一種獲得轉基因玉米的方法

2023-12-10 04:14:36 2

專利名稱：：一種獲得轉基因玉米的方法
技術領域：
：本發明涉及一種獲得轉基因玉米的方法。
背景技術：
：自1983年第一株轉基因植物誕生以來，全球抗蟲、抗病、抗除草劑和品質改良的棉花、水稻、大豆、玉米等轉基因植物已達120多種，種植面積9000萬公頃。在基因工程中將外源目的基因導入植物體，並篩選出極少量的轉化細胞，建立一套高效安全的選擇方法極為重要。到目前為止廣泛用於選擇的標記基因主要有兩大類:一類是抗生素類，包括新黴素磷酸轉移酶基因"pf)、潮黴素磷酸轉移酶基因(力p。、卡那黴素抗性基因(邵t//)等;另一類是抗除草劑類，包括草丁膦抗性基因(&r)、草甘膦抗性基因(印印)等。這些存在於轉基因植物中的具有抗生素或除草劑抗性的標記基因是否會對環境及人類健康有不良影響和損害的爭論自轉基因植物誕生以來一直是人們關注的中心。目前，最為有效的辦法就是利用無爭議的生物安全標記基因。近年來發現的生物安全標記基因主要有綠色螢光蛋白基因(g/p)、核糖醇操縱子(rW)、甘露糖異構酶基因(，力等。木糖是半纖維素的主要組成部分，是自然界中含量僅次於葡萄糖的第二豐富的糖類。自然界中由木糖轉化為木酮糖的代謝途徑有兩條，其一存在於可利用木糖的真菌中，由木糖還原酶(XR)和木糖醇脫氫酶(XDH)共同作用下完成，NAD(P)H和NAD+分別作為XR和XDH的輔酶；其二主要存在於細菌中，通過木糖異構酶(XylA)—步轉化木糖為木酮糖，並且不需要任何輔助因子。在離體培養過程中，幾乎所有高等植物都不能以木糖作為唯一碳源。在大腸桿菌中，D-木糖能被木糖異構酶催化，轉變成木酮糖，再經過磷酸戊糖途徑分解代謝，為細菌生長所利用。Vieille等成功地克隆並表達了木糖異構酶基因O^W)，xyZ4編碼一個444個胺基酸殘基的多肽，該多肽的分子量為50892(Vieille等，Bivalentcationsandamino-acidcompositioncontributetothethermostabilityofBacillus//c/zemybz-m/sxyloseisomerase.EuropeanJournalofBiochemistry268:6291-6301，2001)，該酶最適pH為7.1，但在較寬的pH範圍內都具有相當高的活性(Sriprapundh等，Directedevolutionof7Tzer腳togawea/o/towoxyloseisomerase:highactivityonglucoseatlowtemperatureandlowpH.ProteinEngineeringDesign&Selection16:683-690，2003)。利用生物安全標記基因代替抗生素基因、抗除草劑基因進行外源目的基因的篩選，是今後基因工程研究的一個重要方向。
發明內容本發明的一個目的是提供一種獲得轉基因玉米的方法。本發明所提供的獲得轉基因玉米的方法，是將含有外源目的DNA、並以木糖異構酶基因為篩選標記的重組真核細胞表達載體導入玉米中，在含有D-木糖的愈傷組織誘導培養基中篩選愈傷組織，得到轉基因玉米。其中，所述用於篩選的愈傷組織誘導培養基中D-木糖的濃度具體可為15-30g/L。所述用於篩選的愈傷組織誘導培養基的基本培養基可為N6基本培養基；所述用於篩選的愈傷組織誘導培養基還含有7g/L硝酸銀、0-15g/L的蔗糖，和4mg/L的2,4-D。上述方法中，篩選得到的玉米愈傷組織轉入分化培養基中進行分化培養，分化出的苗轉入生根培養基中培養得到轉基因玉米植株。所述分化培養基中可含有濃度為15-30g/L的D-木糖。所述分化培養基的基本培養基具體可為N6基本培養基；所述分化培養基還含有1.5mg/LKT、0-15g/L蔗糖和4mg/L的2，4-D。上述方法中，所述木糖異構酶的胺基酸序列如GenBankAccessionNo.X04691所示。所述木糖異構酶的編碼序列具體可為GenBankAccessionNo.X04691的自5'端第201位至1535位脫氧核糖核苷酸。本發明克隆了大腸桿菌的木糖異構酶基因^K^，將其作為玉米遺傳轉化的篩選標記，並比較在不同木糖濃度的篩選培養基上的轉化效率，旨在建立以D-木糖為選擇劑的玉米愈傷組織的再生體系。結果表明，利用該篩選標記可以在含有不同濃度木糖的培養基上篩選出玉米再生植株，其中15-30g/L木糖的總體篩選效果較好，雖然在30g/L木糖的選擇培養基上，愈傷組織體積小、褐化嚴重、抗性愈傷率低，但從此培養基上篩選的愈傷組織其再生頻率和移栽成活率較高，故30g/L木糖篩選的綜合效果較好，木糖在篩選體系中不僅為植物細胞的生長提供碳源還對愈傷組織的分化和再生起了一定的促進作用。通過DNA點雜交、PCR及PCR-Southern等不同檢測方法對分子水平的木糖異構酶和目的基因進行檢測，證明外源篩選標記基因已經整合到轉基因玉米中，並可以在玉米中穩定表達，說明該篩選標記基因可用於玉米的遺傳轉化。本發明獲得轉基因玉米的方法中的篩選體系摒棄了存在潛在安全隱患爭議的抗生素和除草劑，利用植物自身代謝產物一木糖為選擇劑，是一種較為安全的新型篩選體系，可以提高玉米遺傳轉化自交系改良的成功率，並降低潛在生物安全隱患。圖1為大腸桿菌木糖異構酶基因(X/W)的克隆與表達載體的構建A為大腸桿菌木糖異構酶基因(義yW)的克隆B為重組載體pBAC405經"3MH和5"scl酶切後的酶切鑑定結果圖2為重組載體pBAC405的結構示意圖圖3為含有木糖異構酶基因(xyW)的玉米愈傷組織誘導、植株分化與移栽照片A為含有木糖異構酶基因(^fW)的玉米愈傷組織誘導B為轉基因小苗在含有D—木糖的培養基上的分化情況C為含有木糖異構酶基因(x/Z4)的轉基因再生植株D為含有木糖異構酶基因(zyW)的轉基因植株的溫室移栽情況圖4為含有木糖異構酶基因(x/M)的玉米轉化植株的DNA點雜交結果圖5為轉基因植株木糖異構酶基因(zyW)的PCR檢測結果圖6為轉基因植株木糖異構酶基因(;^Z4)的PCR—Southern檢測結果具體實施例方式玉米自交系178、478、501和ZP501K，為通用自交系材料，由北京市農林科學院生物技術研究中心提供。限制性內切酶購自NEB公司，pGEM-TeasyVector購自Promega公司，Tag酶購自TaKaRa公司，大腸桿菌(^sc/zen'c/LZ'acoh')菌株DH5a購於天根公司。實施例l、以木糖異構酶基因(;r/W)為篩選標記的表達載體pBAC405的構建1、木糖異構酶基因(xyX4)的克隆與序列分析提取大腸桿菌DH5a的基因組DNA,根據已發表AcoA'的;^W基因序列(GenBankAccessionNo.X0柳1，2011535，1335bp)設計上下遊引物，上遊引物P,(5'-gg力7TaTGGAGTTCAATATGCAAGCCTA-3')、下遊引物P2(5'-g4gC76M7X4TTTGTCGAACAGATAATGGTTT-3')。上下遊引物分別引入酶切位點ifey^l和5^cl，並在下遊引物上加入兩個連續的終止密碼子，以確保木糖異構酶正確表達並及時終止。以所設計的義7^基因特異引物進行PC財廣增，克隆出;u^4基因片段，然後進行電泳檢測，電泳結果如圖1中A，表明得到了1.4kb的木糖異構酶基因(xyW)片段。圖1中A，M:lkbladder分子量標記；1、2、3:x/W基因PCR擴增結果。凝膠回收並純化l.4kb的木糖異構酶基因(x7W)片段，與pGEM-TeasyVector進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，挑選陽性克隆，酶切鑑定。將酶切檢測結果正確的質粒送到上海生工進行Sp6/T7雙向測序。測序結果表明，所克隆序列與GenBankAccessionNo.X04691的自5'端第201位至1535位脫氧核糖核苷酸相同。將含有該^F^片段的重組載體命名為pTxylA。2、以木糖異構酶基因(xyW)為篩選標記的表達載體pBAC405的構建1)用&cI和fcoRI從p35SGFP(美國Clontech公司)切下260bp的根癌農桿菌胭脂鹼合成酶基因(Nos)的終止子(Nos3'),插入到克隆載體pSP72(2462bp)(購自美國Promega公司的)的6^cI和fcoRI位點，得到重組載體pBPC18。2)以質粒p35SGFP為模板，用上遊引物5，-CTGAAGCTTGCGGCCGCTTCGGCCGTCTAG;與下遊引物5，-GGCCTGCAGGTCGTCCTCTCCAAATGAAAT，進行PCR，擴增得到460bp大小的CaMV35S啟動子。將該擴增產物用歷'Miin和/^rt雙酶切後插入到pBPC18的歷/7dlII和/^rt酶切位點之間，得到重組載體pBPC25。3)以玉米(品種黃早四)基因組DNA為模板，用玉米脫氫酶基因第l個內含子的上遊引物5，-CAGGTCGACGGATCAAGTGCAAAGG;與下遊引物5，-GATGGATCCGTCCGCAGCTGCACGGGT，進行PCR，擴增得到560bp大小的Adhl基因第l個內含子。將該PCR產物用5^il和^3/^I雙酶切後插入到pBPC25的6"a2I和^37dn酶切位點之間，得到重組載體pBPC28。4)將質粒pBPC28用歷'7K/III酶切，用DNA聚合酶Klenow大片段補平後，與含有^boyn酶切位點的連接子(linker,5，-CCGGAATTCCGG)連接，得到重組載體pBPC29。5)凝膠回收pTxylA經萬avdn、5"acl雙酶切產生的約1.4kb目標片段;^W，插入到質粒pBPC29的^/dH和6^cI識別位點之間，將兩片段連接並轉化ADH5a，獲得的陽性克隆命名為pBAC405。對pBAC405進行酶切檢測，結果如圖1中B，結果表明，得到了1.4kb大小的插入片段和4kb的載體片段。圖1中B，M:lkbladder分子量標記;4、5、6、7:pBAC405經^3/dH和5"scI酶切後的酶切鑑定結果。pBAC405的結構示意圖如圖2。實施例2、玉米幼胚愈傷組織在不同木糖濃度的培養基上的篩選及再生取玉米自交系178、478、501和ZP501K授粉後1011d的玉米幼胚(大小為l2隱)，放入幼胚愈傷誘導培養基(N6基本培養基，10mg/L硝酸銀，7g/L瓊脂，100mg/L肌醇，30g/L蔗糖，pH5.8)中，26"下暗培養12周。按張曉東等人(2003)(張曉東，梁榮奇，陳緒清，楊鳳萍,張立全。優質H麗谷蛋白亞基轉基因小麥的獲得及其遺傳穩定性和品質性狀分析，科學通報，48(5):474-479，2003。)的方法進行基因槍微彈的製備。用PDS1000/He系統對以上4種材料的幼胚愈傷組織進行轉化，基因槍轉化後的愈傷組織，26"C下暗培養1周，轉入含有不同D-木糖濃度梯度0%(Og/L)、33%(10g/L)、50%(15g/L)、80%(24g/L)和100%(30g/L)的篩選培養基(N6基本培養基+硝酸銀7g/L+2，4-D4mg/L，瓊脂粉7g/L)上繼續暗培養23周，篩選玉米幼胚愈傷組織。表l中的數據是抗性愈傷率(％)(是經過篩選後正常狀態的愈傷組織(質地鬆軟、顆粒狀、顏色淡黃)與總愈傷組織的百分比)。自交系178總共轉化了4505個愈傷組織，每種濃度木糖篩選培養上篩選901個愈傷組織，在0%、33%、50%、80%和100%木糖篩選培養基上分別得到721、525、411、361、318個抗性愈傷組織；自交系478總共轉化了8501個愈傷組織，每種濃度木糖篩選培養上篩選1700個愈傷組織，在0%、33%、50%、80%和100%木糖篩選培養基上分別得到1700、743、755、1061、661個抗性愈傷組織；自交系ZP501K總共轉化了2122個愈傷組織，每種濃度木糖篩選培養上篩選424個愈傷組織，在0%、33%和50%木糖篩選培養基上分別得到424、115、162個抗性愈傷組織，80%和100%木糖篩選培養基上的愈傷由於汙染未得到數據；自交系501總共轉化了8550個愈傷組織，每種濃度木糖篩選培養上篩選1710個愈傷組織，在0%、33%、50%、80%和100%木糖篩選培養基上分別得到1539、1082、979、799、1079個抗性愈傷組織。具體結果如表l所示，表明同一基因型的玉米自交系在不同木糖濃度的篩選培養基上的抗性愈傷率(％)有差異，總體趨勢是抗性愈傷率(％)隨著木糖濃度的提高而降低。當木糖濃度達到33%以上，抗性愈傷率(％)幾乎降低1倍，隨著木糖濃度的提高，愈傷組織的質地變差，在100%木糖的選擇培養基上，愈傷組織體積小、褐化嚴重。_表l不同濃度木糖篩選培養基上抗性愈傷率(％)tableseeoriginaldocumentpage72，4-D4mg/L+蔗糖30g/L，瓊脂粉7g/L，pH5.8)，含有33XD-木糖的篩選培養基的組成為N6基本培養基+硝酸銀7g/L+2,4-D4mg/L+蔗糖20g/L+D-木糖10g/L，瓊脂粉7g/L，pH5.8)，含有50%0-木糖的篩選培養基的組成為N6基本培養基+硝酸銀7g/L+2，4-D4rag/L+蔗糖15g/L+D-木糖15g/L，瓊脂粉7g/L，pH5.8)，含有80%D-木糖的篩選培養基的組成為N6基本培養基+硝酸銀7g/L+2,4-D4mg/L+蔗糖6g/L+D-木糖24g/L，瓊脂粉7g/L，pH5.8)，含有100%D-木糖的篩選培養基的組成為N6基本培養基+硝酸銀7g/L+2，4-D4mg/L+D-木糖30g/L，瓊脂粉7g/L，pH5.8)。將上述自交系178、478、501、ZP501K的經過不同木糖濃度誘導培養基上選擇形成的抗性愈傷組織(愈傷組織質地差和褐化的愈傷組織未計算在內)，轉入到含有50%木糖濃度的分化培養基(N6基本培養基+KT1.5mg/L+蔗糖15g/L+D—木糖15g/L，瓊脂粉7g/L，pH5.8)進行分化培養，在26。C分化培養24-30天,分化結束後轉入無選擇壓的培養基(MS基本培養基+蔗糖30g/L，瓊脂粉7g/L，pH5.8)上壯苗生根，煉苗35天後，帶基質移栽至大田。具體結果如表2。生長在無選擇劑培養基上的對照愈傷在轉入含有50%木糖的分化培養基後，由於突然接觸篩選劑其再生效率明顯降低，其它木糖濃度篩選出的愈傷組織總數少但再生效率隨著初始篩選濃度的增高而增大。玉米自交系幼胚愈傷的誘導、分化與移栽見圖3。37株移栽成活的轉基因玉米株系478的再生株系IO株，其中，來自33%、50%、80%、100%木糖濃度篩選的分別為1株、5株、l株、3株；ZP501K的再生株系2株，都是來自50%木糖濃度的篩選結果；178的再生株系13株，其中，來自33%、50%、80%、100%木糖濃度篩選的分別為2株、7株、2株、2株；501的再生株系12株，其中，來自50%、80%、100%木糖濃度篩選的分別為5株、2株、5株；進行人工授粉自交結實。24株成活T。代轉基因植株正常結實178的再生株系8株，其中，來自33%、50%、80%、100%木糖濃度篩選的分別為1株、4株、2株、l株；ZP501K的再生株系1株，都是來自50%木糖濃度的篩選結果；478的再生株系7株，其中，來自33%、50%、80%、100%木糖濃度篩選的分別為l株、4株、l株、l株；；501的再生株系8株，其中，來自50%、80%、100%木糖濃度篩選的分別為4株、l株、3株。表2四個自交系在不同濃度的木糖選擇壓力獲得愈傷組織的植株分化情況complextableseeoriginaldocumentpage880%9655.21360100%1201613.331275玉米幼胚的抗性愈傷率(％)、再生頻率及移栽成活率(表1，表2)結果表明50%100%木糖篩選濃度的總體篩選效果較好。具體的木糖篩選效率還要考慮玉米基因型的影響。實施例3、178、478、501、ZP501K的轉基因再生玉米株系中木糖異構酶的檢測1、轉基因玉米的DNA點雜交和PCR檢測木糖異構酶篩選標記基因按CTAB法提取實施例2中移栽成活的24株結實的T。代轉基因植株玉米葉片基因組DNA，將基因組DNA按Bio-Rad公司Bio-Dot點雜交的使用手冊進行點膜。按Roche公司的DIGDNALablingandDetectionKit的使用手冊進行雜交和檢測。用地高辛(DIG)標記按照實施例l中的方法得到的1.4kbX7"基因作為探針，對24株結實的T。代轉基因植株進行DNA點雜交檢測，如圖4所示，表明17株轉化株有較強信號。圖4中A1、Cl:質粒pBAC405;A2、C2:陰性對照株(為178非轉基因植株);A3、C3:陰性對照株(為478非轉基因植株)；A4、C4:空白對照(蒸餾水)；其他假定轉入重組質粒pBAC405的轉化株。結果有17株信號較強，說明有17株再生玉米植株可能有外源"^4基因的轉入。上述初步篩選的17株陽性植株再利用xyW基因的特異引物Pi和P2進行PCR檢測，結果如圖5所示，圖5中M:lkbladder分子量標記;1:質粒pBAC405;2:陰性對照株(178的非轉基因植株)；319:轉入木糖異構酶基因的株系。其中有14株擴增出1.4kb目標條帶，其中，玉米自交系178、478、501、ZP501K分別5株、2株、6株和1株。說明點雜交初篩的17株T。代轉基因植株有3株為假陽性植株，另外14株的木糖異構酶基因已經整合到玉米基因組中。2、轉基因玉米的PCR—Southern雜交檢測按照Roche公司PCRDIGProbeSynthesisKit的使用手冊提供的步驟，用地高辛(DIG)標記按照實施例l中的方法得到的1.4kb,y^基因作為探針，對17株點雜交檢測為陽性的T。代轉基因幼苗再進行PCR-Southern雜交檢測。對17株點雜交檢測為陽性的T。代轉基因幼苗的基因組DNA利用基因的特異引物Pt和h進行PCR擴增，將PCR產物按照785型真空吸印儀(Bio-Rad)使用手冊進行DNA轉膜，信號檢測按照Roche公司的DIGDNALabelingandDetectionKit的使用手冊提供的方法進行。結果如圖6所示，圖6中M:lkbladder分子量標記；1:陽性對照質粒pBAC405;2:178非轉基因植株；3:空白對照(蒸餾水)；420:轉入木糖異構酶基因的植株。雜交結果表明，泳道l的陽性對照質粒在1.4kb處有特異條帶，而泳道2的非轉基因植株和泳道3的空白對照沒有出現特異雜交信號。泳道420的轉基因植株，14株經步驟1的PCR檢測為陽性的轉化植株在1.4kb處有特異條帶。分子雜交進一步說明了14株轉化植株的外源基因^F7/I已經整合到了玉米基因組中。序列表〈160〉61〈211〉29〈212〉DNA〈213〉人工序列1ggatccatggagttcaatatgcaagccta29〈210>2<211〉32〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉2gagctcattatttgtcgaacagataatggttt323〈211>30<212〉DNA<213〉人工序列<400〉3ctgaagcttgcggccgcttcggccgtctag30<210〉4<211〉30人工序列〈400>4ggcctgcaggtcgtcctctccaaatgaaat30〈210〉5〈211〉25<212〉DNA人工序列〈400>5caggtcgacggatcaagtgcaaagg25627〈212〉DNA人工序列<400〉6gatggatccgtccgcagctgcacgggt2權利要求1、一種獲得轉基因玉米的方法，是將含有外源目的DNA、並以木糖異構酶基因為篩選標記的重組真核細胞表達載體導入玉米中，在含有D-木糖的愈傷組織誘導培養基中篩選愈傷組織，得到轉基因玉米。2、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述用於篩選的愈傷組織誘導培養基中D-木糖的濃度為15-30g/L。3、根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述D-木糖的濃度為30g/L。4、根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於所述用於篩選的愈傷組織誘導培養基的基本培養基為N6基本培養基；所述用於篩選的愈傷組織誘導培養基還含有7g/L硝酸銀、0-15g/L的蔗糖和4mg/L的2，4-D。5、根據權利要求1至4中任一所述的方法，其特徵在於所述方法中，篩選得到的玉米愈傷組織轉入分化培養基中進行分化培養，分化出的苗轉入生根培養基中培養，得到轉基因玉米植株。6、根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述分化培養基中含有濃度為15-30g/L的D-木糖。7、根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述分化培養基中含有濃度為15g/L的D-木糖。8、根據權利要求6或7所述的方法，其特徵在於所述分化培養基的基本培養基為N6基本培養基；所述分化培養基還含有1.5mg/L的KT、0-15g/L蔗糖和4mg/L的2，4-D。9、根據權利要求1至8中任一所述的方法，其特徵在於所述木糖異構酶的胺基酸序列如GeneBankAccessionNo.X04691所示。10、根據權利要求9的方法，其特徵在於所述木糖異構酶的編碼序列為GenBankAccessionNo.X04691的自5'端第201位至1535位脫氧核糖核苷酸。全文摘要本發明公開了一種獲得轉基因玉米的方法。該獲得轉基因玉米的方法，是將含有外源目的DNA、並以木糖異構酶基因為篩選標記的重組真核細胞表達載體導入玉米中，在含有D-木糖的愈傷組織誘導培養基中篩選愈傷組織，得到轉基因玉米。本發明獲得轉基因玉米的方法中的篩選體系摒棄了存在潛在安全隱患爭議的抗生素和除草劑，利用植物自身代謝產物——木糖為選擇劑，是一種較為安全的新型篩選體系，可以提高玉米遺傳轉化自交系改良的成功率，並降低潛在生物安全隱患。文檔編號C12N15/11GK101173277SQ200710176258公開日2008年5月7日申請日期2007年10月23日優先權日2007年10月23日發明者張曉東,張立全,楊鳳萍,梁榮奇,郭新梅,陳緒清申請人:北京市農林科學院