一種酶法轉化L‑丙氨酸製備丙酮酸的方法與流程
2023-12-10 07:00:52 1
本發明屬於丙酮酸的製備技術領域，涉及一種酶法轉化L-丙氨酸製備丙酮酸的方法。
背景技術：
丙酮酸（焦性葡萄酸）是參與整個生物體基本代謝的中間產物之一。丙酮酸參與生物體的糖代謝、膠質、胺基酸、蛋白質等的生化合成、代謝、醇的發酵等，可以通過乙醯COA和三羧酸循環實現體內糖、脂肪和胺基酸之間的相互轉化，在三大營養物質的代謝聯繫中起著重要的樞紐作用。
丙酮酸在生產領域具有重要的作用，是生產色氨酸、苯丙氨酸和維生素B的主要原料，也是合成L-多巴的原料，在有機合成和生化研究領域具有重要作用。
目前中國主要依賴進口丙酮酸類產品，市場上主要採用的是發酵法、化學合成法、酶轉化法。日本在生產左旋丙酮酸方面處於國際領先地位，主要採用的是生物發酵的方法，但發酵法製取丙酮酸轉化率往往較低，因為丙酮酸在糖代謝中處於最活躍的中心節點，在細胞中很容易轉化為其他化合物, 因此很難累積，而且，丙酮酸作為發酵產物混合物的一種成分，往往是相當低濃度的，從複雜的發酵液中分離提取丙酮酸，一般是難以進行的，費用也較昂貴。化學合成的方法主要採用乳酸氧化法，以乳酸為原料，氧化脫氫一步法生產丙酮酸。但乳酸直接製取丙酮酸非常困難,根據工藝不同必須選用合適的催化劑。可以選擇的催化劑有磷酸鐵、鉬酸碲鹽、銀、釩等。但缺點是成本較高，約6萬元每噸。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是針對上述存在的缺陷而提供一種酶法轉化L-丙氨酸製備丙酮酸的方法，具有成本低廉、純度高、無汙染的優點。
本發明採用酶法轉化L-丙氨酸製備丙酮酸的方法，利用固定化的L-胺基酸氧化酶轉化L-丙氨酸製備丙酮酸。
本發明的利用酶法轉化L-丙氨酸製備丙酮酸的方法，其詳細步驟為：
步驟1、向溼菌體溶液中加入丙烯醯胺單體和交聯劑N,N-甲叉雙丙烯醯胺，在加速劑四甲基乙二胺和催化劑過硫酸銨的作用下聚合交聯成三維網狀的固定化酶凝膠，進而製取固定化的L-胺基酸氧化酶；
步驟2、以L-丙氨酸作為反應底物，在上述固定化的L-胺基酸氧化酶的作用下氧化脫氨得到L-丙酮酸。
溼菌體為含有L-胺基酸氧化酶的大腸桿菌體。
溼菌體溶液為溼菌體矽油-水溶液
矽油-水溶液的濃度為80%。
步驟1中，製取溼菌體溶液的方法為：將溼菌體均勻的分散在矽油-水溶液中，在超聲波細胞破碎機進行低溫破碎，過濾去除菌體殘片，即得到溼菌體溶液。
步驟1中，所述丙烯醯胺單體加入量為所述溼菌體溶液重量的200%-600%，所述交聯劑N,N-甲叉雙丙烯醯胺加入量為溼菌體溶液重量的2.5%-5%，所述加速劑四甲基乙二胺加入量為溼菌體溶液重量的5%-8%，所述催化劑過硫酸銨的加入量為溼菌體溶液重量的2%-5%。
步驟1中，將三維網狀的固定化酶凝膠攪拌均勻，用水洗滌凝膠，過濾後得固體，即為固定化的L-胺基酸氧化酶。
步驟2中，氧化脫氨時，控制反應溫度、溶氧量、調節pH，所述控制反應溫度為25℃-35℃，所述pH為6.0-7.5，所述溶氧量為410-450mg/L。
本發明具有以下特點：
（1）固定化酶催化的最適反應溫度為30℃-35℃；
（2）固定化酶催化的最適pH為6.5；
（3）極易將固定化酶與底物、產物分開；
（4）固定酶的使用效率高，成本降低。
本發明的有益效果為：本發明的酶法轉化L-丙氨酸製備丙酮酸的方法，以L-胺基酸為底物，利用製備的固定化酶，進行生物轉化，獲得產物丙酮酸。固定化酶極易於產物丙酮酸、底物L-胺基酸分開，底物轉化率高，雜質少，成本低，生產每噸丙酮酸成本大約1.3萬元，反應條件溫和，容易控制。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明的技術方案進行詳細的說明。
實施例1：將溼菌體80g均勻的分散在80%矽油-水溶液100ml中，在750W赫茲的超聲波中，低溫15℃進行破碎，採用3s-2s-3s的方式進行破碎15分鐘，向菌體溶液中加入2倍量的丙烯醯胺單體和2.5%的交聯劑N,N-甲叉雙丙烯醯胺，在加速劑四甲基乙二胺（加入量5%）和催化劑過硫酸銨（加入量2%）的作用下聚合交聯成三維網狀的固定化酶凝膠，之後攪拌均勻，用水洗滌凝膠，過濾後得固體，即為固定化酶。
將L-丙氨酸89g溶解在純化水中，配置成8.9%溶液，升溫至30℃，向反應液中加入固定化酶19g，酶活774U，控制溶氧410-450mg/L，反應PH在6.0，反應3h後取樣，經高效液相檢測上清液丙酮酸濃度（80g/L）和L-丙氨酸(≤0.5g/L)剩餘，當L-丙氨酸剩餘小於等於0.5g/L時，認為反應完全，所得料液降溫至室溫，過濾去除固定化酶，將料液濃縮至含丙酮酸30%，向料液中加入活性炭10g，攪拌脫色30分鐘，脫碳過膜後，繼續減壓濃縮得無色粘稠液體106g，即為丙酮酸粗品,轉化率≥99%，純度≥98%。
實施例2：將溼菌體90g均勻的分散在80%矽油-水溶液100ml中，在800W赫茲的超聲波中，低溫15℃進行破碎，採用3s-2s-3s的方式進行破碎15分鐘，向菌體溶液中加入5倍量的丙烯醯胺單體和4%交聯劑N,N-甲叉雙丙烯醯胺，在加速劑四甲基乙二胺（加入量6%）和催化劑過硫酸銨（加入量4%）的作用下聚合交聯成三維網狀的固定化酶凝膠，之後攪拌均勻，用水洗滌凝膠，過濾後得固體，即為固定化酶。
將L-丙氨酸95g溶解在純化水中，配置成9.5%溶液，升溫至32℃，向反應液中加入固定化酶22g，酶活879U，控制反應PH在6.5，溶氧410-450mg/L，反應5h取樣，經高效液相檢測上清液丙酮酸濃度（86g/L）和L-丙氨酸（≤0.5g/L）剩餘，當L-丙氨酸剩餘小於等於0.5g/L時，認為反應完全，所得料液降溫至室溫，過濾去除固定化酶，將料液濃縮至含丙酮酸30%，向料液中加入活性炭10g，攪拌脫色30分鐘，脫碳過膜後，繼續減壓濃縮得無色粘稠液體115g，即為丙酮酸粗品，轉化率≥99%，純度≥98%。
實施例3：將溼菌體100g均勻的分散在80%矽油-水溶液100ml中，在850W赫茲的超聲波中，低溫15℃進行破碎，採用3s-2s-3s的方式進行破碎15分鐘，向菌體溶液中加入6倍量的丙烯醯胺單體和5%的交聯劑N,N-甲叉雙丙烯醯胺，在加速劑四甲基乙二胺（加入量8%）和催化劑過硫酸銨(加入量5%)的作用下聚合交聯成三維網狀的固定化酶凝膠，之後攪拌均勻，用水洗滌凝膠，過濾後得固體，即為固定化酶。
將L-丙氨酸100g溶解在純化水中，配置成10%溶液，升溫至35℃，向反應液中加入固定化酶25g，酶活987U，控制反應PH在7.5，溶氧410-450mg/L，反應5h取樣，經高效液相檢測上清液丙酮酸濃度（92g/L）和L-丙氨酸剩餘（≤0.5g/L），當L-丙氨酸剩餘小於等於0.5g/L時，認為反應完全，所得料液降溫至室溫，過濾去除固定化酶，將料液濃縮至含丙酮酸30%，向料液中加入活性炭10g，攪拌脫色30分鐘，脫碳過膜後，繼續減壓濃縮得無色粘稠液體120g，即為丙酮酸粗品，轉化率≥99%，純度≥98%。