一種螢光定量rt-pcr檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法

2023-12-09 03:31:06 1

專利名稱：一種螢光定量rt-pcr檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法
技術領域：
:本發明涉及一種螢光定量RT-PCR檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法，屬疫苗質量檢測技術領域。
背景技術：
:豬痕(Classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(Classical swine fevervirus, CSFV)引起的一種急性、發熱性、高度接觸性的病毒性傳染病。是養豬業的一種毀滅性傳染病，幾乎遍及全世界，死亡率高達80% 90%，國際動物衛生組織將豬瘟列入A類法定傳染病之一。目前，疫苗接種仍然是預防和控制豬瘟的重要手段，在20世紀50年代中期，中國學者通過將豬瘟石門系強毒在兔體上連續傳幾百代後培育成功了一株豬瘟兔化弱毒疫苗。該疫苗是國際公認的最安全有效的弱毒疫苗，在我國乃至全球得到廣泛應用，在1976年在由聯合國糧農組織和歐共體召開的專家會議上，專家一致認為中國創製的豬瘟兔化弱毒疫苗的應用對控制和消滅歐洲的豬瘟做出了重大貢獻。經歷了半個世紀的風雨洗禮，該疫苗的地位和價值至今無可動搖。國內使用豬瘟兔化弱毒疫苗，使豬瘟大規模流行得到了有效的控制，但豬瘟局部地區流行仍時有發生，防治豬瘟仍然是我國養豬業的重要任務。疫苗病毒抗原含量的高低是疫苗質量的關鍵指標。傳統的檢驗方法主要是通過疫苗注射後檢測免疫動物血清·來確定疫苗效價，如使用兔體定型熱反應法、ELISA、免疫過氧化酶單層實驗、血清中和實驗等，但隨著生物技術的快速發展，這些方法已經越來越凸顯出其劣勢:如免疫動物後才能確定疫苗的質量，需時長，操作過程繁瑣、由於動物個體差異導致準確度低等，無法滿足現有的需要。各疫苗廠家生產的豬瘟兔化弱毒疫苗的效果存在一定差異，因此，建立Taqman螢光定量RT-PCR技術來檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的病毒含量，具有極其重要的意義
發明內容
:本發明的目的在於提供一種省時、省力，特異性高、重複性好、敏感度高的螢光定量RT-PCR檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法。本發明的螢光定量RT-PCR檢測豬藍耳病弱毒疫苗病毒含量的方法的步驟如下:1、通過生物學軟體DNAstar比對GenBank資料庫中登錄的中國國內測序的6株豬瘟兔化弱毒的毒株全序列，最終選擇登錄號為AF091507的基因序列，並在其高度保守區5'端開放閱讀框區域設計一對標準品引物(SEQ ID N0.USEQ ID N0.2)以及一對定量用引物(SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4)和一條探針(SEQ ID N0.5)。引物及探針詳情如表1-1和表1-2。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2用於構建標準濃度的質粒；SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4擴增包含於SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2擴增產物片段之內的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒cDNA ； SEQ ID NO:5為Taqman螢光探針，在其5』端標記報告螢光基團FAM，3』標記猝滅螢光基團TAMRA，用於建立螢光定量PCR標準曲線及檢測未知樣品；表1-1標準品引物相關參數Tabl-1 Parameters of the Standard Primer
權利要求
1.一種螢光定量RT-PCR檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法，包括用於實時螢光定量RT-PCR檢測豬瘟病弱毒疫苗病毒含量的特異性引物、標準質粒的製備及建立標準曲線、確定實驗的成立標準、確定陽性或陰性的判定標準，其具體特徵如下: (I)引物特徵: SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2能特異性擴增豬瘟兔化弱毒疫苗病毒的cDNA，擴增產物大小為197bp，用於構建標準濃度的質粒； SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4能特異性擴增包含於SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2擴增產物片段之內的豬瘟兔化弱毒疫苗病毒cDNA，擴增產物大小為143bp，SEQ ID NO:5為Taqman螢光探針，在其5』端標記報告螢光基團FAM，3』標記猝滅螢光基團TAMRA，用於建立螢光定量PCR標準曲線及檢測未知樣品； (2 )標準曲線的建立方法: 提取豬瘟兔化弱毒疫苗的RNA，並反轉錄為cDNA，作為模板；以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2為引物，進行PCR擴增；將擴增產物純化回收，連接到PMD19-T載體上，轉化到感受態細胞DH5 α內，提取質粒DNA，獲得豬瘟兔化弱毒疫苗檢測用的標準濃度質粒； 將製備的標準質粒作10倍梯度稀釋 ，以稀釋液為模板，進行螢光定量PCR，採集螢光信號，使用Bio-Rad iQ5軟體繪製出實時螢光定量標準曲線，並獲得其產物Tm值； (3)實驗成立標準: 若陽性對照的Ct值 35，電腦繪製的標準曲線各點相關度大於95%，反應效率在80% 120%之間，則說明實驗數據準確、有效，實驗成立； (4)判定陽性或陰性的標準: 在實驗成立的前提下，待測樣品的Ct值 35則判為陰性。
全文摘要
本發明涉及一種螢光定量RT-PCR檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法, 屬疫苗質量監測技術領域。本發明方法包括特異性引物及Taqman螢光探針的設計、RNA提取、cDNA製備、標準質粒構建、Taqman螢光定量PCR檢測標準曲線的建立、有效性驗證和結果判定。設計合成了兩對引物，均能特異性擴增豬瘟兔化弱毒病毒的cDNA，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2擴增產物大小為197bp，用於構建標準濃度的質粒，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4擴增產物大小為143bp，包含於前述擴增產物197bp之內,加入螢光探針SEQ ID NO.5用於Taqman螢光定量RT-PCR檢測豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量。本發明方法檢測靈敏度高，檢測時間短，能同時進行大批量的樣本分析，具有良好的敏感性、特異性、重複性，適用於各品牌豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的測定。
文檔編號G01N21/64GK103224996SQ20131012340
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月10日 優先權日2013年4月10日
發明者張以芳, 馬志亮, 範斌, 柴俊, 孫亭亭, 鄒豐才, 劉嶽, 柳桐, 楊潔 申請人:雲南農業大學