微小rna的功能抑制方法

2023-11-11 22:18:12

專利名稱：微小rna的功能抑制方法
技術領域：
本發明涉及有效率地抑制miRNA的功能的方法、以及該方法中使用的核酸。
背景技術：
微小RNA(miRNA)是內源性表達的小的(約20 M核苷酸)調節性非編碼RNA， 作為RNA誘導沉默複合體(RNA-induced silencing complex ；RISC)的成分，在轉錄後水平調節多個靶基因的表達。當某miRNA與位於mRNA中的其靶序列完全互補時，miRNA誘導其mRNA的切斷，引起mRNA水平的快速減少。但哺乳動物的miRNA大半隻與位於3』非翻譯區(3』 -UTR)的靶序列具有有限水平的互補性，引起翻譯抑制或細質加工小體(P-bodies) 中的靶mRNA的快速脫腺苷化(deadenylation)。預想人的編碼基因的1/3以上是miRNA 的靶(Bartel, D. P. (2004)Cell, 116,281-297 ；Lewis, B. P.等人· (2005)Cell, 120,15-20 ； Ambros, V.等人· (200 foia，9，277-279)，現在不斷有證據表明:miRNA在分化、發生、腫瘤形成和抗感染的細胞防禦中發揮重要作用(Li，Q. J.等人· (2007)Cell, 129,147-161 ； Lu, J.等人.(2005) Nature, 435,834-838 ；Lecellier, C. H.等人· (2005) Science, 308, 557-560)。為了 miRNA分子的綜合性功能分析，有人認為特異性地抑制其活性的技術是不可缺少的。已經存在幾種抑制miRNA的功能的方法，例如存在2』 -0-甲基(2』 -OMe)RNA等化學修飾的單鏈寡核苷酸(Hutvagner, G.等人· (2004)PLoS Biol,2, E98 ；Meister，G.等人· (2004) Rna，10,544-550)、鎖定核酸(LNA)和 「antagomirs」 (Orom, U. Α.等人· (2006) Gene, 372,137-141 ；Krutzfeldt, J.等人· (2005) Nature，438，685-689)。由於這些試劑是使其對成熟miRNA具有互補性的化學合成的試劑，所以這些試劑對細胞性的核酸酶具有耐性，也許會發揮不被RISC切斷的底物的功能。由於這些試劑設計成通過轉染而導入細胞中，所以抑制活性必然是一過性的。最近，有人報導了表達miRNA的競爭抑制劑「微小RNA海綿」的DNA載體^bert， Μ. S.等人j2007)Nat Methods，4，721-726)。雖然微小microRNA海綿載體的一過性表達會有效地抑制miRNA的功能，但即使通過基於DNA的載體導入，其抑制效果也維持不過一個月。因此，人們希望確立更長期地抑制miRNA的方法。現有技術文獻非專利文獻非專利文獻1 :Bartel, D. P. (2004) Cell，116，281-297非專利文獻2 Lewis, B. P.等人· (200 Cell，120，15-20非專利文獻3 =Ambros, V.等人.Q003) Rna, 9, 277-279非專利文獻4 :Li，Q. J.等人.(2007)Cell，129，147-161非專利文獻5:Lu，J.等人.Q005) Nature，4；35，834-838非專利文獻6 :Lecellier，C.H.等人.Q005) kience，308，557-560非專利文獻7 =Hutvagner, G.等人· (2004)PLoS Biol, 2, E98
非專利文獻8 :Meister，G.等人.Q004) Rna，10，544-550非專利文獻9 :0rom，U. Α.等人.Q006) Gene，372，137-141非專利文獻10 =Krutzfeldt, J.等人· (2005)Nature, 438,685-689非專利文獻11 :Ebert, Μ. S.等人· (2007) Nat Methods，4，721-72
發明內容
發明所要解決的課題本發明涉及用於有效率地抑制miRNA的miRNA抑制體、用於在細胞內表達該抑制體的載體、該載體的構建方法、以及利用該抑制體或載體的miRNA的抑制方法等。解決課題的方法為了確立miRNA的更有效率且長期的抑制，本發明人等重新設計了能夠抑制 miRNA的RNA，評價miRNA抑制活性。其結果，發現在雙鏈RNA的單端的兩條鏈上結合有 miRNA結合序列(MBS)的RNA顯示出強的miRNA抑制活性(圖1和圖2)。特別是包含2個雙鏈RNA部分、且雙鏈的各鏈上分別結合有MBS以使其被這2個雙鏈夾持的RNA (圖2、#12 #16)顯示出極強的miRNA抑制活性。而且，本發明人等通過包含雙鏈部分的這些RNA結構的其中一端形成閉合的結構(例如環結構)，以直鏈狀單鏈RNA的形式構成這些miRNA抑制 RNA，可以通過1個轉錄單元表達該RNA。另外，使MBS集中在雙鏈結構的單側，並使其相反側和該雙鏈結構部分形成恆定區，從而將包含目標MBS的套件插入包含該恆定區的表達單元中，由此產生根據目標miRNA極其簡便地構建顯示出特異性抑制活性的RNA的表達載體的系統。在導入有該表達載體的細胞中，可以強效抑制靶miRNA，而且可以根據目標miRNA 簡單地構建載體。S卩，本發明涉及用於有效率地抑制miRNA的miRNA抑制體、用於在細胞內表達該抑制體的載體、該載體的構建方法、以及利用該抑制體或載體的miRNA的抑制方法等，更具體而言，本發明涉及下述[1] [18][1]抑制miRNA的複合體，其中包含RNA或其類似物，該複合體包含雙鏈結構，並且包含miRNA結合序列的至少1條鏈與該雙鏈結構的至少單端的2條鏈結合；[2] [1]所述的複合體，該複合體包含第2多重鏈結構，其中包含miRNA結合序列的鏈分別與該單端的2條鏈的每1條結合，該鏈的各自的另一端分別與該第2多重鏈結構的 2條鏈結合，以使該鏈被該雙鏈結構和多重鏈結構夾持；[3] [2]所述的複合體，該多重鏈為雙鏈或四條鏈；[4] [1] [3]中任一項所述的複合體，該單端的2條鏈通過該單端側相連接；[5] [4]所述的複合體，該複合體由直鏈狀單鏈RNA或其類似物構成；[6] [1] [5]中任一項所述的複合體，該複合體包含2 5個miRNA結合序列；[7] [6]所述的複合體，該複合體包含2個miRNA結合序列；[8] [5]所述的複合體，該複合體包含圖2(C)所示的結構，該結構的I和II為雙鏈結構，該結構的a和b分別包含1個miRNA結合序列；[9] [5]所述的複合體，該複合體包含圖2 (D)所示的結構，該結構的I為雙鏈結構， 並在單側具有各鏈的末端，該結構的II為髮夾結構，該結構的a和b中分別包含IfmiRNA 結合序列；
[10]RNA或其類似物，其構成[1] [9]中任一項的複合體；[11]核酸，該核酸編碼[10]所述的RNA ；[12] [11]所述的核酸，該核酸與啟動子的下遊結合；[13] [12]所述的核酸，其中啟動子為聚合酶III啟動子；[14] [12]或[13]所述的核酸，該核酸被擔載在逆轉錄病毒載體上；[15]製作[12]所述的核酸的方法，該方法包括下述步驟在啟動子的下遊編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列的核酸之間插入編碼至少1個miRNA結合序列的核酸；[16] [15]所述的方法，其中，編碼miRNA結合序列的核酸包含至少2個miRNA結合序列且包含在其間形成莖的序列；[17]試劑盒，該試劑盒用於製作[12]所述的核酸，該試劑盒包含下述(a)和(b) 的核酸(a)核酸，該核酸在啟動子的下遊包含形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列和用於將核酸插入該1對互補序列之間的位點； (b)核酸，該核酸編碼至少1個miRNA結合序列；[18] [17]所述的試劑盒，其中，編碼miRNA結合序列的核酸包含至少2個miRNA結合序列且包含在其間形成莖的序列。本發明還涉及下述[1] [15][1]抑制miRNA的複合體，其中包含RNA或其類似物，該複合體包含雙鏈結構，並且包含miRNA結合序列的至少1條鏈與該雙鏈結構的至少單端的兩條鏈結合；[2] [1]所述的複合體，該複合體包含第2雙鏈結構，包含miRNA結合序列的鏈分別與該單端的2條鏈的每1條結合，該鏈的各自的另一端分別與該第2雙鏈結構的2條鏈結合，以使其被上述2個雙鏈結構夾持；[3] [1]或[2]所述的複合體，其中，該單端的2條鏈通過該單端側相連接；[4] [3]所述的複合體，該複合體由直鏈狀單鏈RNA或其類似物構成；[5] [1] W]中任一項所述的複合體，該複合體包含2 5個miRNA結合序列；[6] [5]所述的複合體，該複合體包含2個miRNA結合序列；[7]RNA或其類似物，其構成[1] [6]中任一項的複合體；[8]核酸，該核酸編碼[7]所述的RNA ；[9] [8]所述的核酸，該核酸與啟動子的下遊結合；[10] [9]所述的核酸，其中，啟動子為聚合酶III啟動子；[11] [9]或[10]所述的核酸，該核酸被擔載在逆轉錄病毒載體上；[12]製作[9]所述的核酸的方法，該方法包括下述步驟將編碼至少1個miRNA 結合序列的核酸插入在啟動子的下遊編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列的核酸之間；[13] [12]所述的方法，其中，編碼miRNA結合序列的核酸包含至少2個miRNA結合序列且包含在其間形成莖環的序列；[14]試劑盒，其用於製作[9]所述的核酸，該試劑盒包含下述(a)和(b)的核酸(a)核酸，該核酸在啟動子的下遊包含形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列和用於將核酸插入該1對互補序列之間的位點；(b)核酸，該核酸編碼至少1個miRNA結合序列；[15] [14]所述的試劑盒，其中，編碼miRNA結合序列的核酸包含至少2個miRNA結合序列且包含在其間形成莖環的序列。需要說明的是，上述各項中，2個或2個以上的引用同一項的各項所記載的發明任意組合而得到的發明，已經包含在它們中所引用的上位的項所記載的發明中。另外，本說明書中記載的任意的發明要素及其任意組合包含在本說明書中。另外，在這些發明中，除本說明書所記載的任意要素或其任意組合以外的發明也包含在本說明書中。說明書中例如記載某特定方案作為優選方案時，本說明書不僅公開該方案，除該方案以外的發明也由包含該方案的更上位的本說明書所公開的發明來公開。發明效果通過本發明，提供可以有效率且特異性地抑制miRNA的功能的miRNA抑制劑。本發明的miRNA抑制劑，例如通過將其表達單元整合逆轉錄病毒載體中，可以長期穩定地抑制 miRNA。這例如可以使擊倒小鼠這樣的體內測定成為可能。並且，由於通過Cre-IoxP調節的U6啟動子系統已經確立，所以還可以利用該系統時間特異性且組織特異性地實施miRNA 擊倒。如圖6所例示，本發明的miRNA抑制RNA的表達套件可以容易地構建，所以還可以利用其構建用於綜合性分析miRNA的RNA文庫。這樣，本發明提供對miRNA的研究非常有用的工具。例如，通過根據是否存在特定的miRNA抑制RNA的表達來全面研究培養細胞中的表達mRNA，可以將本發明用於鑑定靶mRNA候補。另外，預想生物體內的基因有相當的比例是miRNA的靶，提示miRNA在包括分化、發育、腫瘤形成、以及抗感染症的細胞防禦在內的各種方面中發揮重要作用。在基因調節機制的闡明、或腫瘤或感染症的基因治療等中，本發明的方法對控制參與上述行為的miRNA的功能有用。


圖1是顯示原型誘騙RNA的莖長的效果的圖。㈧原型誘騙RNA的結構。粗黑的彎箭頭表示MBS(5，一 3，)。(B)向保有miR-140-3p報導基因和miR140-5p/140-3p載體兩者的HeLaS3細胞中分別導入表達這些誘騙RNA的慢病毒載體，在導入的6 10天後，通過FACS分析確定全集團的GFP表達水平的中值。相對於只保有miR-140-3p報導基因的 HeLaS3細胞的表達水平進行校正，並以平均士SEM表示表達水平。使用以Cre重組酶基因為靶的shRNA作為陰性對照(NC)。圖2是顯示具有各種莖結構的一系列誘騙RNA的抑制效果的比較的圖。(A)誘騙RNA#2和#10 #16的結構。粗黑的彎箭頭表示MBS。I、II、III和IV顯示存在於誘騙 RNA中的莖。(B)使用與圖IB的說明中所示的相同的報導基因細胞系統，確定表達這些誘騙RNA的慢病毒載體的效果。與圖IB同樣校正表達水平。顯示誘騙RNA的各莖序列(I、 II、III和IV)的長度。(C)構成本發明的誘騙RNA的單元的一種形態。I表示第1雙鏈結構，II表示第2雙鏈結構。a和b分別包含至少一個MBS。第2雙鏈結構的末端(圖中的右端)可以形成環，也可以不形成環。形成環時，誘騙RNA成為單鏈。a和b可以包含多個 MBS,而且，即使a和b可以不完全是單鏈狀態，也可以部分性地形成雙鏈結構。多個該單元可以串聯相接(例如圖示(Panel)A的#15和#16)。(D)在圖示(C)所示的單元中，第2雙鏈結構的末端形成環時的結構。對環中所含的核苷酸數目沒有特別限定，可以是0 數個、 例如1、2、3、4、5、6、7個核苷酸。需要說明的是，圖示(A)、(C)、(D)的雙鏈部分的豎線表示取雙鏈結構，核苷酸數目並不受豎線數目的限定。圖3是顯示原型誘騙RNA的MBS序列給抑制效果帶來顯著影響的圖。以圖IB的說明中所示的方式確定相對GFP表達。圖4是顯示誘騙RNA的接頭序列長度的效果的比較的圖。㈧誘騙RNA#22 #26 的結構。粗黑的彎箭頭表示MBS(5』 一3』)。一指示接頭序列。(B)以圖IB的說明中所示的方式確定相對GFP表達。另外，接頭序列的長度也如圖示所示。圖5是顯示MBS序列內的凸起和連接MBS和莖的間隙的接頭的效果的圖。以圖IB 的說明中所示的方式確定相對GFP表達。粗黑的曲線箭頭表示MBS。圖6中，(A)是顯示本發明的miRNA抑制RNA的代表性結構的圖。MBS表示miRNA 結合位點。(B)通過小鼠TO啟動子驅動的miRNA抑制RNA表達用套件的生成的模式圖。將約80 90mer的合成寡核苷酸對退火，再將其克隆到位於BamHI-Ec0RI片段(原來的套件)中的2個BsmBI位點之間，生成miRNA抑制RNA表達套件。圖7是顯示本發明的抑制miRNA的複合體的抑制效果的通用性、特異性和持續期間的圖。(A)利用圖IB中記載的GFP報導基因細胞系統檢測的、TuD-miR140-5p-4ntin或 TuD-miR140-3p-4ntin對miR140_3p活性的效果。但是，在導入後8 12天確定了 GFP表達水平(圖 16D 和 E)。(B)TuD-miR140-5p-4ntin 或 TuD-miR140_3p-4ntin 對 miR140_5p 活性的效果。向保有miR-140-5p報導基因和miR140-5p/140-3p載體兩者的HeLaS3細胞中分別導入表達這些miRNA抑制RNA的慢病毒載體，在導入後8 12天確定了 GFP表達水平。相對於只保有miR-140-5p報導基因的HeLaS3細胞的表達水平進行校正，並以平均士SEM表示表達水平。(C)圖IB中記載的TuD-miR140-3p-4ntin對miR140_3p活性的抑制效果的經時性變化。相對於只保有miR-140-3p報導基因的HeLaS3細胞的相對GFP表達水平進行校正。(D)通過定量實時RT-PCR確定的、圖示(B)中記載的細胞中的成熟miR140-5p 的水平。相對於保有miR-140-5p報導基因和miR140-5p/140-3p載體兩者的HeLaS3細胞的miR140-5p表達水平進行校正，並以平均士SEM表示miR140_5p表達水平(n = 3)。以 U6 snRNA作為內源性對照。(E)miRNA抑制RNA的胞內定位的分析。用三角標記表示W小細胞質 RNA (Y4 scRNA，93nt)和 ACAl 小核 RNA(ACA1 snoRNA，130nt)的遷移率。以細胞組分(fraction)標誌物的形式顯示 Y4 scRNA 和 ACAl snoRNA PA-1。Un、5p、3p、N、C 分別表示非感染細胞、TuD-miR140-5p感染細胞、TuD-miR140_3p感染細胞、核組分、細胞質組分。圖8是顯示抑制miRNA的複合體對內源性miR21活性的抑制效果的圖。將miRNA 抑制RNA表達質粒載體或LNA/DNA反義寡核苷酸和海腎螢光素酶miR-21報導基因(白色棒圖)或非靶定化的對照海腎螢光素酶報導基因(黑色棒圖)和用作轉染的對照的螢火蟲螢光素酶報導基因一同一過性地轉染到PA-I細胞(A)或HCT-116(B)中。在雙螢光素酶測定後，相對於轉染有TuD-NC載體的PA-I細胞或HCT-116細胞的表達水平進行校正，並以平均士SEM表示表達水平。(C) 一過性轉染的miRNA抑制RNA表達質粒載體對作為miR21的靶的內源性PD⑶4蛋白的表達的效果。將miRNA抑制RNA表達質粒載體轉染到PA-I細胞中，在轉染的72小時後製備總蛋白。通過蛋白質印跡確定PD⑶4(上)和β-肌動蛋白加樣對照(下)。(D)通過實時RT-PCR測定進行了與(B)相同的操作的細胞中的miR21表達水平。相對於轉染了 TuD-NC載體的HCT-116細胞的miR21表達水平進行校正，並以平均士SEM表示miR21表達水平(n = 3)。以U6 snRNA作為內源性對照。(E)通過RNA印跡測定進行了與(B)相同的操作的細胞中的pre-miR21和成熟miR21的表達水平。以加樣對照的形式顯示W scRNA。圖9是顯示miRNA抑制RNA表達質粒載體和CMV海綿表達質粒載體、Hl-Antagomir 表達質粒載體、miRNA Eraser表達質粒載體、LNA/DNA反義寡核苷酸的效果的比較的圖。使用HCT-116細胞，自轉染起72小時後進行雙螢光素酶分析。相對於轉染了非靶定化的對照海腎螢光素酶報導基因的HCT-116細胞的表達水平進行校正，並以平均士SEM表示表達水平。圖10是顯示通過RNA印跡進行的miRNA抑制RNA表達水平的分析的圖。通過 RNA印跡分別分析轉染了 miRNA抑制RNA表達載體的PA-I細胞(A)、HCT-116細胞(B) 中TuD-miR-21-4ntin和TuD-miR-21-pf的表達水平。用三角標記顯示Y4 scRNA和ACAl snoRNA的遷移率。以加樣對照的形式顯示W scRNA。圖11是顯示通過導入miRNA抑制RNA而誘導的生物活性的圖。㈧通過導入 TuD-miR21而產生的PA-I細胞的細胞增殖活性的分析。將miRNA抑制RNA表達載體導入 PA-I細胞中，自載體導入起分析細胞數達4天。(B)通過導入TuD-miR21而引起的PA-I細胞的凋亡誘導的分析。將miRNA抑制RNA表達載體導入PA-I細胞中，自載體導入起3天後分析胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的活性。相對於各導入有miRNA抑制RNA表達載體的 PA-I細胞的細胞數目進行校正，並以平均士SEM表示該活性。圖12是顯示miRNA抑制RNA對靶miRNA家族的抑制效果的圖。(A)顯示miR-16、 195、497的序列及其同源性。以括號顯示的序列為seed位點，黑色棒圖顯示同源位點。⑶ 顯示 TuD-miR-16-4ntin、TuD-miR-195_4ntin 和 TuD-miR497-4ntin 的 MBS 與 miR-16 的結合。黑點顯示G-U結合。(C)將miRNA抑制RNA表達質粒載體與海腎螢光素酶miR-16報導基因(白色棒圖)或非靶對照海腎螢光素酶報導基因(黑色棒圖)和用作轉染的對照的螢火蟲螢光素酶報導基因一同轉染到HCT-116細胞中，進行雙螢光素酶測定。相對於轉染了 TuD-NC載體的HCT-116細胞的值進行校正，並以平均士SEM表示表達水平(n = 3)。圖13是顯示用於miR140-3p的誘騙RNA的結構和序列的圖。MBS表示與miR140_3p 完全或部分互補的miRNA結合位點。圖14是顯示用於miR140_3p的誘騙RNA的結構和序列的圖(圖13的續圖)。圖15是顯示用於構建miR-140-3p或miR-140-5p的高靈敏度測定系統的逆轉錄病毒載體的結構的圖。(A)基於報導基因MLV的逆轉錄病毒載體pMXs-GIN-miR140-3pT的原病毒的結構。在緊挨著GFP基因的下遊具有與成熟miR-140-3p完全互補的21bp的插入。U3、R和TO分別顯示MoMLV長末端重複來源所對應的序列。Ψ 逆轉錄病毒載體的包裝信號。(B)基於報導基因MLV的逆轉錄病毒載體pMXs-GIN-miR140-5pT的原病毒的結構。 (C)基於 MoMLV 的 miR140-5p/140-3p 表達載體 pSSCH-miR140-5p/140-3p 的原病毒的結構。 Pri-miR140-5p/140-3p序列被插入ΔU3序列中，使其通過內部的CMV啟動子轉錄。AU3: 除去了主要增強子序列(major enhancer sequences)的U3序列。(D)基於HIV的自身惰性化誘騙RNA表達載體的結構。Δ U3 除去了主要增強子序列(major enhancer sequences) 的U3序列。R 慢病毒的R序列。U5:慢病毒的TO序列。Ψ 慢病毒的包裝信號。
圖16是顯示miR140-3p活性的高靈敏度測定系統的建立、以及miRNA抑制RNA的導入的效果的圖(圖示A E)。HeLaS3細胞的GFP表達水平(自身螢光)的FACS分析 (A)、只保有miR140-3p報導基因的HeLaS3細胞的GFP表達水平的FACS分析(B)、以及保有miR140-3p報導基因和miR140-5p/140_3p表達載體兩者的HeLaS3細胞的GFP表達水平的FACS分析(C)。向miR140-3p報導基因細胞中分別導入TuD-miR140_3p-4ntin (D)或 TuD-miR140-5p-4ntin(E)中的任一種，8天後的GFP表達水平的FACS分析。粗的實線和點線分別表示只保有miR140-3p報導基因的HeLaS3細胞的GFP表達分布圖、保有miR140_3p 報導基因和miR140-5p/140-3p表達載體兩者的HeLaS3細胞的GFP表達分布圖。圖17是顯示螢光素酶表達載體的結構的圖。(A)螢火蟲螢光素酶表達質粒載體 PTK4. 12C. P-的結構。(B)不具有插入的海腎螢光素酶報導基因pGL4. 74的結構。(C)在緊挨著海腎螢光素酶基因的下遊具有與成熟miR-21完全互補的22bp的插入的海腎螢光素酶報導基因pGL4.74-miR21T的結構。(D)在緊挨著海腎螢光素酶基因的下遊具有與成熟 miR-16完全互補的22bp的插入的海腎螢光素酶報導基因pGL4. 74_miR16T的結構。圖18是顯示本發明的miRNA抑制RNA的結構和序列的圖。MBS表示與對應的miRNA 完全或部分互補的miRNA結合位點。圖19是顯示miR-21抑制效果中的TuD-miR-21-4ntin表達載體的量依賴性的圖。 只變更TuD-NC、TuD-miR-21-4ntin表達質粒的量，除此之外，在與圖8(B)相同的條件下將其轉染到HCT-116細胞中。相對於轉染了 TuD-NC載體的HCT-116細胞的值進行校正，並以平均士 SEM表示表達水平(n = 3)。圖20是顯示抑制miRNA的複合體對內源性miR21活性的抑制效果的圖。將miRNA 抑制RNA表達質粒載體或LNA/DNA反義寡核苷酸和海腎螢光素酶miR-21報導基因(白色棒圖)或非靶定化的對照海腎螢光素酶報導基因(黑色棒圖)和用作轉染的對照的螢火蟲螢光素酶報導基因一同一過性地轉染到SW480細胞㈧、HD9細胞⑶、TIG-3/E/TERT細胞 (C)或3Y1細胞(D)中。在雙螢光素酶測定後，相對於轉染了 TuD-NC載體的SW480細胞、 HT29細胞、TIG-3/E/TERT細胞或3Y1細胞的表達水平進行校正，並以平均士SEM表示表達水平(n = 3)。圖21是顯示HCT-116細胞中的miR-15a/15b/16/195/4M/497家族的表達水平的圖。利用Agilent公司的miRNA-微陣列分析表達水平。圖22是由2』 -0-甲基合成寡核苷酸產生的本發明的miRNA抑制RNA及其效果。
(A)雙螢光素酶測定用報導基因質粒。實施例7 9的實驗均使用HCT-116細胞來進行。
(B)由2』-0_甲基合成寡核苷酸產生的本發明的miRNA抑制RNA的結構。將所有核苷酸均被2』-0_甲基化修飾的雙鏈合成寡核苷酸退火後使用。(C)顯示由2』-0_甲基合成寡核苷酸產生的合成RNA的miRNA抑制效果。改變濃度測定該抑制RNA的miRNA抑制效果，與現有的2』 -0-甲基合成寡核苷酸進行比較。圖23顯示將本發明的miRNA抑制RNA的miRNA抑制效果與普通的LNA、PNA和 2』 -0-甲基化寡核苷酸進行比較的結果。圖M顯示將本發明的miRNA抑制RNA的miRNA抑制效果與miRIDIAN抑制劑等進行比較的結果。圖25是利用了鳥嘌呤四重鏈(G-quadruplex)的本發明的miRNA抑制RNA的轉錄及其效果。(A)G-quadruplex-環111的平行四重鏈結構和G-quadruplex-環333 的平行以及反向平行四重鏈結構。(B)TuD-miR21-4ntin、TuD-miR21-4ntin-GqLl 11和 TuD-miR21-4ntin-GqL333的結構的模式圖。(C)各RNA的miRNA抑制活性。圖沈顯示miRNA抑制RNA的結構所帶來的效果。(A)TuD-miR21_4ntin、 TuD-miR21-4ntin-lMBS-l 和 TuD-miR21-4ntin-lMBS_2 的結構的模式圖。在 1MBS-1 中，虛線箭頭表示MBS反向序列；在1MBS-2中，虛線箭頭表示TuD-NC (對照序列)。(B)各RNA的 miRNA抑制活性。圖27是通過人7SK啟動子的本發明的miRNA抑制RNA的轉錄及其效果。(A)顯示通過人7SK啟動子轉錄本發明的miRNA抑制RNA的表達套件的結構。人7SK啟動子通過緊挨著7SK RNA的轉錄起始點的序列(特別是第1位 第8位的核苷酸)使轉錄強化，所以將7SK RNA的第1位 第13位的核苷酸整合本發明的抑制RNA的莖部分。(B)HCT_116細胞中的miR-21抑制效果。通過圖22(A)中記載的雙螢光素酶測定來進行測定。圖28顯示本發明的miRNA抑制RNA的miR200的抑制效果。構建以(A-D) miR200 為靶的本發明的miRNA抑制RNA的表達質粒，使用螢光素酶報導基因測定系統，顯示通過 2種啟動子表達的miRNA抑制RNA的效果。(E)通過TuD-miR200c_4ntin進行的上皮-間充質轉換的情形。將miRNA抑制RNA表達慢病毒載體導入HCT-116細胞中，製作穩定表達 miRNA抑制RNA的細胞集團，在導入的15天後製備總蛋白。通過蛋白質印跡確定作為上皮細胞、間充質細胞各自的基因標誌物的E-鈣粘著蛋白(上)、波形蛋白(中)、以及肌動蛋白加樣對照(下)。
具體實施例方式本發明涉及可以有效率且特異性地抑制miRNA的miRNA抑制複合體。本發明的抑制miRNA的複合體包含雙鏈或多重鏈結構，包含miRNA結合序列(MBS)的至少1條鏈與該雙鏈或多重鏈結構的至少單端的2條鏈結合。需要說明的是，在本發明中，通過將該雙鏈或多重鏈結構稱作「第一」雙鏈結構，有時可以和本發明的複合體所能包含的另外的雙鏈或多重鏈結構區別開來(後述)。本發明的複合體可以是也可以不是單鏈(即通過共價鍵結合的1個分子)，例如可以由單鏈、雙鏈或其以上的多條鏈構成。本發明包括例如由包含MBS 的RNA鏈分別與雙鏈結構的單端的2條鏈的每一條結合的雙鏈RNA形成的複合體。此外， 包含至少1個MBS的單鏈RNA鏈例如可以與雙鏈結構的單端的2條鏈結合。此時，雙鏈結構的單端的2條鏈通過包含MBS的RNA鏈相連接(例如圖1)。連接雙鏈結構的2條鏈的 RNA中雖然包含至少1個MBS，但例如可以包含2個、3個或其以上(例如圖2A)。雙鏈結構包含莖環或髮夾結構。即，雙鏈結構可以是莖環或髮夾結構中所含的雙鏈結構。本發明中，抑制miRNA的複合體可以是具有雙鏈結構、且包含至少1條RNA或其類似物的結構體。該複合體優選包含1分子或2分子的包含RNA或其類似物的分子。本發明中，miRNA結合序列(MBS)是指與miRNA結合的序列。MBS至少包含與miRNA 互補的部分，以使其能夠與miRNA結合。如實施例所示，MBS可以是也可以不是與miRNA完全互補的序列。例如，MBS可以是miRNA所靶向的天然的RNA序列。MBS例如連續或非連續地包含與miRNA互補的至少10個核苷酸、例如11個核苷酸以上、12個核苷酸以上、13個核苷酸以上、14個核苷酸以上、15個核苷酸以上、16個核苷酸以上、17個核苷酸以上、18個核苷酸以上、19個核苷酸以上、20個核苷酸以上、21個核苷酸以上、22個核苷酸以上、23個核苷酸以上或M個核苷酸以上的核苷酸。優選該互補的核苷酸連續、或者具有3處以下、2處以下、優選1處的缺口。缺口可以是MBS側和/或miRNA側的不配對(凸起)，關於1處的缺口，可以是只在單方的鏈上具有凸起核苷酸的缺口，也可以在雙方的鏈上具有不配對的核苷酸。優選設計成至少在MBS側包含不配對的核苷酸。凸起和錯配的核苷酸數為在每 1處凸起和錯配中、在每一單鏈上例如為6個核苷酸以下、優選5個核苷酸以下、4個核苷酸以下、3個核苷酸以下、2個核苷酸以下或1個核苷酸。在本發明中，能夠形成凸起的MBS顯示出較包含完全互補的序列的MBS高的miRNA抑制效果(實施例4)。因此，為了得到更高的miRNA抑制效果，優選以形成凸起的方式設計MBS。例如，從MBS的3，末端起第10位和 /或第11位的核苷酸與miRNA不互補、或者在第10位和第11位之間包含多餘的核苷酸的 MBS (或者從miRNA中的靶序列(與MBS雜交的序列)的5，末端起第10位和/或第11位的核苷酸未形成與MBS互補的核苷酸、或者在第10位與第11位的核苷酸之間包含不配對的核苷酸的MBS)不易被分解，可以期待高的活性。此時，例如可以以包含從miRNA的5』末端起第10位和第11位的核苷酸不配對的形式設計MBS，例如可以以第9 11位、第10 12位、或第9 12位不配對的形式設計MBS。此外，在miRNA側雖然不存在不配對的核苷酸，但在MBS側在從3』末端起第10位與第11位之間(或者在相當於從miRNA中的靶序列 (與MBS雜交的序列)的5』末端起第10位和第11位的位點之間)可以具有不配對的核苷酸。不配對的核苷酸可以存在於miRNA側和/或MBS側，但優選至少存在於MBS側。各鏈中不配對的核苷酸的數可以適當調整，例如為1 6個核苷酸，優選為1 5個核苷酸，更優選為3 5個、例如3、4或5個核苷酸。此外，為了識別miRNA的靶，已知從miRNA的5，端起第2 7位或第3 8位的核苷酸(稱作 seed 區)匹配很重要(Jackson AL 等人·，RNA 12(7) :1179-1187,2006 ； Lewis BP 等人.，Cell 120 15-20，2005 ;Brennecke 等人· PLoS BIOLOGY 3,0404-0418, 2005 ;Lewis 等人· Cell 115，787-798，2003 ;Kiriakidou 等人· Genes & Development 18， 1165-1178,2004) ο實際顯示即使本發明的miRNA抑制RNA是具有僅seed區匹配、與其他區只具有低的互補性的MBS的miRNA抑制RNA，也可以有效抑制miRNA(實施例6、圖12)。 作為本發明中的MBS，優選miRNA的seed區(從miRNA的5』端起第2 7位和/或第3 8位的核苷酸)完全互補的MBS。此時，可以認為G:U對(U:G對)也互補，但優選認為只有 G:C(C:G)和A:U(U:A)互補。另夕卜，作為本發明中的MBS，優選miRNA的seed區(從miRNA 的5』端起第2 7位和/或第3 8位的核苷酸)完全互補、且連續包含與miRNA互補的至少8個核苷酸、更優選9個核苷酸、更優選10個核苷酸的MBS。並且，本發明中的MBS優選包含與miRNA互補的總計11個核苷酸以上、更優選12個核苷酸以上、更優選13個核苷酸以上的核苷酸。MBS優選為在生理條件下與miRNA序列雜交的序列。生理條件下是指例如150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉、pH7.0、37°C。更優選MBS為在嚴格的條件下與miRNA序列雜交的序列。嚴格的條件是指例如IXSSC(IXSSC是指150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉、pH7. 0)或 0. 5X SSC、42 °C的條件，更優選為1 X SSC或0. 5X SSC、45 °C的條件，更優選為1 X SSC或 0. 5XSSC、50°C的條件。在雜交中，例如標記包含miRNA序列的RNA或包含MBS的RNA中的其中之一，將另一方固定在膜上，使兩者雜交。雜交條件例如可以在包含5XSSC、7% (ff/V)SDSUOO μ g/ml 變性鮭精 DNA、5 X Denhardt，s 液(IX Denhardt，s 溶液包含 0.2%聚乙烯吡咯烷酮、0. 2%牛血清白蛋白和0. 2% Ficoll)的溶液中、例如在37°C或45°C或50°C下進行。培養足夠的時間(例如3、4、5或6小時以上)後，在上述條件下清洗，檢測標記的核酸是否雜交，由此可以確定在該條件下核酸是否雜交。或者，MBS優選與miRNA序列的互補序列顯示出高同源性。高同源性是指例如具有 70%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82% 以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、 93%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上的同源性的核苷酸序列。 核苷酸序列的同源性例如可以使用BLAST程序(Altschul，S. F.等人.，J. Mol. Biol. 215 403-410，1990)來確定。例如在NCBI (National Center for Biothchnology Information) 的BLAST的網頁中，可以使用預設參數進行檢索(Altschul S. F.等人.，Nature Genet. 3 266-272,1993 ；Madden, Τ. L.等人·，Meth. Enzymol. 266 :131-141，1996 ;Altschul S. F.等人.，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997 ；Zhang J. & Madden Τ.L. ， Genome Res. 7 649-656,1997)。例如利用進行2個序列的比較的blast 2 sequences程序(Tatiana A等人·，FEMS Microbiol Lett. 174 =247-250,1999)製作2個序列的比對，可以確定序列的同源性。無視miRNA序列的核苷酸序列外側的缺口，內側的缺口例如與錯配同樣處理，計算比對中的miRNA序列相對於核苷酸序列整體(加算進入序列的內側的缺口後的總核苷酸長度)的同源性的值。但是，如實施例所示，MBS和miRNA的錯配可以提高miRNA的抑制活性。 因此，例如優選無視在比對的內側插入miRNA序列中的缺口，算出同源性。或者，MBS優選包含在miRNA序列的互補序列中插入、取代和/或缺失1個或數個核苷酸而得到的序列。優選MBS包含相對於miRNA序列的互補序列具有8個核苷酸以內、 7個核苷酸以內、6個核苷酸以內、5個核苷酸以內、4個核苷酸以內、3個核苷酸以內、2個核苷酸以內或1個核苷酸的插入、取代和/或缺失的序列。更優選MBS包含相對於miRNA序列的互補序列具有8個核苷酸以內、7個核苷酸以內、6個核苷酸以內、5個核苷酸以內、4個核苷酸以內、3個核苷酸以內、2個核苷酸以內或1個核苷酸的插入的序列。本發明中顯示 和與miRNA序列完全互補的序列相比，MBS的存在錯配的序列的miRNA的抑制活性高。認為這是由於若MBS完全互補，則通過包含miRNA的RISC而受到切斷，由此miRNA抑制RNA 的表達水平降低。特別是MBS與miRNA雜交時，設計成從MBS的3，末端起第10位和/或第11位的核苷酸不配對(或者，從與MBS雜交的miRNA側的靶序列的5』末端起第10位和 /或第11位的核苷酸與MBS雜交時不配對)、或者在第10位與第11位的核苷酸之間包含不配對的核苷酸的MBS可以期待高的活性。這樣的不配對例如可以是MBS側的凸起，形成凸起的核苷酸為1 6個核苷酸、優選1 5個核苷酸、更優選為3 5個核苷酸(例如3、 4或5個核苷酸)。MBS可以由RNA組成、或者包含核酸類似物、或者可以由核酸類似物組成(實施例 7)。特別是通過使MBS的被切斷的位點(從MBS的3，末端起第10位和/或第11位的核苷酸等)形成核酸類似物以使其不發生切斷，可以期待提高miRNA抑制效果。另外，還優選使用具有硫代磷酸酯或2，-0-甲基等主鏈或糖的核酸(Krutzfeldt，J.等人.，Nucleic Acids Res. 35 :2885-2892 ；Davis, S.等人·，2006，Nucleic Acids Res. 34 :2294-2304)。對本發明的抑制miRNA的複合體所靶向的miRNA沒有特別限定。只要是它們具有miRNA結構，也可用於來自植物、線蟲、脊椎動物等任何物種的miRNA。已知在以人、小鼠、 雞、斑馬魚、擬南芥(Arabidopsis thaliana)為代表的多種生物中有非常多的miRNA的序列(參照 miRBase Sequences 的網頁microrna. Sanger, ac. uk/sequences/)。例如可以以包括小鼠、大鼠、山羊等在內的哺乳動物、包括猴在內的靈長類、以及人的miRNA作為靶。 例如可以例示miR2l(Lagos-Quintana M 等人.，Science. 294 :853-858,2001 ；Mourelatos Z 等人.，Genes Dev. 16 :720-728,2002 ；Michael MZ 等人.，Mol Cancer Res. 1 :882-891, 2003 ；Dostie J 等人.RNA. 9 180-186，2003)、miR140 (Lagos-Quintana M 等人.，Curr Biol. 12 :735-739,2002 ；Cai X 等人·，Proc Natl Acad Sci USA. 102 :5570-5575, 2005)、miR1995 (Lagos-Quintana M 等人.，RNA. 9 175-179，2003 ；Landgraf P 等人·， Cell. 129 1401-1414，2007)、miR16 (Lagos-Quintana M等人·，Science. 294 :853-858, 2001 ；Mourelatos Z 等人.，Genes Dev. 16 :720-728,2002 ；Lim LP 等人.，Science. 299 1540,2003 ；Calin GA 等人.，Proc Natl Acad Sci U S A. 99 15524-15529，2002 ；Michael MZ 等人·，Mol Cancer Res. 1 :882-891，2003)、miR497 (Bentwich I 等人·，Nat Genet. 37 766-770,2005 ；Landgraf P 等人.，Cell. 129 1401-1414，2007)等，但並不限於這些。另外，本發明的上述抑制miRNA的複合體涉及下述的抑制miRNA的複合體該複合體除了包含第1多重鏈結構，還包含第2多重鏈結構，形成包含MBS的RNA鏈分別與位於第 1多重鏈結構的一端的2條鏈的每1條結合的結構，該RNA鏈的其他各端分別與位於該第2 多重鏈結構的一端的2條鏈結合，使被夾在第1多重鏈結構與第2多重鏈結構之間。多重鏈結構可以是2條鏈，或者可以是G-quadruplex這樣的4條鏈。優選第1多重鏈結構為2 條鏈、第2多重鏈結構為2條鏈或4條鏈。例如，本發明涉及抑制miRNA的複合體，該複合體除了包含第1雙鏈結構，還包含第2雙鏈結構，在第1雙鏈結構中，結合有MBS的一方的末端的2條鏈形成分別結合每1條包含MBS的RNA鏈的結構，該RNA鏈的各另一端分別與該第2雙鏈結構的2條鏈結合，以被夾在第1雙鏈結構與第2雙鏈結構之間。該RNA複合體例如具有至少2個雙鏈結構，構成該2個雙鏈結構的4條RNA鏈各自未經由剩下的3條中的任一條鏈，而是具有與包含MBS的RNA結合的結構。說到更容易理解這樣的抑制miRNA 的複合體時，該抑制miRNA的複合體是包含MBS的2條RNA鏈與2個雙鏈結構的各鏈分別結合，以被夾在2個雙鏈結構中的複合體(圖2(C))。即，本發明包含RNA，該RNA是具有圖 2 (C)的結構的RNA複合體，RNA鏈a禾Π b被夾在雙鏈結構I禾Π II中，該a禾Π b中分別包含 1個以上的MBS。由於包含MBS的2條RNA鏈與雙鏈結構所配對的各鏈結合，所以RNA鏈的方向彼此相反(圖2、#12 #16)。通過以這種方式在雙鏈的各鏈上分別添加MBS，可以發揮更高的miRNA抑制活性。以夾在2個雙鏈結構中的方式存在的、包含MBS的2條RNA鏈中，分別包含1個以上的MBS。這些MBS可以是相同的序列，也可以是不同的序列。另外，可以是以相同的miRNA 為靶的序列，也可以是與不同的靶miRNA結合的序列。例如，1條鏈上可以包含2個以上、 例如2、3、4或5個MBS(圖2、#12 #16)。例如，夾在2個雙鏈結構中的各鏈上可以包含1 個或2個MBS。例如，本發明的抑制miRNA的複合體可以是總計包含2個MBS的複合體，這 2個MBS可以是相同的序列、或與同樣的miRNA結合的序列。如上所述，本發明的抑制miRNA的複合體中所含的雙鏈所配對的各鏈可以是各自的RNA分子，雙鏈中的一方或兩方的末端可以相連接，可以形成直鏈狀或環狀。需要說明的是，直鏈狀是相對於環狀而言的，不過是指具有末端，當然不是指未形成二次結構。由直鏈狀單鏈RNA構成的抑制miRNA的複合體例如可以通過一次的RNA合成來製作，還可以使用表達載體等通過1個表達單元表達。例如，當包含2個雙鏈結構時，第2雙鏈結構的一端(MBS未結合的側)的2條鏈可以通過環連接，使整體形成單鏈。在連接雙鏈的序列中可以包含1個或1個以上的MBS(圖2、#2、#11、#13、#14、#16)。為了使序列儘可能短小，可以通過短環連接雙鏈。例如，可以使雙鏈通過1 10個核苷酸、優選1 8個核苷酸、2 6個核苷酸、3 5個核苷酸、例如4個核苷酸的序列結合。對序列沒有特別限定。例如有 5』-GUCA-3』(圖6A)。例如，本發明包含RNA，該RNA具有圖2 (A) #13或圖2 (D)的結構，RNA 鏈a和b夾在雙鏈結構I和II中，雙鏈結構II形成髮夾結構(或莖 環)，該a和b中分別包含1個以上的MBS。本發明的抑制miRNA的複合體中所含的雙鏈結構，對其序列沒有特別限定，但優選具有4個鹼基對以上的長度。特別是本發明的RNA複合體中所含的雙鏈結構中的至少1 個(即第一雙鏈結構)在RNA複合體的核外輸送中具有重要功能。該雙鏈的鏈長例如可以是 15 50 鹼基對，優選為 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 或 45 個核苷酸、或它們的任一個以上、50、49、48、 47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、 22、21、20、19或18個核苷酸、或它們的任一個以下。在更優選的方案中，雙鏈結構的鹼基對的長度例如為15 30、優選16 28、優選17 25、優選17 24、例如17、18、19、20、21、 22,23或M。即使超過20bp，也可以發揮高的活性，但超過20bp的dsRNA在細胞質中能夠成為被切酶切斷的潛在的靶，所以為了避免這種情形，本發明的複合體中所含的雙鏈結構可以是20bp以下、例如19bp以下或18bp以下。當本發明的抑制miRNA的複合體中包含第二或其以上的雙鏈結構時，對這些雙鏈結構的序列或其長度沒有特別限定。例如為了使抑制miRNA的複合體整體短小，這些雙鏈結構的長度可以短於第一雙鏈結構的長度。各雙鏈的鏈長可以適當調整，例如為4bp 20bp,例如可以是 5bp 15bp、5bp 12bp、5bp 10bp、6bp 9bp 或 7bp 8bp。形成雙鏈結構的鹼基對的序列可以適當設計，以使在抑制miRNA的複合體中可以特異性且穩定地形成雙鏈。例如，優選避免相同的核苷酸長(例如8個核苷酸以上、優選7 個核苷酸以上、更優選5個核苷酸以上、更優選4個核苷酸以上、更優選3個核苷酸以上)且連續的同聚序列。此外，還優選避免二個核苷酸重複序列或3 4個核苷酸重複序列等多個核苷酸的序列串聯重複的序列。雙鏈部分的GC含量可以適當調整，例如為12% 85%、 優選為 15% 80%、20% 75%、25% 73%、32% 72%、35% 70%、37% 68% 或 40% 65%。若列舉一例，則可以例示圖6A所示的莖I和莖II的序列，但並不限於這些序列。作為4條鏈，可以列舉G-quadruplex，具體而言，可以是GGG-環-GGG-環-GGG-環-GGG( GGG-loop-GGG-loop-GGG-loop-GGG)這樣的序列。這裡，環的序列可以適當選擇，例如3個環可以均為1個核苷酸(例如M(A或C))、或者均為3個核苷酸(SEQ ID NO :167、SEQ ID NO :168 等)。MBS與雙鏈結構可以直接連接，也可以經由其他序列連接。例如，可以經由適當的接頭或間隔區序列使MBS與雙鏈結構的末端結合。即使將MBS與雙鏈部分直接連接，也可以得到顯著的抑制活性，但通過添加接頭(或者還稱作間隔區)，對miRNA的抑制效果進一步提高(實施例4)。MBS序列與雙鏈結構之間的接頭或間隔區序列有可能增加MBS與存在於RISC中的miRNA的可接近性。接頭或間隔區的長度可以適當調整，例如為1 10個核苷酸、優選為1 9個核苷酸、1 8個核苷酸、1 7個核苷酸、1 6個核苷酸、1 5個核苷酸、1 4個核苷酸或1 3個核苷酸。例如，即使是連接2個以上的MBS的情況，也可以經由接頭或間隔區進行連接。對接頭或間隔區的序列沒有特別限定，例如可以是包含 A和/或C的序列、或者包含A和/或C較其他核苷酸多的序列。另外，優選注意不使接頭或間隔區序列與對應的接頭或間隔區序列、或MBS之間形成穩定的鹼基對。若列舉一例，則可以例示AAC、CAA、ACC、CCA或包含它們中的任一個的序列等。添加在MBS的兩側的一對接頭或間隔區序列可以是反向序列(鏡像序列)。例如，可以在MBS的5』側添加AAC、在3』 側添加CAA。此外，可以對構成本發明的抑制miRNA的複合體的核酸進行修飾。例如，構成核酸的核苷酸可以是天然核苷酸、被修飾的核苷酸、人工核苷酸、或它們的組合。另外，本發明的抑制miRNA的複合體中所含的核酸可以由RNA組成、或者可以是RNA/DNA嵌合體、或者可以包含其他核酸類似物，可以包含它們的任意的組合。核酸中不僅包括通過磷酸二酯鍵結合的核酸，還包括具有醯胺鍵或其他主鏈的核酸(肽核酸(PNA)等)。核酸類似物中例如包括天然及人工的核酸，可以是核酸衍生物、核酸類似物、核酸派生物等。這樣的核酸類似物在該領域中眾所周知，例如包括硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、 2』 -0-甲基核苷酸、肽核酸(PNA)，但並不限於這些。PNA的骨架中可以包含由氨基乙基甘氨酸、聚醯胺、聚乙基、聚硫代醯胺、聚亞磺醯胺(polysulfinamide)、聚磺醯胺、或它們的組合形成的骨架(Krutzfeldt, J.等人·，Nucleic Acids Res. 35 :2885-2892 ；Davis, S.等人·，2006，Nucleic Acids Res. 34 :2294-2304 ；Boutla, Α.等人·，2003)，Nucleic Acids Res. 31 :4973-4980 ；Hutvagner, G.等人.，2004，PLoS Biol. 2 :E98 ；Chan, J. Α.等人.， 2005，Cancer Res. 65 :6029-6033 ；Esau, C.等人·，2004，J. Biol. Chem. 279 :52361-52365 ； Esau, C.等人.，2006，Cell Metab. 3 :87-98)。可以進行核酸的修飾，以抑制由內切核酸酶引起的分解。在特別優選的修飾中，2』 或3』糖修飾、例如2』 -0-甲基(2』 -O-Me)化核苷酸或2』 -脫氧核苷酸、或2』 -氟、二氟甲苯醯基、5-Me-2』 -嘧啶、5-烯丙基氨基-嘧啶、2』 -0-甲氧基乙基(2』 _0_M0E)、2』 -0-氨基丙基(2』 -0-AP)、2』 -O-N-甲基乙醯胺(2』 -0-NMA)、2』 -0-二甲基氨基乙基氧基乙基 (2，-DMAE(E)、2，_0_ 二甲基氨基乙基(2，-O-DMA(E)、2，_0_ 二甲基氨基丙基(2，-0-ΑΡ)、 2』 -羥基核苷酸、硫代磷酸酯、4』 -硫代核苷酸、2』 -0-三氟甲基核苷酸、2』 -0-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2』 -0- 二氟甲氧基-乙氧基核苷酸、或2』 -ara-氟核苷酸、鎖定核酸(LNA)、 2，_0，4，-C-乙烯交聯核酸(2，_0，4，-C-ethylene bridged nucleic acid (ΕΝΑ))等乙烯核酸、其他交聯核酸(BNA)、己糖醇核酸(hexitol nucleic acid ;HNA)、嗎啉代核酸、三環-DNA(tcDNA)、聚醚核酸(US Pat. No. 5，908，845)、環己烯核酸(CeNA)、以及它們的組合。 另外，可以進行二氟甲苯醯基(DFT)修飾、例如2，4_二氟甲苯醯基尿嘧啶，或者將胍取代成肌苷。此外，核酸可以在其末端包含結合體。作為結合體，例如有親油性物質、萜烯、蛋白結合物質、維生素、碳水化合物、類視黃醇和肽等。具體可以例示C5-氨基烷基dT、萘普生、硝基吲哚、葉酸、可拉酸、布洛芬、類視黃醇、聚乙二醇(PEG)、C5嘧啶接頭、甘油類脂(例如二烷基甘油酯衍生物)、維生素E、膽固醇、硫代膽固醇、dU-膽固醇、烷基鏈、芳基、雜環式複合體、以及修飾糖(D-核糖、脫氧核糖、葡萄糖等)。結合體與核酸例如可以經由任意的接頭結合，具體可以列舉吡咯烷接頭、絲氨醇接頭、氨氧基或羥脯氨醇接頭等。另外，可以在核酸中適當添加細胞透過信號。例如，已知有多種用於將核酸導入細胞中的細胞透過性肽(W02008/08288O。具體可以列舉例如聚精氨酸等富含精氨酸的肽，例如可以是HIV-I Tat(48-60)、HIV-I Rev(34-50)、FHV Coat(35-49)、BMV Gag(7-25)、HTLV-II Rex(4-16)、 它們的部分肽、或其inverso或retro-inverso等。優選的一個例子為SEQ ID NO :152所示的HIV-I Tat 57-49。胺基酸可以使用適當的d體。細胞透過性肽等可以通過眾所周知的接頭與核酸結合。本發明的抑制miRNA的複合體可以設計成由直鏈狀的單鏈核酸構成(圖幻。本發明特別涉及複合體，其中，所有MBS均集中在某雙鏈結構(圖2的莖I)的單側(圖2中為右側)，該雙鏈結構的各鏈在該側形成閉合的結構(即通過包含MBS的序列連接)，在該雙鏈結構的相反側具有單鏈RNA的兩端(圖2)。在包含MBS的序列中，可以進一步包含多重鏈(例如二或四條鏈)結構(圖2的莖II或III等)。單鏈RNA的長度可以適當確定， 例如為500個核苷酸內、優選450個核苷酸以內、420個核苷酸以內、400個核苷酸以內、380 個核苷酸以內、360個核苷酸以內、340個核苷酸以內、320個核苷酸以內、300個核苷酸以內、280個核苷酸以內、260個核苷酸以內、240個核苷酸以內、220個核苷酸以內、200個核苷酸以內、180個核苷酸以內、160個核苷酸以內、140個核苷酸以內、120個核苷酸以內、100 個核苷酸以內或80個核苷酸以內。例如，形成具有2個雙鏈結構和2個MBS的複合體的單鏈RNA的長度例如為60 300個核苷酸、優選為70 250個核苷酸、80 200個核苷酸、 90 180個核苷酸或100 150個核苷酸。第一雙鏈結構(接近單鏈RNA的兩端的雙鏈結構)例如可以為15 30bp、優選16 2^ρ、優選17 25bp、優選17 24bp、例如17bp、 18bp、19bp、20bp、2 Ibp、22bp、23bp或Mbp，為了使整體短小，第二雙鏈結構(包含MBS的序列中所含的另一雙鏈結構)可以較第一雙鏈結構的長度短，例如為4bp 20bp，例如可以是 5bp 15bp、5bp 12bp、5bp 10bp、6bp 9bp 或 7bp 8bp。本發明還涉及構成本發明的抑制miRNA的複合體的RNA(這裡，作為RNA，包含天然RNA和核酸類似物)、以及編碼該RNA的核酸(DNA或RNA)。miRNA抑制RNA複合體由1分子的RNA構成時，通過該RNA的分子內退火，可以構建本發明的複合體；而當由2條以上的RNA分子構成時，通過使這些RNA退火，可以構建本發明的複合體。這些RNA可以適當合成。例如，可以通過RNA的化學合成來製造所期望的RNA。或者，利用表達該RNA的表達載體，也可以使RNA表達。對表達載體沒有特別限定，例如可以使用在大腸桿菌等細菌、酵母等真核細胞、昆蟲細胞、植物細胞或動物細胞等中表達的所期望的表達載體。例如，考慮使用在植物、昆蟲、動物等高等真核生物的細胞中表達的載體，使RNA在這些細胞中表達，抑制miRNA的功能。對用於轉錄RNA的啟動子沒有特別限定，可以使用Pol I啟動子、Pol II啟動子、Pol III啟動子、噬菌體的啟動子等。例如，將噬菌體的轉錄酶和具有該啟動子的載體同時導入後使用時，可以例示T4噬菌體或T7噬菌體的RNA聚合酶或啟動子。另外，作為聚合酶II(Pol II)啟動子，例如可以例示CMV啟動子或β-珠蛋白啟動子等。為了表達數百個核苷酸以內的較短的RNA，優選利用期望較Pol II高的表達量的聚合酶III(Pol III)啟動子。作為Pol III啟動子，可以例示TO啟動子、Hl啟動子、tRNA啟動子、7SK啟動子、7SL啟動子、TO啟動子、5S rRNA啟動子、Ad2 VAI和VAII啟動子等(Das, G.等人.，1988，EMBO J. 7 :503-512 ；Hernandez, N.，1992，第 281-313 頁，In S. L. McKnight 禾口 K. R. Yamamoto (ed.), Transcriptional regulation,第 1 卷· Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ；Kunke1, G. R. ,1991, Biochim. Biophys. Acta 1088 1-9 ；Lobo, S. Μ.，和 N. Hernandez，1989，Cell 58 :55-67 ；Mattaj，I. W.等人·， 1988，Cell 55 :435-442 ；Geiduschek, Ε. P.和 G. A. Kassavetis，1992，第 247-280 頁，In Transcriptional regulation. Monograph 22(ed. S. L. McKnight 禾口 K.R. Yamamoto), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York.)。特別可以例不在多個snRNA或細胞質RNA基因中發現的Class 3啟動子，例如可以列舉TO、7SK、hYl和hY3、 Hl 禾 PMRP/Th RNA 基因的啟動子(Hernandez，N.，1992，第沘1_313 頁，In Transcriptional regulation. Monograph 22(S. McKnight 禾口 K. R. Yamamoto 編),Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。例如可以優選使用人 U6、人 HI、人 7SK或小鼠TO啟動子等。特別是使用7SK啟動子來表達本發明的miRNA抑制RNA時，可以以極高的效率抑制靶miRNA，這在實施例中已顯示。使用Pol III啟動子時，通過在編碼所轉錄的RNA的DNA的下遊添加例如約4 7個核苷酸的poly (T) tract，可以發揮轉錄的終止子的功能。如此操作而構建的轉錄單元還可以直接用於表達，而且還可以整合到其他載體系統中使用。對載體沒有特別限定，可以使用表達質粒或所期望的病毒載體等。作為病毒載體，有逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體等，但並不限於這些(Miller，A. D.等人· (1991) J. Virol. 65, 2220-2224 ；Miyake, S.等人· (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8802-8806 ；Samulski, R. J.等人.(1989) J. Virol. 63，3822-3828)。例如，包含 Pol III 啟動子的轉錄單元可以整合到逆轉錄病毒(包括慢病毒)的LTR中使用。通過將其整合到逆轉錄病毒載體中，可以以高效率將基因導入靶細胞中，此外，由於導入基因被整合到染色體中，所以可以長期穩定抑制miRNA。對使用的逆轉錄病毒沒有特別限定，例如包括同向性病毒載體(Kitamura,T.等人.(1995) Proc. Natl. Acad. ki. USA. 92，9146-9150)、兼向性病毒載體、通過VSV-G等假型化的病毒載體(Arai，T.等人.(1998) J. Virol. 72，1115-1121)、 HIV 載體、SIV 載體、FIV 載體等慢病毒載體(Shimada, T.等人· (1991) J. Clin. Inv. 88, 1043-1047)等。例如可以使用基於MoMLV的逆轉錄病毒載體或基於HIV的慢病毒載體。整合到LTR中時，例如可以整合在U3區具有缺失(AU3)的LTR的AU3區中(圖15)。在優選方案中，載體在導入細胞中後，經過1周以上、優選2周以上、3周以上、4周以上或1個月以上，可以表達miRNA抑制RNA，抑制miRNA的功能。如上所述，在將miRNA抑制RNA複合體設計成由單鏈的直鏈狀RNA分子構成的情況下，僅憑將轉錄該RNA的一種表達載體導入細胞中，即可在細胞內形成miRNA抑制RNA複合體，可以抑制目標miRNA，因此較佳。如上所述，該情況下miRNA抑制RNA複合體中所含的1個或多個MBS全部只存在於某雙鏈結構(第一雙鏈結構；相當於圖2的莖I)的單側， 該單側的雙鏈設計成通過包含MBS的RNA相連接(即閉合)，該雙鏈結構的相反側可以成為直鏈狀RNA鏈的兩端。由此，形成該雙鏈結構的部分和相當於直鏈狀單鏈RNA的兩端的部分可以是不依賴於MBS的恆定區，只有該單鏈RNA的部分可以形成能夠根據MBS而變化的可變區。即，具有這樣的結構的RNA兼具miRNA抑制的效率性和製造的容易性。包含該MBS的RNA可以包含2個以上的MBS，在MBS之間可以包含形成莖(或莖環)的序列。莖例如可以是2或4條鏈的莖。如此設計構成miRNA抑制RNA複合體的單鏈RNA時，預先構建編碼一對互補序列的載體(例如miRNA抑制RNA表達用套件)，所述的一對互補序列構成形成恆定區的雙鏈結構，通過在該一對互補序列之間插入編碼與目標miRNA結合的MBS的DNA，可以根據目標 miRNA簡便地構建表達miRNA抑制RNA複合體的載體(圖6)。在一對互補序列的上遊可以配置適當的啟動子(圖6B)。對啟動子沒有特別限定，優選為Pol III啟動子。此外，在一對互補序列的下遊可以配置終止子。表達一對互補序列的DNA對表達構成miRNA抑制RNA 複合體的單鏈RNA極為有用。可以在一對互補序列之間設計適當的插入位點，使可以插入編碼MBS的DNA。作為插入位點，可以是所期望的限制酶識別序列(可以是多克隆)或att 序列等位點特異性重組序列等，或者可以預先切斷使能夠直接插入。本發明還涉及製造編碼構成本發明的RNA複合體的RNA的核酸(例如DNA)的方法，該方法包括以下步驟在編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列的雙鏈DNA之間插入編碼至少1個miRNA結合序列的雙鏈DNA。本發明還涉及製造表達構成本發明的RNA複合體的RNA的核酸(例如DNA)的方法，該方法包括以下步驟在啟動子的下遊編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列的雙鏈DNA之間插入編碼至少1個miRNA結合序列的雙鏈 DNA。本發明還涉及核酸和/或其互補鏈，所述核酸是用於製造編碼構成本發明的RNA 複合體的RNA的核酸的核酸，該核酸編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列。本發明還涉及用於製造編碼構成本發明的RNA複合體的RNA的核酸的組合物，該組合物包含編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列的核酸和/或其互補鏈。組合物可以進一步包含適當的藥學上可接受的載體。本發明還涉及核酸和/或其互補鏈，所述核酸是用於製造表達構成本發明的RNA複合體的RNA的載體的核酸，該核酸在啟動子的下遊編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列。本發明還涉及用於製造表達構成本發明的RNA複合體的RNA的載體的組合物，該組合物包含在啟動子的下遊編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列的核酸和/或其互補鏈。本發明還涉及核酸和/或其互補鏈，所述核酸是用於製造編碼構成本發明的RNA 複合體的RNA的核酸的核酸(例如DNA)，該核酸編碼至少1個miRNA結合序列。本發明還涉及用於製造編碼構成本發明的RNA複合體的RNA的核酸(例如DNA)的組合物，該組合物包含編碼至少1個miRNA結合序列的核酸和/或其互補鏈。本發明還涉及編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列的核酸和/或其互補鏈在製造編碼構成本發明的RNA複合體的RNA的核酸中的應用。本發明還涉及在啟動子的下遊編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列的核酸和/或其互補鏈在製造表達構成本發明的RNA複合體的RNA的載體中的應用。本發明還涉及編碼至少1個miRNA結合序列的核酸和/或其互補鏈在製造編碼構成本發明的RNA複合體的RNA的核酸中的應用。另外，上述核酸的任意組合可以作為用於製造編碼構成本發明的RNA複合體的 RNA的核酸的試劑盒的要素。本發明特別涉及試劑盒，該試劑盒包含編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列的核酸及其互補鏈。該核酸和互補鏈可以形成雙鏈DNA。另外，在包含 1對互補序列的雙鏈DNA中，啟動子和/或終止子可以進行功能性連接。該核酸例如可以是表達質粒。另外，試劑盒中可以進一步包含編碼至少1個miRNA結合序列的核酸和/或其互補鏈。例如，本發明涉及試劑盒，該試劑盒用於製造表達本發明的RNA複合體的載體，該試劑盒包含(a)核酸，該核酸包含在啟動子的下遊形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列和用於在該一對互補序列之間插入核酸的位點；以及(b)核酸，該核酸編碼至少IfmiRNA 結合序列。通過在上述編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列的核酸之間插入編碼至少 1個miRNA結合序列的核酸，可以簡便地得到編碼本發明的RNA複合體的核酸。各核酸的結構如關於本發明的RNA複合體所詳述的那樣。例如形成雙鏈結構的1對互補序列可以適當確定，其鏈長例如可以是15 50個鹼基對，優選為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 或 45 個核苷酸、或它們的任一個以上，或 50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、 30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18個核苷酸、或它們的任一個以下。在更優選的方案中，雙鏈結構的鹼基對的長度例如為15 30、優選16 觀、優選17 25、優選 17 24、例如為17、18、19、20、21、22、23或M。在優選方案中，該核酸為雙鏈核酸，所期望的啟動子進行功能性連接。啟動子優選為Pol III啟動子。在1對互補序列之間可以具有用於插入核酸的位點，例如可以具有限制酶識別序列，使容易插入核酸。即，本發明涉及載體，該載體用於製造表達本發明的RNA複合體的核酸，該載體包含核酸，所述核酸包含在啟動子的下遊形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列和用於在該一對互補序列之間插入核酸的位點。作為限制酶識別序列，可以例示BsmBI序列，但這只是例示而已，可以適當選擇。編碼至少1個MBS的核酸可以包含2個以上的MBS，在一連續的序列中可以包含能夠形成多重鏈(例如二或四條鏈)結構的1對或1對以上的互補序列的組合。例如，作為該核酸，可以例示包含形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列和在該1對互補序列的兩端分別包含至少1個MBS的核酸。具體而言，這樣的核酸是指在2個MBS之間包含能夠形成莖的一對互補序列的核酸。該莖相當於上述第二雙鏈結構。或者，可以包含形成G-quadruplex 作為第二多重鏈結構的序列。另外，該核酸可以包含2個以上的結構單元，該結構單元包含在2個MBS之間能夠形成雙鏈結構的1對互補序列。可以以嵌入狀包含多個該結構單元，在位於1對MBS之間的、能夠形成雙鏈結構的1對互補序列之間可以進一步包含下述序列包含1對MBS和在其間能夠形成雙鏈結構的1對互補序列的序列(圖2的#15或#16等)。所含的多個MBS的序列可以相同也可以不同。若將這樣的核酸插入上述1對互補序列之間，則得到具有下述結構的核酸在形成第一雙鏈結構的一對互補序列(圖6的莖I)之間插入有具有「MBS-形成第二多重鏈結構的序列-MBS」的結構的序列的結構。具體而言，例如為具有下述結構的核酸插入有具有 "MBS-形成第二雙鏈結構的一對互補序列(圖6的莖II)-MBS」的結構的序列的結構。通過轉錄該核酸，可以得到編碼配置成包含MBS的雙鏈夾在2個多重鏈(例如雙鏈)結構中的RNA複合體的核酸(圖6)。包含2個多重鏈(例如雙鏈)結構和其間的一對相向的單鏈 (分別包含MBS)的核酸短小且顯示出足夠的miRNA抑制活性。能夠形成雙鏈結構的1對互補序列和MBS可以經由適當的接頭或間隔區連接。接頭或間隔區的長度如說明書中所述。另外，互補序列可以經由接頭或間隔區連接，當形成雙鏈時，該接頭或間隔區形成環，組合雙鏈以形成莖環。環的長度也可適當調整，細節如說明書所述。或者，當形成4條鏈時，可以適當使用形成G-quadruplex的序列。合成編碼MBS的核酸及其互補鏈，將兩者退火(例如圖6B的合成寡DNA)。將已退火的2條鏈核酸的末端插入限制酶切識別位點時，與其組合可以形成與用適當的限制酶切斷的末端相同的結構。本發明的抑制miRNA的複合體、或構成該複合體的RNA(這裡，作為RNA，包括天然 RNA及其類似物)、或表達該RNA的載體可以製成用於抑制miRNA的組合物。由於本發明的組合物可以特異性且有效率地抑制靶miRNA，所以對由miRNA的抑制介導的基因的功能調節有用。本發明的組合物根據需要可以與藥理學上可接受的所期望的載體或介質組合。其中，可以列舉通常用於懸浮核酸的所期望的溶液，例如可以例示蒸餾水、磷酸緩衝生理鹽水(PBS)、氯化鈉溶液、Ringer』 s溶液、培養液等。此外，可以含有植物油、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑、殺生物劑等。還可以添加保存劑或其他添加劑。本發明的組合物還可以與作為載體的生物聚合物等有機物、羥基磷灰石等無機物、具體有膠原間質、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物及其化學衍生物等組合。本發明的組合物可以用作所期望的試劑或藥物組合物。本發明還提供本發明的組合物、本發明的抑制miRNA的複合體、或構成該複合體的RNA或表達該RNA的載體在抑制miRNA中的應用。本發明還提供包含它們中的任一種的miRNA抑制劑。向細胞內的導入，這可以在體外、先體外後體內或體內進行。經由細胞進行給藥時，將其導入適當的培養細胞或由接種對象動物採集的細胞等中。作為核酸的導入，有利用磷酸鈣共沉澱法、脂質轉染法、DEAE葡聚糖法、使用注射針等直接向組織中注入DNA溶液的方法、使用基因槍進行的導入等。由於病毒載體可以以高效率將基因導入靶細胞中，因此優選。給藥量根據疾病、患者的體重、年齡、性別、症狀、給藥目的、給藥組合物的形態、給藥方法、導入基因等而不同，但可以根據給藥對象動物、給藥部位、給藥次數等適當調整，本領域技術人員可以適當確定。可以適當選擇給藥途徑。給藥對象優選為哺乳動物(包括人和非人哺乳類)。具體包括人；猴等非人靈長類；小鼠、大鼠等嚙齒類；兔、山羊、綿羊、豬、牛、 狗、貓以及其他哺乳動物。實施例以下，通過實施例進一步詳細說明本發明，但本發明並不限於這些實施例。需要說明的是，本說明書中引用的文獻均作為本說明書的一部分而納入。[實施例1]1.1構建質粒使下述⑴所示的寡核苷酸退火，並將其克隆到用NotI和MlI切斷的 pMXs-GIN(Haraguchi，T.等人.(2007)FEBS Lett，581，4949-4954)中，分別製作 miR-140-5p 和 miR-140_3p 的 GFP 報導基因即 pMXs-GIN-miR140_5pT 和 pMXs-GIN-miR140-3pT。將 pMXs-GFP (Kitamura，Τ. (1998Πη J Hematol，67，351-359) 的 0. 7kb BamHI-EcoRI 片段插入 pcDNA3. 1 (Invitrogen)的 BamHI-EcoRI 位點，製作 pcDNA3. 1-GFP。用Klenow片段分別補平pcDNA3. I-GFP的BamHI位點和EcoRI位點。將該質粒的 1. 7kb BglII-EcoRV 片段插入 pQCXIH(Clontech)的 BglII-EcoRV 位點，製作 pSSCG。 將 pIRESlHyg (Clontech)的 1. 3kb HindIII-XbaI 片段插入 pcDNA3. 1 的 HindIII-XbaI 位點，製作 pCMV-Hyg。將 pCMV-Hyg 的 2. Ikb NruI-ApaI 片段插入 pSSCG 的 NruI-EcoRV 位點， 製作pSSCH。為了構建miR-140-5p/140-3p表達逆轉錄病毒載體質粒，使用下述(1)所示的引物對，通過PCR由小鼠基因組擴增0. 5-kb小鼠miR-140-5p/140-3p片段，將PCR產物克隆到pCR2. 1 (Invitrogen)中。將該質粒的0. 5-kb BamHI-XhoI片段克隆到用BamHI和 SalI 消化的 pSSCH 中，製作 pSSCH-miR140-5p/140_3p。使用的寡核苷酸(1)用於構建GFP報導基因載體的引物對為了構建 pMXs-GIN-miR140-3pT，使用有義鏈 5，-GGCCGCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGT AGGG-3，(SEQ ID NO 1)和反義鏈 5，-TCGACCCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGC-3，(SEQ ID NO 2)；為了構建 pMXs-GIN-miR140-5pT，使用有義鏈 5，-GGCCGCTCTACCATAGGGTAAAACCACTGGGG -3，(SEQ ID NO 3)和反義鏈 5，-TCGACCCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGAGC_3，(SEQ ID NO 4)； 為了構建 PCR-miR140-5p/140-3p，使用有義鏈 5，-TGCTTGCTGGTGGTGTAGTC-3，(SEQ ID NO: 5)和反義鏈 5，-ACCAACACCCACCCAATAGA-3，(SEQ ID NO 6)。使下述(2)所示的寡引物對退火，並將其克隆到用m^I和EcoRI消化的pmU6中， 製作pmU6-TuD-Shuttle。為了構建miRNA抑制RNA表達慢病毒載體質粒，合成下述(3)所示的一系列寡核苷酸對。將各寡引物對退火，並克隆到用BsmBI消化的pmU6-TuD-Shuttle中。 之後，如上所述，將各mU6-TuD RNA套件亞克隆到慢病毒載體質粒(pLSP)中(Haraguchi， Τ.等人.Q007)FEBS Lett，581，4949-4954)。將這些套件還插入 pSLl 180 (Pharmacia)的 BamHI-EcoRI位點，製作miRNA抑制RNA表達質粒載體。使下述( 所示的寡引物對退火， 並克隆到用BbsI和EcoRI消化的pmU6中，製作pmU6-protoshuttle。為了構建抑制RNA 表達慢病毒載體質粒，合成下述(4)所示的一系列寡核苷酸對。將寡引物對(誘騙RNA #1-12、17-21)分別退火，並克隆到用KdsI和EcoRI消化的pmU6中。將寡引物對(誘騙RNA #13-16)分別退火，並克隆到用BsmBI消化的pmU6-protoshuttle中。將寡引物對(誘騙 RNA #22-26)分別退火，並克隆到用BsmBI消化的pmU6-TuD_shuttle中。為了構建mU6_誘騙RNA #27套件，使用下述(4)所示的寡引物對作為PCR的引物和模板，將PCT產物克隆到 pCR2. 1中。將該質粒的0. 2-kb BsmBI片段克隆到用BsmBI消化的pmU6-TuD_shuttle中。 之後，如上所述，將各mU6-誘騙RNA套件亞克隆到慢病毒載體質粒(pLSP)中(Haraguchi， Τ.等人· (2007) FEBS Lett，581，4949-4954)。使用的寡核苷酸(2)用於構建本發明的RNA的穿梭載體的引物對為了構建 pmU6-I\iD-shuttle，使用有義鏈 5，-TTTGACGGCGCTAGGATCATCGGAGACGG TACCGTCTCGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO 7)和反義鏈 5，-AATTCAAAAAAGA CGGCGCTAGGATCATCGAGACGGTACCGTCTCCGATGATCCTAGCGCCGT-3，(SEQ ID NO 8)；為了構建 pmU6-protoshuttle，使用有義鏈 5，-TTTGACGGCGCTAGGATCATCGGAGACGGTACCGTCTCCGATGATC CTAGCGCCGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO 9)和反義鏈 5，-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCGG AGACGGTACCGTCTCCGATGATCCTAGCGCCGT-3』 (SEQ ID NO: 10)。(3)用於構建本發明的RNA的表達載體的引物對為了構建 TuD-miR-140-5p-4ntin，使用有義鏈 5，-CATCAACCTACCATAGGGTCATCAAA ACCACTGCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCTACCATAGGGTCATCAAAACCACTGCAAG-3，(SEQ ID NO 11)和反義鏈 5，-TCATCTTGCAGTGGTTTTGATGACCCTATGGTAGGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGC AGTGGTTTTGATGACCCTATGGTAGGTT-3，(SEQ ID 而1幻。為了構建 TuD-miR-140_3p-4ntin， 使用有義鏈 5，-CATCAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCG TGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAG-3，(SEQ ID NO 13)和反義鏈 5，-TCATCTTGTACCACAGGGAGAT TAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTT-3』 (SEQ ID N0:14)。為了構建 TuD RNA-miR140-3p-pf，使用有義鏈 5，-CATCAACTCCGTGGTTCTACCCTGT GGTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAA-3，(SEQ ID NO 15)和反義鏈 5 』 -CATCTTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGTAGAA CCACGGAGTT-3，(SEQ ID N0:16)。為了構建 TuD RNA-miR21_4ntin，使用有義鏈 5，-CATCAA CTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCMTGTGATAAGCT ACAAG-3，(SEQ ID NO 17)和反義鏈 5，-TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTGTATTC TGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3，(SEQ ID NO: 18)。為了構建 TuD RNA-miR21-pf，使用有義鏈 5，-CATCAACTCAACATCAGTCTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATA CAACTCAACATCAGTCTGATAAGCTACAAG-3' (SEQ ID NO: 19)和反義鏈 5，-TCATCTTGTAGCTTATCA GACTGATGTTGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGTT-3' (SEQ ID NO 20)。為了構建 TuD RNA-NC，使用有義鏈 5，-CATCAACAAGCCACAACGAATCTCTATATCATCAAGTATT CTGGTCACAGAATACAACAAGCCACAACGAATCTCTATATCATCAAG-3，(SEQ ID NO :21)和反義鏈 5，-T CATCTTGATGATATAGAGATTCGTTGTGGCTTGTTGTATTCTGTGACCAGMTACTTGATGATATAGAGATTCGTTGT GGCTTGTT-3，(SEQ ID NO :22)。(4)用於構建誘騙RNA表達載體的引物對為了構建誘騙 RNA #1，使用有義鏈 5，-TTTGACGGCGCTGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTACC CTGTGGTAAGGAAGCATCCAGCGCCGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO 23)和反義鏈 5，-AATTCAAAAAAGA CGGCGCTGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGATCCAAGCATCCAGCGCCGT-3，(SEQ ID NO :24)。為了構建誘騙RNA#2，使用有義鏈5，-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTAC CCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO 25)和反義鏈 5，-AATTCAAAAAA GACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT-3』 (SEQ ID NO 26)。為了構建誘騙RNA#3，使用有義鏈5，-TTTGACAGCGCTCTACGATGAAGGCTCCGTGGTTCTA CCCTGTGGTAAGGTTCATCGTAGAGCGCTGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO :27)和反義鏈 5，-AATTCAAAA AAGACAGCGCTCTACGATGAACCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCTTCATCGTAGAGCGCTGT-3』 (SEQ ID NO 28)。為了構建誘騙 RNA #4，使用有義鏈 5，-TTTGACAGCGCTCTACGATGCAAGGCTCCGTGGTTCT ACCCTGTGGTAAGGTTGCATCGTAGAGCGCTGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO 29)和反義鏈 5，-AATTCAA AMAGACAGCGCTCTACGATGCMCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCTTGCATCGTAGAGCGCTGT-3' (SEQ ID NO 30)。為了構建誘騙RNA#5，使用有義鏈5，-TTTGACAGCGCTCGCAGGATGCTTGGCTCCGTGGTTC TACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTGCGAGCGCTGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO :31)和反義鏈 5，-AATTC AMAAAGACAGCGCTCGCAGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCAAGCATCCTGCGAGCGCTGT-3』 (SEQ ID NO 32)。
為了構建誘騙RNA#6，使用有義鏈5，-TTTGACAGCGCTCAAAGCAGGATGCTTGGCTCCGTGG TTCTACCCTGTGGTMGGMGCATCCTGCTTTGAGCGCTGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO 33)和反義鏈5，-A ATTCAAAMAGACAGCGCTCAMGCAGGATGCTTCCTTACCACAGGGTAGAACCACGGAGCCAAGCATCCTGCTTTGA GCGCTGT-3，(SEQ ID NO :34)。為了構建誘騙RNA#10,使用有義鏈5，-TTTGACGGCGCTAGGATCATCTCCGTGGTTCTACCC TGTGGTAGTATTCTGGTCACAGAATACGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO 35)和反義鏈 5』 -AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCGTATTCTGTGACCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGAGAT GATCCTAGCGCCGT-3，(SEQ ID NO :36)。為了構建誘騙 RNA #11，使用有義鏈 5，-TTTGACGGCGCTAGGATCATCGTATTCTGGTCACAG AATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTATCTTCTCTAACGAGAGMGAGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3』 (SE Q ID NO: 37)和反義鏈 5，-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCTCTTCTCTCGTTAGAGAAGATACCA CAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTGACCAGAATACGATGATCCTAGCGCCGT-3』 (SEQ ID NO :3 。為了構建誘騙RNA#12,使用有義鏈5，-TTTGACGGCGCTAGGATCATCTCCGTGGTTCTACCC TGTGGTAGTATTCTGGTCACAGMTACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGATGATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3』 ( SEQ ID NO 39)和反義鏈 5，-AATTCAAAAAAGACGGCGCTAGGATCATCTACCACAGGGTAGAACCACGGAG TATTCTGTGACCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGAGATGATCCTAGCGCCGT-3' (SEQ ID NO :40)。為了構建誘騙RNA#13，使用有義鏈5，-CATCAACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAAGTAT TCTGGTCACAGAATACAACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAA-3，(SEQ ID NO :41)和反義鏈 5，-CATC TTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAG TTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTT-3，(SEQ ID NO 42)。為了構建誘騙 RNA #14，使用有義鏈 5，-CATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGAG ATCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTA-3，(SEQ ID NO 43)和反義鏈 5 』 -CATCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTCTTACCACAGGGTAGAACCACGGATCTCAGAATAC TACCACAGGGTAGAACCACGGA-3』 (SEQ ID NO :44)。為了構建誘騙RNA#15,使用有義鏈5，-CATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGTC CGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGGTCACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTACAGAATACTCCGTGGT TCTACCCTGTGGTA-3，(SEQ ID NO 45)和反義鏈 5，-CATCTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTG TACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTGACCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGAATACTACCAC AGGGTAGAACCACGGA-3，(SEQ ID NO :46)。為了構建誘騙RNA #16，使用有義鏈 5，-CATCTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGT CCGTGGTTCTACCCTGTGGTAGTATTCTGAGATCCGTGGTTCTACCCTGTGGTAAGACAGAATACTCCGTGGTTCTA CCCTGTGGTACAGAATACTCCGTGGTTCTACCCTGTGGTA-3，(SEQ ID NO 47)和反義鏈 5，-CATCTACC ACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTACCACAGGGTAGAACCACGGAGTATTCTGTCTTACCACAGGGTAGAACCA CGGATCTCAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGAATACTACCACAGGGTAGAACCACGGA-3』 (SEQ ID NO 48)。為了構建誘騙RNA#17，使用有義鏈5，-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTA ACCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO :49)和反義鏈 5，-AATTCAAAA AAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTAC CACAGGGTTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT-3' (SEQ ID NO 50)。
為了構建誘騙RNA #18，使用有義鏈 5，-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCT AATCCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO 51)和反義鏈 5，-AATTCAA AAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTT ACCACAGGGATTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT-3 』 (SEQ ID NO 52)。為了構建誘騙RNA#19，使用有義鏈5，-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTA ACTCCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO 53)和反義鏈 5，-AATTCAA AAAAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGAGTTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT-3' (SEQ ID NO 54)。為了構建誘騙RNA#20，使用有義鏈5，-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTGGATCCGTGGTTCTA ATCTCCCTGTGGTAAGGAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO 55)和反義鏈 5，-AATTCA AAMAGACGGCGCTAGGATGCTTCCTTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGATCCAAGCATCCTAGCGCCGT-3，(SE Q ID NO 56)。為了構建誘騙RNA#21，使用有義鏈5，-TTTGACGGCGCTAGGATGCTTCCATCCCAGTACACA TTTAAATCTGTGGTACCAAGCATCCTAGCGCCGTCTTTTTTG-3，(SEQ ID NO :57)和反義鏈 5，-AATTCA AMAAGACGGCGCTAGGATGCTTGGTACCACAGATTTAAATGTGTACTGGGATGGAAGCATCCTAGCGCCGT-3』 (SE Q ID NO 58)。為了構建誘騙RNA#22，使用有義鏈5，-CATCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACGTAT TCTGGTCACAGAATACCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACG-3，(SEQ ID NO :59)和反義鏈 5，-TCA TCGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGTATTCTGTGACCAGAATACGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAG -3，(SEQ ID NO 60)。為了構建誘騙RNA#23，使用有義鏈5，-CATCCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCGT ATTCTGGTCACAGAATACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCG-3，(SEQ ID NO :61)和反義鏈5，_T CATCGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTATTCTGTGACCAGMTACGGTACCACAGGGAGATTAGAACCA CGGAGG-3，(SEQ ID NO :62)。為了構建誘騙 RNA #24,使用有義鏈 5，-CATCAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACA AGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACAAG-3，(SEQ ID NO 63)和反義鏈 5 』-TCATCTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTACCACAGGGAG ATTAGAACCACGGAGTT-3，(SEQ ID NO :64)。為了構建誘騙RNA #25，使用有義鏈 5，-CATCACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTAC CCAGTATTCTGGTCACAGAATACACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCCAG-3，(SEQ ID NO 65)和反義鏈 5 』 -TCATCTGGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTGTATTCTGTGACCAGAATACTGGGTACCA CAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGT-3』 (SEQ ID NO :66)。為了構建誘騙RNA#26,使用有義鏈5，-CATCAACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTAC CCAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACCCTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGTGGTACCCMG-3，(SEQ ID NO :67) 和反義鏈 5 』 -TCATCTTGGGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGGG TACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGGGTT-3』 (SEQ ID NO :68)。為了構建誘騙RNA#27，使用有義鏈5，_CGTCTCACATCAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCTGT GGTACAAGCGACAAGMCTCCGTGGTTCTMTCTCCCTGTGGTACAAGTATTCTGAACTCCGTGGTTCTAATCTCCCT GTGGT-3，(SEQ ID NO 69)和反義鏈 5，-CGTCTCATCATCTTGTACCACAGGGAGATTAGAAC CACGGAGTTGCGACAAGTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACGGAGTTGTATTCTGTTGTACCACAGGGAGATTAGAACCACG G-3，(SEQ ID NO 70)。為了構建microRNA CMV海綿miR21表達載體質粒，使用下述( 所示的寡引物對作為PCR的引物和模板，將PCR產物克隆到pCR2. 1中。將該質粒的0. 2-kb XhoI-AgeI片段克隆到用 XhoI 和 AgeI 消化的 pLenti6/V5-GW/lacZ (Invitrogen)中，製作 pLenti6/CMV_海綿-miR21/lacZ。將 pCS2_Venus 的 0. 3_kb XbaI-ApaI 片段克隆到 pSL1180 的 XbaI-ApaI 位點中，製作 pSL1180-polyA。將 pLenti6/CMV_海綿 _miR21/lacZ 的 3. 9_kb HindIII-AgeI 片段克隆到pSL1180-polyA的HindIII-AgeI位點中，製作pSL1180-CMV海綿21。為了構建 Antagomir21 表達載體質粒(Scherr, M.等人· (2007) Nucleic Acids Res, 35 (22) :el49)， 使用下述(5)所示的寡引物對作為PCR的引物，使用pSilencer 3. I-Hl hygro (Ambion) 作為模板。將PCR產物克隆到pCR2. 1中，將該質粒的0.2-1Λ Bglll-EcoRI片段克隆到 PSL1180 的 BamHI-EcoRI 片段中，製作 pSL1180-HlAntagomir21。為了構建 miR_21Eraser 表達載體質粒(Sayed, D.等人· (2008)Mol Biol Cell, 19(8) :3272-82)，使用下述(5)所示的寡引物對作為PCR的引物，使用pmU6作為模板。用BamHI和EcoRI消化PCR產物，之後克隆到 PSL1180 的 BamHI-EcoRI 片段中，製作 pSL1180_miR-21 Eraser。為了構建螢光素酶報導基因質粒，將pGL4. 74(Promega)的0. 8-kbKpnI-HindIII 片段克隆到用KpnI和HindIII消化的pGL4. 12 (Promega)中，製作pTK4. 12。將下述(6)所示的寡核苷酸對退火，之後將其與ΡΤΚ4. 12的4. 9-kb EcoRI-XbaI片段連接，製作pTK4. 12C. P-。使下述(6)所示的寡核苷酸對退火，之後克隆到用)(bal和FseI消化的pGL4. 74中，製作 pGL4. 74-miR21T。使用的寡核苷酸(5)用於構建AntagomiR、miRNA Eraser和CMV海綿表達載體的引物對為了構建 CMV 海綿 21，使用有義鏈 5，-CTCGAGTAACTCAACATCAGGACATAAGCTAAGTCT CAACATCAGGACATAAGCTATCAGTCAACATCAGGACATAAGCTACTGATCAACATCAGGACATAAGCTA-3' (SEQ ID NO 71)和反義鏈 5，-ACCGGTTAGCTTATGTCCTGATGTTGACCGATAGCTTATGTCCTGATGTTGACAGT TAGCTTATGTCCTGATGTTGAGTTCTAGCTTATGTCCTGATGTTGATCAG-3，(SEQ ID NO :7 。為了構建 AntagomiR21，使用正向引物 5，-AGATCTAATTCATATTTGCATGTCGCT-3，(SEQ ID NO 73)禾口反向引物 5，-GAATTCAAAAAATAGCTTATGTCCTGATGTTGAGGATC CGAGTGGTCTCATACAGAACTTATA-3，(SEQ ID N0:74)。為了構建 miR-21 Eraser，使用正向引物 5，-CGGGATCCATCCGACGCCGCC ATCTCTA-3，(SEQ ID NO :133)和反向引物 5，-GGAATTCAAAAAA TAGCTTATCAGACTGATGTTGAT AGCTTATCAGACTGATGTTGAAAACAAGGCTTTTCTCCAA-3』 (SEQ ID NO :134)。(6)用於構建螢光素酶報導基因載體的引物對為了構建pTK4. 12C. P-的插入片段，使用有義鏈 5『 -AATTAATAATGACTCGAGT-3『 (SEQ ID NO 75)和反義鏈 5，-CTAGACTCGAGTCATTATT-3，(SEQ ID NO 76)。為了構建 pGL4. 74_miR21T，使用有義鏈 5，-AATTCTCAACATCAGTCTGATAAGCTAC-3，(SEQ ID NO 77)和反義鏈 5，-TCGAGTAGGCTTATCAGACTGATGTTGAG-3，(SEQ ID NO :78)。1. 2細胞培養和穩定細胞株的建立將HeLaS3 細胞(Puck 等人.，J. Exp. Med. 103 :273-284 (1956))、PA-1 細胞 (Giovanella，BC 等人.，In Vitro Cell Dev. Biol. , 10 :382,1974,10 382 ；Giovanella,BC.等人·，J Natl Cancer Inst, 1974,52 :921-30)、HCT_116 細胞(Cancer Res 1981 ；41 1751 J Nat Cancer Inst 1982 ；69 :767)、SW480 細胞(Leibovitz 等人·，Cancer Res. 36 4562-4569(1976))> HT29 MIfi (Fogh & Trempe in Human Tumor Cells in Vitro(ed. Fogh J.) ,Plenum Press,New York，1975，第 115-159 頁)、TIG_3/E/TERT 細胞(Akagi T 等人·，Proc Natl Acad Sci U S A, 100,13567-13572. (2003))和 3Y1 細胞(Ushijima T 等人.，Jpn. J. Cancer Res. 85 :455-458,1994 ；Kimura G 等人.，Int. J. Cancer, 15 :694-706, 1975)在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中、於37°C下培養。將HeLaS3細胞以1 X IO5 細胞/孔接種在6孔板中二4小時後，在8μ g/ml的凝聚胺(polybrene)的存在下分別導入 pMXs-GIN、pMXs-GIN-miR140-5pT 和 pMXs-GIN-miR140_3pT 病毒保存株(viral stocks) (< 1\1041^)，從轉導的對小時後起通過6418(11^/1111)來選擇。在兩周的選擇後，從培養基中除去G418。將保有miR-140-5p報導基因或miR-140_3p報導基因的HeLaS3細胞以IX IO5細胞/孔接種在6孔板中，M小時後，在8μ g/ml的凝聚胺的存在下導入 pSSCH-miR140-5p/140-3p病毒保存株(< 1 X IO4TU)，從轉導的M小時後起通過潮黴素 (0. 5mg/ml)來選擇。在兩周的選擇後從培養基中除去潮黴素。1. 3病毒導入和FACS分析將保有miR-140_5p報導基因和miR140-5p/140-3p載體兩者的HeLaS3細胞、以及保有miR-140-3p報導基因和miR140-5p/140-3p載體兩者的HeLaS3細胞在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中以1 X IO5細胞/孔接種在6孔板上，24小時後，在8 μ g/ml的凝聚胺的存在下導入各miRNA抑制RNA表達病毒保存株O X IO5TU)或各誘騙RNA表達病毒保存株 (2X IO5TU)。並且在M小時後將培養基換成含有10%胎牛血清(FBS)和嘌呤黴素(1 μ g/ ml)的DMEM。在7天的選擇後，從培養基中除去嘌呤黴素。使用FACS Calibur(BD)測定 GFP表達水平。1. 4RNA 分離、miR-qRT-PCR使用mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion)，由保有miR-140_5p報導基因和 miR140-5p/140-3p載體兩者、且導入有miRNA抑制RNA表達慢病毒載體的HeLaS3細胞和導入有miRNA抑制RNA表達載體的HCT-116細胞製備總RNA。通過使用miRNA特異性環式 RT引物和TaqMan探針的miR-qRT_PCR，按照製造商的推薦確定成熟miRNA的表達(Applied Biosystems, Foster City，USA)。使用U6 snRNA作為內部對照。使用7300實時PCR系統 (Applied Biosystems)，按照一式三份進行 PCR。1.5螢光素酶分析在導入的前1天，將PA-I細胞、HCT-116細胞、SW480細胞、HT29細胞、TIG-3/E/ TERT細胞和3Y1細胞在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中分別以1. 5X IO5細胞/孔、 1.7X IO5 細胞 / 孔、3. 5X IO5 細胞 / 孔、3. OX IO5 細胞 / 孔、7. OX IO4 細胞 / 孔和 1.2X105 細胞/孔接種在M孔板上，按照一式三份轉染脂質轉染胺2000 (Invitrogen)和IOng的 pTK4. 12C. P-(螢火蟲螢光素酶質粒)、100ng的IUuc靶報導基因質粒、以及500ng的miRNA 抑制RNA表達質粒。以50nM共轉染鎖定核酸(LNA/DNA)反義寡核苷酸。LNA/DNA反義寡核苷酸由ThermoELECTRON公司合成，在8個連續地位於中央的核苷酸中包含鎖定核酸 (Naguibneva, I.等人.Q006) Biomed Pharmacother，60，633-638)。LNA/DNA 反義寡核苷酸具有下述(7)所示的序列。所有測定均在轉染的48小時後通過雙螢光素酶測定(!Iomega)並使用GLOMAX (!Iomega)來實施。使用的寡核苷酸(7) LNA/DNA 反義寡序列為了 構津 LNA-miR21,使用 5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3 』 (SEQ ID NO :79)。為了構津 LNA-NC,使用 5，-CATTAATGTCGGACAACTCAAT-3，(SEQ ID NO :80)。LNA 以下劃線顯不。1.6蛋白質印跡使用1. 5XSDS緩衝液從細胞中提取總蛋白，再使用Bio-Rad蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白提取物用10% SDS-PAGE分離後轉移到PVDF-膜(Milipore)上。通過將膜和抗PDCD4(ab51495，Abeam)抗體以及抗肌動蛋白(612656，BD轉導)抗體在室溫下培育1 小時，來實施免疫印跡。用含有Tween 20的磷酸緩衝鹽清洗3次，之後將膜與結合有辣根過氧化物酶的二次抗體在室溫下培育1小時。使用ECL試劑(Amersham)檢測信號。1. 7細胞增殖測定和凋亡活性的測定在含有10%胎牛血清(FBQ的DMEM中，將PA-I細胞以IX IO4細胞/孔接種在 48孔板上，24小時後，在8 μ g/ml的凝聚胺的存在下分別導入TuD-miR21_4ntin和TuD-NC 表達慢病毒保存株(IX IO5TU),在轉導的M小時後交換培養基。通過在臨轉導前和自轉導起M、48、72、96小時後利用CellTiter-GloTMO^romega)並使用GL0MAX 測定細胞的代謝活性，來實施細胞增殖的測定。在含有10%胎牛血清(FBQ的DMEM中，將PA-I細胞以3X IO3細胞/孔接種在48 孔板上，18小時後，在8 μ g/ml的凝聚胺的存在下分別導入TuD-miR21-4ntin和TuD-NC表達慢病毒保存株(3xl04TU)，在轉導的對小時後交換培養基。並且，在轉導的72小時後，利用Caspase-Glo 3/7 (Promega)並使用GL0MAX 實施胱天蛋白酶3和7的活性的測定。1.8 RNA 印跡自載體導入起14天後，從非感染HeLaS3細胞或表達TuD-miR-140-3p-4ntin、 TuD-miR-140-5p-4ntin的HeLaS3細胞中分離、回收核組分、細胞質組分。細胞使用14枚 IOcm的培養皿。用冷PBS清洗培養皿2次，再向培養皿中加入2ml的冷PBS，用刮棒回收細胞，以1500rpm的轉速在4°C下離心5分鐘。將細胞沉澱懸浮於NP40裂解緩衝液(IOmM Tris-HCl (pH7. 4) UOmM NaCl、3mM MgCl2^O. 5% Nonidet P_40)中，在冰上靜置 10 分鐘後， 以1500rpm的轉速在4°C下離心5分鐘。回收作為細胞質組分的上清，通過ISOGEN(Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)回收細胞質 RNA。另外，用 4ml 的 NP40 裂解緩衝液清洗作為核組分的沉澱兩次。使用mirVana miRNA分離試劑盒(Ambion，Austin，TX)， 從細胞質RNA和作為核組分的沉澱中只純化小於200bp的RNA。為了將原始的細胞的數目一致進行比較，將5%相當量的回收的RNA用於RNA印跡分析。使用18%變性丙烯醯胺凝膠分離小RNA。此時，在80°C的培養箱內進行電泳。之後，轉移到 Hybond-XL 膜(Amersham Biosciences)上，通過 60mJ/cm2 UV 進行交聯。使用 T4多核苷酸激酶(TAKARA)，用[γ -32PlATP標記DNA探針的5，端。使用Ultrahyb-Oligo 緩衝液(Ambion)，在37°C下進行雜交。膜用2XSSC，0. 5 % SDS緩衝液清洗。使用 FLA-5100(FUJIFILM)測定RI信號。另外，使用0. 5% SDS水溶液進行脫探針。使用的寡核苷酸
(8)用於RNA印跡的DNA探針的序列作為miRNA 抑制 RNA 檢測探針，使用 5，-GTTGATGATCCTAGCGCCGTC-3，(SEQ ID NO 135)。作為 miR-21 檢測探針，使用 5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3，(SEQ ID NO :136)。 作為 Y4 scRNA 檢測探針，使用 5，-GCAGTGGGGGGTTGTATACCAAC-3，(SEQ ID NO :137)。作為 ACAl snoRNA 檢測探針，使用 5，-GTGATGGAAGCATAACCTGTCTC-3，(SEQ ID NO :138)。[實施例2]用於檢測miR-140_3p活性的高靈敏度測定系統使用僅內源性地微量表達miR-140-3p 和 miR-140_5p 的 HeLaS3 (Landgraf，P.等人· (2007) Cell，129，1401-1414)，構建miR-140_3p活性的極高靈敏度的測定系統。為此， 構建在緊挨著GFP基因的下遊插入有與成熟miR-140-3p完全互補的21bp的基於逆轉錄病毒的GFP報導基因(miR-140-3p報導基因)(圖15A)。將它們導入HeLaS3細胞中，建立穩定表達GFP的混合細胞群體。接下來，構建通過Pol II啟動子驅動RNA的逆轉錄病毒載體(miR140-5p/140-3p 載體)，所述RNA包含內含miR140-5p和miR140-3p兩者的pre-miRNA全體(圖15C)。將其導入攜帶miR-140-3p報導基因的HeLaS3細胞中，建立混合細胞群體。與攜帶miR-140_3p 報導基因的非導入的HeLaS3細胞相比，GFP的表達水平不足20% (圖16A、B和C)。[實施例3]原型誘騙RNA的設計和有效性作為誘騙RNA的原型，設計被期待露出與成熟miR-140-3p的RNA序列完全互補的 RNA序列的、具有單純的二次結構的誘騙RNA。這些原型誘騙RNA(圖1A)形成莖環結構，其環由與成熟miR-140-3p完全互補的MBS和位於其兩端的3個核苷酸的接頭構成。為了使這些誘騙RNA在細胞內穩定表達，選擇使用擔載短RNA表達用套件的慢病毒載體，該短RNA 表達用套件由存在於整合後的兩LTR中的聚合酶III啟動子(mU6)驅動(圖15D)。由於通過RNA聚合酶III得到的RNA轉錄產物被設計成以UU(或UUUU)結束，所以RNA誘騙被期待在莖中具有2( 4)個核苷酸的3』 -突出末端(圖1A)。認為合成的誘騙RNA從細胞核輸送到細胞質中，因此對對應的包含作為miRNA的 miR-140-3p的RISC發揮作用。關於具有莖_環結構的小RNA的核輸送，迄今為止人們詳細進行了研究，結果顯示莖長對通過Exp-5進行的核外移送的效率很重要(Zeng，Y.和 Cullen, B. R. (2004) Nucleic Acids Res，32，4776-4785)。研究顯示若莖序列的長度短於16bp，則髮夾RNA與Exp-5的結合活性急劇下降，所以使原型RNA誘騙的莖長在17bp 24bp內變化(誘騙#1 #6，圖1B)。使用以噬菌體基因Cre重組酶的編碼區作為靶的 shRNA(shCre)作為誘騙RNA載體的陰性對照(NC)。具有18bp的莖的原型RNA誘騙顯示出較其他RNA誘騙略高的抑制效果，而且超過20bp的dsRNA在細胞質中能夠成為被切酶切斷的潛在性靶，所以在之後的所有試驗中使用18bp的莖長。[實施例4]原型誘騙RNA的二次結構和由MBS的改變產生的抑制力的最優化為了提高抑制效力，將誘騙RNA設計成具有較原型更複雜的二次結構(圖2A)，將其表達套件插入慢病毒載體中，再導入與圖IB中使用的細胞相同的測定細胞中。這裡，試驗的這些RNA (誘騙#10 #16、圖2A)的效率較原型誘騙RNA (誘騙RNA #2)高(圖2AB)。重要的是，在誘騙RNA #12的MBS的兩端插入3個核苷酸的接頭序列時(誘騙RNA #13)，GFP的表達顯示出幾乎完全的回覆，由誘騙#13的導入產生的GFP水平與只攜帶miR-140-3p報導基因的HeLa S3的GFP水平達到同一水平(99.5%)(圖2B)。該回復顯示出由miR-140_5p/miR-140-3p載體供給的miR-140_3p活性被完全抵消。接下來，為了達成更有效率的誘騙活性，篩選用於MBS的幾個序列。有報導稱哺乳動物中，在自完全互補的MBS的3』末端起第8位的核苷酸與第9位的核苷酸之間包含4 個多餘的核苷酸的MBS中，通過RNA切斷也會引起翻譯的弱化(attenuation) (Kiriakidou, Μ.等人· (2004)Genes Dev，18，1165-1178 ；Vermeulen, Α.等人· (2007) RNA，13 :723-730)。 因此，包含4個多餘的核苷酸的MBS會避免誘騙RNA分子自身的切斷，因此與完全互補的 MBS (MBS-pf)相比，其有可能更有效率地抑制miRNA的功能。為了篩選對抑制有效率的MBS， 通過在RISC中的Ago2蛋白切斷靶mRNA的位點即自完全互補的MBS的3』末端起第10位核苷酸與第11位核苷酸之間插入1 4個核苷酸的多餘的序列，改變原型誘騙(圖1A)。 通過研究這些誘騙的效果，發現具有4個核苷酸的插入的MBS (MBS-4ntin)在所研究的誘騙中顯示出最大的GFP表達的回覆(52% )(圖3)。通過在原型誘騙的MBS與莖之間插入接頭，也可以明顯改善抑制效果(圖2B、比較誘騙RNA#12和#13)，所以使用MBS被取代成MBSIntin的誘騙#12型RNA，小心翼翼地改變接頭長度至1 5個核苷酸。1 3個核苷酸的插入會帶來高的抑制效果，4個核苷酸或 5個核苷酸的插入雖然帶來的抑制效果較其低，但也顯示出中等程度的活性(圖4)。於是， 在以後的分析中，MBS與莖RNA之間的接頭長度為3個核苷酸。通過綜合上述結果，嘗試著提高圖2所示的誘騙#16的抑制效果。在莖序列與MBS 之間插入3個核苷酸的接頭，再將MBS-pf取代成MBSIntin，從而生成誘騙#27。誘騙#27 大有改善(由55. 2%變為80. 1%、圖2和5)。另一方面，根據相同原理對誘騙#13進行結構改變，製作誘騙#24，但其抑制能力並沒有提高。這可能是由於誘騙#24的誘騙活性已經基本飽和，完全抵消了外來導入的miR-140-3p活性的緣故。暫定的結論為由於具有誘騙#13和#24的結構的誘騙RNA(圖6A)非常有效率地抑制miRNA的功能，所以非常有用。該誘騙RNA包含2個MBS，這2個MBS與2個莖結構相鄰。例如，2個MBS分別夾在該2個莖結構中，各MBS的核酸鏈的方向相反。2個莖結構可以是2條鏈，也可以是4條鏈。如圖6B所示，用於該RNA的表達套件可以容易地構建。 由此判明具有包含2個MBS、且這2個MBS被夾在2個莖結構中的結構的誘騙RNA (Tough Decoy ；稱作TuD)帶來特別強的miRNA抑制效果。[實施例5]本發明的RNA複合體的抑制效果的通用性、特異性和持續期間為了研究本發明的RNA複合體的抑制效果的通用性和特異性，構建只將miR-140-3p報導基因的插入序列取代成與miR-140_5p完全互補的序列的、用於 miR-140-5p的報導基因細胞系統(圖15(B))。使用這兩個報導基因細胞系統，確定MBS中包含4個核苷酸的多餘的核苷酸的TuD-miR-140-3p(TuD-miR-140-3p-4ntin)(誘騙#24) 或TuD-miR-140-5p-4ntin (圖18)中任一者的抑制效果。在miR-140_3p報導基因系統中， TuD-miR-140-3p-4ntin的導入顯示出GFP表達的完全恢復，但在iTuD miR-140_5p-4ntin的表達中沒有顯示出效果(圖7A)。在miR-140-5p報導基因系統中，TuD miR-140_5p-4ntin 載體的導入顯示出GFP表達的完全恢復，但通過TuD-miR-140-3p-4ntin載體的導入，對該報導基因沒有顯示出效果(圖7B)。這些結果提示這些RNA的抑制效果對於其靶miRNA是高度有效率且特異性的，本發明的RNA複合體對各種miRNA具有高的特異性，可以使用。基於慢病毒的載體的重要優點之一在於能夠長期維持誘騙RNA的表達。於是，將TuD-miR-140-3p-4ntin 載體導入攜帶 miR-140_3p 報導基因和 miR140-5p/140_3p 載體兩者的HeLaS3細胞中，用超過一個月的時間監測GFP表達水平的經時性變化(圖7C)。由這些結果可知在HeLaS3細胞中TuD-miR-140_3p-4ntin有效率地抑制作為靶的miR-140_3p 超過一個月，而在TuD-miR-140-5p-4ntin中則維持一切均未被抑制的狀態。接下來，利用定量的實時RT-PCR直接研究miR-140_5p水平。只要通過該方法進行檢測，TuD-miR-140-5p-4ntin就使miR-140_5p的表觀上的表達水平減少約65%，但在 TuD-miR-140-3p-4ntin中沒有減少(圖7D)。由該結果可知游離的miR-140_5p的量減少至約1/3，但在RNA誘騙與成熟miRNA之間形成的dsRNA，例如即使是製備RNA後，利用實時 PCR檢測成熟miRNA時仍然有可能過於穩定。研究在表達TuD-miR-140-3p-4ntin 或 TuD-miR-140_5p-4ntin 的 HeLaS3 細胞中表達的 RNA 的胞內定位。自 I\iD-miR-140-3p-4ntin 載體或 I\iD-miR-140-5p-4ntin 載體的導入起14天後，分別製備細胞的核組分RNA和細胞質組分RNA，在高溫下進行PAGE，以使分子內、分子間結合達到最小，通過RNA印跡進行分析。利用抗所表達的miRNA抑制RNA 的探針，在120nt的譜帶和90nt附近觀察到寬的譜帶(圖7E)。在室溫下進行PAGE，通過 RNA印跡分析相同的RNA樣品時，該寬的譜帶變得更強，所以這是分子內結合的全長RNA。 TuD-miR-140-3p-4ntin和TuD-miR-140_5p-4ntin主要存在於細胞質中，核內只存在微量的TuD-miR-140-5p-4ntin。由此確認所轉錄的RNA被有效率地輸送到核外。結果還顯示 雖然MBS序列對RNA的核外輸送效率有一定程度的影響，但其影響是輕微的。[實施例6]本發明的RNA複合體對內源性miRNA的抑制效果為了確認本發明的RNA複合體的抑制功能具有通用性，接下來，使用可以與現有的合成miRNA抑制劑進行比較的、不同的靶miRNA(內源性miR-21)和不同的測定系統進行若干實驗。利用與TuD-miR-140-3p-4ntin和I\iD-miR-140_3p-pf相同的原理，構建2個 I\iD-miR21、分別為 TuD-miR-21-4ntin 和 TuD_miR21-pf (圖 18)。接下來，為了調查 PA-1 細胞中的內源性miR-21活性的抑制，將表達TuD-miR-21-4ntin或TuD-miR-21-pf (圖18) 的基於DNA的載體和3，-UTR中具有或不具有與成熟miR-21完全互補的2Ibp DNA序列的插入的Renilla Iuciferase報導基因以及作為轉染的對照的對照螢火蟲螢光素酶報導基因(圖17 (A-C)) —同一過性地轉染到PA-I細胞中。與轉染了表達陰性對照的基於DNA的載體(TuD-NC)的細胞的表達相比，表達TuD-miR21-4ntin的細胞集團使miR21報導基因的表達、即根據螢火蟲螢光素酶活性校正的Renilla Iuciferase活性上升約25倍(圖8A)。 TuD-miR-21-pf雖然顯示出更低的抑制效果，但仍帶來相當於約14倍的活性的依然顯著的恢復。重要的是，恢復的報導基因活性的水平與不具有miR-21靶序列的對照報導基因的活性水平相近。如期待的那樣，該對照報導基因的活性與導入的誘騙RNA獨立，幾乎恆定。接下來，如實施例1之段1. 5所述，將一過性轉染的生成本發明的RNA複合體的表達載體的抑制效果與LNA/DNA反義寡核苷酸的抑制效果進行比較(圖8A)。與轉染了用作陰性對照的LNA/DNA-NC的PA-I細胞的轉染相比，通過鎖定核酸(LNA/DNA)反義寡核苷酸 (LNA-miR21)進行的PA-I細胞的轉染使miR21靶報導基因的表達上升2倍。這些結果顯示與這些現有的合成試劑相比，在上述轉染條件下，本發明的RNA複合體具有高得多的抑制miRNA的能力。將用於測定的細胞株由上述使用的PA-I換成HCT-116，如實施例1之段1. 5所述，進行表達本發明的RNA複合體的質粒載體與CMV海綿表達質粒載體、Hl-Antagomir表達質粒載體、miRNAEraser表達質粒載體、以及LNA/DNA反義寡核苷酸的miRNA抑制效果的比較 (圖9)。其結果，與其他方法相比，本發明的RNA複合體顯示出極高的效果。接下來，將用於測定的細胞株由PA-I換成HCT-116，以進行類似的實驗。有報導稱=HCT-116的內源性miR-21較PA-1的內源性miR-21高。除TuD-miR-21-pf的抑制效果急劇降低以外，整體結果非常類似(圖8B)。這些結果也許表明通過大量內源性miR-21極有效率地切斷TuD-miR-21-pf分子，與TuD-miR-21_4ntin的濃度相比，該誘騙的物理濃度顯著降低。在轉染了miRNA 抑制 RNA(TuD-miR-21_4ntin 和 TuD-miR-21-pf)的表達載體的 PA-I 細胞、HCT-116 細胞中，通過 RNA 印跡分別分析 TuD-miR-21_4ntin 和 TuD-miR-21-pf 的表達水平。在PA-I細胞中，TuD-miR-21-4ntin、TuD-miR-21-pf均強烈表達(圖10A)。 在HCT-116細胞中，雖然TuD-miR-21-4ntin強烈表達，但與其相比，TuD-miR-21-pf只見到弱的表達(圖10B)。該現象與上述假說完全一致即在miR-21濃度高的條件下， TuD-miR-21-4ntin對miRNA的分解穩定；而TuD-miR-21-pf容易接受分解。利用定量的實時RT-PCR研究miR-21水平。其結果，TuD-miR-21_4ntin和 TuD-miR-21-pf使miR-21的表觀上的表達水平大幅減少(圖8D)。但是，在通過RNA印跡研究miR-21水平的結果中，pre-miR-21、成熟-miR-21均未見減少(圖8E)。作為該結果的說明，認為雖然miR-21的實際的量沒有減少，但由於miR-21與TuD-miR-21強力結合，所以抑制了利用RT-PCR進行的檢測。這種現象也被其他研究小組指出。研究在HCT-116細胞中miR-21抑制效果中的TuD-miR-21_4ntin表達質粒的量依賴性。雖然圖8A、B和9的實驗在M孔板中以500ng/孔進行，但在研究量依賴性時，在 300ng/孔時效果飽和，即使IOng/孔也觀察到其1/3左右的miRNA抑制效果(圖19)。本發明的RNA在大腸癌細胞(SW480，HD9)、無限增殖的人肺胚性成纖維細胞 (TIG-3/E/TERT)和大鼠成纖維細胞(3Y1)中也顯示出高的miRNA抑制效果(圖20)。為了直接監測miR21對作為內源性靶的PD⑶4蛋白的效果，將一系列的miRNA抑制RNA表達載體分別轉染到PA-I細胞中，回收總蛋白，通過蛋白質印跡研究PDCD4的表達水平(圖 8C)。PDCD4 的表達因 TuD-miR21-4ntin 或 TuD_miR21-pf 而上升，TuD-NC 未顯示出效果。該結果顯示本發明的RNA複合體可以特異性地抑制內源性miRNA的功能。在PA-I細胞株中，通過上述miRNA抑制RNA抑制miRNA的功能，研究是否誘導生物活性。將表達TuD-miR21-4ntin和TuD-NC的慢病毒載體以MOI 10導入PA-I細胞中，測定細胞增殖活性(圖11A)。導入有TuD-NC的細胞4天增殖至5倍以上，而導入有TuD-miR21-4ntin的細胞只增殖至1. 6倍左右。並且，進行同樣的培養，測定胱天蛋白酶3和7的活性，對凋亡進行評價(圖11B)。與導入有TuD-NC的細胞相比，導入有 TuD-miR21-4ntin的細胞上升至3倍左右。這提示在導入有TuD-miR21_4ntin的細胞中凋亡誘導也許是細胞增殖程度低的一個原因。以上結果顯示本發明的RNA充分抑制miRNA 的功能，由此抑制miR-21的增殖刺激活性、凋亡抑制活性(Corsten, M. F.，(2007) Cancer Res.67,8994-9000)。認為在miRNA中存在seed序列相同、並具有共通的靶基因的miRNA家族。於是， 為了研究本發明的miRNA抑制RNA對靶miRNA的家族是否也具有抑制效果，以miRNA_15a、15b、16、195、似4、497家族為靶進行實驗。構建將miR-21螢光素酶報導基因的插入序列取代成與miR-16完全互補的序列的miR-16的螢光素酶報導基因載體(圖17D)。使用通過 miRNA 微陣列觀察到 miRNA-15a、15b、16 表達、而 miRNA_195、424、497 未表達的 HCT-116 細胞(圖21)。如圖12A所示，miRNA-16、195的同源性高，而miRNA_16、497的同源性除seed 位點以外低。於是，構建 TuD-miR-16-4ntin、TuD-miR-195-4ntin 和 TuD-miR497_4ntin (圖 18、12B)。在該條件下miRNA-195、497未表達，所以可以觀測I\iD-miR-1954ntin和 TuD-miR497-4ntin對miRNA_15a、15b、16的抑制效果。進行螢光素酶分析時，與轉染7 TuD-NC的細胞集團的表達相比，表達TuD-miR16-4ntin、TuD-miR-195-4ntin和 TuD-miR497-4ntin的細胞集團使miR16報導基因的表達、即根據螢火蟲螢光素酶活性校正的Renilla Iuciferase活性分別上升3. 1倍、5. 2倍、2. 6倍(圖12C)。特別是通過 TuD-miR-16-4ntin和TuD-miR-195_4ntin恢復的報導基因活性的水平與不具有miR-16靶序列的對照報導基因的活性為同一水平。另外，對照報導基因的活性並不依賴於導入的 miRNA抑制RNA，幾乎恆定。通過該實驗確認本發明的RNA的抑制效果不僅針對靶miRNA， 還針對其家族。此外，結果顯示對同源性高的家族的抑制效果較對同源性低的家族的抑制效果高，即使同源性低，也具有抑制效果。[實施例7]由合成寡核苷酸介導的miRNA抑制使用寡核苷酸製造本發明的RNA複合體，研究其對內源性miRNA的抑制效果。細胞培養將HCT-116細胞(CancerRes 1981 ；41 :1751 J Nat Cancer Inst 1982 ；69 :767) 在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中、於37°C下培養。螢光素酶測定在導入的前1天，將HCT-116細胞在含有10 %胎牛血清(FBQ的DMEM中以 1. 0 X IO5細胞/孔接種在M孔板上，按照一式三份轉染脂質轉染胺2000 (Invitrogen)和 IOng的pTK4. 12C. P-(螢火蟲螢光素酶質粒；內部對照)、IOOng的pGL4. 74_miR21T (Rluc靶報導基因質粒)、或不具有靶序列的pGL4. 74和1、3、10、50、200ηΜ的2，-0_甲基-TuD-RNA寡核苷酸、以及2』 -0-甲基-RNA反義寡核苷酸.LNA/DNA反義寡核苷酸·ΡΝΑ反義寡核苷酸。 LNA/DNA反義寡核苷酸由ThermoELECTRON公司合成，在8個連續位於中央的核苷酸中包含鎖定核酸(Naguibneva, I.等人.(2006) Biomed Pharmacother，60，633-638)。TuD_2，-0-甲基-RNA寡核苷酸、2』-0-甲基-RNA反義寡核苷酸、LNA/DNA反義寡核苷酸、PNA反義寡核苷酸具有下述(1)所示的序列。miRIDIAN抑制劑是從Thermo scientific Dharmacon公司購入的合成寡核苷酸。所有測定均在轉染的48小時後通過雙螢光素酶測定(!Iomega)並使用 GLOMAX (Promega)來實施。使用的寡核苷酸(1)2' -0-甲基反義寡和LNA/DNA反義寡的序列為了構建 2，-0-甲基-TuD-miR21，將混合 5，-GACGGCGCUAGGAUCAUCAACUCAACAUCA ⑶CAAU⑶GAUAAGCUACAAGUAUUCUGGU-3，(SEQ ID NO 148)和5，-ACCAGAAUACAACUCAACAUCA⑶ CAAU⑶GAUAAGCUACAAGAUGAUCCUAGCGCC⑶C-3，(SEQ ID NO :149)得到的混合物退火後使用。 所有核苷酸均被2』 -0-甲基化。為了構建 2，-0-甲基-miR21，使用 5，-⑶CAACAUCA⑶CUGAUAAGCUA-3，(SEQ ID NO 150)。為了構建 2，-0-甲基-NC，使用 5，-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3，(SEQ ID NO :151)。 所有核苷酸均被2』 -0-甲基化。為了 構津 LNA-miR21,使用 5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3 』 (SEQ ID NO :79)。為了構津 LNA-NC,使用 5，-CATTAATGTCGGACAACTCAAT-3，(SEQ ID NO :80)。進行了 LNA 修飾的序列以下劃線顯示。為了 構津 PNA-miR21,使用 5，-RRRQRRKKR-QQ-ATTAATGTCGGACAA-3 』 (SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO :153)。為了構津 PNA-NC,使用 5，-RRRQRRKKR-00-TCAACATCAGTCTGA-3，(S EQ ID NO :152, SEQ ID NO :154)。所有核苷酸均為 PNA。細胞穿透肽(cell penetrating peptide)和AEEA接頭(AEEA :8_氨基_3，6_ 二氧雜辛酸)以下劃線顯示。MM為了研究2』 -0-甲基-TuD-RNA寡核苷酸的抑制功能，將各種反義寡和在3』 -UTR 中具有或不具有與成熟miR-21完全互補的21bp DNA序列的插入的Renilla Iuciferase報導基因和作為轉染的內部對照的螢火蟲螢光素酶報導基因PTK4. 12C. P-—同一過性地轉染到HCT-116細胞中(圖22)。與轉染了 2』-0-甲基-NC的細胞的表達相比，轉染了 2』-0-甲基-TuD-miR21的細胞集團在1ηΜ、3ηΜ、10nM、50nM、200nM的濃度下使miR21報導基因的表達、即以螢火蟲螢光素酶活性校準的Renilla Iuciferase活性分別上升約21倍、約43倍、 約 51 倍、約 58 倍、約 69 倍(圖 22、23)。而 2，-0-甲基 _miR21、LNA_miR21、PNA_miR21 在 200nM下使miR21報導基因的表達分別上升約6倍、約2倍、約11倍左右。另外，在0. InM, 0. 3nM、lnM、3nM的濃度下比較2，-0_甲基-jTuD-RNA寡核苷酸和miRIDIAN抑制劑的miR-21 抑制效果時，在各濃度下2』-0_甲基-TuD-miR21顯示出約3. 0倍、約9. 1倍、約28. 9倍、約 45. 9倍左右的上升，而miRIDIAN抑制劑_miR21顯示出約2. 5倍、約5. 2倍、約11. 6倍、約 20. 1倍左右的上升(圖M)。另一方面，不具有靶序列的Renilla Iuciferase報導基因的活性在低濃度下與導入的反義寡獨立，幾乎恆定。這些結果顯示與現有的合成試劑相比， 在上述轉染條件下，2』 -0-甲基-TuD-miR21具有高得多的抑制miRNA的能力。[實施例8]使用其他啟動子的miRNA抑制質粒構建使用下述⑵所示的引物，由人基因組DNA進行PCR，之後克隆到pCR2. 1中， 製作 ph7SK-protoshuttle(圖 27(A))。用 KpnI-HindIII 消化 ph7SK-protoshuttle, 使下述⑵所示的寡核苷酸退火併進行克隆，製作ph7SK-TUD-shUttle。將下述(3) 所示的各寡引物對退火，之後將其克隆到用BsmBI消化的ph7SK-TuD-Shuttle中，製作 ph7SK-TuD-miR21-4ntin。之後，將 ph7SK-TuD-miR21_4ntin 的 BamHI-EcoRI 片段插入pSLl 180 (Pharmacia)的BamHI-EcoRI位點中，製作miRNA抑制RNA表達質粒載體 pSL1180-TuD-miR21-4ntin。使用的寡核苷酸(2)用於構建本發明的RNA的穿梭載體的引物對為了構建ph7SK-protoshuttle，使用正向引物 5，-GGATCCTGCAGTATTTAGCATGCCC CA-3，(SEQ ID NO 155)和反向引物 5，-GAATTCAAAAAAGGATGTGAGGGCGTCATCGAGACGGTACC GTCTCCGATGACGCCCTCACATCCGAGGTACCCAGGCGGCGCACAAGC-3，(SEQ ID NO :156)；為了構建 ph7SK-TuD-shuttle，使用有義鏈 5，-CTCGGATGTGAGGGCGTCATCGGAGACGACACCATCCACAGCCAGCGTCTCGATGACGCCCTCACATCCTTTTTTGAATTCA-3，(SEQ ID NO :157)和反義鏈 5，-AGCTTGAATTC AMAAAGGATGTGAGGGCGTCATCGAGACGCTGGCTGTGGATGGTGTCGTCTCCGATGACGCCCTCACATCCGAGGTA C-3， (SEQ ID NO :158)。(3)用於構建本發明的RNA的表達載體的引物對為了構建TuD RNA-miR21-4ntin,使用有義鏈5，-CATCAACTCAACATCAGTCAATGTGATA AGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCMCATCAGTCAATGTGATAAGCTACMG-3，(SEQ ID NO :17) 和反義鏈 5 』 -TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTAGCTT ATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3』 (SEQ ID NO :18)。MMmU6啟動子和h7SK啟動子的抑制效果的比較為了進行mU6啟動子和h7SK啟動子的抑制效果的比較，將miRNA抑制RNA表達質粒載體和在3』 -UTR中具有或不具有與成熟miR-21完全互補的21bp DNA序列的插入的 Renilla Iuciferase報導基因(分別為pGL4. 74_miR21T和pGL4. 74)和作為轉染的內部對照的螢火蟲螢光素酶報導基因(PTK4. 12C.P-) —同一過性地轉染到HCT-116細胞中。轉染了 mU6啟動子-TuD-miR21的細胞集團使miR21報導基因的表達、即根據螢火蟲螢光素酶活性校正的Renilla Iuciferase活性較轉染了 mU6啟動子-TuD-NC的細胞的表達上升約59 倍(圖27 (B))。另一方面，h7SK啟動子-TuD-miR21較轉染了 h7SK啟動子-TuD-NC的細胞的表達也上升約77倍。這些結果顯示在上述轉染的條件下，h7SK啟動子具有高的能力。[實施例9]高次結構的效果質粒構建將下述⑷所示的各寡引物對退火，之後將其克隆到用BsmBI it 的 pmU6 — TuD — shuttle 中，# pmU6-TuD-miR2 1-4ntin-GqL 111,
pmU6-TuD-miR2 1-4ntin-GqL333,pmU6-TuD-miR2 1-4ntin-lMBS-K pmU6-TuD-miR21-4ntin-lMBS-2。將這些質粒的 BamHI-EcoRI 片段插入 pSLl 180 (Pharmacia)的 BamHI-EcoRI 位點中，製作 miRNA 抑制 RNA 表達質粒 i(； # pSL1180-TuD-miR21-4ntin-GqLllU pSLl 180-TuD-miR2l-4ntin-GqL333, pSL1180-TuD-miR21-4ntin-lMBS-l、pSL1180-TuD-miR21-4ntin-lMBS-2。使用的寡核苷酸(4)用於構建本發明的RNA的表達載體的引物對為了構建TuDRNA-miR21-4ntin-GqLlll，使用有義鏈5，-CATCAACTCAACATCAGTCAA TGTGATAAGCTACAAGGGAGGGCGGGAGGGAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAG-3，(SEQ ID NO 159)和反義鏈 5，-TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTCCCTCCCGCCCTCCCTTGTAGCTT ATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3』 (SEQ ID NO :160)。為了構建 iTuD RNA-miR21-4ntin_GqL333，使用有義鏈 5，-CATCAACTCAACATCAGTCA ATGTGATAAGCTACAAGGGAGAGGGGCGGGGCGCGGGAACTCAACATCAGTCAATGTGATAAGCTACAAG-3』 (SEQ ID NO 161)和反義鏈 5，-TCATCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTTCCCGCGCCCCGCCCCTCT CCCTTGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3』 (SEQ ID NO :162)。為了構建TuD RNA-miR21-4ntin-lMBS-l，使用有義鏈5，-CATCAACTCAACATCAGTCAA TGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACATCGAATAGTGTMCTGACTACAACTCAAG-3』(SEQ IDNO 163)和反義鏈 5，-TCATCTTGAGTTGTAGTCAGTTACACTATTCGATGTTGTATTCTGTGACCAGAATACT TGTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3』 (SEQ ID NO :164)。為了構建TuD RNA-miR21-4ntin-lMBS-2,使用有義鏈5，-CATCAACTCAACATCAGTCAA TGTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACAAGCCACAACGAATCTCTATATCATCAAG-3』 (SEQ ID NO 165)和反義鏈 5，-TCATCTTGATGATATAGAGATTCGTTGTGGCTTGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTT GTAGCTTATCACATTGACTGATGTTGAGTT-3』 (SEQ ID NO :166)。MM⑴比較各結構對抑制效果的影響(G-quadruplex)製作用作為強固的結構而已知的G-quadruplex取代了 2個莖結構中長度短的莖結構的 miRNA 抑制 RNA(圖 25)。G-quadruplex 是 GGG-環-GGG-環-GGG-環-GGG 序列。 該環的序列長度為1-1-1的結構形成被稱作平行的結構，而該環的序列長度為3-3-3的結構遷移在平行結構與反向平行結構之間。將它們分別稱為GqLlll、GqL333。利用使用 HCT-116細胞的螢光素酶報導基因測定系統，比較各結構的miRNA抑制RNA的效果。與mU6 promoter-TuD-NC相比，mU6-TuD-miR21-4ntin使miR21報導基因的表達上升約40倍。另一方面，mU6-TuD-miR21-4ntin-GqLlll、mU6-TuD-miR21-4ntin-GqL333 分別使 miR21 報導基因的表達上升約33倍、約20倍(圖25(C))。(ii)比較各結構對抑制效果的影響(IMBS)將1分子中相互對向存在的2個MBS中的一方取代成不與靶miRNA結合的序列，製作MBS為1個的2種miRNA抑制RNA(圖^(A))。利用使用HCT-116細胞的螢光素酶報導基因測定系統，比較各結構的miRNA抑制RNA的效果。與mTO啟動子-TuD-NC 相比，mU6啟動子-TuD-miR21使miR21報導基因的表達上升約59倍。另一方面， mU6-TuD-miR21-4ntin-lMBS-l、mU6-TuD-miR21-4ntin-lMBS-2 分別使 miR21 報導基因的表達上升約22倍、約6. 5倍(圖沈(B))。由以上結果可知MBS的數目對抑制效果的影響大。MBS為1個或3個的miRNA抑制RNA也顯示出高的抑制效果，但具有2個MBS的miRNA抑制RNA最有效。特別是具有2個 MBS 的 TuD-miR21，與具有 1 個MBS 的 TuD-miR21-4ntin-lMBS_l 或 TuD-miR21-4ntin-lMBS_2 相比，發揮顯著超過2倍的高的抑制作用。當與MBS對向存在的區不是MBS時，顯示其核苷酸序列能夠對抑制效果帶來大的影響。[實施例10]由miR-200家族抑制產生的生物學活性1. 1質粒的構建將下述⑶所示的各寡引物對退火，之後將其克隆到用BsmBI消化的 pmU6-TuD-shuttle 禾口 ph7SK-TuD_shuttle 中，製作 pmU6-TuD_miR200c-4ntin-3L、 pmU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL>ph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L> ph7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pLo 將這些質粒的 BamHI-EcoRI 片段插入 PSL1180 (Pharmacia)的 BamHI-EcoRI 位點中，製作 miRNA 抑制 RNA 表達質粒載體 pSL1180 -mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pSLl180-mU6-TuD-miR200c-4ntin_3pL、pSLl180-h7SK_TuD-miR200c-4ntin-3L、pSL1180-h7SK-TuD-miR200c-4ntin_3pL。將同樣的 BamHI-EcoRI 片段插入pLCG (擔載HIV-I基盤的GFP基因的慢病毒載體)的BamHI-Ec0RI位點中，製作miRNA 抑制 RNA 表達慢病毒載體 pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin_3pL0為了構建螢光素酶報導基因質粒，使下述所示的寡核苷酸對退火，之後將其克隆到用 XbaI 和 FseI 消化的 pGL4. 74 (Promega)中，製作 pGL4. 74_miR200cT。1. 2細胞培養和穩定細胞株的建立在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中、於37°C下培養HCT-116細胞(Cancer Res 1981 ；41 :1751 J Nat Cancer Inst 1982 ；69 :767)。將HCT-116細胞以1 X IO5細胞/孔接種在6孔板上，24小時後，在8 μ g/ ml 的凝聚胺的存在下分別導入 pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-mU6-TuD_NC、 pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL、pLCG-h7SK-TuD-NC 病毒保存株(1 X IO6TU)，在轉導的 8天後，使用FACS Area分離收集GFP表達細胞。1. 3螢光素酶測定在導入的前一天，將HCT-116細胞在含有10 %胎牛血清(FBS)的 DMEM中以1.0X105細胞/孔接種在對孔板上，按照一式三份轉染脂質轉染胺 2000 (Invitrogen)和IOng的pTK4. 12C. Ρ-(螢火蟲螢光素酶質粒；內部對照)、100ng的 pGL4. 74-miR200cT(Rluc靶報導基因質粒)或不具有靶序列的pGL4. 74(圖28A)、lng禾口 IOng 的 pSLl 180-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L和 pSLl 180-mU6-TuD-NC .pSLl 180-h7SK_TuD-miR200c-4ntin-3pL .pSLllSO-hTSK-TuD-NC。此外，將自 pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin_3L、 pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL慢病毒導入起21天後分別導入的細胞在含有10%胎牛血清(FBQ的DMEM中、以1.0X IO5細胞/孔接種在M孔板上，按照一式三份轉染脂質轉染胺2000 (Invitrogen)和IOng的pTK4. 12C. P-(螢火蟲螢光素酶質粒；內部對照)、100ng 的pGL4. 74-miR200cT(Rluc靶報導基因質粒)或不具有靶序列的pGL4. 74(圖28A)。所有測定均在轉染的48小時後通過雙螢光素酶測定(ftOmega)並使用GL0MAXTM(ftx)mega)來實施。1.4蛋白質印跡自慢病毒導入起15天後，利用1. 5X SDS緩衝液從細胞中提取總蛋白，使用 Bio-Rad蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。用10% SDS-PAGE分離蛋白提取物，之後轉移到 PVDF-膜(Milipore)上。通過將膜與抗E-鈣粘著蛋白(ab76055，Abeam)抗體、抗波形蛋白(sc6260, Santa cruz)抗體和抗肌動蛋白(612656，BD轉導)抗體在室溫下培育2小時， 實施免疫印跡。用含有Tween 20的磷酸緩衝鹽清洗膜3次，之後將膜與辣根過氧化物酶結合二次抗體在室溫下培育1小時。使用ECL試劑(Amersham)檢測信號。使用的寡核苷酸(5)用於構建本發明的RNA的表達載體的引物對為了構建 pmU6-TuD-miR200c-4ntin-3L 和 ph7SK-TuD-miR200c-4ntin_3L，使用有義鏈 5 』 -CATCAACTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCCATCATTA CCCCACTGGCAGTATTACAAG-3，(SEQ ID NO :179)和反義鏈 5，_TCATCTTGTAATACTGCCAGTGGGGTA ATGATGGAGTTGTATTCTGTGACCAGAATACTTGTMTACTGCCAGTGGGGTAATGATGGAGTT-3』(SEQ ID NO 180)。為了構建 pmU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL 和 ph7SK-TuD-miR200c-4ntin_3pL，使用有義鏈 5 『 -CATCTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACGTATTCTGGTCACAGAATACTCCATCATTACCCCACTGGCAGTATTACG-3，(SEQ ID NO :181)和反義鏈 5，-TCATCGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGAG TATTCTGTGACCAGAATACGTAATACTGCCAGTGGGGTAATGATGGA-3』 (SEQ ID NO :182)。為了構建 pGL4. 74-miR200cT,使用有義鏈 5，-CTAGACCGGAATTCTCCATCATTACCCGGC AGTATTACTCGAGCGGAGGCCGG-3，(SEQ ID NO 183)和反義鏈 5，-CCTCCGCTCGAGTAATACTGCCGG GTAATGATGGAGAATTCCGGT-3，(SEQ ID NO :184)。MM通過螢光素酶測定來研究TuD200的miR200抑制效果使用螢光素酶報導基因測定系統，研究由mTO啟動子和h7SK啟動子這2種啟動子表達的miRNA抑制RNA的效果。並且，對接頭序列的長度不同的2種miRNA 抑制 RNA、TuD-miR200c-4ntin-3L 和 TuD-miR200c-4ntin_3pL 進行試驗。在轉染了 Ing的以miR200為靶的本發明的miRNA抑制RNA (TuD200)表達質粒載體的實驗中， mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L>mU6-TuD-miR200c-4ntin-3pL>h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L> h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL 的 miR200c 報導基因的表達較 mU6-TuD_NC 分別上升約 5. 7 倍、約6. 7倍、約6. 1倍、約6. 7倍。而h7SK-TuD-NC幾乎同等(圖^B)。在轉染了 IOng的TuD RNA 表達質粒載體的實驗中，mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、mU6-TuD-miR200c-4ntin_3pL、 h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3L、h7SK-TuD-miR200c-4ntin_3pL 的 miR200c 報導基因的表達較mU6-TuD-NC分別上升約8. 2倍、約8. 7倍、約8. 0倍、約8. 5倍。而h7SK_TuD_NC幾乎同等。另外，即使是轉染lng，與轉染IOng的結果相比，也發揮大致相同的效果(圖觀0。由以上結果可知TuD-200c以少的導入量即可充分抑制內源性miR-200。另外， 在使用miR-200的實驗中也表明mU6啟動子、h7SK啟動子和TuD-miR200c-4ntin_3L、 TuD-miR200c-4ntin-3pL均顯示出高的抑制活性。並且，在導入TuD-miR200c表達慢病毒載體而製作的TuD RNA穩定表達細胞中，自病毒導入起23天後進行螢光素酶報導基因測定時，與mU6-TuD-NC表達細胞相比， mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL 表達細胞的 miR200c 報導基因的表達也分別上升約6. 9倍、約6. 9倍。而h7SK-TuD-NC表達細胞幾乎同等(圖^D)。該結果顯示通過使用TuD-miR200c表達慢病毒載體，可以長期、高效率地抑制miR-200。通過miR200抑制進行的上皮-間充質轉換的誘導將miRNA 抑制 RNA 表達慢病毒載體 pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin_3L、 pLCG-mU6-TuD-NC、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin_3pL 禾Π pLCG_h7SK-TuD_NC 分另Ij 導入作為上皮系細胞的HCT116細胞中，分離收集GFP表達細胞。回收這些細胞的蛋白， 利用蛋白質印跡法分析作為上皮細胞·間充質細胞的基因標誌物的E-cadherind^ 形蛋白的表達量。與導入有pLCG-mU6-TuD-NC、pLCG-h7SK-TuD_NC的細胞相比，在導入有 pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin_3pL 的細胞中，E-cadherin 的表達量顯著減少；在導入有 pLCG-mU6-TuD_NC、pLCG_h7SK-TuD_NC 的細胞中，沒有確認到波形蛋白的表達，但在導入有pLCG-mU6-TuD-miR200c-4ntin-3L、 pLCG-h7SK-TuD-miR200c-4ntin-3pL的細胞中，波形蛋白表達(圖^E)。以上結果顯示通過由TuD-miR200c介導的miR-200家族的抑制，上皮系細胞HCT116轉換成間充質系細胞。產業實用性通過本發明，提供可以有效率且特異性地抑制miRNA的miRNA抑制複合體。本發明的miRNA抑制複合體例如通過逆轉錄病毒載體表達，由此可以長期穩定地抑制miRNA，例如可以進行擊倒小鼠這樣的體內測定。並且，還可以利用Cre-IoxP來時間特異性且組織特異性地實施miRNA擊倒。如圖6所例示，本發明的miRNA抑制RNA的表達套件可以容易地構建，因此還可以構建用於綜合性分析miRNA的RNA文庫。這樣，本發明提供對miRNA的研究極為有用的工具。此外，預想生物體內的基因有相當的比例是miRNA的靶，提示miRNA在包括分化、發生、腫瘤形成和抗感染症的細胞防禦的各種場面中發揮重要作用。在基因調節機制的解明或腫瘤或感染症的基因治療等中，本發明的方法對於控制這些miRNA的功能有用。
權利要求
1.抑制miRNA的複合體，其中包含RNA或其類似物，該複合體包含雙鏈結構，並且包含 miRNA結合序列的至少1條鏈與該雙鏈結構的至少單端的2條鏈結合。
2.權利要求1所述的複合體，該複合體包含第2多重鏈結構，其中包含miRNA結合序列的鏈分別與該單端的2條鏈的每1條結合，該鏈的各自的另一端分別與該第2多重鏈結構的2條鏈結合，以使該鏈被該雙鏈結構和多重鏈結構夾持。
3.權利要求2所述的複合體，該多重鏈為雙鏈或四條鏈。
4.權利要求1 3中任一項所述的複合體，該單端的2條鏈通過該單端側相連接。
5.權利要求4所述的複合體，該複合體由直鏈狀單鏈RNA或其類似物構成。
6.權利要求1 5中任一項所述的複合體，該複合體包含2 5個miRNA結合序列。
7.權利要求6所述的複合體，該複合體包含2個miRNA結合序列。
8.權利要求5所述的複合體，該複合體包含圖2(C)所示的結構，該結構的I和II為雙鏈結構，該結構的a和b中分別包含1個miRNA結合序列。
9.權利要求5所述的複合體，該複合體包含圖2(D)所示的結構，該結構的I為雙鏈結構，並在單側具有各鏈的末端，該結構的II為髮夾結構，該結構的a和b中分別包含1個 miRNA結合序列。
10.RNA或其類似物，其構成權利要求1 9中任一項的複合體。
11.核酸，該核酸編碼權利要求10所述的RNA。
12.權利要求11所述的核酸，該核酸與啟動子的下遊結合。
13.權利要求12所述的核酸，其中啟動子為聚合酶III啟動子。
14.權利要求12或13所述的核酸，該核酸被擔載在逆轉錄病毒載體上。
15.製作權利要求12所述的核酸的方法，該方法包括下述步驟在啟動子的下遊編碼形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列的核酸之間插入編碼至少1個miRNA結合序列的核酸。
16.權利要求15所述的方法，其中，編碼miRNA結合序列的核酸包含至少2個miRNA結合序列且包含在其間形成莖的序列。
17.試劑盒，該試劑盒用於製作權利要求12所述的核酸，該試劑盒包含下述(a)和(b) 的核酸(a)核酸，該核酸在啟動子的下遊包含形成至少1個雙鏈結構的1對互補序列和用於將核酸插入該1對互補序列之間的位點；(b)核酸，該核酸編碼至少1個miRNA結合序列。
18.權利要求17所述的試劑盒，其中，編碼miRNA結合序列的核酸包含至少2個miRNA 結合序列且包含在其間形成莖的序列。
全文摘要
本發明提供用於有效率地抑制miRNA的RNA、用於在細胞內表達該RNA的載體、該載體的構建方法、以及利用該RNA的miRNA的抑制方法等。發現利用miRNA抑制RNA複合體可以有效率地抑制miRNA，所述miRNA抑制RNA複合體包含雙鏈結構，並且包含miRNA結合序列的至少1條RNA鏈與該雙鏈結構的至少單端的2條鏈結合。特別是包含miRNA結合序列的2條RNA配置成夾在2個雙鏈結構間的RNA可以強力抑制miRNA。該RNA例如可以通過Pol III啟動子表達，將其整合到逆轉錄病毒載體中，可以長期穩定地抑制miRNA。本發明提供用於控制miRNA的有用的工具，期待應用於miRNA參與的分化、發育、腫瘤形成、以及感染症等中的基因調節或基因治療等中。
文檔編號C12N15/63GK102264898SQ20098015292
公開日2011年11月30日 申請日期2009年10月2日 優先權日2008年10月23日
發明者伊庭英夫, 原口健 申請人:國立大學法人東京大學