一種酶的製作方法

2023-11-12 03:07:27 1

專利名稱：一種酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種酶。本發明還涉及編碼該酶的核苷酸序列。
Boos和同事們在1981和1982年(1，2)通過大腸桿菌E.coli中乙醯-輔酶A的乙醯基團被轉移到麥芽糖上而證明了一種能夠使麥芽糖乙醯化的酶存在。特別地，Boos等人(1)觀察到在E.coli中麥芽糖和寡聚麥芽糖苷(maltooligosides)積累後形成乙醯麥芽糖和乙醯寡聚麥芽糖苷(acetyl-oligomaltosides)。Boos等人(2)也觀察到當把麥芽糖或麥芽三糖，乙醯-輔酶A和E.coli的細胞質提取液混合後，形成了乙醯麥芽糖和乙醯寡聚麥芽糖苷。
Boos等人於1981年聲明對麥芽糖和麥芽糖糊精乙醯化作用的活性是未知的。但是，他們在1982年(2)的進一步的研究中，Feundlieb和Boos將這種未知的酶命名為「麥芽糖轉乙醯酶」，但是接著說E.coli中的麥芽糖轉乙醯酶的功能尚不清楚。
後來Brand和Boos(3)分離出了缺少編碼麥芽糖轉乙醯酶基因的E.coli突變株。該突變株使他們能夠將該基因作圖於E.coli連鎖圖上的10.4分鐘。另外，他們在一個高拷貝質粒中克隆了含有該基因的一個3.4kb的DNA片段。然後從帶有上述質粒的E.coli菌株無細胞提取液中將過量表達的麥芽糖轉乙醯酶純化至均質。該酶被證明是一種有兩個相同的20kDa亞基的同源二聚體。該酶對底物葡萄糖，麥芽糖和乙醯-輔酶A的km(mM)和Vmax(μmol/min×mg酶)值分別是62和200，90和110，以及0.018和166。發現麥芽三糖和其它寡糖的乙醯化速率是所測定葡萄糖乙醯化速率的2％。另外，Brand和Boos提供了下述相對乙醯化速率葡萄糖1，麥芽糖0.55，甘露糖0.2，果糖0.07，半乳糖0.04，麥芽三糖和其它寡聚麥芽糖0.02。寡糖是含有少於10個糖基的糖類。
儘管有這些發現，Brand和Boos沒有對編碼麥芽糖乙醯轉移酶的核苷酸及這種酶進行測序。
根據本發明的第一方面，本發明提供了一種有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性的酶，其中，該酶含有如SEQ ID No.1所示的胺基酸序列，或其變體，同系物或片段。
根據本發明的第二方面，本發明提供了一種有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性的重組酶，其中，該酶含有如SEQ ID No.1所示的胺基酸序列，或其變體，同系物或片段。
根據本發明的第三方面，本發明提供了一種有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性的重組酶，其中，該酶具有如SEQ ID No.1所示的胺基酸序列。
根據本發明的第四方面，本發明提供了一種有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性的重組酶，其中，該重組酶同用本發明上述方面的純化的重組酶製備的抗體發生免疫反應。
根據本發明的第五方面，本發明提供了一種編碼本發明酶的核苷酸序列或與其互補的序列。
根據本發明的第六方面，本發明提供了一種含有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列，或其變體，同系物或片段或者是同其互補的序列。
根據本發明的第七方面，本發明提供了一種具有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列。
根據本發明的第八方面，本發明提供了一種構建體，該構建體含有或表達本發明的核苷酸序列或酶。
根據本發明的第九方面，本發明提供了一種載體，該載體含有或表達本發明的構建體或核酸序列或酶。
根據本發明的第十方面，本發明提供了一種質粒，該質粒含有或表達本發明的載體，構建體，核苷酸序列或酶。
根據本發明的第十一方面，本發明提供了一種轉基因生物，該轉基因生物含有或表達本發明的質粒，載體，構建體或核苷酸序列或酶。
根據本發明的第十二方面，本發明提供了一種修飾糖(優選為澱粉)，該修飾糖是用含有或表達或使用本發明的方法製備的。
本發明的酶可從任何一種細菌，真菌，藻類，酵母，或植物中獲得。優選的，該酶從E.coli中獲得。
本發明的α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶有時被稱作Mac。編碼本發明α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶的基因有時被稱作mac基因。
優選的，該酶含有如SEQ ID No.1所示的胺基酸序列或其變體，同系物或片段。
優選的，該酶含有如SEQ ID No.1所示的胺基酸序列。
優選的，該酶由含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的核苷酸序列或者其變體，同系物或片段或者與其互補的序列所編碼，優選的，該酶由如SEQ ID No.2所示的核苷酸編碼。
優選的，該生物體是一種植物。
優選的，該核苷酸序列是一種DNA序列。
所述酶或編碼它的核苷酸序列可以同一種或多種其它的酶或編碼它們的核苷酸序列相組合，用於體內或體外，這些酶或編碼它們的核苷酸序列優選是用重組DNA技術製備。
因此，根據本發明的一個方面，在體內酶促修飾反應之後接著是一體外酶促修飾反應。在這些修飾步驟中，不必使用相同的酶。
同所述酶相關的術語「變體」，「同系物」或「片段」包括任何從所述序列中取代，變異，修飾，替代，缺失或添加一個(或多個)胺基酸的序列，只要所得胺基酸序列具有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶的活性，優選的至少具有同SEQ ID No.1所示的酶一樣的活性。尤其是，如果所得的酶具有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性，術語「同系物」則包括在結構和/或功能上的同源性。就序列的同源性而言，優選的是與SEQ ID No.1所示的序列具有至少75％的同源性，更優選的是至少有85％的同源性，更優選的是至少有90％的同源性。更優選的是同SEQ ID No.1所示的序列具有95％的同源性，更加優選的是具有98％的同源性。
同編碼所述酶的核苷酸序列相關的術語「變體」，「同系物」或「片段」包括任何從該序列中取代，變異，修飾，替代，缺失或增加一個(或多個)核苷酸的序列，只要所得到的核苷酸序列編碼一種具有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶的活性的酶，優選至少具有同如SEQ IDNo.1所示的酶一樣的活性。尤其是，如果該所得核苷酸序列編碼一種具有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性的酶，術語「同系物」包括在結構和/或功能上的同源性。就序列的同源性而言，優選的是與SEQ IDNo.2所示的序列具有至少75％的同源性，更優選的是至少有85％的同源性，更優選的是至少有90％的同源性。更優選的是同SEQ ID No.2所示的序列具有95％的同源性，更加優選的是具有98％的同源性。
上述術語與所述序列的等位變異體是同義的。
術語「互補」指的是本發明也包括能夠同本發明序列雜交的序列。
對於本發明來說，術語「核苷酸」包括基因組DNA，cDNA，合成DNA以及RNA。優選的指的是DNA，更優選的指的是編碼本發明序列的cDNA。
優選的，所述核苷酸序列不是一個天然核苷酸序列。關於這一點，術語「天然核苷酸序列」是指一個處於其天然環境下的全長核苷酸序列並且當有效地連接到一個與其天然相關的完整啟動子上時，該啟動子也處於其天然環境中。
因此，本發明的酶可通過其天然生物體內的核苷酸序列來表達，但是所述的核苷酸序列不在該生物體內與其相關的啟動子的控制之下。
本發明的酶可同其它的酶組合使用。
優選的，所述酶不是天然酶。關於這一點，術語「天然酶」是指一種由其天然核苷酸序列所表達的處於其天然環境中的完整的酶。
術語「構建體」-與諸如「結合物」，「表達盒」以及「雜合體」的術語具有相同的含義-包括直接或間接與一個啟動子相連或融合的核苷酸序列。間接相連的例子是提供象內含子序列一樣的合適的間隔基團，例如Sh1內含子或ADH內含子，插入啟動子和所述核苷酸序列之間。
在每種情況下，更優選的是這些術語不包括編碼該酶的基因同野生型基因啟動子均處於天然環境時它們之間通常的天然結合。因此，本發明的一個優選的實施例涉及將本發明的核苷酸序列有效的連接到一個異源啟動子上。
所述構建體甚至可以含有或表達一種標記物以便於從植物-如馬鈴薯中選擇出已經被轉入其中的遺傳構建體。現有多種標記物可供選用，比如那些編碼6-磷酸-甘露糖異構酶(特別對於植物而言)或用於抗生素抗性-例如對G418，潮黴素，博來黴素，卡那黴素以及慶大黴素具有抗性的標記物。
術語「載體」包括表達載體以及轉化載體。
術語「表達載體」是指能夠在體內或體外表達的構建體。
術語「轉化載體」是指能夠從一個物種轉移到另一個物種中的構建體-例如從E.coli質粒到土壤桿菌中再到植物中。
術語「組織」包括組織和器官，可以是分離出的組織或器官，也可以是在生物體內的組織或器官。
本發明所涉及的術語「生物體」包括含有編碼本發明酶的核苷酸序列的任何生物體和/或從中得到的產物，和/或其中本發明所述核苷酸序列在該生物體中能夠進行表達。
優選的生物是植物。
本發明中所涉及的術語「轉基因生物體」包括含有編碼本發明酶的核苷酸序列的任何生物體和/或從中得到的產物，和/或其中本發明的核苷酸序列在該生物體中能夠進行表達。優選的，所述核苷酸序列被整合到該生物體的染色體組中。
優選的，所述轉基因生物是植物。
因此，本發明的轉基因生物包括含有編碼本發明的酶的核苷酸序列，本發明的構建體，本發明的載體，本發明的質粒，本發明的細胞，本發明的組織，或其產物之任何一種或其組合的生物。例如，該轉基因生物也可以含有在異源啟動子控制下的編碼本發明酶的核苷酸序列。所述轉基因生物不包括啟動子和核苷酸序列對該生物均是天然的並且均處於它們的天然環境中的狀態下的編碼本發明的酶的核苷酸序列和啟動子的結合。
術語「啟動子」是本領域常用的意思，例如Jacob-Mond的基因表達理論中的RNA聚合酶結合位點。
所述啟動子可以額外地具有一種或多種特性以確保或增強在適宜的宿主中的表達。例如，這些特性可以是諸如Pribnow框或TATA框的保守區。該啟動子甚至可以帶有其它序列以影響(比如保持，增強，降低)本發明核苷酸序列的表達水平。例如，適宜的其它序列包括Sh1-內含子或ADH-內含子。其它的序列包括誘導因子-比如溫度，化學，光或激應誘導因子。
也應當有促進轉錄或翻譯的適宜因子存在。後面的因子的一個例子是TMV5』信號序列(見Sleat基因217217-225；以及Dawson植物分子生物學2397)。
因此，一方面，本發明的核苷酸序列是在啟動子的控制之下，該啟動子使所述核苷酸序列能夠表達。在這方面，該啟動子可以是細胞或組織特異性啟動子。例如，如果該生物是一種植物，那麼該啟動子是可以在種子，莖，塊莖，芽，根以及葉組織的任何一個或多個中影響該核苷酸序列的表達的啟動子。
可以在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis T.(編者)的分子克隆。實驗手冊。第二版，冷泉港實驗室出版社，紐約1989，中找到關於重組DNA技術的一般性指導。
雖然在EP-B-0470415和CA-A-2006454中沒有公開本發明的酶和核苷酸序列，但是兩個文件中的確提供了製備本發明的轉基因植物的有用的背景技術評論。這些背景技術指導中的一部分包括在下述評論中。
構建遺傳修飾植物的基本原理是將遺傳信息插入到植物的染色體中並使插入遺傳材料能穩定保持。
現有許多用作插入遺傳信息的技術，兩種主要的原理是遺傳信息的直接導入和用載體系統來導入遺傳信息。可以在Potrykus的文章(植物生理學分子生物學年報42205-225)和Christou的文章(農業-食品-工業高技術3月/4月1994 17-27)中找到對這些常用技術的評論。
因此，一方面，本發明涉及一種攜帶有本發明的核苷酸序列或構建體的載體系統，該載體能夠將所述核苷酸序列或構建體引入某種生物比如植物的染色體組中。
所述載體系統可以含有一個載體，但是也可以包括兩個載體。在含有兩個載體的情況下，通常將該載體系統稱作雙載體系統。Gynheung An等(1980)，在雙載體，植物分子生物學手冊A3，1-19一文中對雙載體系統作了進一步的詳細描述。
一個廣泛使用的以特定的啟動子或核苷酸序列或構建體轉化植物細胞的系統是以使用來自根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti質粒或來自髮根農桿菌(agrobacteriumrhizogenes)的Ri質粒為基礎的(An等(1986)，植物生理學，81，301-305以及Butcher D.N.等(1980)，植物病理學家組織培養方法，編輯Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。)已經構建了適用於構建上述植物或植物細胞構建體的幾種不同的Ti和Ri質粒。
本發明的核苷酸序列或構建體應優選插入Ti質粒的T-DNA末端序列或相鄰T-DNA序列之間，以避免緊鄰T-DNA邊緣的序列被破壞，因為至少看起來這些區域之一對於修飾的T-DNA插入植物染色體組中是必需的。
從上述解釋中可以理解，如果該生物是一種植物，那麼本發明的載體系統優選含有對感染該植物所必需的序列(例如vir區)以及至少一個T-DNA序列的邊緣部分，該邊緣部分位於同遺傳構建體相同的載體上。
另外，該載體系統優選是根癌農桿菌Ti質粒或毛根農桿菌Ri質粒或其衍生物，因為這些質粒是公知的而且廣泛用於轉基因植物的構建，許多現有的載體系統是以這些質粒或它們的衍生物為基礎的。
在轉基因植物的構建中，可將本發明的核苷酸序列或構建體在插入植物體之前首先在能夠使其複製並且易於擴增的微生物中構建。一個有用的微生物的例子是E.coli，但是也可以使用具有上述特性的其它微生物。當在E.coli中構建上述定義的載體系統中的載體時，如果需要，就將該載體轉入適宜的農桿菌菌株中，例如根癌農桿菌中。這樣，優選的將帶有本發明核苷酸序列或構建體的Ti-質粒轉入到農桿菌菌株中，例如根癌農桿菌中，以獲得帶有本發明核苷酸序列或構建體的農桿菌細胞，然後將該DNA轉入待修飾的植物細胞中。
如CA-A-2006454中所報導的，有大量的克隆載體可供選用，所述載體含有E.coli複製系統以及使轉化細胞能夠被選出的標記物。所述載體包括例如pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。這樣，本發明的核苷酸或構建體可以被導入所述載體中適宜的限制性位點上。將含有的質粒用於轉化E.coli。在適宜的營養培養基中培養這些E.coli細胞然後回收並裂解。然後回收質粒。作為一種分析方法，這裡通常用序列分析，限制性分析，電泳和進一步的生物化學分子生物學方法。每次操作後，用限制酶切割所用DNA序列並同另一個DNA序列連接起來。可將每個序列克隆在相同或不同的質粒中。
每次根據本發明的方法將構建體或核苷酸序列引入植物後還可能需要存在和/或插入另外的DNA序列，例如，如果用Ti-或Ri-質粒轉化植物細胞，那麼作為引入基因的側翼區，至少Ti-或Ri-質粒T-DNA的右邊界而且通常是右邊界同左邊界應被連接起來。已經對用T-DNA進行植物細胞轉化有了深入細緻的研究並在EP-A-120516中作了描述；見Hoekema的The Binary Plant Vector SystemOffset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第5章；Fraley，等，植物科學評論，41-46；以及An等，歐洲分子生物學雜誌(1985)4277-284。
用土壤桿菌屬直接侵染植物組織是一種已被廣泛使用並且由Butcher D.N.等在(1980)，植物病理學家的組織培養方法，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208頁中作了描述的簡單技術。對於這一主題的進一步的介紹見Potrykus(植物生理學植物分子生物學年報42205-225)和Christou(農業-食品-工業高技術3月/4月1994 17-27)。用這種技術，可侵染植物特定的部分或組織，即葉子，塊莖，根，莖的一部分或該植物的其它部分。
一般地，用帶有本發明核苷酸序列的農桿菌屬直接侵染植物組織時，要用例如剃刀劃傷植物或用針刺破植物或用研磨劑對植物擦磨以使待侵染的組織受傷。然後用農桿菌屬在傷口處接種。然後將被接種的植物或植物的一部分在適宜的培養基中培養，使其發育成成熟的植物。
當構建植物細胞時，可根據公知的組織培養方法使這些細胞生長並保存下來，比如將細胞在適宜的含有胺基酸，植物激素，維生素等必需的生長因子的培養基中培養。
用已知的用於由細胞或組織培養物再生植物的方法可使轉化的細胞再生成遺傳修飾過的植物，例如，用一種抗生素選擇出轉化的芽並在含有適宜營養物，植物激素等的培養基中對其傳代培養。
在丹麥的專利申請No.940662(1994年6月10日申請)和/或英國專利申請No.9702592.8(1997年2月7日申請)中可找到對植物轉化的更進一步的有用的介紹。
更可以參考Spngstad等(1995年植物細胞組織器官培養40第1到15頁)，因為這些作者對轉基因植物的構建作了一般性的綜述。
總之，本發明涉及一種具有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性的酶及編碼這種酶的核苷酸序列。本發明還提供了可用該酶得到的修飾的糖類(優選的是澱粉)。
根據布達佩斯條約，於1996年3月7日將下面的樣品保藏在位於23 St.Machar Drive，Aberdeen，蘇格蘭，英國，AB2 1RY的認可的保藏機構-國家工業及海洋細菌保藏有限公司(NCIMB)。
DH5α-pMAC3(它包含來自E.coli的含有mac基因的一個3.2kbEcoRI-Pst1片段)。
保藏號為NCIMB 40789。
相關的保藏質粒是pMAC3。
根據布達佩斯條約，於1996年3月7日將下面的樣品保藏在位於23 St.Machar Drive，Aberdeen，蘇格蘭，英國，AB2 1RY的認可的保藏機構-國家工業及海洋細菌保藏有限公司(NCIMB)。
NF1830-pMAC5(含有E.coli的mac基因)。
保藏號為NCIMB 40790。
相關的保藏質粒是pMAC5。
因此本發明的一個更優選的方面涉及一種具有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性的酶，其中，所述酶含有如SEQ ID No.1所示的胺基酸序列，或其變體，同系物，或其片段；並且所述酶是由可從保藏號NCIMB 40789或保藏號NCIMB 40790中得到的核苷酸序列所表達的。
因此，本發明的另一個更優選的方面涉及一種含有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列，或其變體，同系物，或其片段，或與其互補的序列；並且所述核苷酸序列可從保藏號NCIMB 40789或保藏號NCIMB40790中得到。
本發明還提供了用這一質粒可得到的一種修飾糖類(優選的是澱粉)。
現將本發明僅以舉例的方式予以描述，其中參考下列附圖

圖1顯示了相當於SEQ ID No.2的核苷酸序列；圖2顯示了相當於SEQ ID No.1的胺基酸序列；圖3顯示了含有相當於SEQ ID No.2序列的核苷酸序列；圖4是pMAC1的質粒圖譜；圖5是pMAC2的質粒圖譜；圖6是pMAC3的質粒圖譜；圖7是pMAC5的質粒圖譜；圖8是pMAC8的質粒圖譜；
圖9是pMAC9的質粒圖譜；並且圖10是pMAC10的質粒圖譜。
附圖的一些詳情如下圖1相當於Seq ID No 2的核苷酸序列圖2相當於Seq ID No 1的胺基酸序列183個胺基酸20076 MW圖4質粒名稱pMAC1質粒大小7.26kb說明來自λ151的一個4.3kb的EcoR1片段插入pBluscript IISK+的EcoR1位點中。
圖5質粒名稱pMAC2質粒大小7.26kb說明來自λ151(Kohara保藏中心)的一個4.3kb的EcoR1片段插入pBluscript II SK+的EcoR1位點中。
圖6質粒名稱pMAC3質粒大小7.26kb說明從pMAC2中去除1.1kb的Pst1片段。
圖7質粒名稱pMAC5質粒大小4060bp說明用下面的引物擴增E.coli mac基因#B411(有EcoRI位點的上遊引物)CGG AAT TCC GCC ATG AAG ACA TAC CC#B412(有HindIII位點的下遊引物)CAC AAG CTT ATT TTG CAT AAC AGT TGC用pMAC3作模板。
用EcoR1和HindIII消化704bp的PCR產物並插入到用相同的限制酶消化的pUHE21-2中。
圖8質粒名稱pMAC8質粒大小4935bp說明用下列引物並以pMAC3為模板擴增E.coli的mac基因#B478 CGG GAT CCG AGC ACA GAA AAA GAA AAG ATG(有BamHI位點的上遊引物)#B479 AAC TGC AGA TTT TGC ATA ACA GTT GC(有PstI位點的下遊引物)用BamHI和PstI消化PCR產物並插入到用同樣的酶消化了的pBETP5中。
用引物#C028對SBE TP-mac融合物進行控制測序用引物#B456或#C027對35S中止子-mac融合物測序。
圖9質粒名稱pMAC9質粒大小9.37kb說明將來自pMAC8的2294bp的EcoRI片段(Patatin啟動子-SBE TP-mac-35S終止子)插入到pVictor IV Man的EcoRI位點上。
圖10質粒名稱pMAC10質粒大小9.37kb說明將pMAC8的2294bp的EcoRI片段(Patatin啟動子-SBETP-mac-35S終止子)插入到pVictor IV Man的EcoRI位點上。
來自E.coli的mac基因的克隆與測序首先根據Boos和Brand的指導(3)，從Kohara保藏中心的λ噬菌體8C4(151)的4.3kb EcoRI片段中分離出mac基因(4)。將該片段以兩種取向插入到質粒pBluescriptII SK(+)的EcoRI位點從而生成質粒pMAC1和pMAC2(圖4和圖5)。當E.coli攜帶這些質粒時，麥芽糖乙醯轉移酶的量大大增高，說明4.3kb EcoRI片段含有mac基因。
為了在4.3kb EcoRI片段上定位mac基因，從質粒pMAC2中去除1.1kb的EcoRI片段。該質粒構建體pMAC3(圖6)也使有這種質粒的菌株的麥芽糖轉乙醯酶表達量大大增高，因此證明mac基因存在於3.2kb的EcoRI-PstI片段上。
然後用A.L.F測序儀自動測序以確定插入pMAC3的3.2kbEcoRI-PstI的核苷酸序列。3137bp的DNA序列揭示了E.coli acrB基因的3』端的372bp區以及可能分別編碼蛋白質的124，126和183個胺基酸的三個開放閱讀框(圖3)。
相應的，用含有pMAC3的E.coli小細胞做35S-甲硫氨酸標記試驗，表明具有相當於這些分子量大小的蛋白質的合成。
由於E.coli麥芽糖轉乙醯酶有一個估計分子量為20000的亞基(3)，預測編碼分子量為20073蛋白的183個密碼子(圖2)是mac基因。
Mac酶在E.coli中的過量表達為了純化Mac酶，在pUHE21-2中可被異丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)誘導的噬菌體T7-啟動子之後插入mac基因，得到pMAC5(圖7)。當向生長培養基中加入IPTG以誘導mac基因的表達時，發現獲得了pMAC5的E.coliNF1830菌株培養物(MC1000，recA1，F』lacIq1Ztm5，由哥本哈根大學的Niels Fiil惠贈)中有大量的麥芽糖轉乙醯酶。
生長條件在NF1830-pMAC5的A1L LB培養基物添加氨苄青黴素(100μg/ml)及卡那黴素(25μg/ml)，並在37℃下強力振動培養直到A600達到0.7。加入IPTG使最終濃度為2mM並繼續培養4小時。離心(4000×g下10分鐘)回收細胞並在200ml 0.9％的NaCl中重懸浮洗滌。然後將細胞沉澱物重懸浮於pH值為7.5並含有0.4mM PMSF，0.4mg/ml胃蛋白酶抑制劑以及1.6mM EDTA的250ml的20mM磷酸鉀中。用Vibra Cell VC600及19mm的High Gain Horn以及充填器(均由Sonics and Materials有限公司提供，美國)將懸浮液用超聲處理5×1分鐘。在4℃下以90000×g離心60分鐘使細胞勻漿澄清，然後用0.22μm的濾膜過濾。
重組Mac的純化將所得的粗提取物以2ml/min的流速流經用20mM pH 7.5的磷酸鉀(下文中稱作「緩衝液A」)平衡的Q-Sepharose 26/10柱(Pharmacia生物技術公司)。用300ml緩衝液A洗滌該柱並用線性梯度濃度為0到3M NaCl的緩衝液A(300ml)洗脫附著蛋白。收集具有酶活性的餾分以1ml/min的低流速使其流經用緩衝液A平衡的8mlAffi-Gel Blue(Biorad)柱(16mm×26mm)。用50ml含有0.4M NaCl相同的緩衝液洗滌該柱。然後用含有2M NaCl的相同緩衝液洗脫該酶。在緩衝液A中將活性收集液透析過夜，並用Centriprep-30(Amico)濃縮到大約3ml。使餾分以0.3ml/min的低流速流經用緩衝液A平衡的6ml Acetyl-coA-Minileak柱。室溫下在10ml pH 11的1M NaCO3中將200mg的Acetyl-coA和5g(乾重)的Minileak High(Kem-En-Tek，丹麥)偶聯20小時製備成吸附樹脂。用20ml的緩衝液A洗滌該柱。然後倒置並用少於20ml的含有0.5M NaCl的緩衝液A洗脫純化酶。
經三個層析步驟後，使純化的麥芽糖乙醯轉移酶變為均質。從1升培養基中我們能夠獲得5.8mg純化Mac。回收率為29％並且該酶被純化了80-倍。用SDS-PAGE和質譜分析法來確定酶的純度。後一方法揭示分子量為19，982 Da。
酶濃度和活性的測定根據(5)的Mac的胺基酸組分的測定，以0.66為消先係數，用分光光度計法在280nm處確定純Mac溶液的濃度。按照改進的Alpers的分析法(6)，用分光光度計分析Mac的乙醯轉移酶的活性。使用Perkin Elmer生產的Lambda 18分光光度計。總體積為1ml的分析混合物含有50mM的磷酸鉀，pH 7.5的2mM EDTA緩衝液，1M的麥芽糖100μl，0.4mM的乙醯-輔酶A 100μl，溶於甲醇的40mM的5，5』-二硫雙(2-苯甲酸)(DTNB)10μl以及10μl的酶。通過加入酶或麥芽糖來起始反應並於25℃下在412nm處監測。將25℃下每分鐘能提高一個吸光度的酶量定義為一個活性單位。為了計算乙醯輔酶A的消耗量，用13,600M-1×cm-1作為DTNB的消光係數。
對重組Mac的N-端測序用應用生物系統公司的476A蛋白質測序儀對純Mac的N-末端測序。在裝入測序儀前，用反向高效液相層析在C2柱(4.6/30)中將1納摩爾的蛋白質脫鹽。已將Mac的N-端序列測定到殘基48並與mac基因(圖1)的核苷酸序列完全一致。而且，在成熟蛋白上沒有N-末端的甲硫氨酸殘基(圖2)。
用重組Mac生產多克隆抗體在6周中每隔2周用90μg被弗氏佐劑乳化(1∶1，體積比)的純化蛋白給兔子予以皮下注射免疫，此後免疫間隔時間為4周。用免疫印跡檢測Mac的抗血清並發現其具有高度的特異性。
重組Mac的性質鑑定及活性分布圖經質譜研究表明Mac是一個三聚體。
在PhastGel IEF 4-6.5(Pharmacia)上通過等電聚焦測定Mac的等電點為5.7。
在含有100mM NaCl的50mM緩衝液中，麥芽糖濃度為100mM下，在pH為5和8.5之間研究Mac的pH值分布圖。在這樣的條件下，最佳pH值為7.7。
於25℃下在pH 3.0到10.0之間檢測pH的穩定性。在pH為3.0時Mac馬上失活，但在pH 4.0到10.0之間至少穩定6個小時。
pH為7.5時，在40℃和70℃之間研究Mac的熱穩定性。在40℃和50℃下溫浴4小時後，Mac的剩餘活性分別為100％和75％。其在60℃和70℃下的半衰期分別為70分鐘和22分鐘。
按照「酶的濃度及活性的測定」中所述的方法，通過測量不同糖(在50和100mM的濃度下)的乙醯化初始速度來研究糖乙醯基受體底物中優選的Mac底物。結果如表1，2和3所示。在試驗過的單糖中，葡萄糖是最佳底物，在試驗過的二糖中，麥芽糖和異麥芽糖是最佳底物。
表1.以不同的單糖作為乙醯基受體時Mac的相對活性比較
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表2.以不同的二糖作為乙醯基受體時Mac的相對活性比較。
表3.以不同的寡聚麥芽糖作為乙醯基受體時Mac的相對活性比較。
動力學研究對Mac催化乙醯化反應的動力學研究表明受體底物的Km值在mM的範圍而乙醯-輔酶A的Km值在μM的範圍。因此，Mac對於乙醯-輔酶A的親和性是對受體的親和性的1000倍。
NMR研究用Mac得到葡萄糖和麥芽糖的乙醯化產物，並對產物的1H-NMR結構鑑定進行研究。
為了研究關於Mac受體底物乙醯化位點的底物區域特異性，我們通過將10mg葡萄糖或麥芽糖同E.coliMac和1mg乙醯-輔酶A在pH7.5的磷酸緩衝液中一起溫浴48小時從而製備了毫克量的乙醯化葡萄糖和麥芽糖。在溫浴的過程中另加入1mg等分試樣的乙醯-輔酶A。通過薄層層析分離反應物並從層析譜中分離出乙醯化的葡萄糖和麥芽糖並冷凍乾燥。用1H-NMR鑑定這些乙醯化糖的結構。葡萄糖僅在C6位置被乙醯化，麥芽糖的乙醯化位點在其非還原萄葡糖部分的C6位置。結果表明Mac乙醯化六糖的C6位點。
E.coli中的SBE-Mac融合體的活性由於下面描述的pMAC9和pMAC10中的SBE-Mac融合體的27個胺基酸的SBE部分會影響乙醯轉移酶的活性，為了使融合酶在E.coli中過量表達並分析其活性，將SBE-Mac融合體插入到E.coli表達載體pAL781(Invitrogene，San Diego，美國)中。在SDS凝膠上比較大大過量表達的SBE-Mac融合體與純化的野生型Mac酶，結果表明由於增加的27個胺基酸使融合體的遷移速度略有降低。而且，融合體保持了麥芽糖作為乙醯化底物的能力。因此，看起來E.coli中的融合酶是完整的並且具有完全的活性。所以，可以設想SBE-Mac融合酶在馬鈴薯中將是有活性的。
馬鈴薯澱粉的體內修飾在我們的另外的正在審查之中的專利申請PCT/EP96/03053，PCT/EP96/03052，PCT/EP94/01082中(每個申請的內容均被收作本文的參考文獻)可以找到有關於馬鈴薯轉化的一般性介紹。
對本研究而言，採用下述方法。
構建質粒以在馬鈴薯中表達E.coli mac基因。
用下面的引物並以pMAC3作為模板擴增E.coli mac基因5』-CGG GAT CCG AGC ACA GAA AAA GAA AAG ATG-3』(有BamHI位點的上遊引物)和5』-AAC TGC AGA TTT TGC ATA ACA GTT GC-3』(有PstI位點的下遊引物)。
用BamHI和PstI消化PCR產物並插入用同樣的酶消化的pBETP5(見PCT專利申請No.WO94/24292，該申請的內容被收作本文的參考文獻)中以得到pMAC8。這樣，mac基因插入到了可提供塊莖特異性表達-從patatin啟動子開始並在CaMV 35S終止子處終止轉錄的表達盒中。而且，Mac酶同馬鈴薯澱粉分支酶N-端的102個胺基酸的融合，其中包括引導mac基因產物至馬鈴薯塊莖造粉體的75個胺基酸的轉運肽。在進入造粉體中時，切除75個胺基酸的轉運肽，以得到具有來自成熟澱粉分支酶N-端的27個胺基酸的Mac融合蛋白。從pMAC8中分離出2294bp EcoRI表達盒並插入植物轉化載體pVictorIV Man的EcoRI位點中(見PCT專利申請No.WO 94/24292和英國專利申請No.951443.8，每個專利申請的內容均被收作本文的參考文獻)從而得到質粒pMAC9和pMAC10(分別為圖9和圖10)。
馬鈴薯小塊莖的製備含有節(nodium)的片段-即從該節上部2mm到其下部5mm的片段-從體外生長的馬鈴薯植物或甘露糖選擇根上切出的片段(關於甘露糖選擇我們以前的專利申請WO 93/05163和/或WO 94/20627)上切下的。從所述節段上去除葉子後垂直放在含有MS培養基(Sigma)的瓊脂平板上，該培養基添加每升60g的蔗糖和每升2mg的6-苄基-氨基嘌呤。在20℃下使所述節段以16小時的光照周期和8小時的黑暗周期生長7天。然後，用鋁箔將平板包起來並置於20℃下的黑暗中。28天後收集小塊莖並用蛋白質印跡分析以檢測Mac的表達。
馬鈴薯小塊莖中SBE-Mac融合物的表達通過蛋白質印跡分析用E.coli麥芽糖乙醯轉移酶製備的抗體和E.coli mac基因的表達以檢測被構建體pMAC9和pMAC10轉化的馬鈴薯小塊莖。分析結果清楚地證明了5個MAC9小塊莖中的3個和7個MAC10小塊莖中的5個明顯有E.coli麥芽糖乙醯轉移酶的表達。陽性小塊莖表達了209個胺基酸的SBE-Mac融合物，該融合物同一個在E.coli中表達的相似構建體共遷移。這些結果表明最初同209個胺基酸的SBE-Mac融合體融合的75個胺基酸的SBE轉運肽已從SBE-融合體中去除。而且，這意味著在造粉體細胞膜中的信號肽酶正確地對轉運肽進行了處理，並且SBE-Mac融合體已經被引入造粉體中。
馬鈴薯塊莖提取物的免疫印跡在冰中用20％的三氯乙酸將0.5ml馬鈴薯蛋白提取物沉澱30分鐘。離心後回收蛋白質沉澱並在50μl SDS-PAGE樣品緩衝液中重懸浮。然後向15％的聚丙烯醯胺凝膠中加入25μl。在電泳後通過半乾印跡把蛋白質轉移到Problot PVDF膜上。為了進行免疫檢測，將Mac抗血清稀釋為1∶2000，並把第二抗體同鹼性磷酸酶偶合。
同上述的小塊莖的蛋白質印跡分析相一致，轉基因塊莖的蛋白質印跡分析清楚地證明了209個胺基酸的SBE-Mac融合體在塊莖中得到表達。
用馬鈴薯塊莖分析Mac的活性選出可大小相當的馬鈴薯塊莖並切成片，並用研缽和研杵或電動搗碎機使其在提取物緩衝液和Dower(1％，w/vol)中形成勻漿。每克馬鈴薯用5ml提取緩衝液(50mM磷酸鉀pH7.5，2mM EDTA，0.5mMPMSF)。將混合物置於冰上30分鐘並通過離心去除不溶物。用BCA試劑(Pierce)測定蛋白質濃度。
用如下方法測定Mac的活性，重複2次或3次在微量滴定板加樣孔中混合0，50，100或200μl馬鈴薯提取物，1mM的乙醯-輔酶A10μl，1M的葡萄糖25μl以及試驗緩衝液(50mM的磷酸鉀，2mM的EDTA，pH 7.5)並使每個加樣孔中的總體積為250μl。加入乙醯-輔酶A以起始反應。在室溫下反應10分鐘後，加入4mM的新製備的DTNB並立即測量A405值。給每一次測試準備兩個加樣孔，一個有葡萄糖一個沒有。從含有葡萄糖的加樣孔的吸光度中扣除不含葡萄糖加樣孔的吸光度(背景吸光度)從而計算出活性。
9個轉基因塊莖中的8個可測定到相當高的Mac活性水平。一些塊莖的Mac活性高於在未轉化塊莖中發現的幾乎可忽略的活性15到20倍。
粘度研究用水懸浮液澱粉粘度測定儀Newport Scientific Rapid ViscoAnalyser對未轉化的馬鈴薯和根據本發明轉化的馬鈴薯的塊莖中的澱粉樣品進行分析。結果表明轉化的馬鈴薯中的澱粉與未轉化的馬鈴薯的澱粉的粘度測定圖譜不同。
DSC研究用差分掃描比色法對未轉化的馬鈴薯和本發明轉化的馬鈴薯的塊莖中的澱粉樣品進行分析(用10％w/w的水澱粉懸浮液)。將樣品以每分鐘10℃的速度從20℃加熱到100℃。所得結果表明轉化的馬鈴薯澱粉與未轉化的馬鈴薯澱粉具有不同的焓。我們也發現轉化馬鈴薯的澱粉同未轉化馬鈴薯的澱粉相比較，其凝膠化溫度也有差別。
對本發明的其它的修改對於本領域技術人員來說是顯而易見的。參考文獻1.Boos W.，Ferenci T.和Shuman H.A.1981.細菌學雜誌146，725-732。
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GACGCTTGAT60GCGGTGCGGA TGCGTTTACG TCCGATCCTG ATGACCTCGC TGGCGTTTAT CCTCGGCGTT 120ATGCCGCTGG TTATCAGTAC TGGTGCTGGT TCCGGCGCGC AGAACGCAGT AGGTACCGGT 180GTAATGGGCG GGATGGTGAC CGCAACGGTA CTGGCAATCT TCTTCGTTCC GGTATTCTTT 240GTGGTGGTTC GCCGCCGCTT TAGCCGCAAG AATGAAGATA TCGAGCACAG CCATACTGTC 300GATCATCATT GATACAACGT GTAATCACTA AGGCCGCGTA AGCGGCCTTT TTTATGCATA 360ACCTACGAAC ATTAAGGAGT AATTGAACCA CCAACTCAGG ATCTCATACG AAAACCAGTA 420TTAACCACGG ATAAAATTCA TAAAAAATAC TGATTGTTAG TTAATTTATA TTAAGTAGCG 480CTAATAGATT TAATAATCCA TAATCATTTA GAGGCTATTC TTAATTATTT GCGGTAATTC 540TTTATTCATT CCTCGGTTAT TACGTCATAT TCAGAGCAAT CCTGGTATTA GTGTCACCAA 600TTTCATCTGG CGATAATCCT GAAATGTTAT GAATAGTTCG AGCAAACTGC TTTTACCTGC 660TGCGGGTTAG TGCTAGTATG AAAAAGTGAG TCCTGTCCCG CTTCCTTCCT AATTGTAATT 720TTTCGTAATA ATGCGATGAA AACCTGCAAA GAGTGGCTTA TAGTTAAGCT AACAAACGAG 780AGGGCAAGTC CAGGTCAGTA AGTTTTTTCC ATCCCGAAAG GTGTCCGTTA GTTCAACCGC 840TAAGAAGGGG ACGCGTTATG GATGAATACT CACCCAAAAG ACATGATATC GCACAGCTTA 900AGTTTCTCTG TGAAACCCTG TATCATGACT GCCTTGCAAA CCTTGAAGAA AGCAATCATG 960GCTGGGTAAA CGACCCAACC TCGGCGATCA ACCTCCAGTT GAATGAACTG ATTGAGCATA 1020TTGCGACCTT CGCACTTAAT TACAAAATTA AGTATAATGA AGACAATAAG CTCATTGAGC 1080AGATCGACGA ATATCTGGAT GACACCTTTA TGTTGTTCAG TAGTTATGGT ATTAATATGC 1140AGGATCTTCA GAAATGGCGG AAGTCAGGTA AHCGACTATH CCGTTGTTTT GTCAATGCGA 1200CGAAAGAGAA TCCTGCGAGT TTATCTTGTT AGAATTATTA CAACCATAGG TAGAAGTATG 1260TCCGAAAAAC CTTTAACGAA AACCGATTAT TTAATGCGTT TACGTCGTTG CCAGACAATT 1320GACACGCTGG AGCGGTTTAW TCGAGAAAAA TAAATACGAA TTATCAGATA ATGAACTGGC 1380GGTATTTTAC TCAGCCGCAG ATCACCGCCT CGCCGAATTG ACCATGAATA AACTGTACGA 1440CAAGATCCCT TCCTCAGTAT GGAAATTTAT TCGCTAATAA ATAATTCGCT TTCGGAGCTA 1500TAACCGGCTG TTTATTAAGA ATTTTATACT TTTTCGCCAT GAAGACATAC CCTATGTGAT 1560CTTTATCACA CAGATGTAAT GGGAACGTTC TCTTCACTGA CTTTTCGTCT TACTGTGTTG 1620CCGCATTTTC AGCAACCGGA GTCAGTAATG AGCACAGAAA AAGAAAAGAT GATTGCTGGT 1680GAGTTGTATC GCTCGGCAGA TGAGACGTTA TCTCGCGATC GCCTGCGCGC TCGTCAGCTT 1740ATTCACCGAT ACAATCATTC CCTGGCGGAA GAGCACACAT TACGCCAGCA AATTCTCGCT 1800GATCTATTCG GTCAGGTGAC AGAGGCTTAT ATTGAGCCAA CGTTTCGCTG TGACTATGGC 1860TATAACATTT TTCTCGGTAA TAATTTTTTC GCCAACTTCG ATTGCGTGAT GCTTGATGTC 1920TGCCCTATTC GCATCGGTGA TAACTGTATG TTGGCACCAG GCGTTCATAT CTACACGGCA 1980ACACATCCCA TCGACCCTGT AGCACGTAAT AGCGGTGCTG AACTGGGGAA ACCCGTCACC 2040ATCGGTAATA ACGTCTGGAT TGGCGGACGC GCGGTCATTA ACCCTGGTGT GACCATTGGT 2100GATAACGTCG TGGTAGCCTC AGGTGCAGTT GTCACAAAAG ATGTCCCGGA CAACGTTGTC 2160GTGGGCGGTA ATCCAGCCAG AATAATTAAA AAATTGTAAT CGGTTTTTCG CAACTGTTAT 2220GCAAAATTGT GGTAGATCTG TTACTTCCCC TCTACTATTC CCACGTTAAA ATAGGGTGTT 2280CCCTGGAAAG TTGCAGATAC CACGAAGGCA AACGATGACC GAAATACAAC GCCTGCTGAC 2340CGAAACGATT GAGTCTCTGA ATACCCGCGA AAAACGCGAC AACAAACCCC GCTTTAGTAT 2400CAGTTTTATC CGTAAACATC CGGGGCTGTT TATCGGTATG TACGTTGCTT TTTTTGCCAC2460CCTGGCGGTG ATGTTGCAGT CCGAAACGCT GTCAGGCTCT GTCTGGCTAC TGGTTGTATT2520ATTTATCCTG CTTAATGGTT TCTTCTTTTT CGATGTCTAC CCACGCTACC GCTATGAAGA2580TATCGACGTG CTGGATTTCC GCGTTTGCTA TAACGGCGAA TGGTACAACA CGCGCTTTGT2640ACCTGCCGCG CTGGTTGAAG CCATCTTGAA CTCTCCGTGT CGCGGATGTT CATAAGGAAC2700AACTGCAAAA AATGATCGTC CGTAAAGGTG AACTGTCTTT TTACGATATT TTTACCCTCS2760TCGCGCCGAA TCAACATCTT AAGTTAGGGT TACATACCAG GCGTAAAGCT CTGCGCCTGG2820TCAAATGACA ATGATCGTTT CCACCCATCA CTTCATGAAA TACCAGCTCT ACCTCCTTAT2880CTCCAGCCAG CCTTTTTCCA CAATCAGATA TACTTTCCCT ACACTGTGTT AATAAGGATA2940TGCTGGTGAG AACACGACAT CTGGTCGGCC TTATTTCGGG AGTACTGATT CTTTCAGTAT3000TGCTGCCTGT CGGCTTAAGC ATCTGGCTGG CCCATCAGCA GGTAGAAACA TCGTTTATTG3060AAGAGCTGGA TACCTATTCC TCCCGCGTCG CTATTCGAGC CAATAAGGTG GCGACACAAG3120GGAAAGATGC GCTGCAG 3137SEQUENCE ID NO.4pMAC3中的3.2kb EcoRI-Pst片段的全長核苷酸序列。在mac基因編碼序列下也給出了由其編碼的Mac酶的胺基酸序列。GAATTCGCCAAAGACTTGATGGATAAAGAAGGTAAAGGTCTGATTGAAGCGACGCTTGAT 60GCGGTGCGGATGCGTTTACGTCCGATCCTGATGACCTCGCTGGCGTTTATCCTCGGCGTT 120ATGCCGCTGGTTATCAGTACTGGTGCTGGTTCCGGCGCGCAGAACGCAGTAGGTACCGGT 180GTAATGGGCGGGATGGTGACCGCAACGGTACTGGCAATCTTCTTCGTTCCGGTATTCTTT 240GTGGTGGTTCGCCGCCGCTTTAGCCGCAAGAATGAAGATATCGAGCACAGCCATACTGTC 300GATCATCATTGATACAACGTGTAATCACTAAGGCCGCGTAAGCGGCCTTTTTTATGCATA 360ACCTACGAACATTAAGGAGTAATTGAACCACCAACTCAGGATCTCATACGAAAACCAGTA 420TTAACCACGGATAAAATTCATAAAAAATACTGATTGTTAGTTAATTTATATTAAGTAGCG 480CTAATAGATTTAATAATCCATAATCATTTAGAGGCTATTCTTAATTATTTGCGGTAATTC 540TTTATTCATTCCTCGGTTATTACGTCATATTCAGAGCAATCCTGGTATTAGTGTCACCAA 600TTTCATCTGGCGATAATCCTGAAATGTTATGAATAGTTCGAGCAAACTGCTTTTACCTGC 660TGCGGGTTAGTGCTAGTATGAAAAAGTGAGTCCTGTCCCGCTTCCTTCCTAATTGTAATT 720TTTCGTAATAATGCGATGAAAACCTGCAAAGAGTGGCTTATAGTTAAGCTAACAAACGAG 780AGGGCAAGTCCAGGTCAGTAAGTTTTTTCCATCCCGAAAGGTGTCCGTTAGTTCAACCGC 840TAAGAAGGGGACGCGTTATGGATGAATACTCACCCAAAAGACATGATATCGCACAGCTTA 900AGTTTCTCTGTGAAACCCTGTATCATGACTGCCTTGCAAACCTTGAAGAAAGCAATCATG 960GCTGGGTAAACGACCCAACCTCGGCGATCAACCTCCAGTTGAATGAACTGATTGAGCATA1020TTGCGACCTTCGCACTTAATTACAAAATTAAGTATAATGAAGACAATAAGCTCATTGAGC1080AGATCGACGAATATCTGGATGACACCTTTATGTTGTTCAGTAGTTATGGTATTAATATGC1140AGGATCTTCAGAAATGGCGGAAGTCAGGTAAHCGACTATHCCGTTGTTTTGTCAATGCGA1200CGAAAGAGAATCCTGCGAGTTTATCTTGTTAGAATTATTACAACCATAGGTAGAAGTATG1260TCCGAAAAACCTTTAACGAAAACCGATTATTTAATGCGTTTACGTCGTTGCCAGACAATT1320GACACGCTGGAGCGGTTTAWTCGAGAAAAATAAATACGAATTATCAGATAATGAACTGGC1380GGTATTTTACTCAGCCGCAGATCACCGCCTCGCCGAATTGACCATGAATAAACTGTACGA1440CAAGATCCCTTCCTCAGTATGGAAATTTATTCGCTAATAAATAATTCGCTTTCGGAGCTA1500TAACCGGCTGTTTATTAAGAATTTTATACTTTTTCGCCATGAAGACATACCCTATGTGAT1560CTTTATCACACAGATGTAATGGGAACGTTCTCTTCACTGACTTTTCGTCTTACTGTGTTG 1620CCGCATTTTCAGCAACCGGAGTCAGTAATGAGCACAGAAAAAGAAAAGATGATTGCTGGT 1680M S T E K E K M I A GGAGTTGTATCGCTCGGCAGATGAGACGTTATCTCGCGATCGCCTGCGCGCTCGTCAGCTT 1740E L Y R S A D E T L S R D R L R A R Q LATTCACCGATACAATCATTCCCTGGCGGAAGAGCACACATTACGCCAGCAAATTCTCGCT 1800I H R Y N H S L A E E H T L R Q Q I L 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2460CCTGGCGGTGATGTTGCAGTCCGAAACGCTGTCAGGCTCTGTCTGGCTACTGGTTGTATT 2520ATTTATCCTGCTTAATGGTTTCTTCTTTTTCGATGTCTACCCACGCTACCGCTATGAAGA 2580TATCGACGTGCTGGATTTCCGCGTTTGCTATAACGGCGAATGGTACAACACGCGCTTTGT 2640ACCTGCCGCGCTGGTTGAAGCCATCTTGAACTCTCCGTGTCGCGGATGTTCATAAGGAAC 2700AACTGCAAAAAATGATCGTCCGTAAAGGTGAACTGTCTTTTTACGATATTTTTACCCTCS 2760TCGCGCCGAATCAACATCTTAAGTTAGGGTTACATACCAGGCGTAAAGCTCTGCGCCTGG 2820TCAAATGACAATGATCGTTTCCACCCATCACTTCATGAAATACCAGCTCTACCTCCTTAT 2880CTCCAGCCAGCCTTTTTCCACAATCAGATATACTTTCCCTACACTGTGTTAATAAGGATA 2940TGCTGGTGAGAACACGACATCTGGTCGGCCTTATTTCGGGAGTACTGATTCTTTCAGTAT 3000TGCTGCCTGTCGGCTTAAGCATCTGGCTGGCCCATCAGCAGGTAGAAACATCGTTTATTG 3060AAGAGCTGGATACCTATTCCTCCCGCGTCGCTATTCGAGCCAATAAGGTGGCGACACAAG 3120GGAAAGATGCGCTGCAG 313權利要求
1.一種具有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性的酶，其中所述酶含有如SEQ ID No.1所示的胺基酸序列，或其變體，同系物或片段。
2.一種具有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性的重組酶，其中，所述酶含有如SEQ ID No.1所示的胺基酸序列，或其變異體，同系物或片段。
3.一種具有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性的重組酶，其中，所述酶具有如SEQ ID No.1所示的胺基酸序列。
4.一種具有α(1，4)葡聚糖乙醯-轉移酶活性的重組酶，其中，所述重組酶可同用根據權利要求3所述的純化的重組酶製備的抗體發生免疫反應。
5.一種編碼如權利要求1到4中任一項所述的酶的核苷酸序列或與其互補的序列。
6.一種根據權利要求5所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列是一個DNA序列。
7.一種核苷酸序列，含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或其變異體，同系物或片段或與其互補的序列。
8.一種具有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列。
9.一種含有或表達本發明權利要求1到8的任何一個的構建體。
10.一種含有或表達本發明權利要求1到9的任何一個的載體。
11.一種含有或表達本發明權利要求1到10的任何一個的質粒。
12.一種含有或表達本發明權利要求1到11的任何一個的轉基因生物。
13.一種根據權利要求12所述的轉基因生物，其中所述轉基因生物是一種植物。
14.一種製備修飾糖類(優選的是澱粉)的方法，所述方法包括或表達或使用根據本發明權利要求1到13中的任何之一。
15.一種實質上如本文所描述的酶。
全文摘要
本發明公開了一種酶。該酶具有α(1,4)葡聚糖乙醯－轉移酶活性。
文檔編號C12N15/09GK1259997SQ97194352
公開日2000年7月12日 申請日期1997年3月7日 優先權日1996年3月13日
發明者F·達爾德甘, P·鮑爾森, J·馬庫森, S·奧克森波爾·索倫森 申請人:丹尼斯科有限公司