一種具有核殼結構的糖基化聚丙烯微球的製備方法及其應用的製作方法

2023-11-07 18:47:57 2

專利名稱：一種具有核殼結構的糖基化聚丙烯微球的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微球表面改性的方法及其應用，尤其涉及一種新型的具有核殼結構的糖基化聚丙烯微球的製備方法及相應的微球產品和應用。
背景技術：
目前，微球的製備技術日益成熟，不同規格的微球在醫學工程、生物技術、電子技術等越來越多的領域發揮著重要的作用。微球的廣泛使用得益於本身的特性，1)一般是形狀規整的微小顆粒，可通過各種規模化生產技術來批量製備，而且生產的重複性、穩定性好；2)物理化學性質比較穩定，顆粒之間的空隙均勻，耐壓程度也遠遠高於同等材料的無定型顆粒或者其他形狀的顆粒；3)比表面積很大，有的微球內部還有孔道，可以在有限的填充體積內提供令人難以想像的巨大表面。對微球進行表面改性，可優化微球的表面性能，賦予微球新的功能，進一步提高了微球的綜合優勢。表面改性的方法主要包括表面等離子體處理、紫外光輻照接枝改性、γ-射線輻射改性、臭氧接枝改性和表面活性劑塗敷改性等。經特定的改性過程，微球可被賦予不同的表面特性，具備諸如親水性、親合性、pH響應性、溫度響應性、生物相容性、抗汙染性等功能，可用作高分子材料填充劑，還可用作水處理劑、催化劑、傳感器和蛋白質等生物大分子的載體，使之廣泛應用於材料加工、醫藥、診斷、生物工程、精細化工等領域。
在醫學領域，常利用抗原-抗體間的特異性結合來診斷疾病，而微球較大的比表面積能提高診斷的靈敏度，可以更快速、更直觀、更方便地達到診斷目的。聚苯乙烯為基材的疏水性微球是最早被用於臨床診斷的免疫微球，其特點是利用聚苯乙烯強的疏水性，通過抗體的疏水部位將抗體吸附在微球表面，可不採用化學法固定。但疏水性表面會產生非特異性吸附，如 panováA.等的文章「I mmunomagnetic separation anddetection of Salmonella cells using newly designed carriers」(《J.Chromatogr.A》2003，1009215)；Hosaka S.等人的文章「Microparticle-enhanced nephelometric immunoassay of anti-thyroidperoxidase autoantibodies in thyroid disorders」(《Clin.Chem.》1994，40442)公開的技術開始採用親水性較強的微球作為抗體的載體，如聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯)微球等。此外，還發展了一種表面由親水性微區和疏水性微區交替組成的微球，如Okubo M.等的文章「Competitive adsorption of fibrinogen and albuminonto polymer microspheres having hydrophilic/hydrophobic heterogenoussurface structures」(《Colloid Polym.Sci.》1993，2711157)以及MaeharaT.等人的「Glycidyl methacrylate-styrene copolymer latex particles forimmunologic agglutination tests」(《Biomaterials》1990，11122)，疏水微區用於吸附抗體，裸露的親水性微區可以避免實際使用時其他雜蛋白質的吸附。Hatakeyama M.等公開的文章「DNA-carrying latex particles forDNA diagnosis 2.Distinction of normal and point mutant DNA using S1nuclease」(《Colloids Surf.B，Biointerfaces》1998，10171)表明微球近年來還被用於DNA診斷，即將DNA單鏈固定在微球上，然後用於捕獲互補的DNA或RNA，可以檢測出發生突變的DNA。利用其他的特異性親和作用，微球還可用於其他疾病的診斷。利用藥物和作用靶點的特異性相互作用，還可進行藥物的篩選(將靶點固定在微球上)以及藥物作用靶點的探索(將藥物固定在微球上)。
在生物技術領域，從細胞培養的載體，到分離純化的介質；從固定化酶，到生物晶片，到處都有高分子微球的應用。特別是將微球作為分離純化的介質，使得層析技術成為生物活性物質分離純化最常用的手段。其中，親和層析由於具有高度的專一性和可逆性，被用於製備高純度的生物活性物質。自80年代以來，出現了聚苯乙烯微球(大孔樹脂)、瓊脂糖系列微球、葡聚糖系列微球、聚乙烯醇微球、多羥基化合物覆蓋層的聚苯乙烯微球、新型的聚丙烯酸系列微球和聚丙烯醯胺微球等先後用作分離純化的介質。
近年來，將糖基引入材料中，利用糖的生物相容性與識別作用，在食品、醫藥、臨床診斷、化妝品、蛋白質分離等領域取得了一定成效。公開號為CN1450907的文獻中，公開了一種通過β聚糖增加細胞中活化素誘導的信號傳導的方法，該方法可用於治療許多病理情況，包括生殖、反應、皮膚、骨骼、肝臟、造血和中樞神經系統疾病。公開號為CN1417347的文獻中，公開了一種將糖等配體以一定距離共價連接於基質表面，用於鑑定病源微生物及其毒性蛋白。公開號為CN1460524的文獻中，公開了製備α-烯丙基葡糖苷表面修飾的人工晶狀體，這種白內障囊外摘除術的人工晶狀體光學部和袢的外表面均帶有α-烯丙基葡糖苷單體的分子層，提高了人工晶狀體的生物相容性，且製法科學、醫用移植安全可靠。公開號為CN1030005的文獻中，公開的技術將具有酸性官能團的二乙胺乙基葡聚糖包被在二氧化矽顆粒上，通過吸附和洗脫從乳清中選擇性地提取金屬蛋白質，尤其是固定鐵的金屬蛋白，例如乳鐵傳遞蛋白、乳過氧化物酶和鐵傳遞蛋白。公開號為CN1130375的文獻中，公開的技術將多糖衍生物(多糖的酯或氨基甲酸酯衍生物)負載於用芳烷基甲矽烷基化試劑處理過的表面擁有矽烷醇基團的矽膠顆粒上製成旋光異構體分離劑，作為反相液相色譜的填充材料，把旋光異構體從外消旋化合物中分離出來。公開號為CN1763126的文獻中，公開了一種以羅望子膠或沙蒿膠與殼聚糖為原料，四氧化三鐵為磁流體，戊二醛為交聯劑，對氨基苯磺酸為胺化劑製備的具有一定磁響應性的磁性微球，是一種溶脹體積小、耐酸性較好、成本低的複合生物多糖磁性微球。公開號為CN1708688的文獻中，提供了用於固化至少一種碳水化合物分子的方法，包括將表面與至少一種單體的等離子體接觸來提供等離子聚合體包被的帶有氨基的表面，及將所述聚合體表面接觸不同的天然多糖溶液諸如透明質酸、硫酸皮膚素、硫酸軟骨素、肝素、硫酸乙醯肝素或硫酸角質素等，將多糖通過靜電作用被動吸附到聚合體表面，固化的多糖在表面有充分的結合強度，並保留了天然的生物活性。這種糖結合表面可用於生物傳感器、治療載體、細胞培養、醫療裝置、純化基質和晶片等方面。
由於糖在生物學上的獨特地位，自20世紀80年代末，糖生物學成為繼基因組學和蛋白組學之後的又一門新興的前沿學科——糖組學，得到了越來越多的關注和應用。因此，製備糖基化材料的重要性日趨迫切。但到目前為止，將具有不同生物功能的糖單體直接固定在應用廣泛的高分子材料上並不多見，大大限制了糖的生物功能在工業上的應用。本發明將糖基引入聚丙烯微球的表面，可使糖的生物功能與聚丙烯優良的物理化學性能結為一體，並能直接用於蛋白質的選擇性分離、濃縮或靶向清除。

發明內容
本發明提供一種操作簡單，經濟可行的具有核殼結構的糖基化聚丙烯微球的製備方法，得到的糖基化聚丙烯微球具有良好的機械強度、優良的化學穩定性與熱穩定性。
一種具有核殼結構的糖基化聚丙烯微球的製備方法，包括如下步驟(1)將聚丙烯微球浸入含有複合光引發劑和帶羥基的丙烯酸酯類單體的溶液中(每1克聚丙烯微球需10毫升單體溶液)，通氮氣保護(約10分鐘)後進行紫外光輻照接枝聚合，反應結束後分離產物、洗滌、烘乾，得到羥基化聚丙烯微球；所述溶液的溶劑是丙酮和水的混合物，其體積比為0.25～4。，所述的複合光引發劑為三氯化鐵和二苯甲酮的複合物，其中三氯化鐵的濃度為0～0.033摩爾/升，二苯甲酮的濃度為0.0007～0.033摩爾/升，帶羥基的丙烯酸酯類單體在溶液中的體積百分數為5～20％；紫外光輻照時間為10～60分鐘；(2)將羥基化聚丙烯微球浸入糖單體的二氯甲烷溶液中，糖單體的量為微球表面羥基數的5～20倍當量，在氮氣保護下加入三氟化硼乙醚絡合物進行反應，反應結束後分離產物、洗滌、烘乾得到表面固定糖基的聚丙烯微球；三氟化硼乙醚絡合物濃度為糖單體濃度的5倍(質量百分比濃度)；在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時，(3)將表面固定糖基的聚丙烯微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，得到核殼結構的糖基化聚丙烯微球。
步驟(1)所述的聚丙烯微球的直徑為0.2～2000微米。
步驟(1)所述的帶羥基的丙烯酸酯類單體為甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸羥丙酯(HPMA)、丙烯酸羥乙酯(HEA)、丙烯酸羥丙酯(HPA)或丙烯酸羥丁酯(HBA)等。
步驟(2)所述糖單體可以是任何乙醯基保護的糖(單糖、寡糖、多糖等)，糖基上的保護基團(乙醯基)可以方便地脫除，且可通過重量法快速計算出聚丙烯微球上結合的糖基含量。
步驟(2)所述的糖單體為葡萄糖五乙酸酯、甘露糖五乙酸酯、半乳糖五乙酸酯、巖藻糖四乙酸酯、麥芽糖八乙酸酯、乳糖八乙酸酯或蔗糖八乙酸酯中的一種或幾種。
步驟(3)所述的甲醇鈉的甲醇溶液，其濃度為0.5摩爾/升。
步驟(1)所述羥基化聚丙烯微球，接枝率為0～600％(質量百分比)步驟(3)所述的核殼結構的糖基化聚丙烯微球，糖基的固定率為0～400％(質量百分比)。，本發明還提供了所述的核殼結構的糖基化聚丙烯微球的應用，所述的核殼結構的糖基化聚丙烯微球對特定蛋白質具有選擇性識別作用，可根據不同的微球尺寸裝填成柱(在高效液相色譜或質譜中)或用作流化床的固體相，直接用於蛋白質的分離、濃縮或靶向清除。
本發明將糖基引入聚丙烯微球的表面，可使糖的生物功能與聚丙烯優良的物理化學性能結為一體。由於聚丙烯微球的粒徑小，比表面積提高，可一定程度上提高糖基在微球表面的結合，進一步發揮糖的集簇效應；同時，微球的三維結構使得糖基化聚丙烯微球吸附蛋白質時結合點多，空間位阻小，吸附速率提高。利用不同糖基對特定蛋白質的選擇性識別作用，糖基化聚丙烯微球可實現對蛋白質及微生物的分離、濃縮或靶向清除。這種糖基化聚丙烯微球作為高效液相色譜或流化床的固定相可實現蛋白質的高效、快速分離，並利於保持生物大分子高的生物活性和回收率。
本發明方法在室溫下進行，操作簡單，經濟可行。通過調節紫外輻照接枝聚合條件，聚丙烯微球上接枝的帶羥基的丙烯酸酯類單體的接枝率可在很寬的範圍內調節(0～600％，質量百分比)，採用光引發劑可以提高的接枝率；利用不同接枝率的聚丙烯微球，進而可得到不同糖基化程度的聚丙烯微球(0～400％，質量百分比)，可實現微球表面糖基的集簇效應，顯著增強了糖基對蛋白質的選擇性吸附；同時，這種不同糖基化程度的聚丙烯微球可適用於一系列從低濃度到高濃度的蛋白質溶液(0.1克/升～100克/升)的分離和濃縮，使用範圍廣。
本發明方法得到的糖基化聚丙烯微球是通過帶羥基的丙烯酸酯類接枝聚合鏈將糖基固定在微球表面，在吸附蛋白質時空間位阻小，且糖基與蛋白質易於形成多價結合，使糖基化微球吸附蛋白質的能力提高。具有良好的機械強度、優良的化學穩定性與熱穩定性及其低廉的成本，適用範圍廣。在使用過程中性能穩定，糖基不會脫落，用於蛋白質的選擇性分離、濃縮或靶向清除時，可通過吸附、洗脫的循環方式重複使用，且能避免產物的汙染，大大降低了生產成本。


圖1為糖基化聚丙烯微球的結構示意圖，圖中最內層A聚丙烯微球核；中間層B羥基化接枝層；最外層C糖基化殼；具體實施方式
本發明中接枝率採用重量法計算；本發明中糖基化聚丙烯微球對蛋白質的吸附分離採用高效液相色譜在線檢測，分離效果也可用雙向電泳測定。
糖基化聚丙烯微球的製備實施例1～13糖基化聚丙烯微球的製備條件及結果如表1所示。實施例中涉及的具體的糖基的結構式見表2所示。
實施例1稱取適量的三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成濃度0.0007摩爾/升的光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，配成體積濃度為20％的單體溶液；將直徑為100微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照25分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEMA接枝率為23.12％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升五乙醯基葡萄糖(五乙醯基葡萄糖為聚丙烯微球表面接枝的HEMA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到五乙醯基葡萄糖改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為7.76％(質量百分比)。
實施例2稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.0007摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥丙酯(HPMA)，配成體積濃度為20％的單體溶液；將直徑為100微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照25分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HPMA接枝率為172.66％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升五乙醯基葡萄糖(五乙醯基葡萄糖為聚丙烯微球表面接枝的HPMA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到五乙醯基葡萄糖改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為59.54％(質量百分比)。
實施例3稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.033摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，配成體積濃度為20％的單體溶液；將直徑為100微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照25分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEMA接枝率為11.97％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升五乙醯基葡萄糖(五乙醯基葡萄糖為聚丙烯微球表面接枝的HEMA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到五乙醯基葡萄糖改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為3.52％(質量百分比)。
實施例4稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.0007摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，配成體積濃度為5％的單體溶液；將直徑為100微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照25分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEMA接枝率為111.19％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升五乙醯基葡萄糖(五乙醯基葡萄糖為聚丙烯微球表面接枝的HEMA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到五乙醯基葡萄糖改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為38.34％(質量百分比)。
實施例5稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.0007摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，配成體積濃度為5％的單體溶液；將直徑為100微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照60分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEMA接枝率為197.32％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升五乙醯基葡萄糖(五乙醯基葡萄糖為聚丙烯微球表面接枝的HEMA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到五乙醯基葡萄糖改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為103.51％(質量百分比)。
實施例6稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.0007摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，配成體積濃度為5％的單體溶液；將直徑為100微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照25分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEMA接枝率為169.23％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升五乙醯基葡萄糖(五乙醯基葡萄糖為聚丙烯微球表面接枝的HEMA的5倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到五乙醯基葡萄糖改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為56.41％(質量百分比)。
實施例7稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.0007摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入丙烯酸羥乙酯(HEA)，配成體積濃度為5％的單體溶液；將直徑為0.2微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照25分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEA接枝率為336.12％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升葡萄糖五乙酸酯(葡萄糖五乙酸酯為聚丙烯微球表面接枝的HEA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到葡萄糖五乙酸酯改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為195.46％(質量百分比)。
實施例8稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.0007摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，配成體積濃度為5％的單體溶液；將直徑為2000微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照25分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEMA接枝率為10.08％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升葡萄糖五乙酸酯(葡萄糖五乙酸酯為聚丙烯微球表面接枝的HEMA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到葡萄糖五乙酸酯改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到葡萄糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為2.98％(質量百分比)。
實施例9稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.0007摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，配成體積濃度為5％的單體溶液；將直徑為100微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照60分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEMA接枝率為195.61％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升甘露糖五乙酸酯(甘露糖五乙酸酯為聚丙烯微球表面接枝的HEMA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到甘露糖五乙酸酯改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到甘露糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為102.83％(質量百分比)。
實施例10稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.0007摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，配成體積濃度為5％的單體溶液；將直徑為100微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照60分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEMA接枝率為203.58％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升半乳糖五乙酸酯(半乳糖五乙酸酯為聚丙烯微球表面接枝的HEMA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到半乳糖五乙酸酯改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到半乳糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為105.09％(質量百分比)。
實施例11稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.0007摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，配成體積濃度為5％的單體溶液；將直徑為100微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照60分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEMA接枝率為192.17％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升巖藻糖四乙酸酯(巖藻糖四乙酸酯為聚丙烯微球表面接枝的HEMA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到巖藻糖四乙酸酯改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到巖藻糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為99.45％(質量百分比)。
實施例12稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.0007摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，配成體積濃度為5％的單體溶液；將直徑為100微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照60分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEMA接枝率為198.24％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升麥芽糖八乙酸酯(麥芽糖八乙酸酯為聚丙烯微球表面接枝的HEMA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到麥芽糖八乙酸酯改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到麥芽糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為88.99％(質量百分比)。
實施例13稱取適量的二苯甲酮(BP)和三氯化鐵(FeCl3)溶解到以等體積混合的丙酮與水的混合溶劑中，配成各光引發劑濃度分別為0.033摩爾/升和0.0007摩爾/升的複合光引發劑溶液，再加入甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)，配成體積濃度為5％的單體溶液；將直徑為100微米的聚丙烯微球放入10毫升該單體溶液中浸泡1小時，紫外光(UV)輻照60分鐘，然後取出聚丙烯微球，以丙酮和大量的水清洗，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到HEMA接枝率為201.73％(質量百分比)的羥基化聚丙烯微球。取上述羥基化聚丙烯微球置入20毫升乳糖八乙酸酯(乳糖八乙酸酯為聚丙烯微球表面接枝的HEMA的20倍當量)的二氯甲烷溶液中，並於氮氣氛下加入100倍當量的三氟化硼乙醚絡合物，密封，在冰水浴中振蕩反應2小時，然後將反應體系移至室溫下繼續振蕩反應20小時；停止反應，用丙酮洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到乳糖八乙酸酯改性的聚丙烯微球。將該微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液(濃度為0.5摩爾/升)中，室溫下振蕩，脫去糖基上的保護基團乙醯基，用水洗滌，放入40℃烘箱，真空乾燥24小時，得到乳糖糖基化的聚丙烯微球，糖基化率為93.37％(質量百分比)。
糖基化聚丙烯微球的應用應用例1～5的分離效果如表3所示，糖基對凝集素的選擇性識別作用如表4所示。
應用例1、葡萄糖糖基化聚丙烯微球對伴刀豆球蛋白(Con A)的吸附分離取實施例4製備的葡萄糖糖基化聚丙烯微球(糖基化率為38.34％)浸入10毫升無水乙醇中預浸潤，再以磷酸鹽緩衝溶液(PBS，0.01摩爾/升，pH＝7.36)清洗，放入10毫升伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)的PBS溶液中，密封，其中，Con A的濃度為20克/升，PNA的濃度為20克/升，溶液中CaCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，MnCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，NaCl的濃度為0.1摩爾/升。在25℃下恆溫30分鐘後，取出葡萄糖糖基化聚丙烯微球，並以1摩爾/升的葡萄糖磷酸鹽緩衝溶液衝洗，即可將吸附在微球上的伴刀豆球蛋白洗脫，從而實現將伴刀豆球蛋白從蛋白質的混合溶液中分離的目的。
應用例2、葡萄糖糖基化聚丙烯微球對伴刀豆球蛋白(Con A)的吸附分離取實施例7製備的葡萄糖糖基化聚丙烯微球(糖基化率為195.46％)浸入10毫升無水乙醇中預浸潤，再以磷酸鹽緩衝溶液(PBS，0.01摩爾/升，pH＝7.36)清洗，放入10毫升伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)的PBS溶液中，密封，其中，Con A的濃度為100克/升，PNA的濃度為100克/升，溶液中CaCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，MnCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，NaCl的濃度為0.1摩爾/升。在25℃下恆溫30分鐘後，取出葡萄糖糖基化聚丙烯微球，並以1摩爾/升的葡萄糖磷酸鹽緩衝溶液衝洗，即可將吸附在微球上的伴刀豆球蛋白洗脫，從而實現將伴刀豆球蛋白從蛋白質的混合溶液中分離的目的。
應用例3、葡萄糖糖基化聚丙烯微球對伴刀豆球蛋白(Con A)的吸附分離取實施例8製備的葡萄糖糖基化聚丙烯微球(糖基化率為2.98％)浸入10毫升無水乙醇中預浸潤，再以磷酸鹽緩衝溶液(PBS，0.01摩爾/升，pH＝7.36)清洗，放入10毫升伴刀豆球蛋白/花生凝集素(ConA/PNA)的PBS溶液中，密封，其中，Con A的濃度為1克/升，PNA的濃度為1克/升，溶液中CaCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，MnCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，NaCl的濃度為0.1摩爾/升。在25℃下恆溫30分鐘後，取出葡萄糖糖基化聚丙烯微球，並以1摩爾/升的葡萄糖磷酸鹽緩衝溶液衝洗，即可將吸附在微球上的伴刀豆球蛋白洗脫，從而實現將伴刀豆球蛋白從蛋白質的混合溶液中分離的目的。
應用例4、半乳糖糖基化聚丙烯微球對花生凝集素(PNA)的吸附分離取實施例10中製備的半乳糖糖基化聚丙烯微球(糖基化率為105.09％)浸入10毫升無水乙醇中預浸潤，再以磷酸鹽緩衝溶液(PBS，0.01摩爾/升，pH＝7.36)清洗，放入10毫升伴刀豆球蛋白/花生凝集素(ConA/PNA)的PBS溶液中，密封，其中，ConA的濃度為100g/L，PNA的濃度為100g/L，溶液中CaCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，MnCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，NaCl的濃度為0.1摩爾/升。在25℃下恆溫30分鐘後，取出半乳糖糖基化聚丙烯微球，並以1摩爾/升的半乳糖磷酸鹽緩衝溶液衝洗，即可將吸附在微球上的伴刀豆球蛋白洗脫，從而實現將花生凝集素從蛋白質的混合溶液中分離的目的。
應用例5、乳糖糖基化聚丙烯微球對花生凝集素(PNA)的吸附分離取實施例13製備的乳糖糖基化聚丙烯微球(糖基化率為93.37％)浸入10毫升無水乙醇中預浸潤，再以磷酸鹽緩衝溶液(PBS，0.01摩爾/升，pH＝7.36)清洗，放入10毫升伴刀豆球蛋白/花生凝集素(Con A/PNA)的PBS溶液中，密封，其中，Con A的濃度為100g/L，PNA的濃度為100g/L，溶液中CaCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，MnCl2的濃度為0.1毫摩爾/升，NaCl的濃度為0.1摩爾/升。在25℃下恆溫30分鐘後，取出乳糖糖基化聚丙烯微球，並以1摩爾/升的乳糖磷酸鹽緩衝溶液衝洗，即可將吸附在微球上的伴刀豆球蛋白洗脫，從而實現將花生凝集素從蛋白質的混合溶液中分離的目的。
表1 實施例1～13糖基化聚丙烯微球的製備條件及結果

a參比物為聚丙烯微球上接枝的帶羥基的丙烯酸酯類單體表2 實施例1～13中涉及的具體的糖基的結構式

表3 應用例1～5的分離效果

表4 應用實例1～13中涉及的具體糖基可識別的凝集素

權利要求
1.一種具有核殼結構的糖基化聚丙烯微球的製備方法，包括如下步驟(1)將聚丙烯微球浸入含有複合光引發劑和帶羥基的丙烯酸酯類單體的溶液中，進行紫外光輻照接枝聚合反應，反應結束後分離產物、洗滌、烘乾，得到羥基化聚丙烯微球；所述的複合光引發劑為三氯化鐵和二苯甲酮的複合物，其中三氯化鐵的濃度為0～0.033摩爾/升，二苯甲酮的濃度為0.0007～0.033摩爾/升，帶羥基的丙烯酸酯類單體在溶液中的體積百分數為5～20％；(2)將羥基化聚丙烯微球浸入糖單體的二氯甲烷溶液中，糖單體的量為微球表面羥基數的5～20倍，在氮氣保護下加入三氟化硼乙醚絡合物進行反應，反應結束後分離產物、洗滌、烘乾得到表面固定糖基的聚丙烯微球；(3)將表面固定糖基的聚丙烯微球浸入甲醇鈉的甲醇溶液中，室溫下振蕩90分鐘，脫去糖基上的保護基團乙醯基，得到核殼結構的糖基化聚丙烯微球。
2.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)所述的聚丙烯微球的直徑為0.2～2000微米。
3.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)所述的帶羥基的丙烯酸酯類單體為甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯或丙烯酸羥丁酯等。
4.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)所述的溶液的溶劑是丙酮和水的混合物，其體積比為0.25～4。
5.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(1)所述的接枝聚合反應前，體系通氮氣保護，紫外光輻照時間為10～120分鐘。
6.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述的糖單體是乙醯基保護的單糖、寡糖或多糖。
7.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於所述的糖單體為葡萄糖五乙酸酯、甘露糖五乙酸酯、半乳糖五乙酸酯、巖藻糖四乙酸酯、麥芽糖八乙酸酯、乳糖八乙酸酯或蔗糖八乙酸酯中的一種或幾種。
8.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述的三氟化硼乙醚絡合物濃度為所用糖單體濃度的5倍。
9.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述的反應為在冰水浴中振蕩反應2小時，然後室溫下繼續振蕩反應20小時。
10.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於步驟(3)所述的甲醇鈉的甲醇溶液，其濃度為0.5摩爾/升。
全文摘要
本發明公開了一種具有核殼結構的糖基化聚丙烯微球的製備方法，是以聚丙烯微球為載體材料，在紫外光輻照下接枝帶羥基的丙烯酸酯類單體，得到羥基化的聚丙烯微球；再將乙醯基保護的糖結合到此微球表面的羥基上；然後把乙醯基保護的糖基化聚丙烯微球浸入甲醇鈉/甲醇溶液中，脫去乙醯基，得到糖基化的聚丙烯微球；本發明將糖基結合在微球表面，可直接裝填成柱(高效液相色譜的固定相)或用作流化床的固體相，用於蛋白質的分離、濃縮或靶向清除，糖基穩定存在於微球表面，易於回收並可重複使用。
文檔編號C08L23/00GK101070401SQ200710068480
公開日2007年11月14日 申請日期2007年5月10日 優先權日2007年5月10日
發明者徐志康, 胡夢欣, 萬靈書 申請人:浙江大學