectivegroupsinorganicsynthesis,」第三版,johnwiley和sons,inc.,紐約,1999論文中發現的那些。「烷基」是指具有指定碳原子數的直鏈或支鏈的、飽和的、脂族基團。例如，c1-c6烷基包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基等。其他烷基包括但不限於庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可以包括任何數量的碳，例如1-2,1-3,1-4,1-5,1-6,1-7,1-8,1-9,1-10,2-3,2-4,2-5,2-6,3-4,3-5,3-6,4-5,4-6和5-6。烷基通常是一價的，但可以是二價的，例如當烷基連接兩個部分時其為二價的。上文和下文中與有機基團或化合物有關的術語「低級」分別定義了可以具有多達7個並包括7個，優選多達4個並包括4個和(作為非支鏈的)一個或兩個碳原子的支鏈或非支鏈的化合物或基團。「亞烷基」是指如上定義的連接至少兩個其他基團的烷基，即二價烴基。與亞烷基連接的兩個部分可以連接到亞烷基的相同原子或不同原子。例如，直鏈亞烷基可以是二價基團(ch2)n，其中n為1、2、3、4、5或6。亞烷基包括但不限於亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞異丙基、亞丁基、亞異丁基、亞仲丁基、亞戊基和亞己基。烷基和雜烷基(包括通常稱為亞烷基、烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基和雜環烯基的那些基團)的取代基可以是選自以下的各種基團：-or』、＝o、＝nr』、＝n-or』、-nr』r」、-sr』、-滷素、-sir』r」r」』、-oc(o)r』、-c(o)r』、-co2r』、-conr』r」、-oc(o)nr』r」、-nr」c(o)r』、-nr』-c(o)nr」r」』、-nr」c(o)2r』、-nh-c(nh2)＝nh、-nr』c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr』、-s(o)r』、-s(o)2r』、-s(o)2nr』r」、-cn和-no2，其數量範圍為0至(2m』+1)，其中m'為這種基團中碳原子的總數。r』、r」和r」』各自獨立地表示氫、未取代的(c1-c8)烷基和雜烷基、未取代的芳基、被1-3個滷素取代的芳基、未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基(c1-c4)烷基。當r』和r」連接到相同的氮原子時，它們可以與氮原子結合形成5元環、6元環或7元環。例如，nr』r」意在包括1-吡咯烷基和4-嗎啉基。術語「烷基」包括諸如滷代烷基(例如-cf3和-ch2cf3)和醯基(例如-c(o)ch3、-c(o)cf3、-c(o)ch2och3等)的基團。優選地，取代的烷基和雜烷基具有1-4個取代基，更優選1、2或3個取代基。例外是那些全滷代烷基(例如五氟乙基等)，其也是本發明所優選和預期的。烷基和雜烷基(包括通常稱為亞烷基、烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基和雜環烯基的那些基團)的取代基可以是選自以下的多種基團：-or』、＝o、＝nr』、＝n-or』、-nr』r」、-sr』、-滷素、-sir』r」r」』、-oc(o)r』、-c(o)r』、-co2r』、-conr』r」、-oc(o)nr』r」、-nr」c(o)r』、-nr』-c(o)nr」r」』、-nr」c(o)2r』、-nr-c(nr』r」r』」)＝nr」」、-nr-c(nr』r」)＝nr』」、-s(o)r』、-s(o)2r』、-s(o)2nr』r」、-nrso2r』、-cn和-no2，其數量範圍為0至(2m』+1)，其中m'為這種基團中碳原子的總數。r』、r」、r」』和r」」各自獨立地表示氫、取代或未取代的雜烷基，取代或未取代的芳基，例如被1-3個滷素取代的芳基，取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。當本發明的化合物包含多於一個r基團時，例如，當存在這些基團中的多於一個時，每個r基團各自獨立地選自r』、r」、r」』和r」」基團。當r』和r」連接到相同的氮原子時，它們可以與氮原子結合形成5元環、6元環或7元環。例如，nr』r」意在包括但不限於1-吡咯烷基和4-嗎啉基。術語「烷基」包括與氫基以外的基團結合的碳原子，例如滷代烷基(例如-cf3和-ch2cf3)和醯基(例如-c(o)ch3、-c(o)cf3、-c(o)ch2och3等)。「烷氧基」是指具有氧原子的烷基，該氧原子將烷氧基連接到連接點或被連接到烷氧基的兩個碳原子。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基可進一步被本文所述的各種取代基取代。例如，烷氧基可被滷素取代以形成「滷代烷氧基」基團。「羧基烷基」是指被羧基取代的烷基(如本文所定義)。術語「羧基環烷基」是指被羧基取代的環烷基(如本文所定義)。術語烷氧基烷基是指被烷氧基取代的烷基(如本文所定義)。本文所用的術語「羧基」是指羧酸及其酯。「滷代烷基」是指如上定義的烷基，其中一些或全部氫原子被滷素原子取代。滷素(滷素)優選表示氯或氟，但也可以是溴或碘。例如，滷代烷基包括三氟甲基、氟甲基、1,2,3,4,5-五氟苯基等。術語「全氟」定義了所有可用氫被氟取代的化合物或基團。例如，全氟苯基是指1,2,3,4,5-五氟苯基，全氟甲基是指1,1,1-三氟甲基，全氟甲氧基是指1,1,1-三氟甲氧基。「氟取代的烷基」是指其中一個、一些或全部氫原子被氟代替的烷基。「環烷基」是指含有約3-12個、3-10個或3-7個環內碳原子的環狀烴基。環烷基包括稠合結構、橋環結構和螺環結構。「環內」是指構成部分環狀結構的原子或原子團。「環外」是指與環狀結構連接但不限定環狀結構的原子或原子團。「環烷基醚」是指具有3或4個環內碳原子和1個環內氧原子或硫原子的4元或5元環狀烷基(例如氧雜環丁烷、硫雜環丁烷、四氫呋喃、四氫噻吩)；或具有1或2個環內氧原子或硫原子的6-7元環狀烷基(例如，四氫吡喃、1,3-二噁烷、1,4-二噁烷、四氫噻喃、1,3-二噻烷、1,4-二噻烷、1,4-氧硫雜環戊烷)。「烯基」是指具有至少一個雙鍵的2-6個碳原子的直鏈或支鏈烴。烯基的實例包括但不限於乙烯基、丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、異戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。烯基也可以具有2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6個碳。烯基通常是一價的，但可以是二價的，例如當烯基將兩個部分連接在一起時，其為二價的。「亞烯基」是指連接至少兩個其他基團的如上定義的烯基，即二價烴基。與亞烯基連接的兩個部分可以連接到亞烯基的相同原子或不同的原子。亞烯基包括但不限於亞乙烯基、亞丙烯基、亞異丙烯基、亞丁烯基、亞異丁烯基、亞仲丁烯基、亞戊烯基和亞己烯基。「炔基」是指具有至少一個三鍵的、2-6個碳原子的直鏈或支鏈烴基。炔基的實例包括但不限於乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、異丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、異戊炔基、1,3-戊二炔、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔。炔基也可以具有2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6個碳。炔基通常是一價的，但可以是二價的，例如當炔基將兩個部分連接在一起時，其為二價的。「亞炔基」是指連接至少兩個其他基團的如上所定義的炔基，即二價烴基。與亞炔基連接的兩個部分可以連接到亞炔基的相同原子或不同的原子。亞炔基包括但不限於亞乙炔基、亞丙炔基、亞丁炔基、亞仲丁炔基、亞戊炔基和亞己炔基。「環烷基」是指含有3-12個環原子或指定數目的原子的飽和或部分不飽和的單環、稠合雙環或橋連多環組合。單環包括例如環丙基、環丁基、環戊基、環己基和環辛基。雙環和多環包括例如降冰片烷、十氫萘和金剛烷。例如，c3-8環烷基包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環辛基和降冰片烷。「亞環烷基」是指連接至少兩個其他基團的如上所定義的環烷基，即二價烴基。與亞環烷基連接的兩個部分可以連接到亞環烷基的相同原子或不同原子。亞環烷基包括但不限於亞環丙基、亞環丁基、亞環戊基、亞環己基和亞環辛基。「雜環烷基」是指具有3個環成員至約20個環成員和1至約5個諸如n、o和s雜原子的環系。也可以使用其他雜原子，包括但不限於，b、al、si和p。這些雜原子也可被氧化，例如但不限於-s(o)-和-s(o)2-。例如，雜環包括但不限於四氫呋喃基、四氫噻吩基、嗎啉基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、哌啶基、二氫吲哚基、奎寧環基和1,4-二氧雜-8-氮雜螺[4.5]-8-癸基。「亞雜環烷基」是指連接至少兩個其他基團的如上所定義的雜環烷基。連接到亞雜環烷基的兩個部分可以連接到亞雜環烷基的相同原子或不同原子。「芳基」是指含有6-16個環碳原子的單環或稠合雙環、三環或更大的芳族環組合。例如，芳基可以是苯基、苄基或萘基，優選苯基。「亞芳基」是指衍生自芳基的二價基團。芳基可以是被一個、兩個或三個下述基團單取代、二取代或三取代的芳基：烷基、烷氧基、芳基、羥基、滷素、氰基、氨基、氨基烷基、三氟甲基、亞烷基二氧和氧-c2-c3亞烷基。所有這些都可以任選地進一步被取代，例如如上所定義；或1-萘基或2-萘基；或1-菲基或2-菲基。亞烷基二氧基是連接到苯基的兩個相鄰碳原子的二價取代基，例如亞甲二氧或亞乙二氧。氧-c2-c3-亞烷基也是連接到苯基的兩個相鄰碳原子的二價取代基，例如，氧亞乙基或氧亞丙基。氧-c2-c3亞烷基苯基的實例是2,3-二氫苯並呋喃-5-基。優選芳基為萘基、苯基或被下述基團單取代或二取代的苯基：烷氧基、苯基、滷素、烷基或三氟甲基，特別為苯基或被烷氧基、滷素或三氟甲基單取代或二取代的苯基，尤其為苯基。作為r的、取代的苯基的實例是例如4-氯苯-1-基、3,4-二氯苯-1-基、4-甲氧基苯-1-基、4-甲基苯-1-基、4-氨基甲基苯-1-基、4-甲氧基乙基氨基甲基苯-1-基、4-羥乙基氨基甲基苯-1-基、4-羥乙基-(甲基)-氨基甲基苯-1-基、3-氨基甲基苯-1-基、4-n-乙醯氨基甲基苯-1-基、4-氨基苯-1-基、3氨基苯-1-基、2-氨基苯-1-基、4-苯基苯-1-基、4(咪唑-1-基)苯基、4-(咪唑-1-基甲基)苯-1-基、4(嗎啉-1-基)苯-1-基、4-(嗎啉-1-基甲基)苯-1-基、4-(2-甲氧基乙基氨基甲基)苯-1-基和4-(吡咯烷-1-基甲基)苯-1-基、4-(噻吩基)苯-1-基、4-(3-噻吩基)苯-1-基、4(4-甲基哌嗪-1-基)苯-1-基和4-(哌啶基)苯基和4-(吡啶基)苯基，上述基團任選地在雜環上取代。「亞芳基」是指連接至少兩個其他基團的如上所定義的芳基。與亞芳基連接的兩個部分連接到亞芳基的不同原子上。亞芳基包括但不限於亞苯基。「亞芳基氧」是指如上定義的亞芳基，其中與亞芳基連接的部分之一通過氧原子連接。亞芳基氧包括但不限於亞苯基基。類似地，芳基和雜芳基的取代基是變化的並且選自：-滷素、-or』、-oc(o)r』、-nr』r」、-sr』、-r』、-cn、-no2、-co2r』、-conr』r」、-c(o)r』、-oc(o)nr』r」、-nr」c(o)r』、-nr」c(o)2r』、,-nr』-c(o)nr」r」』、-nh-c(nh2)＝nh、-nr』c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr』、-s(o)r』、-s(o)2r』、-s(o)2nr』r」、-n3、-ch(苯基)2、全氟(c1-c4)烷氧基和全氟(c1-c4)烷基，其數量範圍為0至芳族環系上的開放化合價總數；並且其中r』、r」和r」』獨立地選自氫、(c1-c8)烷基和雜烷基、未取代的芳基和雜芳基、(未取代的芳基)(c1-c4)烷基和(未取代的芳基)氧(c1-c4)烷基。芳基或雜芳基環的相鄰原子上的兩個取代基可任選地被式-t-c(o)(ch2)q-u-的取代基取代，其中t和u獨立地是-nh-、-o-、-ch2或單鍵，並且q是0-2的整數。或者，芳基或雜芳基環的相鄰原子上的兩個取代基可以任選地被式-a-(ch2)rb的取代基取代，其中a和b獨立地是-ch2-、-o-、-nh-、-s-、-s(o)-、-s(o)2-、-s(o)2nr』-或單鍵，r是1-3的整數。如此形成的環的單鍵之一可任選地被雙鍵替代。或者，芳基或雜芳基環的相鄰原子上的兩個取代基可任選地被式-(ch2)s-x-(ch2)t-的取代基取代，其中s和t獨立地為0-3的整數，x是-o-、-nr』-、-s-、-s(o)-、-s(o)2-、or-s(o)2nr』-。nr'和s(o)2nr'中的取代基r'選自氫或未取代的(c1-c6)烷基。「雜芳基」是指含有5-16個環原子的單環或稠合雙環或三環芳環，其中1-4個環原子是n、o或s的雜原子。例如，雜芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、異喹啉基、苯並噻吩基、苯並呋喃基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯並噻唑基、噁唑基、異唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基，或被烷基、硝基或滷素取代的，特別是單取代或二取代的，任意其他基團。吡啶基表示2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，有利的是2-吡啶基或3-吡啶基。噻吩基表示2-噻吩基或3-噻吩基。喹啉基優選表示2-喹啉基、3-喹啉基或4-喹啉基。異喹啉基優選表示1-異喹啉基、3-異喹啉基或4-異喹啉基。苯並吡喃基、苯並噻喃基優選分別表示3-苯並吡喃基或3-苯並噻喃基。噻唑基優選表示2-噻唑基或4-噻唑基，最優選4-噻唑基。三唑基優選為1-(1,2,4-三唑基)、2-(1,2,4-三唑基)或5-(1,2,4-三唑基)。四唑基優選為5-四唑基。優選地，雜芳基是吡啶基、吲哚基、喹啉基、吡咯基、噻唑基、異噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、苯並噻唑基、苯並呋喃基、異喹啉基、苯並噻吩基、噁唑基、吲唑基，或取代的(特別是單取代或二取代)的任意所述基團。如本文所用，術語「雜烷基」是指具有1-3個諸如n、o和s雜原子的烷基。也可以使用其他雜原子，包括但不限於b、al、si和p。雜原子也可以被氧化，例如但不限於-s(o)-和-s(o)2-。例如，雜烷基可以包括醚、硫醚、烷基胺和烷基硫醇。如本文所用，術語「雜亞烷基」是指連接至少兩個其他基團的如上所定義的雜烷基。與雜亞烷基連接的兩個部分可以連接到雜亞烷基的相同原子或不同原子。「親電體」是指具有親電中心(即尋找電子的、能夠與親核體反應的中心)的離子或原子或可以是離子性的原子集合。親電體(或親電試劑)是通過接受來自反應配偶體(親核體)的兩個成鍵電子而與反應配偶體形成鍵的試劑。「親核體」是指具有親核中心(即尋找親電中心的或能夠與親電體反應的中心)的離子或原子或可以是離子性的原子集合。親核體(或親核試劑)是通過供給兩個成鍵電子而與其反應配偶體(親電體)形成鍵的試劑。「親核基團」是指與反應性基團反應後的親核體。非限制性實例包括氨基、羥基、烷氧基、滷代烷氧基等。「馬來醯亞胺基」是指具有以下結構的吡咯-2,5-二酮-1-基：其與巰基(例如硫代烷基)反應時形成具有以下結構的-s-馬來醯亞胺基，其中「·」表示馬來醯亞胺基團的連接點，表示硫醇的硫原子與原始的具有巰基的基團的剩餘部分的連接點。對於本發明的目的，蛋白質和多肽中發現的「天然存在的胺基酸」是l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬醯胺、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸、l-穀氨醯胺、l-穀氨酸、l-甘氨酸、l-組氨酸、l-異亮氨酸、l-亮氨酸、l-賴氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、l-蘇氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和/或l-纈氨酸。在蛋白質中發現的「非天然存在的胺基酸」是除了作為天然存在的胺基酸所記載的胺基酸之外的任何胺基酸。非天然存在的胺基酸包括但不限於天然存在的胺基酸的d異構體(混合物會被更準確地描述為一些天然胺基酸和一些非天然胺基酸)。雖然在天然存在的蛋白質中發現了其他胺基酸，如4-羥脯氨酸、鎖鏈素、異鎖鏈素、5-羥基賴氨酸、ε-n-甲基賴氨酸、3-甲基組氨酸，但為了本發明的目的，將其認為是蛋白質中發現的非天然存在的胺基酸，因為它們通常通過mrna的核糖體翻譯之外的方式引入。「線性」與聚合物的幾何結構、架構或整體結構有關，其是指具有單個聚合物臂的聚合物。「支鏈的」與聚合物的幾何結構、架構或整體結構有關，其是指具有從引發劑延伸的2個或更多個聚合物「臂」的聚合物。引發劑可以用於原子轉移自由基聚合(atrp)反應。支鏈聚合物可以具有2個聚合物鏈(臂)、3個聚合物臂、4個聚合物臂、5個聚合物臂、6個聚合物臂、7個聚合物臂、8個聚合物臂、9個聚合物臂、10個聚合物臂、11個聚合物臂、12個聚合物臂或更多。每個聚合物臂從聚合物引發位點延伸。每個聚合物引發位點都能夠作為通過添加單體實現聚合物鏈生長的位點。例如但不限於使用atrp，引發劑上的每個聚合物引發位點通常是經歷由過渡金屬化合物(如滷化亞銅)催化的可逆的氧化還原過程的有機滷化物。優選地，滷化物是溴化物。「藥學上可接受的」組合物或「藥物組合物」是指包含本發明化合物和一種或多種藥學上可接受的賦形劑的組合物。「藥學上可接受的賦形劑」和「藥學上可接受的載體」是指可以包括在本發明的組合物中的、對患者沒有引起顯著的不良毒理作用的並被fda批准或可批准用於治療用途(特別是對人的治療用途)的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑的非限制性實例包括水、nacl、生理鹽水溶液、乳酸林格氏素、標準蔗糖、標準葡萄糖等。「患者」或「有需要的個體」是指患有或易於患有可通過施用本文提供的藥物組合物預防或治療的病症的活生物體。非限制性實例包括人、其他哺乳動物和其他非哺乳動物。綴合物優選以分離形式提供。分離意味著目標物質至少部分地從與其天然相關汙染物或在其製造中使用的汙染物分離，但不一定排除旨在與分離的物質聯合起作用的其他成分的存在，例如藥用賦形劑。優選地，綴合物是存在於組合物樣品中的主要大分子物質(即以摩爾為基準)，並且通常包含存在的所有大分子物質的至少約50％(基於摩爾數)。通常，分離的綴合物包含存在於組合物中的所有大分子物質的80％、90％、95％或99％。最優選地，綴合物被純化至基本均勻(即，通過常規檢測方法不能在組合物中檢測到汙染物質)，使得組合物基本上由單一大分子物質組成。儘管在蛋白質部分上的糖基化以及與綴合物的不同分子連接的聚合物部分中的單體數目可能存在差異，但具有相同的重鏈和輕鏈的綴合物被認為是相同的物質。「有效量」是指用於治療、改善或預防確定的疾病或病症或用於表現出可檢測的治療或抑制作用的藥物組合物或綴合的功能劑的量。可以在單個患者中相對於治療前的基線測量檢測該作用或通過確定治療組和對照組之間的結果的統計學上的顯著性差異檢測該作用。同樣地，有效的方案是指有效減少、抑制或延遲疾病的至少一種病徵或症狀的本文所述的任何綴合物、融合蛋白或其他藥劑的給藥量、給藥頻率和給藥途徑的組合。物質的「生物半衰期」是藥代動力學參數，其規定了在將物質引入生物體後將一半物質從生物體中除去所需的時間。序列同一性可以通過使用默認間隙參數並使用在wisconsingeneticssoftwarepackagerelease7.0，geneticscomputergroup，575sciencedr.，madison，wi中的諸如bestfit、fasta和tfasta的算法進行序列比對來確定，或者通過檢查和最佳比對(即，導致比較窗口中序列相似度的最高百分比)來確定。通過以下步驟計算序列同一性的百分比：比較兩個比較窗口中的兩個最佳比對序列，確定兩個序列中存在的相同殘基的位置數以產生匹配位置數，將匹配位置數除以在比較窗口中的位置總數(即窗口尺寸)，並將結果乘以100以產生序列同一性的百分比。如果為全長成熟蛋白質提供具體的seqidno.，從成熟蛋白質的第一殘基(即，不考慮任何信號肽的殘基)的1位開始對殘基進行連續編號。seqidno.的變體或片段中的殘基通過與seqidno.進行最大比對並為對齊的殘基分配相同的數字來編號。術語「蛋白質」以其最廣泛的含義用於指兩個或多個亞單位，即胺基酸、胺基酸類似物或模擬肽。亞單位可以通過肽鍵連接。在另一個實施方案中，亞基可以通過其他鍵(例如酯，醚等)連接。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，並且對胺基酸的最大數量沒有限制，其可以包含蛋白質或肽的序列。如果肽鏈短，則三個或更多個胺基酸的肽通常稱為寡肽。如果肽鏈長，則肽通常稱為多肽或蛋白質。蛋白質的非限制性實例包括酶、細胞因子、神經營養因子、抗體、肽、激素、dna結合蛋白、適體、疫苗、毒素、白細胞介素-1(il-1α)、il-1β、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-11、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-31、il-32、il-33、集落刺激因子-1(csf-1)、巨噬細胞集落刺激因子、葡糖腦苷脂酶(glucocerobrosidase)、促甲狀腺激素、幹細胞因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子(g-csf)、epo、幹擾素-α(ifn-α)、複合幹擾素(consensusinterferon)-β(ifn-β)、幹擾素-(ifn-)、幹擾素-ω(ifn-ω)、血小板生成素(tpo)、血管生成素-1(ang-1)、ang-2、ang-4、ang-y、血管生成素樣多肽1(angptl1)、血管生成素樣多肽2(angptl2)、血管生成素樣多肽3(angptl3)、血管生成素樣多肽4(angptl4)、血管生成素樣多肽5(angptl5)、血管生成素樣多肽6(angptl6)、血管生成素樣多肽7(angptl7)、玻連蛋白、血管內皮生長因子(vegf)、血管生成素、激活素a、激活素b、激活素c、骨形態發生蛋白-1、骨形態發生蛋白-2、骨形態發生蛋白-3、骨形態發生蛋白-4、骨形態發生蛋白-5、骨形態發生蛋白-6、骨形態發生蛋白-7、骨形態發生蛋白-8、骨形態發生蛋白-9、骨形態發生蛋白-10、骨形態發生蛋白-11、骨形態發生蛋白-12、骨形態發生蛋白-13、骨形態發生蛋白14、骨形態發生蛋白-15、骨形態發生蛋白受體ia、骨形態發生蛋白受體ib、骨形態發生蛋白受體ii、腦源性神經營養因子、心肌營養素-1、睫狀中性白細胞因子、睫狀中性白細胞因子受體、cripto、隱性細胞因子誘導的嗜中性粒細胞趨化因子1、細胞因子誘導的嗜中性粒細胞、趨化因子2α、B型肝炎疫苗、C型肝炎疫苗、drotrecoginalfa、細胞因子誘導的嗜中性粒細胞趨化因子2β、內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子(egf)、epigen、上皮調節蛋白、上皮衍生的嗜中性粒細胞引誘劑、成纖維細胞生長因子4、成纖維細胞生長因子5、成纖維細胞生長因子6、成纖維細胞生長因子7、成纖維細胞生長因子8、成纖維細胞生長因子8b、成纖維細胞生長因子8c、成纖維細胞生長因子9、成纖維細胞生長因子10、成纖維細胞生長因子11、成纖維細胞生長因子12、成纖維細胞生長因子13、成纖維細胞生長因子16、成纖維細胞生長因子17、成纖維細胞生長因子19、成纖維細胞生長因子20、成纖維細胞生長因子21、酸性成纖維細胞生長因子、鹼性成纖維細胞生長因子、神經膠質細胞系衍生的中性粒細胞因子受體α1、神經膠質細胞系衍生的中性粒細胞因子受體、生長相關蛋白、生長相關蛋白a、igg、ige、igm、iga和igd、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、dnase、胎球蛋白、促黃體激素、阿替普酶、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整聯蛋白、凝血酶因子ix(fix)、因子viii(fviii)、因子viia(fviia)、血管性血友病因子(vwf)、因子fv(fv)、因子x(fx)、因子xi(fxi)、因子xii(fxii)、因子xiii(fxiii)、凝血酶(fii)、蛋白c、蛋白s、tpa、pai-1、組織因子(tf)、adamts13蛋白酶、生長相關蛋白β、生長相關蛋白、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝細胞源性生長因子、胰島素樣生長因子i、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子ii、胰島素樣生長因子結合蛋白、角質細胞生長因子、白血病抑制因子、生長激素、抗血友病因子、培門冬酶(pegaspargase)、orthocloneokt3、腺苷脫氨酶、阿糖腦苷酶(alglucerase)、伊米苷酶(imiglucerase)、白血病抑制因子受體α、神經生長因子受體、neuropoietin、神經營養因子-3、神經營養因子-4、制瘤素m(osm)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生的內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子a鏈、血小板衍生生長因子aa、血小板衍生生長因子ab、血小板衍生生長因子b鏈、血小板衍生生長因子bb、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前b細胞生長刺激因子、幹細胞因子(scf)、幹細胞因子受體、tnf、tnf0、tnf1、tnf2、轉化生長因子α、胸腺基質淋巴生成素(tslp)、i型腫瘤壞死因子受體、ii型腫瘤壞死因子受體、尿激酶型纖溶酶原激活物受體、磷脂酶活化蛋白(pup)、胰島素、凝集素蓖麻毒素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、促卵泡激素、甲狀腺刺激激素、組織纖溶酶原激活物(tpa)、瘦蛋白、enbrel(依那西普、etanercept)。在一些實施方案中，蛋白質是抗體。如本文所用，「抗體」包括但不限於完整抗體和任何抗原結合片段，抗原結合片段包括但不限於fab或其單鏈。因此，術語「抗體」包括但不限於包含具有與抗原結合的生物學活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的、任何含蛋白質或肽的分子。其實例可包括重鏈或輕鏈的互補決定區或其配體結合部分、重鏈可變區或輕鏈可變區、重鏈恆定區或輕鏈恆定區、框架(fr)區，或其任何部分，或結合蛋白的至少一部分。「抗體」還包括單克隆抗體和多克隆抗體。抗體的實例包括但不限於英夫利昔單抗(infliximab)、貝伐珠單抗(infliximab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、阿巴伏單抗(abagovomab)、阿昔單抗(abciximab)、阿託續單抗(actoxumab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿非莫單抗(afelimomab)、阿夫妥珠單抗(afutuzumab)、阿珠單抗(alacizumab)、培化阿珠單抗(alacizumabpegol)、ald518、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿里若庫單抗(alirocumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿麥妥昔單抗(amatuximab)、麻安莫單抗(anatumomabmafenatox)、安蘆珠單抗(anrukinzumab)、阿泊珠單抗(apolizumab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿賽珠單抗(aselizumab)、altinumab、阿利珠單抗(atlizumab)、atorolimiumab、託珠單抗(tocilizumab)、巴匹珠單抗(bapineuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝利木單抗(belimumab)、貝那珠單抗(benralizumab)、柏替木單抗(bertilimumab)、貝索單抗(besilesomab)、貝伐單抗(bevacizumab)、貝茲羅圖單抗(bezlotoxumab)、比西單抗(biciromab)、比伐單抗(bivatuzumab)、比伐單抗美登素(bivatuzumabmertansine)、博納吐單抗(blinatumomab)、布索珠單抗(blosozumab)、妥昔單抗維多汀(brentuximabvedotin)、布拉吉單抗(briakinumab)、巴羅達魯單抗(brodalumab)、康納單抗(canakinumab)、坎託珠單抗美登素(cantuzumabmertansine)、坎託珠單抗美坦新、卡普拉西珠單抗(caplacizumab)、卡羅單抗噴地肽(capromabpendetide)、卡魯單抗、卡妥索單抗(catumaxomab)、cc49、西利珠單抗、培化賽託珠單抗(certolizumabpegol)、西妥昔單抗、泊西他土珠單抗(citatuzumabbogatox)、西妥木單抗(cixutumumab)、克拉扎珠單抗(clazakizumab)、克立昔單抗、替坦司可利妥珠單抗(clivatuzumabtetraxetan)、可那妥木單抗(conatumumab)、克雷內珠單抗(crenezumab)、cr6261、達西妥珠單抗(dacetuzumab)、達利珠單抗(daclizumab)、達洛妥珠單抗(dalotuzumab)、達拉妥木單抗(daratumumab)、德美西珠單抗(demcizumab)、地諾單抗(denosumab)、地莫單抗(detumomab)、阿託度單抗(dorlimomabaritox)、卓齊妥單抗(drozitumab)、度利戈妥單抗(duligotumab)、度匹魯單抗(dupilumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、依庫珠單抗(eculizumab)、埃巴單抗、依決洛單抗、依法珠單抗、依夫單抗(efungumab)、依洛妥珠單抗(elotuzumab)、艾西莫單抗(elsilimomab)、依納伐妥珠單抗(enavatuzumab)、培化恩莫單抗、依諾珠單抗(enokizumab)、依諾替庫單抗(enoticumab)、恩西妥昔西單抗(ensituximab)、西依匹妥莫單抗(epitumomabcituxetan)、依帕珠單抗、厄利珠單抗(erlizumab)、厄馬索單抗(ertumaxomab)、伊瑞西珠單抗(etaracizumab)、依託珠單抗(etroiizumab)、艾韋單抗(exbivirumab)、法索單抗(fanolesomab)、法拉莫單抗、法勒珠單抗(farletuzumab)、法西奴單抗(fasinumab)、fbta05、非維珠單抗、非扎奴單抗(fezakinumab)、芬克拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、芬妥木單抗(figitumumab)、弗拉伏妥單抗(flanvotumab)、芳妥珠單抗(fontolizumab)、佛拉魯單抗(foralumab)、佛拉韋蘆單抗(foravirumab)、夫蘇木單抗(fresolimumab)、弗拉奴單抗(fulranumab)、弗妥昔單抗(futuximab)、加利昔單抗(galiximab)、甘尼妥單抗(ganitumab)、甘特蘆單抗(gantenerumab)、加韋莫單抗(gavilimomab)、吉妥珠單抗-奧佐米星(gemtuzumabozogamicin)、吉沃珠單抗(gevokizumabvedotin)、吉瑞妥昔單抗(girentuximab)、格列姆巴妥木單抗-維多汀(glembatumumab)、戈利木單抗(golimumab)、戈米昔單抗(gomiliximab)、gs6624、伊巴珠單抗(ibalizumab)、伊莫單抗-替坦(ibritumomabtiuxetan)、伊克蘆庫單抗(icrucumab)、伊戈伏單抗、英西單抗、英加妥珠單抗(imgatuzumab)、英克勒庫單抗(inclacumab)、英達妥昔單抗-拉夫坦辛(indatuximabravtansine)、英利昔單抗、英特妥木單抗(intetumumab)、伊諾莫單抗、伊諾妥珠單抗-奧佐米星(inotuzumabozogamicin)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊拉妥木單抗(iratumumab)、伊託珠單抗(itolizumab)、伊克塞珠單抗(ixekizumab)、凱利昔單抗、拉貝妥珠單抗(labetuzumab)、來金珠單抗(lebrikizumab)、來馬索單抗(lemalesomab)、樂地單抗、來沙妥木單抗(lexatumumab)、利韋單抗(libivirumab)、利格珠單抗(ligelizumab)、林妥珠單抗、利利單抗(lirilumab)、美登素洛妥珠單抗(lorvotuzumabmertansine)、魯卡妥木單抗(lucatumumab)、魯米昔單抗(lumiliximab)、馬帕妥木單抗(mapatumumab)、馬司莫單抗、馬利木單抗(mavriiimumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、美泊利單抗、美特木單抗(metelimumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗、米妥莫單抗、莫加木珠單抗(mogamulizumab)、莫羅木單抗、莫他韋珠單抗(motavizumab)、莫西妥莫單抗(moxetumomab)-假單胞菌外毒素(pasudotox)、莫羅單抗(muromonab)-0)3、他那可單抗(nacolomabtafenatox)、那米魯單抗(namilumab)、他那莫單抗(naptumomabestafenatox)、納那妥單抗(narnatumab)、那他珠單抗、奈巴庫單抗、奈昔妥木單抗(necitumumab)、奈瑞莫單抗、耐斯伐庫單抗(nesvacumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、尼伏魯單抗(nivolumab)、諾莫單抗-默噴坦(nofetumomabmerpentan)、奧卡拉妥珠單抗(ocaratuzumab)、奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、奧度莫單抗、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉妥單抗(olaratumab)、奧洛珠單抗(olokizumab)、奧馬佐單抗、奧納妥珠單抗(onartuzumab)、莫-奧珠單抗(oportuzumabmonatox)、奧戈伏單抗(oregovomab)、奧替庫單抗(orticumab)、奧特利昔珠單抗(otelixizumab)、奧昔魯單抗(oxelumab)、奧扎尼珠單抗(ozanezumab)、奧左拉珠單抗(ozoralizumab)、帕吉昔單抗(pagibaximab)、帕利珠單抗、帕尼單抗(panitumumab)、帕諾巴庫單抗(panobacumab)、巴薩妥珠單抗(parsatuzumab)、帕考珠單抗(pascolizumab)、帕特克珠單抗(pateclizumab)、帕曲妥單抗(patritumab)、培妥莫單抗(pemtumomab)、培拉珠單抗(perakizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、培克珠單抗(pexelizumab)、皮地珠單抗(pidilizumab)、平妥莫單抗(pintumomab)、普拉庫魯單抗(placulumab)、泊尼珠單抗(ponezumab)、普立昔單抗、普立妥木單抗(pritumumab)、pro140、奎利珠單抗(quilizumab)、雷妥莫單抗(racotumomab)、雷得妥單抗(radretumab)、瑞非韋魯(rafivirumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、瑞西巴庫(raxibacumab)、瑞加韋單抗、瑞利珠單抗(reslizumab)、利妥木單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗、羅妥木單抗(robatumumab)、羅度單抗(roledumab)、羅莫索珠單抗(romosozumab)、羅利珠單抗(rontalizumab)、羅維珠單抗、魯利單抗、沙馬珠單抗(samalizumab)、沙裡魯單抗(sarilumab)、沙妥莫單抗-噴地肽(satumomabpendetide)、司庫奴單抗(secukinumab)、司韋單抗、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、西法木單抗(sifalimumab)、西妥昔單抗(siltuximab)、西妥珠單抗(simtuzumab)、西利珠單抗(siplizumab)、西蘆庫單抗(sirukumab)、索蘭珠單抗(solanezumab)、索利託單抗(solitomab)、索耐珠單抗(sonepcizumab)、松妥珠單抗(sontuzumab)、司他木魯單抗(stamulumab)、硫索單抗、蘇韋珠單抗(suvizumab)、他巴魯單抗(tabalumab)、替坦司他卡妥珠單抗(tacatuzumabtetraxetan)、他度珠單抗(tadocizumab)、他利珠單抗(talizumab)、他尼珠單抗(tanezumab)、帕-他莫單抗(taplitumomabpaptox)、替非珠單抗(tefibazumab)、阿替莫單抗(telimomabaritox)、替妥莫單抗(tenatumomab)、替奈昔單抗(teneliximab),替利珠單抗(teplizumab)、替妥木單抗(teprotumumab)、tgn1412、曲美木單抗(tremelimumab)、替昔木單抗(ticilimumab)、替拉珠單抗(tildrakizumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、tnx-650、託珠單抗(＝阿利珠單抗)、託拉珠單抗(toralizumab)、託西莫單抗、特拉羅奴單抗(tralokinumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、trbs07、曲加珠單抗(tregalizumab)、曲美木單抗、妥可妥珠單抗(tucotuzumab)-西莫白介素、妥韋單抗、優利妥昔單抗(ublituximab)、優瑞魯單抗(urelumab)、優託珠單抗(urtoxazumab)、優特克單抗(ustekinumab)、伐利昔單抗(vapaliximab)、伐特珠單抗(vatelizumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、維帕莫單抗、維森庫單抗(vesencumab)、維西珠單抗(visilizumab)、伏洛昔單抗(volociximab)、伏司妥珠單抗(vorsetuzumab)-馬佛多汀(mafodotin)、伏妥莫單抗、扎魯妥木單抗(zalutumumab)、扎諾木單抗(zanolimumab)、扎妥昔單抗(zatuximab)、齊拉木單抗(ziralimumab)和阿左莫單抗(zolimomabaritox)。對於上述每一個，本發明預期使用其fab以及全抗體。iii.生物清除劑綴合物和構建體從人血清中分離的buche是分子量為340kda的球狀四聚體分子。haupth,heidek,zwislero和schwickhg.1966.isolierunundphysikalischchemisclecharakterisierungdercholinesteraseaushumanserum.blut.14:65-75。酶的四個亞基中的每一個長度為574個胺基酸。每條鏈都有九個asn連接的碳水化合物鏈。lockridgeo,bartelscf,vaughanta,wongck,nortonse,johnsonll.1987.completeaminoacidsequenceofhumanserumcholinesterase.jbiolchem.262:549-557。進行了各種嘗試以製備重組型buche。然而，證明在血漿中觀察到的主要四聚體形式只是由重組dna技術製備的蛋白質的次要組分。例如，rhbuche在中國倉鼠卵巢(cho)細胞中的表達產生蛋白質的混合物：二聚體(不穩定)(50-55％)、單體(15-40％)和相對小百分比的四聚體(10-30％)。blongrm,bedowse,lockridgeo.1997.tetramerizationdomainofhumanbutyrylcholinesteraseisatthec-terminus.biochemj.327:747-757。已確定hbuche的c末端負責四聚化。c末端缺失的蛋白質的表達導致單體的唯一生產。此外，blong等人報導說可以除去c-末端多達50個胺基酸而不損失酶活性(如上所述，僅能檢測到單體形式)。然而，從c-末端缺失51個胺基酸產生保留在細胞中的蛋白質的無活性形式(即不分泌)。人丁醯膽鹼酯酶(p06276.1)的602胺基酸序列示於seqidno.1。前28個胺基酸(mhskvtiicirflfwflllcmligksht(seqidno.27))構成hbuche的天然前導序列。因此，成熟酶以序列eddiii(seqidno.28)開始。根據本發明的一個方面，提供了丁醯膽鹼酯酶(buche)酶。優選地，丁醯膽鹼酯酶為人類酶(hbuche)。更優選地，酶為重組人類酶(rhbuche)。在本發明的優選實施方案中，丁醯膽鹼酯酶具有一個或多個缺失和/或胺基酸取代。優選地，將66位的半胱氨酸殘基(從成熟體的n末端開始)變為其他天然或非天然胺基酸，更優選，將c66變換為酪氨酸或異亮氨酸，最優選c66變換為酪氨酸(c66y)。根據本發明的一個方面，提供了rhbuche的c末端缺失。優選從rhbuche的c末端缺失不多於50個的胺基酸。更優選地，從rhbuche的c末端缺失50個胺基酸，得到構建體rhbuche524(指524n末端保留的胺基酸)。更優選地，從rhbuche的c末端缺失40個胺基酸，得到構建體rhbuche534。優選地，缺失突變具有上述c66突變中的一個或多個。更優選地，缺失突變具有c66y突變。在本發明的最優選方面，具有c66y突變的524缺失的蛋白質序列(rhbche524(c66y))示於seqidno.11。在本發明的另一個最優選的方面，具有c66y突變的534缺失的蛋白質序列(rhbche534(c66y))示於seqidno.10。根據本發明的一個方面，聚合物可以與buche綴合。優選地，使用馬來醯亞胺將聚合物與cys殘基綴合。cys殘基可能是一個天然存在的半胱氨酸。在本發明的其他優選實施方案中，半胱氨酸殘基可以加入到rhbuche的c末端缺失體之一中，使得蛋白質可以與聚合物綴合。優選地，將半胱氨酸加入到缺失後的rhbuche的c末端。在更優選的實施方案中，通過ggc或gggc(seqidno.20)肽向c末端添加半胱氨酸。在更優選的實施方案之一中，將肽gggc(seqidno.20)加入到rhbuche524(c66y)酶的c末端(見seqidno.12)。在另一個更優選的實施方案中，將肽ggc加入到rhbuche534(c66y)的c末端(見seqidno.13)。根據本發明的一個方面，提供了具有丁醯膽鹼酯酶片段和非丁醯膽鹼酯酶蛋白片段的丁醯膽鹼酯酶融合蛋白。在本發明的優選方面，丁醯膽鹼酯酶蛋白片段是非丁醯膽鹼酯酶片段的n-末端。優選地，非丁醯膽鹼酯酶蛋白是免疫球蛋白(ig)結構域。更優選ig結構域選自igg-fc、igg-ch和igg-cl。更優選地，ig結構域來自igg1(seqidno.8)。在本發明的其他優選實施方案中，igg1fc序列可以以各種方式進行修飾，例如調節補體結合和效應子功能。任選地，igg1fc結構域具有一個或多個突變以降低效應子功能。任選地，突變是以下胺基酸位置中的一個或多個(eu編號)：e233、l234、l235、g236、g237、a327、a330和p331。在這方面，優選地，igg1fc具有以下取代：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。fc結構域c末端的賴氨酸殘基有時可以通過翻譯後處理來使其缺失。因此，當fc結構域的seqid以賴氨酸終止時，賴氨酸可以省略也可以不省略。根據本發明的一個方面，可以引入fc區的修飾以提供聚合物綴合的位點。例如，可以加入半胱氨酸殘基，該半胱氨酸殘基可以是聚合物綴合位點。優選地，fc結構域具有選自q347c和l443c的突變。更優選地，突變為q347c。根據本發明的一個方面，融合蛋白優選在丁醯膽鹼酯酶和非丁醯膽鹼酯酶蛋白之間含有多肽接頭。優選地，接頭為g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)以及前述接頭的低聚物。更優選地，接頭選自gggsgggsgggs(seqidno.21)和ggsgggsgggs(seqidno.25)。在本發明的優選實施方案中，融合蛋白的丁醯膽鹼酯酶為融合物n末端的、具有優選的c66y突變的上述c末端截短體之一(rhbuche524(c66y)或rhbuche534(c66y))，接著是接頭以及c末端的非丁醯膽鹼酯酶蛋白序列。在本發明的更優選方面，從n末端開始，融合蛋白由上述的具有c66y突變的524或534c-末端截短體、與其融合的接頭gggsgggsgggs(seqidno.21)以及隨後的具有以下突變的igg1fc序列組成：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。在本發明最優選的實施方案中，融合蛋白的丁醯膽鹼酯酶截短體為rhbuche534(c66y)。該構建體的蛋白質序列示於seqidno.15。在本發明的另一個非常優選的實施方案中，融合物的fc區具有q347c或l443c突變。最優選地，融合物的fc區具有q347c突變和l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。該優選實施方案的蛋白質序列示於seqidno.2。根據本發明的另一方面，提供了具有共價結合至聚合物的op生物清除劑(即催化op生物清除劑或化學計量的op生物清除劑)的蛋白質-聚合物綴合物。優選地，聚合物為兩性離子聚合物，該聚合物具有一個或多個單體單元，其中至少一個單體單元具有兩性離子。催化op生物清除劑通常為選自芳基二烷基磷酸酶、有機磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶(triesterase)、磷酸三酯酶、芳基酯酶、對氧磷酶(pon)、有機磷酸酐酶和二異丙基氟磷酸酶(dfpases)的酶。在本發明的一個方面，op生物清除劑是化學計量的op生物清除劑。優選地，化學計量的op清除劑是選自乙醯膽鹼酯酶(ache)和丁醯膽鹼酯酶的膽鹼酯酶。優選地，膽鹼酯酶是buche。根據本發明的一個方面，膽鹼酯酶(包括丁醯膽鹼酯酶)可以根據已知技術從血清中純化而來。因此，如果希望根據本發明的一個方面製備用於施用於人的綴合物，則人血清可以用作膽鹼酯酶的來源。或者，根據本發明的另一方面，使用重組dna技術製備膽鹼酯酶以及與催化op生物清除劑相關的各種酶。根據本發明的某些方面，膽鹼酯酶(或與催化op生物清除劑相關的酶)的生產包括本領域已知的任何用於以下操作的方法：(i)通過基因工程生產重組dna，(ii)通過例如但不限於轉染、電穿孔或顯微注射將重組dna引入原核或真核細胞，(iii)培養所述轉化細胞，(iv)表達蛋白質，例如組成型表達或誘導型表達，和(v)分離蛋白質，例如從培養基中或通過收穫轉化的細胞分離蛋白，以(vi)獲得純化的蛋白質。在本發明的優選方面，通過在合適的原核或真核宿主系統中表達產生蛋白質，其特徵在於產生藥理學上可接受的蛋白質分子。真核細胞的實例是哺乳動物細胞，例如cho、cos、hek293、bhk、sk-hip和hepg2。在另外的方面，多種載體用於製備蛋白質，其選自真核和原核表達載體。用於原核表達的載體的實例包括質粒，例如但不限於preset、pet和pad，其中用於原核表達載體的啟動子包括lac、trc、trp、reca或arabad中的一個或多個。用於真核表達的載體的實例包括：(i)用於在酵母中表達的載體，例如但不限於pao、ppic、pyes或pmet，其使用例如但不限於aox1、gap、gal1或aug1的啟動子；(ii)用於在昆蟲細胞中表達的載體，例如但不限於pmt、pac5、pib、pmib或pbac，其使用諸如但不限於ph、p10、mt、ac5、opie2、gp64或polh的啟動子，以及(iii)用於在哺乳動物細胞中表達的載體，例如但不限於psvl、pcmv、prc/rsv、pcdna3或pbpv，以及一方面來源於病毒系統的載體，例如但不限於牛痘病毒、腺相關病毒、皰疹病毒或逆轉錄病毒，其使用例如但不限於cmv、sv40、ef-1、ubc、rsv、adv、bpv和β-肌動蛋白的啟動子。buche的測定法在本領域中是已知的，buche高效地催化乙醯硫代膽鹼(atch)—酶的天然底物的硫類似物的水解。可以使用其他硫醇膽鹼底物，包括s-丁醯硫基膽鹼(btch)碘化物。在水解時，該底物類似物產生乙酸鹽和硫代膽鹼。硫代膽鹼在高反應性二硫代二硝基苯甲酸(dtnb)離子存在下產生黃色，其是可見的並且可以通過在405nm的分光光度吸收進行定量監測。這些技術在以下文獻中描述，所有這些文獻都通過引用併入本文：g.l.ellman,k.d.courtney,v.andres和r.m.featherstone,「anewandrapidcolorimetricdeterminationofacetylcholinesteraseactivity,」biochemicalpharmacology,vol.7,no.2,pp.8895,1961；m.a.gordon,d.e.carpenter,h.w.barrett和i.b.wilson,「determinationofthenormalityofcholinesterasesolutions,」analyticalbiochemistry,vol.85,no.2,pp.519527,1978；以及v.gorun,i.proinov,v.baltescu,g.balaban,和o.barzu,「modifiedellmanprocedureforassayofcholinesterasesincrudeenzymaticpreparations,」analyticalbiochemistry,vol.86,no.1,pp.324326,1978。根據本發明的一個方面，hbuche的內源性前導肽可用於蛋白質的重組表達。然而，更優選地，應選擇前導肽以最大化蛋白質表達的水平。在優選實施方案中，使用ctla4前導肽。最優選地，優選seqidno.18所示的前導肽。根據本發明的優選方面，兩性離子聚合物由具有磷酸膽鹼基團的單體形成。優選單體是2-(丙烯醯氧基乙基)-2'-(三甲基銨乙基)磷酸酯。更優選地，單體是2-(甲基丙烯醯氧基乙基)-2'-(三甲基銨乙基)磷酸酯(hema-pc)。綴合於生物清除劑的聚合物優選具有至少2個聚合物臂，更優選3個或更多個臂。一些聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個臂。更優選地，聚合物具有3、6或9個臂。最優選地，聚合物具有9個臂。優選地，聚合物具有300,000-1,750,000da的峰值分子量。更優選地，聚合物具有500,000-1,000,000da的峰值分子量。更優選地，聚合物具有600,000-800,000da的峰值分子量。除非另有說明，支鏈聚合物的分子量是指所有臂的總分子量。根據本發明的一個方面，可用於綴合聚合物的、蛋白質上的親核基團(包括抗體)包括但不限於：(i)n-末端胺基，(ii)側鏈胺基，例如賴氨酸，(iii)側鏈巰基，例如半胱氨酸，和(iv)糖羥基或氨基，在此處蛋白被糖基化。胺、硫醇和羥基是親核的並且能夠與接頭部分和接頭試劑上的親電子基團反應形成共價鍵，該連接到聚合物上的接頭部分和接頭試劑包括：(i)活性酯如nhs酯、hobt酯、滷代甲酸酯和醯滷；(ii)烷基和苄基滷化物，例如滷代乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基和馬來醯亞胺基團。許多包括抗體在內的蛋白質都具有潛在地用於綴合的半胱氨酸硫醇基團。優選地，通過重組dna技術加入半胱氨酸殘基用於綴合。許多半胱氨酸殘基是可還原的鏈間二硫鍵，即半胱氨酸橋的形式。通常不能獲得二硫化物形式的半胱氨酸殘基以與諸如馬來醯亞胺的試劑反應。半胱氨酸殘基也可以是游離的或未配對的。然而，經常發現游離半胱氨酸殘基被各種培養基中的一種或多種試劑「封端(capped)」，並且也不可用於綴合。可以通過用諸如dtt(二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(tcep)的還原劑處理使半胱氨酸殘基具有與諸如馬來醯亞胺的接頭試劑綴合的反應性，使得蛋白質被完全或部分還原。因此，每個半胱氨酸橋理論上將形成兩個反應性硫醇親核試劑。在游離半胱氨酸的情況下，通過還原形成一種硫醇親核試劑。根據所使用的條件，被tcep或dtt還原可導致適當的蛋白質摺疊的喪失並伴隨著活性的喪失。然而，通過允許在適當條件下的蛋白質重摺疊可以恢復活性。可以通過賴氨酸殘基的修飾將另外的親核基團引入抗體，例如通過使賴氨酸殘基與2-亞氨基四氫噻吩(traut's試劑)反應，使得胺轉化為硫醇。通過引入一個、兩個、三個、四個或更多個半胱氨酸殘基(例如通過製備包含一個或多個非天然半胱氨酸胺基酸殘基的變體)，可將反應性硫醇基團引入蛋白質。根據本發明的優選方面，丁醯膽鹼酯酶融合物對應於seqidno.2，用於與聚合物綴合的cys殘基是在胺基酸672處的cys殘基。根據本發明的一個方面，提出了一種用於治療或預防op中毒的方法，其中在有效的方案中將本發明的綴合物或融合蛋白施用於有需要的患者。關於預防，與從普通公眾中隨機選擇的個體的對照群相比，將要或可能以統計學上顯著較高的頻率暴露於op化合物(op農藥或op神經毒劑)的個體會需要本發明。例如，在戰場或犯罪背景下可能暴露於op神經毒劑的士兵或執法辦公室人員可能需要本發明。類似地，參與向農作物施用op農藥的工人可能需要本發明，負責處理農藥或神經毒劑意外洩漏的工作人員也可能需要本發明。雖然可能有防護服和防毒面具來防止暴露，但這種保護措施可能無法提供保護。在這種情況下，可以採用本預防方法。在本發明的優選方面，綴合物或融合蛋白通過靜脈內給藥、皮下給藥、肌內給藥、病灶內給藥或皮內給藥來施用。優選地，通過肌內給藥施用。在本發明的另一方面，提出了一種針對op中毒進行長期預防的方法，其中在預期暴露於op化合物前至少7天施用綴合物，所述綴合物具有選自化學計量的有機磷(op)生物清除劑和與兩性離子聚合物共價結合的催化op生物清除劑的有機磷生物清除劑，其中所述聚合物具有一種或多種類型的單體單元，並且其中至少一種類型的單體單元具有兩性離子基團。換句話說，這種預防性施用的綴合物對可能的暴露於op中毒保持至少七天有效。在本發明的優選方面，綴合物在預期暴露於op神經毒劑前至少14天施用。更優選地，綴合物在預期暴露於op神經毒劑前至少21天施用。更優選地，綴合物在預期暴露於op神經毒劑之前至少30天施用。或者換句話說，針對可能的暴露於op，綴合物提供至少14、21或30天的有效保護。在本發明的另一方面，提出了一種用於快速預防op中毒的方法，其中在預期暴露於op化合物之前至少12小時施用綴合物，所述綴合物具有選自化學計量的有機磷(op)生物清除劑和與兩性離子聚合物共價結合的催化op生物清除劑的有機磷生物清除劑，其中所述聚合物具有一種或多種類型的單體單元，並且其中至少一種類型的單體單元具有兩性離子基團。更優選地，綴合物在預期暴露於op化合物之前至少24小時施用。換句話說，綴合物保持至少12或24小時的有效保護。本發明的藥物組合物還可以包含藥學上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。適於口服給藥的藥物組合物可以作為離散單元例如膠囊、溶液、糖漿或懸浮液(在水性或非水性液體中)提供，或作為可食用泡沫或泡沫狀物提供，或作為乳劑提供。用於片劑或硬膠囊的合適的賦形劑包括乳糖、玉米澱粉或其衍生物、硬脂酸或其鹽。與軟明膠膠囊一起使用的合適的賦形劑包括例如植物油、蠟、脂肪、半固體或液體多元醇等。為了製備溶液和糖漿，可以使用的賦形劑包括例如水、多元醇和糖。為了製備懸浮液，可以使用油(例如植物油)來提供水包油或油包水懸浮液。其中載體是固體的適於鼻腔給藥的藥物組合物包括具有例如20-500微米範圍內的粒度的粗粉末，其以攝取鼻煙的方式施用，即通過從被保持靠近鼻子的粉末容器經由鼻通道快速吸入。其中載體為液體的、作為鼻噴霧劑或鼻滴劑給藥的合適的組合物包括活性成分的水溶液或油溶液。適於通過吸入給藥的藥物組合物包括可以通過各種類型的劑量計量加壓氣噴器、噴霧器或吹入器產生的細顆粒粉末或霧。適於腸胃外給藥的藥物組合物包括水性和非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和溶質，其使製劑基本上與預期接受者的血液等滲；以及可以包含懸浮劑和增稠劑的水性和非水性無菌懸浮液。可用於可注射溶液的賦形劑包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。組合物可以在單位劑量或多劑量容器中提供，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，並且可以在冷凍乾燥(凍幹)條件下儲存，其僅需在使用前加入無菌液體載體，例如用於注射液的水即可。臨場注射溶液和懸浮液可以由無菌粉劑、顆粒劑和片劑製備。藥物組合物可以是基本上等滲的，意味著約250-350mosm/kg水的重量摩爾滲透壓濃度(osmolality)。通常，藥物組合物可以含有防腐劑、增溶劑、穩定劑、潤溼劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、氣味劑、鹽(本發明的物質本身可以以藥學上可接受的鹽的形式提供)、緩衝劑、包衣劑或抗氧化劑。除了本發明的物質之外，它們還可以含有治療活性劑。本發明的藥物組合物可以與藥學上可接受的稀釋劑、佐劑或載體組合使用。這樣的賦形劑可以包括但不限於鹽水、緩衝鹽水(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、葡萄糖、脂質體、水、甘油、乙醇及其組合。藥物組合物可以以對治療患者疾病有效的任何有效方便的方式施用，包括例如通過口服、靜脈內、皮下、肌內、骨內、鼻內途徑等施用。在治療中或作為預防劑，活性劑可作為可注射組合物施用於個體，例如作為無菌水性分散體，優選等滲無菌水性分散體。對於施用於哺乳動物，特別是人，預期活性劑的日劑量為0.01mg/kg體重，通常為約1mg/kg。無論如何，醫生將根據包括個體的年齡、體重、性別和反應在內的因素確定最適合個體的實際劑量。上述劑量是平均情況的示例。當然，可以存在使用更高或更低劑量的實例，並且這些在本發明的範圍內。根據待治療的疾病或病症、待治療的個體的年齡和狀況等，本發明物質的劑量可以在寬的範圍內變化，並且醫師將最終確定適當的劑量。該劑量可以按適當的頻率重複。如果發生副作用，可以根據正常的臨床實踐減少劑量的量和/或頻率。在一個實施方案中，藥物組合物可以每1-3天施用一次。本發明的藥物組合物可以單獨使用或與其他化合物結合使用，其他化合物例如治療性化合物或分子，例如氨基甲酸酯、抗毒蕈鹼、膽鹼酯酶活化劑和抗驚厥藥。可以與其他化合物同時地、分開地或順序地施用。組分可以以試劑盒的形式製備，試劑盒可以視情況包括說明書。優選地，將本發明的藥物組合物和其他治療性化合物直接(相對於什麼？)施用於有需要的患者。本發明還提供了包含本發明的藥物組合物和包含但不限於用於口服給藥的膠囊、用於肺部給藥的吸入劑和用於腸胃外給藥的可注射溶液的給藥載體的成套試劑盒。如本文所用，術語「治療」包括可以使人或非人動物受益的任何方案。「非人動物」的治療延伸到對家畜的治療，家畜包括馬和寵物(例如貓和狗)以及農場/農業動物，農場/農業動物包括綿羊、犬、豬、牛和馬家族的成員。治療可以是針對任何現有的病症或疾病，或者可以是預防性的(預防性治療)。治療可以針對遺傳疾病或後天疾病。治療可以針對急性或慢性疾病。根據本發明的一個方面，提供了一種製備綴合物的方法，其具有在合適的條件下使聚合物試劑與包含游離巰基殘基的生物活性劑接觸從而提供綴合物的步驟，其中聚合物試劑具有以下結構：其中p為支鏈或非支鏈的水溶性聚合物；l1為第一接頭，l2為第二接頭，l3為第三接頭，其中l1、l2和l3相同或不同，並且各自選自-c1-c12烷基-、-c3-c12環烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12環烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12環烷基)-、-(c3-c12環烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12環烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-，鍵以及以上的任意組合；x選自f、cl、br和i；r1和r2相同或不同，並且選自h(條件為r1和r2不都是h)和一個或多個鹼性基團，其中鹼性基團選自其中r3、r4、r5、r6和r7相同或不同，並且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r8和r9相同或不同，並且選自鍵、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r10、r11、r12、r13和r14相同或不同，並且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一個或多個精氨酸殘基。優選地，生物活性劑選自治療性蛋白質和適體。更優選地，生物活性劑是治療性蛋白質。治療性蛋白質優選為細胞因子、酶、抗體和抗體片段。更優選地，治療性蛋白質是fab。最優選地，fab是igg1。當生物活性劑是治療性蛋白質時，游離巰基優選由蛋白質的半胱氨酸殘基貢獻。在本發明的某些方面，半胱氨酸殘基是天然存在的半胱氨酸殘基。或者，通過重組dna技術引入半胱氨酸殘基。p優選為聚(環氧烷)、聚(mpc)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(n-丙烯醯基嗎啉)。更優選地，p是聚(環氧烷)。更優選地，p是聚(環氧乙烷)，其更常被稱為聚乙二醇或peg。其中p是peg，peg優選是支鏈的。優選地，分支peg具有兩個臂。每個臂優選在約5kda至約40kda之間。更優選地，每個臂具有約20kda的peg的分子量。對於水溶性聚合物，本發明的聚合物試劑還包含至少一種水溶性聚合物片段。具有2至約2000個單體單元的、非肽的且水溶性的水溶性聚合物在本發明中特別有利。合適的水溶性聚合物的實例包括但不限於聚(亞烷基二醇)，例如聚(乙二醇)(「peg」)、具有水溶性的乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羥烷基甲基丙烯醯胺)、聚(甲基丙烯酸羥烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(mpc)和聚(n-丙烯醯基嗎啉)，例如第5,629,384號美國專利中所述，該文獻通過引用併入本文。在需要相對高的水溶性的一些應用中，水溶性聚合物不是聚(環氧丙烷)。在本發明的另一方面，p是聚(mpc)。聚(mpc)優選具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個臂。更優選地，聚(mpc)具有3、6或9個臂。最優選地，聚(mpc)具有9個臂。根據本發明的一個方面，聚(mpc)優選具有300,000-1,750,000道爾頓，更優選500,000-1,000,000道爾頓，更加優選600,000-800,000道爾頓的峰值分子量。根據本發明的優選方面，l3為鍵，r2為h，r1為優選的，l2為-(ch2)1-6-。更優選地，l2為-(ch2)3-。在本發明的另一方面，提供了用於聚合物合成的引發劑，其具有以下結構：其中l1為第一接頭，l2為第二接頭，l3為第三接頭，其中l1、l2和l3相同或不同，並且各自選自-c1-c12烷基-、-c3-c12環烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12環烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12環烷基)-、-(c3-c12環烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12環烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-，鍵以及以上的任意組合；r1和r2相同或不同，並且選自h(條件為r1和r2不都是h)，和一個或多個鹼性基團，其中鹼性基團選自其中r17和r18是c1-6烷基，優選其中r17和r18都是甲基，其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，並且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，並且選自鍵、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，並且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一個或多個精氨酸殘基；且r3、r4和r5相同或不同，並且選自：其中y為ncs、f、cl、br或i。優選地，y為br。r3、r4和r5優選各自為更優選地，r3、r4和r5各自為更加優選地，r4、r5和r6各自為在本發明的一個方面，l3為鍵，r2為h，r1為l2優選為-(ch2)1-6-。更優選的，l2為-(ch2)3-。iv.實施例實施例1.rbuche截短物通過在524位(指成熟蛋白)上截短hbuche酶來製備op生物清除劑(rhbuche524)。此外，引入突變c66y。rhbuche524(c66y)的蛋白質序列示於seqidno.10。如果希望將聚合物與rhbuche524(c66y)綴合，則可以在末端加入ggc或gggc序列(seqidno.20)。rhbuche524gggc(c66y)的蛋白質序列示於seqidno.12(公開的「gggc」示於seqidno.20)。另一種生物清除劑是通過在位置534(指成熟蛋白)上截短hbuche來製備的。rhbuche534(c66y)的序列示於seqidno.10。對於使用半胱氨酸與聚合物的綴合，任選地將ggc加入到末端。rhbuche534ggc(c66y)的蛋白質序列為seqidno.13。實施例2.rbuche融合蛋白藉助重組基因工程，通使用上述534截短物並將其融合到igg1的fc區來製備rhbuche融合蛋白，其中在兩個蛋白質片段之間具有gs接頭(gggsgggsgggs)(seqidno.21)。rhbuche534-fc序列顯示於seqidno.16。具有c66y突變的融合構建體(rhbuche534(c66y)-fc)顯示於seqidno.17。在另一個形式中，引入了各種效應子功能突變：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。hbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s和p331s)融合物顯示於seqidno.15。可以工程化進入蛋白質的fc部分的另一個突變是q347c，其可用於將諸如poly(mpc)的聚合物與蛋白質綴合。rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)的蛋白質序列示於seqidno.2。使用用於真核基因表達的合適的dna構建體在cho-k1細胞中表達各種蛋白質構建體。儘管內源性hbuche前導序列可用於構建體(參見seqidno.1)的重組表達，但優選ctla4前導序列，其序列示於seqidno.18。用於表達rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)的dna序列示於seqidno.9。實施例3.構建體的瞬時表達在expi293表達系統(gibco)中進行瞬時表達分析。檢查了許多rhbuche524截短物的表達。一般來說，rhbuche524構建體未被表達或與相應的rhbuche534構建體一樣未被表達。關於rhbuche534構建體，發現c66y構建體通常比沒有這種改變的構建體更好地被表達。534構建體的瞬時表達數據總結於下表：表1實施例4.穩定的轉染子基於瞬時表達分析的結果，由rhbuche534ggc(c66y)和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)製備穩定的轉化體。用於fc融合的穩定轉染子使用seqidno.18所示的ctla4前導序列，該前導序列在seqidno.2所示的蛋白質的n-末端融合。該構建體的dna序列示於seqidno.9。實施例5.buche-fc融合蛋白與mpc聚合物的綴合seqidno.2的人buche-fc融合蛋白用tcep變性(如以下實施例6中所述)，以在fc鏈的347位提供游離半胱氨酸硫醇，然後進行有限的復性。然後將經tcep處理的buche-fc與750kda的聚合物綴合，其中使用相對於蛋白質過量15-50倍的聚合物，從而生成如下所示的綴合物。實施例6.buche-fc的脫帽和重摺疊在室溫下，在edta的存在下，用30倍摩爾過量的tcep將buche-fc融合物還原數小時。在該還原之後，對蛋白質進行通過uf/df洗滌tcep的步驟以將tcep濃度降低至約8倍摩爾過量。進一步進行uf/df和稀釋以將tcep降低至小於1μm。然後使還原的buche-fc復性，在復性過程(通過單體buche-fc的消失和二聚體buche-fc的出現觀察)後進行sds-page。復性後，如上所述進行蛋白質與聚合物的綴合。實施例7.聚合物r5743的合成對下面所示的聚合物r5743進行如下合成：按照如下步驟合成具有以下結構的tfa/胺鹽引發劑(化合物l)。化合物l首先，合成具有以下結構的化合物k：化合物k在氮氣下向200ml圓底燒瓶中加入化合物j(1.9g，2.67mmol，3.3當量)化合物j和化合物e(0.525g，0.81mmol，1.0當量)(參見以下結構)，化合物e接著加入二甲基甲醯胺(10ml)，然後加入二異丙基乙胺(2.5ml，14.6mmol，18當量)。將燒瓶用冰浴冷卻至0℃。在約6分鐘內向其中加入丙基膦酸酐溶液(50wt.％的乙酸乙酯溶液，2.5ml，4.04mmol，5當量)。將反應物升溫至室溫並攪拌15分鐘。通過加入水(20ml)、飽和碳酸氫鈉水溶液(20ml)和乙酸乙酯(100ml)淬滅反應。分離有機層，用乙酸乙酯(75ml)萃取水層。將合併的有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液(30ml)、0.5m檸檬酸水溶液(40ml)、水(25ml)和飽和氯化鈉水溶液(40ml)洗滌，然後乾燥(硫酸鈉)、過濾並在真空下濃縮。得到無需進一步純化即可使用的殘餘物，即2.0g(0.80mmol，99％)化合物k。1hnmr(400mhzdmso-d6):δ＝1.36(s,9h,occh3),1.90(s,54h,cc(ch3)2br),2.31(t,j＝7.2hz,6h,cch2ch2nh),2.98(d,j＝5.6hz,6h,cch2nh),3.04(q,j＝6.0hz,2h,och2ch2nh),3.18(s,2h,och2c),3.3-3.37(m,8h,ch2),3.47-3.55(m,12h,ch2),3.58(s,6h,och2c),3.87(s,6h,d)。在室溫下進行30分鐘，將反應物在真空下濃縮，用二氯甲烷(10ml)稀釋，並真空濃縮。使用乙腈(10ml)溶解殘餘物，通過針筒式過濾器(acrodisccr25，pn4225t)過濾，並上樣至製備hplc柱，用60％乙腈水溶液(含0.1％三氟乙酸)至98％乙腈(含0.1％三氟乙酸)洗脫。合併含有產物的試管，真空濃縮，冷凍並置於冷凍乾燥器上，得到990mg(0.4mmol，兩步產率50％)化合物l，其為白色粉末。1hnmr(400mhzdmso-d6):＝1.90(s,54h,cc(ch3)2br),2.31(t,j＝7.2hz,6h,cch2ch2nh),2.97-3.0(m,8h,cch2nh和och2ch2nh),3.17(s,2h,och2c),3.3(q,6h,ch2ch2nhc＝o),3.4-3.59(m,20h,ch2),3.87(s,6h,o＝cch2o),4.27(s,18h,cch2oc＝o),7.69-7.84(m,9h,ch2nhc＝o和nh3+)。lc-ms(es,m/z):[(m+2h)/2]+(c84h136br9n7o33+2h)/2的計算值＝1196.6；實驗值1197.4。按照如下步驟合成具有以下結構的tfa/胺鹽引發劑(化合物p)：化合物p向20ml的小瓶中加入化合物l(430mg，0.172mmol，1.0當量)(見上文)和α-叔丁氧基羰基氨基-ω-羧基十二(乙二醇)(154mg，0.215mmol，1.25當量)，然後加入n,n-二甲基甲醯胺(2ml)，然後加入n,n-二異丙基乙胺(0.18ml，1.03mmol，6當量)。將燒瓶用冰浴冷卻至0℃。在1分鐘內向其中加入丙基膦酸酐溶液(50wt.％的乙酸乙酯溶液，0.215ml，0.343mmol，2當量)。將反應物升溫至室溫並攪拌30分鐘。通過加入水、飽和碳酸氫鈉水溶液和乙酸乙酯淬滅反應。分離有機層，用乙酸乙酯萃取水層。合併的有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液、0.5m檸檬酸水溶液、水和飽和氯化鈉水溶液洗滌，然後乾燥(硫酸鈉)、過濾並真空濃縮。得到無需進一步純化即可使用的殘餘物，即0.6g(0.194mmol)如下所示的化合物n。lc-ms(es,m/z):[(m+2h-boc)/2]+(c111h189br9n8o46+2h-boc)/2計算值＝1496.3；實驗值1497.2。化合物n在氮氣下向100ml圓底中加入化合物n(0.6g)和二氯甲烷(4ml)然後加入三氟乙酸(3ml)。將反應物在室溫下攪拌15分鐘。將反應物在真空下濃縮。殘餘物用乙腈(3ml)溶解，通過針筒式過濾器(acrodisccr25，pn4225t)過濾，並上樣至製備hplc柱，用50％乙腈(含0.1％三氟乙酸)在50％水(含0.1％三氟乙酸)中的溶液至90％乙腈(含0.1％三氟乙酸)洗脫。合併含有產物的試管，真空濃縮，冷凍並置於冷凍乾燥器上，得到200mg(0.064mmol，兩步產率37％)化合物p。1hnmr(400mhzdmso-d6):＝1.90(s,54h,cc(ch3)2br),2.3(brt,8h,cch2ch2nh和ch2ch2c＝o),3.0(m,8h,cch2nh和och2ch2nh),3.1-3.6(m,84h,och2c),3.87(s,6h,o＝cch2o),4.27(s,18h,cch2oc＝o),7.6-7.8(m,10h,ch2nhc＝o和nh3+)。lc-ms(es,m/z):[(m+2h)/2]+(c106h181br9n8o44+2h)/2計算值＝1496.3；實驗值1496.6。實施例8.兩性離子聚合物的製備通常將引發劑製備為約100mg/ml的dmf中的儲備溶液。將引發劑和配體(2,2'-聯吡啶)引入schlenk管中。使用乾冰/丙酮混合物將所得溶液冷卻至-78℃，並在真空下脫氣10分鐘。將管在氬氣下再填充，並將保持在氬氣下的催化劑(cubr，除非另有說明)引入到schlenck管中(引發劑/催化劑(cubr)/配體上的溴原子的摩爾比保持在1/1/2)。溶液立即變成深棕色。將schlenk管密封並立即通過施加短循環真空/氬氣淨化。通過將限定量的單體與200美製酒精度(proof)的脫氣乙醇混合來製備hema-pc溶液，其中所述單體是在保持在氮氣下的手套箱中製備的。將單體溶液逐滴加入schlenk管(經由套管)。溫度保持在-78℃。對反應混合物施加徹底的真空至少10-15分鐘直到溶液不再冒泡。然後將管用氬氣再次填充並加熱至室溫。攪拌溶液，隨著聚合反應的進行，溶液變粘。3-8小時後或過夜後，通過直接暴露於空氣以將cu(i)氧化為cu(ii)使反應猝滅，混合物變成藍綠色，使混合物通過矽膠柱以除去銅催化劑。通過旋轉蒸發濃縮收集的溶液，將所得混合物用四氫呋喃沉澱或用水透析，然後冷凍乾燥，得到自由流動的白色粉末。表2列出了根據本發明製備的示例性聚合物。表2表3實施例9.馬來醯亞胺9-臂可綴合聚合物的製備按照如下步驟合成具有以下結構的馬來醯亞胺可綴合的9-臂聚合物(q)：聚合物q可綴合聚合物q的製備如下：向20ml小瓶中加入編號160(表2)的聚合物(540mg，0.0007mmol，1.0當量)，並用水(4ml)溶解。向其中加入0.5m磷酸氫二鈉水溶液(0.4ml)。在單獨的小瓶中將3-馬來醯亞胺基丙酸nhs酯(0.93mg，0.0035mmol，5當量)溶解在四氫呋喃(1ml)中。在室溫下約2分鐘內將nhs酯溶液加入到聚合物溶液中，將所得溶液攪拌30分鐘。將反應物用水(約15ml)稀釋，通過針筒式過濾器(acrodiscsupor，pn4612)過濾，並均勻地放入3個amicon離心膜透析管(30,000mwco)中。將管中物料稀釋並與水(各約5ml)混合，置於離心機(rpm3000)中離心30分鐘。移除濾液並對濾液進行分析，同時將保留物稀釋並與水(約10ml/管)混合。將離心程序再重複5次，之後取出保留物並置於小瓶中。將amicon膜管用水衝洗(每個管2×約2ml)，並與保留物合併。通過針筒式過濾器(acrodiscsupor，pn4612)過濾保留物溶液，冷凍並置於冷凍乾燥器上，得到508mg(94％)聚合物q，其為白色粉末。實施例10.馬來醯亞胺9-臂共軛聚合物的製備使用與所述的可綴合聚合物q相同的技術合成具有以下結構的馬來醯亞胺可綴合9-臂聚合物(r)：聚合物r實施例11.綴合物的活性測量如下表1所示的綴合的蛋白質和未綴合的蛋白質的buche酶活性。在表1中，rbuche534(c66y)為rhbuche534ggc，rbuche534fc為rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)：表4樣品酶活性(eu/mg)s.d.(％)δ活性rbuche534(cho-k1)7244-rbuche534fc(cho-k1)7885-rbuche534-9a750khema-pc620414％rbuche534fc-9a750khema-pc74835％buche(人血漿)(對照)6404-rbuche(山羊乳)(對照)4235-rbuche(山羊乳)是指在轉基因山羊中產生的rhbuche。總之，buche-fc融合蛋白保持良好的活性。此外，在與聚合物綴合之後，活性保持良好。對於fc構建體，與mpc聚合物綴合後的活性損失僅為5％。實施例12.buche的血漿穩定性為了確定rbuche534ggc(c66y)(seqidno.13)和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)(seqidno.2)是否克服了與轉基因山羊rbuche相關的穩定性問題，我們測試了在食蟹猴(cyno)血漿中這些構建體相比於人血漿來源的buche和轉基因山羊rhbuche(全長)的穩定性。將樣品引入市售的食蟹猴血漿中，隨著時間推移取等量試樣並通過埃爾曼氏測定法測定酶活性。圖1顯示在cyno血漿中於37℃下保存近35天後，rbuche534ggc(c66y))和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)的活性都能很好的保持。這兩種構建體都比金標準人血漿純化而得的buche表現更好。相比之下，轉基因山羊酶的活性隨著時間的推移迅速下降，在研究結束時接近小於5％。還測定了與聚合物的綴合是否影響酶的穩定性。圖2顯示了活性-時間曲線，其中在4℃和37℃的條件下將與9臂750kda的hema-pc聚合物綴合的蛋白質rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)與來源於人血漿的buche進行對比。儘管與聚合物綴合的蛋白質的活性隨時間有所下降，但其下降幅度不超過所觀察到的來源於人血漿的酶。實施例13.神經毒劑對buche的體外抑制為了確定本發明的rbuches是否對神經毒劑具有活性，使用上述的埃爾曼氏測定法在下述op試劑存在下測定了綴合的和未綴合的不同buche批次：ga(塔崩(二甲氨基氰磷酸乙酯))、gb(沙林(甲氟膦酸異丙酯))、gd(梭曼(甲氟磷酸3,3-二甲基-2-丁基酯))、gf(環沙林(甲氟膦酸環己酯))、vx(v系神經毒劑(({2-[雙(2-丙基)胺基]乙基}磺醯基)(甲基)膦酸乙酯)和vr(v系列神經毒劑(n,n-二乙基-2-(甲基-(2-甲基丙氧基)磷醯基)磺醯乙胺)。表2顯示了人血漿rbuche、rbuche534＝rbuche534ggc(c66y)、rbuche534-fc＝rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)和rbuche534-fc-聚合物＝rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)-9臂750kda的hema-pc聚合物對各種神經毒劑的抑制常數ki。表5神經毒劑的ki(m-1min-1)從表中可以看出，包括綴合物在內的每個構建體非常接近標準人血漿buche。實施例14.buche構建體的體內藥代動力學為了確定本發明的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)(和相應的綴合物)的體內藥代動力學性質，將構建體注射給藥至c57bl/6背景的、羧酸酯酶es1敲除的純合子小鼠(-/-)。duysen,e.g.,等人，productionofes1plasmacarboxylesteraseknockoutmicefortoxicitystudies(2011)chem.res.toxicol.24(11)1891-1898。這些es1ko小鼠完全缺乏血漿羧酸酯酶活性。據報導，相對於人，血漿羧酸酯酶升高小鼠中神經毒劑的ld50。duysen等人。按照上述的測試猴血清中血清穩定性的方法，在小鼠血清(c57bl/6)中測試下述各種構建體和綴合物的血清穩定性。結果相似(數據未顯示)。在時間0(零)點將各種構建體和綴合物靜脈內注射到4-6隻小鼠的組中。然後在注射後的不同時間從動物中取出血液等份試樣，並如上所述測量buche的活性。以下是注射入ko小鼠的試驗物質的總結。表6在ko小鼠中體內pk研究的設計在取出的血液樣品中監測buche酶活性，並根據上述活性數據進行歸一化。表1中列出的各種構建體的pk數據示於圖3中。實施例15.37℃下buche綴合物的緩衝液穩定性比較使用馬來醯胺或碘乙醯胺將從轉基因山羊的乳中純化的全長rhbuche經由天然半胱氨酸與聚合物綴合。在圖4中比較了這兩種不同綴合物的穩定性。為了評估綴合物穩定性，將基於馬來醯亞胺和碘乙醯胺的綴合物在磷酸鹽緩衝鹽水中在37℃、ph7.0的條件下孵育30天。取出等份試樣，並通過sdspage分析游離蛋白質。結果見圖1。碘代乙醯胺綴合物在30天內非常穩定，其曲線保持在時間零點設定的基線附近。相比之下，基於馬來醯亞胺的綴合物迅速地從時間零點設定的基線跳離。因此，根據本發明，可以看出對於一些蛋白質基於碘乙醯胺的綴合物比馬來醯亞胺綴合物在本質上更穩定。馬來醯亞胺綴合物的不穩定性取決於蛋白質。許多馬來醯亞胺綴合物相當穩定。實施例16.與來源於山羊的rhbuche綴合的馬來醯亞胺750kda的mpc聚合物對於馬來醯亞胺綴合，使用可熱去保護的馬來醯亞胺引發劑將mpc聚合物與buche綴合。如pct/us2012/060301所述合成具有上述結構的引發劑，即化合物aa(參見實施例6)：如pct/us2012/060301的實施例11所述進行mpc聚合物的合成以產生約750kda的6臂mpc聚合物。如第us61/875,099號美國臨時申請所述，通過熱去保護製備聚合物以用於綴合。將所得經熱去保護的聚合物在tris緩衝鹽水中在ph7.5、4℃的條件下與經tcep處理的buche綴合過夜。通過sdspage測定綴合。通過deae色譜從游離蛋白質和聚合物中純化綴合物。實施例17.與山羊來源的rhbuche綴合的碘乙醯胺3臂250kda的mpc聚合物對具有以下結構的tfa/胺鹽引發劑(化合物b)進行如下合成。首先，對具有以下結構的boc保護的3臂引發劑，即化合物a：進行如下製備：在氮氣下向25ml圓底燒瓶中加入2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基氨基甲酸叔丁酯(66mg，0.26mmol，1.2當量)和(2,2,2-三(2-溴-2-甲基-丙醯氧基甲基)-乙氧基)-乙酸(按照pct/us2012/060301中所述的製備產品4.5的方法製備，該文獻通過引用併入本文)(142mg，0.22mmol，1.0當量)，隨後加入n,n-二甲基甲醯胺(2ml)，然後加入n,n-二異丙基乙胺(0.19ml，1.1mmol，5.0當量)。將燒瓶用冰浴冷卻至0℃。在1分鐘內向其中加入丙基膦酸酐溶液(50wt％的乙酸乙酯溶液，0.16ml，0.26mmol，1.2當量)。將反應物升溫至室溫並攪拌1.5小時。通過加水淬滅反應，然後用水和乙酸乙酯對其進行分配。分離有機層，水層用乙酸乙酯萃取。合併的有機層用水、飽和碳酸氫鈉水溶液、水、0.5m檸檬酸水溶液、水洗滌，然後乾燥(硫酸鈉)、過濾並真空濃縮。將殘餘物加到矽膠柱(60ml)上，用70％乙酸乙酯和30％己烷洗脫。合併含有產物的試管，真空濃縮，得到150mg(0.17mmol，77％)化合物a。化合物a被去保護以生成化合物b，操作如下：在氮氣下向20ml圓底中加入化合物a(120mg，0.14mmol，1當量)、二氯甲烷(2ml)，然後加入三氟乙酸(2ml，26.9mmol，192當量)。將反應物在室溫下攪拌30分鐘。將反應物用己烷二氯甲烷(20ml)稀釋並在真空下濃縮。將反應物用己烷(50ml)稀釋並真空濃縮(兩次)，得到2.2g(2.73mmol，(含有殘餘二氯甲烷))化合物b。對具有以下結構的聚合物b2進行如下製備。將聚合物103(280mg，0.00123mmol，1.0當量)放入20ml小瓶中，並用水(2ml)溶解。向其中加入0.5m磷酸氫二鈉(0.2ml)。在單獨的小瓶中溶解碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯(1.6mg，0.00548mmol，4.5當量)的四氫呋喃(0.5ml)溶液。將nhs酯溶液在室溫下在約2分鐘內加入到聚合物溶液中，將所得溶液攪拌75分鐘。將反應物用4:1的水:四氫呋喃(4ml)稀釋，並置於amicon離心膜透析管(30,000mwco)中，將管置於離心機(rpm3000)中處理30分鐘。移出濾液進行分析，同時將保留物稀釋並與4:1的水:四氫呋喃(6ml)混合，並將管置於離心機(rpm3000)中處理30分鐘。移出濾液進行分析，同時將保留物物稀釋並與水(8ml)混合，置於離心機(rpm3000)中處理30分鐘。移出濾液用於分析，同時將保留物稀釋並與水(8ml)混合。重複3次以上該離心程序，然後取出保留物並置於小瓶中。用水(2×約2ml)衝洗amicon膜管，將衝洗液與保留物合併，將所得混合物冷凍並置於冷凍乾燥機上，得到270mg(96％)聚合物b2，其為白色粉末。將聚合物b2與按照以上所述製備的經tcep處理的rhbuche綴合。使用相對於rhbuche約5倍摩爾過量比例的聚合物b2，在室溫下在約ph8.5的碳酸鈉緩衝液中過夜。通過deae色譜從游離聚合物和蛋白質中純化綴合物。實施例18.通過鹼性基團增強與3臂-250kda的碘乙醯胺mpc聚合物的綴合將各種鹼性基團置於碘乙醯胺官能團附近，並測定其增強與rbuche綴合的能力。表7與來自山羊乳的rhbuche的綴合實施例19.聚合物r4341的合成首先，合成具有以下結構的r4163：具有如下所示結構的化合物r3329購自jstarresearch。在室溫下將6gr3329與2.8gn-boc-2,2'-(亞乙二氧基)二乙胺在thf中混合。向其中加入8.2ml二異丙基乙胺，然後加入7.7ml丙基膦酸酐溶液(1.6m)。在室溫下孵育30分鐘後，用etoacmbe和水對反應混合物進行分配。然後用0.5m檸檬酸×1、飽和碳酸氫鈉和飽和nacl洗滌。產物用硫酸鎂乾燥。r4163通過lcms被證實。接下來，從r4613中除去boc基團。將9.4gr4163溶於60ml二氯甲烷中。向其中加入60ml三氟乙酸。在室溫下孵育10分鐘。將溶液乾燥。將固體物質溶於水/乙腈中，並通過rp-hplc純化如下所示的r4180。接下來，製備具有以下結構的化合物r4203：將200mgr4180與43mgboc-l-ala-oh在2ml乙腈中混合。向其中加入200μl二異丙基乙胺，然後加入175μl丙基膦酸酐溶液(1.6m)。在室溫下孵育20分鐘後，加入水，將溶液攪拌5分鐘。然後將溶液用乙酸酸化並在甲醇中稀釋。通過rv-hplc純化r4203。通過使用三氟乙酸除去boc官能團以製備tfa鹽來製備用於聚合物合成的引發劑。將171mgr4203溶解在500μl三氟乙酸中，並在室溫下孵育幾分鐘。通過rv-hplc純化如下所示的r4235，r4235通過lcms和nmr被證實。然後使用r4235引發mpc聚合物合成以產生如下所示的化合物r4258：在25mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯吡啶，然後加入47.7μl的引發劑(r4235)在dmf中的儲備溶液(6.3mg的引發劑在63ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然後加入2.8mgcubr，脫氣，然後逐滴加入單體(甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)磷醯膽鹼(pc))在乙醇中的溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，並在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色(browncoloration)：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)純化，洗滌4次，之後冷凍乾燥。最後，通過將碘乙酸酯基團放在單一伯胺上合成r4341。將聚合物r4258(100mg)溶於添加有磷酸鹽緩衝液的水中。向其中加入100μl的6.5mg/ml碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯的thf溶液。5分鐘後，再加入100μl酯，反應混合物在室溫下孵育30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心，透析(截留分子量為30kda)。再透析4次。用水稀釋至約10ml，過濾並冷凍乾燥：產品：mp：221.9kda，pdi1.10。實施例20.聚合物r4118的合成聚合物r4118如下所示：首先，按照上述步驟合成r4180。然後將r4180用於以下反應以製備rxxx1：將200mgr4180和107mgrxxx1溶於乙腈(2ml)中。向其中加入200微升n,n'-二異丙基乙胺和175微升丙基丙酸酐(50％乙酸乙酯溶液)。將該反應混合物在室溫下孵育約3小時。加入3ml水，將溶液攪拌5分鐘。將溶液用乙酸酸化並用1ml甲醇稀釋。通過rv-hplc純化rxxx1。用tfa除去boc保護基，得到tfa鹽。將140mgrxxx1溶於1.5ml二氯甲烷中。向其中加入1.5ml的tfa。將該溶液在室溫下孵育約2小時45分鐘。真空除去tfa和二氯甲烷，將固體物質溶於水/乙腈。如下所示的化合物r4037通過rv-hplc純化，並通過lcms得到證實。接下來，使用r4037作為引發劑製備mpc聚合物。向10mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯吡啶，然後加入57.7μl的引發劑(r4037)於dmf中的儲備溶液(6.2mg的引發劑在62ul的dmf中)中。將儲備溶液脫氣，然後加入2.9mgcu(i)br，脫氣，然後逐滴加入單體(甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)磷醯膽鹼(pc))在乙醇中的溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，並在3psi的ar下密封。使反應在室溫下過夜(20小時)。然後對如下所示的聚合物r4053進行sec/mals，發現其pdi為1.073，mp為213.7kda。然後通過使r4053與碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯反應製備化合物r4118。將150mg的聚合物在水中攪拌直到溶解並加入磷酸鹽緩衝液。將3mg碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯溶於450μl的thf中。加入兩份150μl的等份的nhs酯溶液，兩次加入相隔5分鐘。在室溫下攪拌30分鐘。用水稀釋至約10ml，離心並透析(截留分子量為30kda)。用約10ml水重新透析5次。將上清液溶解在約10ml水中，過濾並冷凍乾燥：sec/mals：mp215.3kda，pdi1.1。實施例21.聚合物r4440的合成首先，使r4180(如下)按照以下所示進行反應以產生boc保護的引發劑：將r4180(200mg)和r4247(111mg)溶於2ml乙腈中。加入200μln,n'-二異丙基乙胺，然後加入175μl丙基膦酸酐。將該溶液在室溫下孵育25分鐘。加水，接著加入乙酸，然後加入甲醇。通過rp-hplc純化r4302。通過lcms證實產物身份。接下來，通過tfa從r4302中除去boc基團以產生如下所示的r4315。將173mgr4302溶於500μltfa中，並在室溫下孵育80分鐘。將溶液用水/乙腈稀釋，產物通過rp-hplc純化。用lcms和nmr證實產物身份。將化合物4315作為引發劑用於聚合物合成以製備mpc聚合物(r4367，如下所示)。在25mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯吡啶，然後加入56.2μl引發劑(r4315)在dmf中的儲備溶液(6.8mg的引發劑在63ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，加入2.8mgcu(i)br，脫氣，然後逐滴加入單體({2-[(2-甲基-2-丙烯醯基)氧基]乙氧基}[2-(三甲基氨基)乙氧基]次膦酸)在乙醇中的溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，並在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)純化，洗滌4次，之後冷凍乾燥。通過sec/mals分析所得聚合物，結果為：pdi1.1和mp200.7kda。最後，通過將碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯偶聯至r4367製備如下所示的化合物r4440。將100mgr4367溶於800μl水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4磷酸鈉緩衝液。向緩衝溶液中加入100μl的6.5mg/ml碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯溶液。在室溫下孵育5分鐘，然後再加入100μl，並在室溫下再孵育30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心，透析(截留分子量為30kda)。從水中再透析4次。稀釋至約10ml，過濾並冷凍乾燥。sec/mals分析：mp206kda，pdi1.1。實施例22.聚合物r4342的合成首先，將r4180(參見上文)與boc-his(3-me)-oh反應以製備r4176，如下面的反應方案所示：將165mgr4180和50mgboc-his(3-me)-oh懸浮於乙腈中。r4180溶解但boc-his(3-me)-oh未溶解。加入165μl的n,n-二異丙基乙胺，酸溶解。隨後，加入144μl多聚膦酸酐溶液，將反應混合物孵育約1小時。再加入80μl多膦酸酐溶液，將反應混合物靜置45分鐘。然後將反應混合物用乙酸酸化並用甲醇稀釋。r4176通過rp-hplc純化。接下來，通過tfa除去r4176的boc基團，得到如下所示的化合物r4182。將117mgr4176溶於500μl的tfa中，並在室溫下孵育10分鐘。然後將反應混合物用水/乙腈稀釋，通過rv-hplc純化r4182。將化合物r4182用作mpc聚合物合成的底物以製備化合物r4259。在25mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯吡啶，然後加入57.1μl的引發劑(r4182)在dmf中的儲備溶液(6.8mg的引發劑在68ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然後加入2.8mgcubr，脫氣，然後滴加單體甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)磷醯膽鹼(pc)在乙醇中的溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，並在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)純化，洗滌4次，之後冷凍乾燥。sec/mals：pdi＝1.1和mp＝225.7kda。最後，使化合物r4259與碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯反應，得到如下所示的化合物r4342。將100mg聚合物r4259溶解800μl水。向其中加入50μl的0.5m、ph7.4磷酸鈉緩衝液中加入。加入100μl的6.5mg/ml的碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯的thf溶液。將該溶液在室溫下孵育5分鐘。再加入100μl的6.5mg/mlnhs酯/thf溶液。在室溫下再孵育30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心並透析(截留分子量為30kda)。再透析4次。用水稀釋至約10ml，過濾並冷凍乾燥。sec/mals：mp227.7kda，pdi1.1。實施例23.聚合物r4439的合成首先，將r4180(如上所示)與2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-5-(二甲基氨基)戊酸三氟乙酸鹽進行如下所示的反應，得到化合物r4301。將200mgr4180溶於2ml乙腈中。將該溶液加入130mg溶解的2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-5-(二甲基氨基)戊酸三氟乙酸鹽。加入300μl的n,n-二異丙基乙胺(dipea)，然後加入175μl丙基膦酸酐(t3p溶液)。將反應混合物在室溫下靜置約30分鐘。再加入200μl的dipea和100μl的t3p，將反應混合物靜置15分鐘。混合物用水、乙酸和甲醇稀釋。r4301通過rp-hplc純化，並通過lcms證實。接下來，通過tfa從r4301中除去boc保護部分，得到化合物r4314。將93mg的r4301溶於500μl的tfa中。將反應混合物在室溫下靜置20分鐘。此後，將反應混合物用水/乙腈稀釋，通過rv-hplc對r4314進行純化。然後將r4314用作mpc聚合物製備的底物以製備r4366。在25mlschlenk管中加入4.8mg2,2'-聯吡啶基，然後加入56.9μl的引發劑(r4314)在dmf中的儲備溶液(9.2mg的引發劑在92ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然後加入2.8mgcubr，脫氣，然後逐滴加入單體的乙醇溶液(1g在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，並在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)純化，洗滌4次，之後冷凍乾燥。sec/mals：pdi＝1.1，mp＝233.4kda。最後，r4366與碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯反應生成r4439(如下所示)。將100mg聚合物r4366溶於800μl水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸鈉緩衝液。向其中加入100μl6.5mg/ml的碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯的thf溶液。將反應混合物在室溫下靜置5分鐘，此時再加入100μl的酯。將反應混合物在室溫下靜置30分鐘。用水稀釋至～10ml，過濾，離心並透析(截留分子量為30kda)。從水中再透析4次。稀釋至～10ml，過濾並冷凍乾燥：sec/mals：mp233.4kda，pdi1.1。實施例24.r4441的合成首先，將r4108(參見上文)與boc-dab(me2)-oh，tfa鹽反應以製備r4308，如下方案所示：將200mg的r4180溶解在2ml乙腈中。然後將該溶液用於溶解106mg的boc-dab(me2)-oh，tfa鹽。加入200μl的n,n-二異丙基乙胺(dipea)和265μl的丙基膦酸酐(t3p)。在室溫下孵育15分鐘。加入200μl的dipea和175μl的t3p，再孵育15分鐘。加水，然後加乙酸。用甲醇稀釋，通過rv-hplc純化r4308。通過lcms進行證實。接下來，通過tfa除去boc保護基以提供r4331。將135mg的r4308溶於500μl的tfa中。將反應混合物靜置15分鐘。r4331通過rv-hplc純化。然後將r4331用作聚合物合成的引發劑以提供聚合物r4368。在25mlschlenk管中加入4.8mg2,2'-聯吡啶，然後加入56.2μl的引發劑在dmf中的儲備溶液(7.1g的引發劑在71μl的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然後加入2.8mg的cubr，脫氣，然後逐滴加入單體的乙醇溶液(1g單體在4ml乙醇中)。將反應混合物至少放置1小時，在3psi的ar下密封，並使反應在室溫下進行20小時。當進行棕色顯色時，將反應淬滅，進行取樣、轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)進行純化，洗滌4次，之後冷凍乾燥。sec/mals分析：pdi1.1，mp256.6kda。最後，r4368與碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯反應，得到如下所示的r4441。將100mgr4368溶於800μl水中。加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸鈉緩衝液。加入100μl的6.5mg/ml的nhs酯溶液。在室溫下放置5分鐘，再加入100μl。靜置(sit)30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心，透析(截留分子量為30kda)。再透析4次。用水稀釋至約10ml，過濾並冷凍乾燥。sec/malsr4441mp256.6kda，pdi1.1。實施例25.聚合物r4320的合成首先，將r4108(參見上文)與boc-lys(me2)-oh反應以製備r4196。將200mg的r4180和74mg的boc-l-lys(me2)-oh溶於2ml乙腈中。向其中加入200μl的n,n-二異丙基乙胺(dipea)和204μl的丙基膦酸酐(t3p)。使反應混合物在室溫下靜置15分鐘。然後將反應混合物用水稀釋並攪拌5分鐘。最後，將反應混合物用乙酸酸化並用甲醇稀釋。r4196通過rv-hplc純化，產物通過lcms證實。接下來，通過tfa除去r4196上的boc基團，得到如下所示的化合物r4211。將153mg的r4196溶於500μl的tfa中。溶液在室溫下靜置15分鐘。用水/乙腈稀釋。通過rv-hplc進行純化。通過lcms和nmr對結構進行證實。接下來，r4211用作mpc聚合物製備的底物以製備聚合物r4255。在25ml的schlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯吡啶，然後加入57.7μl的引發劑在dmf中的儲備溶液(8mg引發劑在80ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然後加入2.8mg的cubr，脫氣，然後逐滴加入單體的乙醇溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，並在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(截留分子量為1kda)純化，洗滌4次，之後冷凍乾燥。sec/mals：pdi1.076，mp205.3。最後，通過將聚合物r4255偶聯到碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯來製備聚合物r4320(如下所示)。將100mg的r4255溶於800μl的水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸鈉緩衝液。加入100μl的6.5mg/mlnhs酯的thf溶液。攪拌5分鐘，再加入100μl的nhs酯溶液。在室溫下放置30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心並透析(截留分子量為30kda)。稀釋至～10ml，再透析4次。稀釋至約10ml，過濾並冷凍乾燥。sec/mals：mp：225.7kda，pdi：1.1。實施例26.聚合物r4438的合成首先，將r4180(如上所示)與boc-dap(me2)-ohtfa鹽反應以製備如下所示的化合物r4300。將200mg的r4180和86mg的boc-dap(me2)-ohtfa鹽溶解在2ml乙腈中。加入200μl的n,n-二異丙基乙胺(dipea)和175μl丙基膦酸酐溶液(t3p)，將溶液在室溫下孵育約15分鐘。加入40mg或更多的boc-dap(me2)-ohtfa鹽，再加入200μl的dipea和100μl的t3p，然後在室溫下再孵育10分鐘。用水稀釋，用乙酸酸化，然後用甲醇稀釋。r4300通過rv-hplc純化並通過lcms得到證實。接下來，通過tfa除去r4300上的boc基團，得到如下所示的r4307：將118mg的r4300溶於500μl的tfa中，將反應混合物靜置20分鐘。加入水/乙腈，化合物4307通過rf-hplc純化並通過lcms得到證實。接下來，將r4307用作mpc聚合物合成的引發劑。在25ml的schlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯吡啶基，然後加入55.5μl的引發劑在dmf中的儲備溶液(6.8mg的引發劑在68ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然後加入2.8mgcubr，脫氣，然後逐滴加入單體的乙醇溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，並在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)純化，洗滌4次，之後冷凍乾燥。sec/mals：mp230.8kda，pdi1.1。最後，向r4307中加入碘乙醯胺官能團以製備化合物r4438(如下所示)。將100mg的r4307溶於800μl的水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸鈉緩衝液。然後加入100μl的6.5mg/ml的nhs酯溶液，然後在室溫下孵育5分鐘。再加入100μl的6.5mg/ml的nhs酯溶液，並在室溫下孵育約40分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心並透析(截留分子量為30kda)。再透析4次。用水稀釋至約10ml，過濾並冷凍乾燥。sec/mals：mp230.8kda，pdi1.1。實施例27.聚合物r4451的合成首先，將r4180(參見上文)與boc-高精氨酸·hcl(boc-homoarg-oh·hcl)反應以產生如下所示的r4366：將200mg的r4180溶於2ml乙腈中。將該溶液加入到80mg的可部分溶解的boc-高精氨酸·hcl中。加入175μl二異丙基乙胺(dipea)，似乎全部boc-高精氨酸·hcl都沉澱出來。然而，當加入200μl的丙基膦酸酐溶液(t3p)時，所有固體都溶解。將該反應混合物在室溫下孵育40分鐘。再加入81mg的boc-高精氨酸·hcl，然後加入200μl或更多的dipea和175μl的t3p。將反應混合物再孵育50分鐘。將反應混合物用水稀釋，r4366通過rv-hplc進行純化，並通過lcms證實。接下來，除去boc基團以製備如圖所示的化合物r4354：將90mg的r4366溶於500μl的tfa中。在室溫下反應30分鐘。加入水/乙腈。通過rv-hplc純化，並通過lcms和nmr證實。接下來，將r4354用作mpc聚合物合成的底物以製備r4386。在25ml的schlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯吡啶，然後加入58.3μl的引發劑(r4354)在dmf中的儲備溶液(7.4mg的引發劑在74ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然後加入2.8mg的cubr，脫氣，然後逐滴加入單體的乙醇溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，並在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為3.5kda)進行純化，之後進行冷凍乾燥的步驟。sec/malspdi1.1，mp258.4kda。最後，向r4386中加入碘乙醯胺官能團以製備r4551(如下所示)。將100mg的r4386溶於800μl的水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸鈉緩衝液。加入100μl的6.5mg/ml的碘乙酸n-羥基琥珀醯亞胺酯溶液。在室溫下孵育5分鐘，再加入100μl的nhs酯。在室溫下孵育30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心並透析(截留分子量為30kda)。從水中再透析4次。稀釋至約10ml，過濾並冷凍乾燥。sec/mals：mp258.4kda，pdi1.1。實施例28.peg試劑的合成peg試劑通過nhs酯與胺的偶合方便地製備。以胺官能團結尾的分支peg是可商購獲得的。例如，根據本發明可以使用以下peg碘乙醯胺試劑：其中n為peg單元的數量。peg試劑r500通過以下反應方便地合成：實施例29rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s、q347c)的哺乳動物表達載體、細胞系和表達優化。將含有rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s、q347c)構建體的dna片段克隆到編碼嘌呤黴素抗性基因的哺乳動物表達載體中。插入的序列示於seqidno.9。將具有插入的buche-fc融合物的表達載體稱為構建體14。將構建體14轉染到cho細胞中並構建穩定的轉染池。將穩定池進行細胞系發育，分離穩定轉染的克隆，稱為c98。進行搖瓶研究以確定使用什麼培養基和條件來最大化產生的蛋白質的量。每個燒瓶的接種密度為0.4×106個細胞/ml。結果列於下表2中：表8搖瓶實驗實施例30.單分子引發劑共價連接到先前的atrp引發劑的鹼性基團(例如，胍或叔胺)的引入導致了當添加配體(2,2'-聯吡啶，bpy)時在atrp聚合過程中由於滷化銅物質(cubr)與這些鹼性基團可能絡合而引起的可能的幹擾。該實施例測試本發明所要求保護的這種鹼性基團是否也可以作為atrp方法中的配體，並且當旨在使用這種引發劑獲得定製的聚合物時能夠不使用這些化合物。已在苯乙烯聚合中報導了含有共價連接的叔胺基團的單分子atrp引發劑(polym.printrint201243(2)，第245頁)。在乙烯基單體(苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯)的atrp系統中使用這種引發劑的目的僅僅是通過將胺共價連接到引發劑上以抑制外部試劑的使用，而不是為了與生物活性化合物有關的綴合目的。單分子引發劑的研究僅在需要加熱的苯乙烯和mma上在有機溶劑(甲苯)中進行。根據作者所述，分子量得到適度控制。在更廣泛的分布範圍內實現了高分子量。報導了在atrp方法中使用胍分子作為配體，胍分子是作為胍-吡啶衍生物(二甲基亞乙基胍)亞甲基吡啶(dmegpy)或(四甲基胍)亞甲基吡啶(tmgpy)使用的。不使用這些結構作為苯乙烯和甲基丙烯酸甲酯控制聚合的atrp方法中的配體。僅獲得低分子量聚合物(低於10,000da)。該實施例測試新引入引發劑的基團是否不幹擾上述傳統的atrp方法，並檢查其在atrp聚合方法中用作配體的能力。在不引入任何bpy的條件下合成第一嵌段聚(hema-pc)(步驟1)，以檢查聚合物的形成和分子量的控制。此步驟之後為引入bpy並逐漸添加單體(步驟2)，以檢查根據以下圖式的擴鏈反應和系統活性。化合物r4235用作參照。使用的所有其他化合物的結構如下所述：對於所有的引發劑，使用的方案都是相同的：未使用bpy作為配體的聚合方案。新鮮製備100mg/ml的引發劑的dmf溶液作為儲備溶液。分配溶液以在schlenk管中引入5×10-6mol的引發劑。將溶液脫氣，然後加入2.48mg的cubr(1.7×10-5mol)(未變色)。滴加hema-pc的乙醇溶液(1g，4ml)。將反應混合物置於3psi，並在室溫下聚合20小時反應保持無色，並在每種情況下取等份試樣以分析轉化率和分子量(參見下表第1步)。在步驟2中，將bpy加入到步驟1的粗混合物中，隨後向反應混合物中逐漸加入溶液形式的單體(hema-pc)(1g單體在2ml乙醇中)和4.8mg的bpy(3.1×10-5mol)(立即呈現棕色)。將反應密封，徹底脫氣，均化，並使其在室溫下進行直到變粘，然後進行最後猝滅。結果顯示在下表9中：表9在參照物(化合物r4235)不存在bpy的情況下，在bpy存在下無聚合物形成。僅當將聯吡啶作為配體引入反應混合物內時聚合反應才得以進行從而達到所需分子量和高轉化率。對於表中列出的所有其他引發劑(化合物r4315、r4334、r4037、r4354、r4314、r4211和r4182)，在未向步驟1的反應中引入任何bpy配體的條件下，所有實例都進行了聚合反應。獲得受控分子量和低pdi(1.2以下)。當在步驟2加入bpy並逐漸添加的hema-pc單體時，立即呈現棕色，表明銅物質與bpy的重新絡合。在所有情況下，通過步驟1中獲得的聚合物的擴鏈，聚合反應繼續進行，得到所需的分子量和窄的多分散性。新引入的基團不僅參與中性ph下的綴合，而且還可以作為atrp中的有效配體。對於這種聚合，不需要使用外部配體(例如bpy)。上述或下文引用的所有專利申請、網站、其他出版物、登錄號等的全部內容通過引用併入本文用於所有目的，其程度如同明確並單獨地指出將每個單獨文獻如此通過引用併入。如果序列的不同版本與不同時間的登錄號碼相關聯，則意旨與在本申請的有效申請日期的登錄號相關聯的版本。有效申請日期是指比引用該登錄號(如果適用)的優先申請的實際提交日期或提交日期早的時間。同樣，如果不同版本的出版物、網站等在不同時間被公開，則意指在申請的有效申請日期內最近公布的版本，除非另有說明。本發明的任何特徵、步驟、要素、實施方案或方面可以與任何其他組合使用，除非另有特別說明。儘管出於清楚和理解的目的已經通過說明和示例的方式對本發明進行了詳細的描述，但顯而易見的是，可以在所附權利要求的範圍內實施某些改變和修改。序列表seqidno.1(人丁醯膽鹼酯酶p06276.1)天然前導序列，c66y突變和碳末端移除的結構域用下劃線表示。seqidno.2(優選的rbuche534(c66y)-gs10-fc(w/突變)融合物)通過使用gs接頭與igg1-fc連接(下劃線)而結合的buche以及與野生型相比的胺基酸改變用下劃線表示。seqidno.3(人acheaaa68151.1)前導肽用下劃線表示。seqidno.5(芳基二烷基磷酸酶[巴士脫硫孤菌(desulfarculusbaarsii)dsm2075；adk83762.1])seqidno.6(人pon1,p27169.3)seqidno.7(來自歐洲烏賊(loligovulgaris)的二異丙基氟磷酸酶q7sig4.1)seqidno.8(人igg1)seqidno.9(優選的dna序列buche-gs10-fc(w/突變)融合物)seqidno.10(rbuche534)seqidno.11(rbuche524截短物w/c66y)seqidno.12(rbuche524gggc截短物w/c66y)seqidno.13(rbuche534ggc截短物w/c66y)seqidno.14(rbuche534(c66y)-gs10-fc(wt)融合物)gs接頭用下劃線表示。seqidno.15(rbuche534(c66y)-gs10-fc(無q347cw/效應子功能突變)融合物)gs接頭和效應子功能突變用下劃線表示。seqidno.16(rbuche534-gs10-fc(wt)融合物)gs接頭用下劃線表示。seqidno.17(rbuche534(c66y)-gs10-fc(wt)融合物)gs接頭用下劃線表示。seqidno.18(前導肽)maclgfqrhkaqlnlatrtwpctllffllfipvfckaseqidno.19(hbuche成熟蛋白質序列)序列表kodiaksciencesinc.丁醯膽鹼酯酶兩性離子聚合物綴合物057768-470678pct/us2015/0561122015-10-1662/065,4712014-10-1728patentinversion3.51602prt智人1methisserlysvalthrileilecysileargpheleuphetrpphe151015leuleuleucysmetleuileglylysserhisthrgluaspaspile202530ileilealathrlysasnglylysvalargglymetasnleuthrval354045pheglyglythrvalthralapheleuglyileprotyralaglnpro505560proleuglyargleuargphelyslysproglnserleuthrlystrp65707580seraspiletrpasnalathrlystyralaasnsercyscysglnasn859095ileaspglnserpheproglyphehisglyserglumettrpasnpro100105110asnthraspleusergluaspcysleutyrleuasnvaltrpilepro115120125alaprolysprolysasnalathrvalleuiletrpiletyrglygly130135140glypheglnthrglythrserse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