一種促進動物生長的口服重組dna疫苗及應用的製作方法

2023-12-08 19:45:11 3

專利名稱：一種促進動物生長的口服重組dna疫苗及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於動物基因工程技術領域，具體涉及一種促進動物生長的口服重組DNA疫苗及應用。
背景技術：
動物生長是遺傳、營養、環境和激素調節等因素綜合影響的結果，其中加強品種改良、提供全價營養及提供適宜的環境已成為提高動物生產性能的行之有效的途徑，但其作用最終是通過神經內分泌的整合、調控得以實現。目前，通過改變激素分泌以調控動物生長是當前研究的熱點之一。隨著激素免疫學的興起與發展，激素免疫中和技術(Hormone Immunoneutralization，HIN)應運而生，即主動誘導或被動輸入抗激素抗體以中和內源性激素的生物活性。動物的生長是一個複雜的生理過程，形成了以生長激素為核心的生長軸，生長激素(Growth Hormone，GH)可以調節機體的營養分配，促進骨骼生長，促進蛋白質合成和減少脂肪沉積，GH的生成、釋放受到下丘腦生長激素釋放因子(Growth Hormone Release Factor，GHRF)和生長抑素(Somatostatin，SS)的雙重調節，GHRF促進GH的分泌，機體內SS的濃度與生長速度間存在著顯著的負相關，從而提示了可以通過降低體內SS的濃度來促進GH的釋放。生長抑素(SS)是下丘腦釋放的14肽激素，在動物體內具有廣泛的抑制作用，特別是對生長及免疫反應具有明顯的影響，促使許多學者致力於通過耗竭或免疫中和體內的SS水平相應提高GH等水平促進動物生長。SS與載體構建成抗原後，所產生的抗體與SS結合，能阻斷SS與受體作用；同時在肝臟的作用下，加速循環中SS的清除，從而促進GH等多種激素的釋放。早在1981年Spencer等將合成肽SS聯接於人α-球蛋白，製成複合抗原(合成肽疫苗)，免疫3周齡綿羊，試驗組生長速度是對照組的17.6％，證實了SS主動免疫能夠促進動物生長。SS免疫羔羊的採食量降低10％，但飼料轉化率提高14％，羔羊16周即達30kg屠宰體重，而對照羔羊則需20周(Spencer GSG等，Increased growth in lambs following auto-immunization against somatostatin，Anim.Prod，1981，32376-382)。曾義祥等化學合成了SS基因，並在大腸桿菌中成功地表達了β-半乳糖苷酶(β-gal)與SS的融合蛋白，用以製備SS基因工程苗(曾義祥等，生長抑制激素基因在大腸桿菌中的表達，遺傳學報，1989(3)282-288)。通過免疫大白鼠試驗，取得了一定的增重效果，但由於從菌體中提取SS需用親和層析法，因而生產成本較高。另外該基因工程疫苗由於一個分子只與一個β-gal分子相連，即一個載體分子上只有一個半抗原決定簇，免疫原性較差。劉永慶等利用大腸桿菌高效表達系統pET32，高效、穩定地表達了SS，獲得了免疫原性較好的SS亞單位疫苗(劉永慶等，生長抑素(SS)基因在pET32表達系統中的高效表達，南京農業大學學報，2003，26(1)61-65)。該融合蛋白具有較好的免疫原性與增重效果，但要作為疫苗推廣應用，必須經過純化過程，而該表達產物是以硫氧還原蛋白為載體，提純較困難。另外，動物試驗時的硫氧還原蛋白載體效應太強烈，也影響了該疫苗的推廣應用(劉永慶等，生長抑素(SS)與硫氧還原蛋白(Thioredoxin)相融合生成的2種基因工程化融合蛋白SS-N/X和SS-N/S的表達特性，中國獸醫學報，2003，23(2)172-176)。徐文忠等將SS與HBsAg的融合基因(HBsAg/SS)克隆到痘苗病毒表達質粒pGJP-5中，通過與痘苗病毒天壇株感染細胞內重組和蝕斑挑選技術獲得含融合基因的重組病毒(VV-HBsAg/SS)(徐文忠等，生長抑素與B肝表面抗原融合基因重組痘苗病毒的構建及其表達，南京農業大學學報，1992(3)74-80)，它保持了痘苗病毒原有的感染性，表達的HBsAg/SS雜合顆粒具有SS的免疫原性。將VV-HBsAg/SS接種到雞胚中培養，可生產出能表達HBsAg/SS的痘苗病毒活載體苗，再製成凍乾粉，被命名為激生1號痘苗。該苗的不足之處在於重組痘苗病毒作為活載體苗直接免疫動物，初次免疫後，動物體內產生抗病毒體，再次免疫時病毒不能大量複製，影響免疫效果；其次還存在減毒病毒毒力回升的風險。為彌補此缺點，杜念興等相繼設計研製了生長抑素基因工程亞單位苗，先後構建了多株基因工程體，所制的疫苗分別簡稱激生2號苗和激生3號苗。隨著基因疫苗的興起，杜念興等又根據基因疫苗的優點構建了生長抑素基因疫苗基因工程體，據報導其基因疫苗免疫後，表達質粒能在動物細胞內表達2-3月，不斷分泌免疫原，誘導產生SS抗體，從而促進動物生長。但並未見到關於該DNA疫苗在仔豬上的應用，而且生產該疫苗需要大量提取質粒，提取過程中有可能存在內毒素清除不淨而導致動物內毒素中毒等風險，另外肌肉注射易使動物產生較大的應激，不利於大動物的生長。

發明內容
本發明的任務在於克服現有生長抑素基因免疫技術的缺陷，研製一種簡單、有效、安全的口服重組促生長DNA疫苗，以達到促進動物生長的目的。
本發明的目的具體包括本發明的第一個目的是獲得GM-CSF與SS基因融合表達質粒。
本發明的第二個目的是獲得含有上述融合表達質粒的鼠傷寒沙門氏菌株。
本發明的第三個目的是獲得促進動物生長的口服重組DNA疫苗。
本發明的第四個目的是將上述融合質粒應用於製備促進動物生長的口服重組DNA疫苗上。
本發明通過如下技術方案實施一種促進動物生長的基因疫苗的製備是首先克隆得到粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因，編碼該基因的質粒能增強DNA疫苗的免疫效果，然後將其融合插入到現有生長抑素質粒pcS/2SS中，得到融合表達質粒pGMCSF-SS，將該融合表達質粒轉化到減毒鼠傷寒沙門氏菌中，得到具有促進動物生長的口服重組DNA疫苗。在本發明中已經成功地應用於促進動物生長中，如在斷奶仔豬中促進生長的應用。
本發明具體技術方案如下一、pGM-CSF質粒的構建1、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因克隆及序列分析採取三元雜交豬(品種為杜長大，來源於江蘇省農業科學院畜牧研究所)的外周血，提取單核細胞總RNA，採用常規的RT-PCR方法克隆豬粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)(本申請人克隆的該基因序列已在GenBank登錄，登錄號為DQ108393)。GM-CSF的cDNA開放閱讀框為435bp，編碼144個胺基酸，與用作PCR模板的參考序列比較，其核苷酸的同源性為97.5％，胺基酸的同源性為95.1％。同綿羊、人、牛、小鼠和犬的GM-CSF序列比較，其核苷酸的同源性分別為86.2％、80.5％、81.7％、69.7％和81.8％，胺基酸的同源性分別為78.5％、71.3％、70.3％、55.9％和71.5％。
2、pGM-CSF質粒的構建以pcDNA3.1(-)(購自Invitrogen公司)為質粒載體，構建豬GM-CSF基因真核表達質粒pGM-CSF(詳細製備如實施例11.1所述)並測序。
二、GM-CSF與SS融合表達質粒的構建1、GM-CSF編碼基因的擴增採用Primer5.0引物設計軟體，根據已在GenBank登錄的豬GM-CSF序列，設計上、下遊引物(引物結構如實施例22.2所述)，以真核表達質粒pGM-CSF(如實施例1)為模板進行PCR獲得GM-CSF基因，然後用QIAquick PCR Purification Kit純化，定量備用。
3、GM-CSF與SS融合表達質粒的構建將純化、回收的GM-CSF基因片段和pcS/2SS分別進行EcoR I和XhoI雙酶切，用低融點瓊脂糖凝膠電泳分離回收GM-CSF目的片段和pcS/2SS大片段。4℃過夜連接後，用CaCl2法製備新鮮感受態細菌DH5α用於重組質粒轉化，之後篩選和鑑定陽性融合表達質粒pGMCSF-SS(見實施例2)，鑑定結果參見附圖5。
三、疫苗的製備1、質粒的轉化採用熱休克法將上一步篩選得到的陽性克隆質粒pGMCSF-SS、原始質粒pcS/2SS和真核表達質粒pGM-CSF分別轉化減毒鼠傷寒沙門氏菌(見實施例3和4)。
2、疫苗製備取原始質粒pcS/2SS、真核表達質粒pGM-CSF和融合表達質粒pGMCSF-SS單菌落分別接種至LB液體培養基上，於37℃、150rpm振搖培養至OD6000.3-0.4，4℃、1500g離心10min，棄上清，用滅菌的PBS溶液調整細菌濃度至1010CFU/mL，得到試驗用的備用疫苗。
四、疫苗的免疫效力檢驗選擇40頭斷奶的品種為「長大」的二元雜交仔豬，隨機分為4組，每組10頭，公母各半，其中編號為1的組為對照組，編號為2-4的組分別口服以減毒鼠傷寒沙門氏菌為載體的基因疫苗pcS/2SS、pGMCSF-SS和pGM-CSF+pcS/2SS，分析這些基因疫苗對斷奶仔豬的生產性能、抗體水平、激素分泌和代謝物濃度的影響。結果顯示，與對照組比較，pGMCSF-SS免疫組提高了仔豬的日增重和飼料利用率，分別為6.6％和15.7％。同時三個試驗組均對SS的免疫產生了較強免疫應答。與對照組相比，生長抑素抗體P/N值均提高。2組、3組和4組血漿中GH的含量有升高的趨勢，對照組GH的含量在整個實驗期都比較平穩，第3組的GH含量總體上高於2組和4組(P＞0.05)。第2組IGF-I的含量一直處於較高的水平，第3組和4組在第2周後處於較低的分泌水平，第3組IGF-I分泌的峰值高於其它組的峰值。第1組、2組和4組T3的含量呈下降的趨勢，而第3組呈上升之勢，免疫後第8周，第3組的T3分泌水平顯著高於2組和4組(P＜0.05)，與對照組差異顯著。第1組T4的含量不斷降低，而第2組、3組和4組有不斷升高的趨勢，2組和3組T4的分泌一直保持在較高的水平；免疫對仔豬葡萄糖和非酯化脂肪酸(NEFA)和尿素氮濃度無明顯影響。
本發明克隆的GM-CSF基因可以提高SS基因疫苗的免疫效果，含有pGMCSF-SS質粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌要優於含有pGM-CSF+pcS/2SS質粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌共同免疫。用含有pGMCSF-SS質粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌口服免疫斷奶仔豬能產生較強的免疫應答，提高了GH、IGF-I的分泌水平，T3、T4一直保持較高的濃度，提高了斷奶仔豬的日增重和飼料利用率。


圖1是本發明克隆的GM-CSF片斷通過RT-PCR擴增的電泳圖。
圖2是本發明製備的pGM-CSF質粒酶切鑑定結果。
圖3是本發明製備的融合表達質粒pGMCSF-SS構建技術路線圖。
圖4是本發明製備的DNA片段GM-CSF PCR擴增產物電泳圖。
圖5是本發明製備的融合表達質粒pGMCSF-SS酶切鑑定結果圖中各泳道表示如下M.-DL2000；1.pGMCSF-SS/(HindIII+EcoR I)；2.pGMCSF-SS/(HindIII+XhoI)；3.pGMCSF-SS/(EcoR I+XhoI)。
圖6是本發明的融合表達質粒pGMCSF-SS酶切鑑定結果。圖中各泳道表示如下M.-DL2000；1.pGMCSF-SS/(HindIII+EcoR I)；2.pGMCSF-SS/(HindII+XhoI)；3.pGMCSF-SS/(EcoR I+XhoI)。
圖7是本發明的口服重組DNA疫苗對各個階段仔豬日增重的效應。
圖8是本發明的口服重組DNA疫苗對各個階段仔豬的飼料轉化率的效應。
具體實施例方式
實施例1 真核表達質粒pGM-CSF的構建1.1反轉錄與PCR擴增採用RT-PCR試劑盒(參照寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)的RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒使用說明書)，取提取的細胞總RNA 1-2μg進行反轉錄，反應總體積10μL，其中含MgCl22μLOligodT引物(2.5pmol/μL)0.5μLdNTP Mixture(各10mM)1μLRNA酶抑制劑(40U/μL)0.25μL反轉錄酶(5U/μL)0.5μL10×RT Buffer 1μLRNase Free dH2O使反應總體積10μL。
按以下條件進行反轉錄反應30℃10min42℃30min99℃5min5℃5min反應1個循環。RT產物-20℃保存，備用。
將10μL反轉錄產物加入到40μL(其中含5×PCR Buffer 10μL，上、下遊引物各0.5μL，TaqTM酶0.25μL，最後加滅菌蒸餾水至40μL)的體系中，總體積為50μL。
按以下條件進行PCR反應94℃變性2min，然後94℃變性30sec、59℃退火30sec、72℃延伸1min，35個循環後72℃再延伸7min。
最後，將PCR產物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000作為分子量標準，觀察電泳結果。(見附圖1)1.2酶切和連接用QIAquick PCR Purification Kit將PCR擴增產物回收和純化(參照上海華舜生物有限公司生產的PCR產物純化試劑盒使用說明書)。純化後的PCR產物與表達載體pcDNA3.1(-)分別用EcoRI和XhoI雙酶切。
酶切體系10×H buffer 6μLGM-CSF(或pcDNA3.1)20μLEcoR I和XhoI分別為1.5μLddH2O至總體積60μL，37℃，反應2-3h，酶切後用低融點瓊脂糖凝膠電泳分離回收GM-CSF目的片段和pcDNA3.1(-)大片段。
然後按如下體系進行連接反應，連接目的片段和載體，連接體系為10×ligase buffer 2uLGM-CSF 6μLpcDNA3.1(-)5μLT4DNA Ligase 1μLddH2O至總體積20μL，4℃過夜。連接產物-20℃保存，備用。
1.3感受態細菌的製備和重組質粒轉化感受態細菌製備新鮮感受態細菌DH5α用於重組質粒轉化方法如下
(1)從LB平板上(1L LB固體培養基組成10g氯化鈉、5g酵母提取物、10g胰蛋白腖，15g瓊脂粉，pH 7.0)挑取新活化的E.coli DH5α單菌落，接種於10mL LB液體培養基中(1L LB液體培養基組成10g氯化鈉、5g酵母提取物、10g胰蛋白腖，pH 7.0)，37℃下振蕩培養12h左右，直至對數生長後期。將該菌懸液以1∶100的比例接種於100mL LB液體培養基中，37℃振蕩培養2.5h至OD600＝0.5左右；(2)將步驟(1)的培養液轉入離心管中，冰上放置10min，然後於4℃下3000g離心10min；(3)去步驟(2)培養液的上清，用預冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10mL輕輕懸浮細胞，冰上放置30min後，4℃下3000g離心10min；(4)棄去步驟(3)培養液的上清，加入4mL預冷含15％甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置10min，即成感受態細胞懸液。
(5)感受態細胞分裝成100μL的小份，可以立刻用於轉化，或者貯存於-70℃冰箱。
將連接產物轉化感受態細菌DH5α，方法如下(6)從-70℃冰箱中取100μL感受態細胞懸液，置於冰上融解；(7)加入連接產物DNA溶液，輕輕搖勻，冰上放置30min；(8)42℃水浴中熱擊90s，熱擊後迅速置於冰上冷卻3min；(9)向管中加入400μL LB液體培養基(不含氨苄青黴素)，混勻後37℃振蕩培養1h，使細菌恢復正常生長狀態，並表達DNA編碼的氨苄抗生素抗性基因。
(10)將上述菌液搖勻後取100μl塗布於含氨苄青黴素(Amp終濃度為50mg/mL)的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿，37℃培養16-24h。
1.4陽性克隆的篩選、鑑定與測序從上步的平板中挑取陽性克隆，接種於含Amp(終濃度為50mg/mL)的LB液體培養基培養，用質粒小量試劑盒抽提質粒(參照上海華舜生物有限公司的質粒提取試劑盒使用說明書)，EcoRI和XhoI雙酶切，酶切體系為10×H buffer 1.6μL，重組質粒9μL，EcoR I和XhoI分別為0.8μL，加ddH2O至總體積16μL，37℃，反應2-3h，觀察酶切結果，電泳條帶與目的條帶大小相符，送上海英駿生物技術有限公司測序。獲得的陽性克隆命名為豬pGM-CSF。(見附圖2)實施例2 融合表達質粒pGMCSF-SS的構建2.1質粒pGM-CSF提取與純化從LB平板上挑取新活化的pGM-CSF單菌落，接種至10mL LB液體培養基中，37℃、240rpm培養過夜，按體積比1∶250的比例稀釋到適當體積LB中，繼續培養12h，離心收集菌體，抽提純化pGM-CSF質粒(參照上海華舜生物有限公司的質粒提取試劑盒使用說明書)。
2.2GM-CSF編碼基因的擴增參見附圖4，採用Primer5.0引物設計軟體，以豬的真核表達質粒pGM-CSF(實施例1)為模板進行PCR獲得GMCSF基因。上遊引物(P1)為5』-GTAT CTCAGAAGGATGTGGC-3』，引入了限制性內切酶XhoI位點(方框內為其序列)，下遊引物(P2)為5』-GGCG TAACTTTTTGACTGGC-3』，引入限制性內切酶EcoRI位點(方框內為其序列)。引物合成由上海英駿生物技術有限公司完成。
以pGM-CSF質粒為模板，按照如下PCR反應體系進行GM-CSF基因的擴增。
5×PCR buffer 10μLMgCl2(25mmol/L)4μLdNTP(10mmol/L)1μL
pGMCSF質粒0.5μL上、下遊引物各0.5μL(P1、P2引物濃度為20pmol/μL)Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μLddH2O至總體積50μL反應條件94℃預變性2min，然後94℃變性30sec，58.5℃退火30sec，72℃延伸1min，35個循環，最後72℃延伸7min；1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收，然後用QIAquick PCR Purification Kit(參照上海華舜生物有限公司的PCR產物純化試劑盒使用說明書)純化，定量備用。
2.3GM-CSF與SS融合表達質粒的構建如附圖3所示的技術路線，將純化、回收得到的GM-CSF基因片段和pcS/2SS(原始質粒)分別按如下體系進行EcoR I和XhoI雙酶切，反應體系為10×H buffer 6μL、GM-CSF15μL(或pcS/2SS 20μL)、EcoR I和XhoI分別為1.5μL、加ddH2O至總體積60μL，37℃，反應2-3h，酶切後，用低融點瓊脂糖凝膠電泳分離回收GM-CSF目的片段和pcS/2SS大片段。
然後按如下體系進行連接反應10×ligase buffer 2μL、GM-CSF 6μL、pcS/2SS 5μL、T4DNA ligase1μL、加ddH2O至總體積20μL，4℃過夜，CaCl2法製備新鮮感受態細菌DH5α用於重組質粒轉化(具體步驟同實施例1.3)。
2.4陽性重組質粒(pGMCSF-SS)的篩選和鑑定挑取陽性克隆，接種於含Amp的LB液體培養，提取質粒DNA，進行酶切鑑定，分別用EcoR I和XhoI雙酶切、EcoR I和HindIII、HindIII和XhoI雙酶切鑑定重組質粒，酶切體系為10×H buffer 1.6μL、重組質粒9μL、EcoR I和XhoI(或HindIII)分別為0.8μL、加ddH2O至總體積16μL，37℃，反應2-3h，1.2％瓊脂糖電泳檢測，電泳條帶與目的條帶大小相符(見附圖5)，送上海英駿生物技術有限公司進行DNA測序。融合表達質粒被命名為pGMCSF-SS。
實施例3 以減毒鼠傷寒沙門氏菌為載體製備口服重組DNA疫苗3.1pGMCSF-SS質粒轉化減毒鼠傷寒沙門氏菌採用同上述的方法製備新鮮感受態減毒鼠傷寒沙門氏菌，將融合表達質粒pGMCSF-SS轉化感受態減毒鼠傷寒沙門氏菌(具體操作步驟同實施例1.3)。
含有融合表達質粒的減毒鼠傷寒鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)CSO22/pGMCSF-SS已於2006年12月19日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCC M206141。
3.2重組鼠傷寒沙門氏菌中質粒的鑑定挑取步驟3.1得到的陽性克隆單菌落接種於含Amp的LB液體培養基中37℃培養過夜，從鼠傷寒沙門氏菌中抽提質粒(參照上海華舜生物有限公司的質粒提取試劑盒使用說明書)，用1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。將從鼠傷寒沙門氏菌中抽提的質粒用熱休克法迴轉至E.coli DH5α(方法同實施例1.3)，抽提的質粒分別用HindIII+EcoR I、HindIII+XhoI、EcoR I+XhoI雙酶切，酶切體系10×H buffer 1.6μL，重組質粒9μL，EcoR I和XhoI分別為0.8μL，加ddH2O至總體積16μL，37℃，反應2-3h，1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑑定，鑑定結果如附圖6所示。
3.3重組減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗的製備挑取pGMCSF-SS的減毒鼠傷寒沙門氏菌單菌落接種於含有Amp的LB液體培養基中，37℃、150rpm振搖培養至OD6000.3-0.4，4℃、1500g離心10min，棄上清，用滅菌的PBS溶液(PBS溶菌液為pH 7.4、10mmol/L的磷酸鹽緩衝液)調整細菌濃度至1010CFU/mL，備用。
實施例4 本發明口服重組DNA疫苗在仔豬上促生長中的應用
4.1疫苗製備按實施例1.3方法所述分別將pcS/2SS、pGM-CSF轉化感受態鼠傷寒沙門氏菌，之後按照3.3方法所述製備含有pcS/2SS、pGM-CSF和pGMCSF-SS三種質粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗，並調整細菌濃度至1010CFU/mL，備用。
4.2試驗動物試驗動物來自江西農業大學種豬場，選擇來源相同、體重相近(8.8kg左右)，35日齡的斷奶「大長」二元仔豬40頭，隨機分為4組，每組10頭，公、母各半，其中第1組為對照組，口服PBS緩衝液；第2組口服免疫含有原始質粒pcS/2SS的減毒鼠傷寒沙門氏菌；第3組口服免疫含有融合表達質粒pGMCSF-SS的減毒鼠傷寒沙門氏菌菌液；第4組同時口服免疫含pGM-CSF質粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌菌液和含有pcS/2SS質粒的減毒鼠傷寒沙門氏菌菌液。
4.3免疫方法受免疫的動物(35日齡斷奶仔豬)免疫前12h禁食禁水，免疫前30min，預先口服7.5％的NaHCO3(5mL/頭)以中和胃酸，免疫劑量為4×1010CFU/頭。初次免疫後2周以相同劑量、相同方法加強免疫一次。
4.4飼養管理試驗用35日齡斷奶仔豬，採用一次斷奶，離母不離仔。斷奶仔豬在原欄飼養5-7d後轉入小豬欄。小豬舍為單列式，南面為運動場，供斷奶仔豬自由運動。試驗開始前先進行7d的預飼期，在預飼期內對小豬進行驅蟲和去勢。預飼期結束後，稱重初始重，經統計分析，差異不顯著，進入試驗期，試驗期為56d。試驗豬日餵3次，自動飲水器自由飲水，保持舍內清潔、衛生，及時清除舍內糞尿，保持舍內乾燥。
4.5稱重和血漿製備以初次免疫為0周，分別在第0、2、4、6、8周早晨空腹稱取試驗豬的重量，並採用清箱底的方法，記錄每次稱重時的飼料消耗；稱重的同時前腔靜脈採取血樣，肝素鈉抗凝，製備血漿，-20℃保存，用以抗體、激素和代謝物濃度的檢測(參照楊利國等主編.酶免疫測定技術，[M].南京南京農業大學出版社，1998138-139)。
4.6測定指標4.6.1日增重和飼料轉化率記錄每次斷奶仔豬的稱重和飼料消耗，計算各個階段斷奶仔豬的日增重和飼料轉化率。
本發明的重組口服DNA疫苗對斷奶仔豬生長性能的影響如表1所述，本發明第3組試驗豬全期平均日增重最高，達427.3±40.70g，分別比1組、2組和4組提高了6.6％、8.4％和17.2％。第3組飼料轉化率最高，為1.67∶1；第1組最差，高達1.98∶1。2組、3組和4組分別比對照組提高了1.0％、15.7％和9.6％，斷奶仔豬各個階段的日增重和飼料轉化率分別如附圖7和附圖8所示表1 不同生長抑素DNA疫苗對斷奶仔豬生長性能的影響


注同行數據小寫字母不相同者表示差異顯著。
4.6.2生長抑素抗體檢測採用間接ELISA方法檢測血漿中抗生長抑素抗體。步驟如下包被標準生長抑素抗原每孔100ng/100μL，4℃反應12h，棄反應液，於自動洗板機上洗滌6次，每次30秒；加封閉液(5％的脫脂牛奶溶液)200μL/孔，37℃反應1.5h，棄反應液，洗滌6次，每次30秒；仔豬血漿稀釋50倍，加待測血漿100μL/孔，同時設對照孔(調零孔不加任何反應液；非特異性吸附孔用PBS緩衝液代替血漿)，每個樣本三個重複，37℃反應1h，棄反應液，洗滌6次，每次30秒；加兔抗豬IgG-HRP 1∶5000稀釋，每孔100μL，37℃反應1h，棄反應液，洗滌6次，每次30秒；加TMB底物液，每孔150μL，37℃反應25min；加2mol/L硫酸終止反應，每孔50μL；OD450讀數。以P/N值≥2判為陽性，其中P為待測血樣的吸光值，N為陰性對照血樣吸光值，其測定結果見表2。
本發明的口服重組疫苗第一次口服免疫後的第2周P/N值就達高峰，其它3個組P/N值高峰期均在一免後的第4周，隨後4個組P/N值都有所下降，但試驗組均高於對照組(P＞0.05)。pGMCSF-SS組直到第6周仍然高於其它各組。
在整個抗體監控期(全期)總的抗體陽性豬的比例顯著高於對照組(P＜0.05)，對照組沒有出現抗體陽性豬。三個試驗組中以pGM-CSF+pcS/2SS免疫組陽性比例為最大，達到30％，其次是pcS/2SS組和pGMCSF-SS，陽性比例均為20％，差異不顯著(P＞0.05)。
表2 口服不同DNA疫苗斷奶仔豬血漿中生長抑素抗體P/N值及陽性豬比例


注全期的抗體陽性率是指整個抗體監控期內檢出抗體陽性次數≥1的仔豬的百分數。
4.6.3血漿中GH、IGF-I、T3和T4的檢測採用北京市福瑞生物工程公司生產的試劑盒檢測GH、T3和T4，採用天津九鼎醫學生物工程有限公司生產的試劑盒檢測IGF-I，具體操作按上述單位提供的試劑盒的使用說明書進行。試驗開始時對照組GH濃度略高於試驗組，隨著免疫時間的延長，試驗2、3、4組血漿中GH的含量有升高的趨勢，pcS/2SS、pGM-CSF+pcS/2SS免疫組在第6周時達到高峰，融合表達質粒pGMCSF-SS組GH含量的最大值出現在第8周，而對照組GH的含量在整個實驗期都比較平穩。pGMCSF-SS免疫組的GH含量總體上高於2、4組(P＞0.05)。這可能是生長抑素抗體中和了體內的SS，促進了GH的合成和分泌，提示SS基因疫苗對保持體內生長激素(GH)較高水平有明顯作用，GM-CSF有一定的免疫增強作用(見表3)。
表3 斷奶仔豬不同時期血漿中GH的濃度變化(ng/mL)

注同列(行)數據大寫(小寫)字母不相同者，表示差異顯著(P＜0.05)，下同。
試驗開始時對照組IGF-I濃度略高於試驗組，隨著免疫時間的延長，其濃度的變化類似於GH的動態變化。1組、2組和4組分泌的最高峰是在第2周，以pGM-CSF+pcS/2SS組為最高，但差異不顯著；2組IGF-I的分泌從第2周開始一直高於其它組，3組和4組在第2周後處於較低的分泌水平。第3組的分泌高峰出現在第4周，高於其它組的高峰分泌水平。這可能是由於SS水平的下降，促進了GH的合成和分泌，GH分泌的增加提高了血液中IGF-I的分泌水平，但組間差異不明顯(P＞0.05)(見表4)。
表4 斷奶仔豬不同時期血漿中IGF-I的濃度變化(ng/mL)


隨著免疫時間的延長，1組、2組和4組T3的分泌呈下降的趨勢，它們的最高峰出現在0和2周。而第3組T3的分泌呈上升之勢，最高峰在第8周，與0周分泌水平相比，差異顯著(P＜0.05)。儘管在後期，各組T3的分泌水平均有所下降，但pGMCSF-SS免疫組(3組)的T3分泌水平顯著高於2組和4組，與1組差異顯著。這可能是pGMCSF-SS疫苗的免疫耗竭了體內SS，解除SS對T3分泌的抑制作用，促進了T3分泌(見表5)。
表5 斷奶仔豬不同時期血漿中T3的濃度變化(nmol/L)

隨著免疫時間的延長，T4的分泌第1組不斷降低，而2組、3組和4組有不斷升高的趨勢，2組和4組的最大值出現在第6周，第3組在第4周就達到78.73±4.64nmol/L，此後T4的分泌一直保持在較高的水平，這與T3的分泌是一致的，說明pGMCSF-SS疫苗的免疫耗竭了體內SS，解除SS對T4分泌的抑制作用，促進了T4分泌。(見表6)表6 仔豬不同時期血漿中T4的濃度變化(nmol/L)

4.6.4血漿葡萄糖、尿素氮和游離脂肪酸的測定採用上海榮盛生物技術有限公司生產的試劑盒檢測葡萄糖(Glu)，採用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒檢測尿素氮(BUN)、游離脂肪酸(NEFA)，具體操作按試劑盒使用說明書進行。
試驗開始時1組、3組和4組葡萄糖的濃度高於3組。用基因疫苗免疫後，從動態變化分析來看，pcS/2SS免疫組葡萄糖的濃度變化不大，pGM-CSF+pcS/2SS免疫組呈現下降的趨勢，融合表達質粒pGMCSF-SS免疫組則出現上升的態勢，至最後幾周與前幾周相比，差異顯著(P＜0.05)。而對照組葡萄糖的濃度一直變化不明顯。提示SS基因免疫對血漿葡萄糖的濃度影響不明顯，融合表達質粒pGMCSF-SS則可提高血漿葡萄糖的濃度。(見表7)表7 斷奶仔豬不同時期血漿中葡萄糖的濃度變化(mmol/L)

從動態變化分析來看，血漿游離脂肪酸的濃度pcS/2SS免疫組第4周達到高峰，pGM-CSF+pcS/2SS免疫組的分泌高峰在0周，而對照組和pGMCSF-SS免疫組在第6周達到高峰，爾後對照組急劇下降，免疫後第8周時，2組、3組和4組血漿游離脂肪酸的濃度顯著高於對照組(P＜0.05)。提示SS基因免疫對血漿游離脂肪酸的分泌水平無明顯影響。(見表8)表8 斷奶仔豬不同時期血漿中游離脂肪酸的濃度變化(mmol/L)

在不同的免疫時期血漿尿素氮的濃度變化不明顯，從動態變化分析來看，pGMCSF-SS免疫組有上升的趨勢，在第2周、4周和6周血漿尿素氮的濃度高於其它三個組(P＞0.05)，pcS/2SS免疫組則隨免疫時間的延長而逐漸下降。對照組和pGM-CSF+pcS/2SS免疫組一直保持比較平穩的態勢。(見表9)
表9 斷奶仔豬不同時期血漿尿素氮的濃度變化(mmol/L)

權利要求
1.含有融合表達質粒pGMCSF-SS的鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimuriumCSO22/pGMCSF-SS，其保藏號為CCTCC NOM206141。
2.包含權利要求1的促進動物生長的口服重組DNA疫苗。
3.一種融合表達質粒pGMCSF-SS。
4.權利要求1所述的鼠傷寒沙門氏菌在製備促進動物生長的口服重組DNA疫苗中的應用。
全文摘要
本發明屬於動物基因疫苗製備技術領域，具體涉及一種促進動物生長的口服重組DNA疫苗的製備及應用。本發明包含一種細胞因子GMCSF的克隆，然後將其融合插入到現有生長抑素質粒pcS/2SS中，得到融合表達質粒pGMCSF－SS，將該融合表達質粒轉化到減毒鼠傷寒沙門氏菌中，得到具有促進動物生長的口服重組DNA疫苗。含有融合表達質粒的鼠傷寒沙門氏菌CSO22/pGMCSF－SS，保藏在CCTCC，其保藏號為CCTCC M206141。本發明還公開了所述的減毒鼠傷寒沙門氏菌在製備促進動物生長的口服重組DNA疫苗中的應用。
文檔編號A61K48/00GK101050448SQ200610125580
公開日2007年10月10日 申請日期2006年12月26日 優先權日2006年12月26日
發明者楊利國, 舒鄧群, 梁愛心 申請人:華中農業大學