確定患者對腦卒中遺傳易感性的方法
2023-12-09 06:33:01 1
專利名稱：確定患者對腦卒中遺傳易感性的方法
技術領域：
本發明涉及確定患者對腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性的方法，用於該方法的物質、組合物、試劑盒及其用途。
背景技術：
腦血管病流行趨勢嚴峻、危害嚴重腦卒中(Stoke)，又稱中風或腦血管意外(Cerebrovascularaccident)，是一組突然起病，以局灶性神經功能缺失為共同特徵的急性腦血管疾病。腦卒中有極高的病死率和致殘率，在我國，腦卒中則是僅次於癌症的第二大致死疾病，每年死於腦卒中的超過100萬人，是冠心病死亡人數的2-3倍。腦卒中的防治已成為衛生工作中的一項重要課題，越來越引起國內外醫學界特別是神經科學界的重視。
腦卒中是臨床症狀複雜的多因素疾病腦卒中的臨床症狀複雜，但主要可分為兩大類缺血性卒中和出血性卒中。前者約佔60-70％，後者佔30-40％。缺血性卒中又進一步分為大血管阻塞性疾病，是由於動脈狹窄、管腔內逐漸形成血栓而最終阻塞動脈所致，稱為腦血栓形成，其最常見的病因是動脈粥樣硬化；小血管阻塞性疾病，是由於大腦小動脈逐漸狹窄而最終閉塞所致，管腔內既無血栓亦無栓子，稱為腔隙性腦梗塞，高血壓動脈硬化是最常見的原因；心源性腦卒中，是由於血栓脫落或其它栓子進入血流中阻塞腦動脈所引起，如房顫或冠心病患者心腔內的栓子脫落便可引起腦栓塞。出血性腦卒中根據出血部位的不同又分為腦出血和蛛網膜下腔出血。腦出血俗稱「腦溢血」，是由於腦內動脈破裂，血液溢出到腦組織內。蛛網膜下腔出血則是腦表面或腦底部的血管破裂，血液直接進入含有腦脊液的蛛網膜下腔和腦室中。長期的原發性高血壓和動脈粥樣硬化是出血性卒中的主要原因。
研究腦卒中新的遺傳危險因素意義重大大量的臨床實踐已證明，對已發生的腦卒中，無論如何完美的治療，對其病死率和自然史的影響都不很理想。因此，對腦卒中的防治更應特別強調「預防為主」的方針，而尋找、確定腦卒中的危險因素(risk factor)，然後設法減少或清除這些危險因素的損害，則是預防腦卒中最基本的手段。存在危險因素的人，可稱之為「卒中易患個體」(stroke-prone individual)。目前已確定的危險因素包括種族、性別、高齡和腦血管病家族史這類不可改變的因素；吸菸、酗酒、肥胖、食鹽攝入過多等可以改變的不良生活習慣，以及高血壓、糖尿病、心血管病、高脂血症等在一定程度上可以控制的疾病[5]。此外，同型半胱氨酸血症、血漿纖維蛋白原水平異常[7]、血小板高聚集性[8]等也是腦卒中的危險因素。
腦卒中是一種多因素疾病，其發病受基因之間以及基因與環境因素之間相互作用的共同影響[9]，特定的遺傳變異與某些特定的危險因素如食鹽攝入過多、肥胖、吸菸、酗酒、高血壓、糖尿病、高脂血症等相互作用，可能增加了某些個體患腦卒中的危險性，反之，一些個體即使具有這些傳統的危險因素，卻未發生心腦血管病事件。因此，研究腦卒中相關的保護基因或有害基因，並在此基礎上進一步研究這些基因與環境危險因素之間的關係，是腦卒中個體化預防和治療的重要途徑。
由於種族間的差異，中國人群同西方人群在遺傳背景、生活習慣、飲食結構和社會經濟結構等各方面都有很大的差異，因而心腦血管病的流行趨勢也不相同。據國外統計資料，在發達國家腦血管病以缺血性為多見，腦梗塞佔59.2％～85％，腦出血除日本外，一般在20％以下。我國腦梗塞雖然發病率較多見，但腦出血所佔比例為30-40％，顯然比國外高。其原因尚不清楚，這也正是我們進行腦卒中遺傳易感性研究的興趣點。
血管發生和血管內皮生長因子在腦卒中發病中的重要作用在血管形成的過程中，多種細胞因子發揮著重要的調控作用，包括血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體(VEGFR)，血管生成素(Angiopoietin)及其受體Tie，以及EphrinB2/EphB4等細胞因子。其中，VEGF及其受體VEGFR不僅啟動血管形成，而且在其後的血管成熟穩定過程中均發揮著重要作用。血管形成異常與多種疾病的病理生理過程有關，如腫瘤、牛皮癬、糖尿病性眼病以及肥胖、哮喘、動脈粥樣硬化等。
VEGF是特異作用於血管內皮細胞的生長因子，在血管發育、成熟、重構過程中起著重要的調控作用。其作用主要為(1)促進內皮細胞的有絲分裂，誘導血管內皮細胞增生和遷移；(2)增加血管通透性，(3)是單核細胞和血管平滑肌細胞(SMC)的趨化劑。最近越來越多的證據表明，VEGF與動脈粥樣硬化的進展和斑塊的不穩定性有密切關係。Chen等(ATVB，1999，19131-139)應用原位免疫組織化學方法證實在動脈粥樣硬化斑塊中，平滑肌細胞及巨噬細胞都有VEGF的強表達，VEGF陽性細胞數目與內膜血管化程度呈正相關，且分布與新生血管的分布高度一致。將人重組的VEGF轉入動脈粥樣硬化易感小鼠模型，發現VEGF可通過炎症浸潤和新生血管的形成等機制促進動脈粥樣硬化損傷的進展，斑塊內的巨噬細胞和血管內皮細胞數量也顯著增加(NatureMedicine.2001；7425-429.)。抑制血管形成的拮抗劑endostatin作用於Apo E-/-的小鼠模型，可顯著抑制粥樣斑塊損傷的發展，斑塊體積也隨之縮小(Circulation.1999；991726-1732.)。Lemstrom KB等研究心肌移植的動脈粥樣硬化發生機制，結果提示VEGF和移植物所處微環境中的其他細胞因子共同作用，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成(Circulation.2002，1052524-2530)。Slevin等報導急性缺血性腦卒中患者的血清中VEGF水平升高，並觀察到梗塞面積和血清VEGF之間有相關性(Stroke，2000，31(8)1863-1870)。
到目前為止，VEGF受體發現有4種VEGFR-1(fms-relatedtyrosine kinase 1；FLT1)、VEGFR-2(kinase insert domainreceptor；KDR)、VEGFR-3和一種內皮細胞表面球蛋白neuropilin-1。VEGFR-1和VEGFR-2的是VEGF的高親和力受體，但是VEGFR-1的酪氨酸激酶活性較低，其確切功能和信號傳導途徑尚不清楚。VEGFR-2主要在血管內皮細胞特異表達，此外在前體細胞如新生造血幹細胞也表達，在成年期靜息狀態的血管內皮細胞呈低水平表達。VEGF主要通過VEGFR-2在血管形成中促進內皮細胞間的相互作用以及新生血管管腔的形成。基因敲除小鼠的實驗表明VEGFR-2缺乏的純合小鼠在E 9.5天死於急性血管缺陷，病理表現為內皮細胞和造血前體細胞缺乏，提示VEGFR-2在血管形成的初始階段不可或缺。
單核苷酸多態性人類基因組中的序列變異主要由單核苷酸多態性(″SNP″)組成，其餘序列變異是短串聯重複(包括微衛星)、長串聯重複(小衛星)和其它插入和缺失。SNP是群體中以可測頻率(即＞1％)出現兩個可替換鹼基的位置。SNP被稱為是″等位的″，因為由於此多態性的存在，一個物種的一些成員可能具有未突變序列(即，原始「等位基因」)，而其它成員可能具有突變序列(即變體或突變等位基因)。在最簡單的情況下，可能僅存在一個突變序列，該多態性被稱為二對等位基因多態性。可替換突變的發生可產生三對等位基因多態性等。SNP廣泛存在於基因組中，改變基因功能的SNP可能直接有助於表型變異。由於它們的流行和普遍本質，SNP已成為定位參與人類疾病情況的基因的重要工具。
研究目的以VEGFR-2基因作為候選基因，採用多臨床中心的病例對照方法研究基因多態性與腦卒中發病風險的相關性。
發明內容
本發明涉及用於確定VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的遺傳多態性型式的工具。它可以是VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多態性分型寡核苷酸，優選地，所述多態性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的多態性，或者(2)用於檢測VEGFR-2基因中的多態性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多態性的核酸雜交，優選地，寡核苷酸探針的長度為17-50個核苷酸。本發明的工具可以是限制性內切酶。
本發明還涉及用於腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的診斷試劑盒，包含本發明的工具。
本發明還涉及診斷患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在，其中，VEGFR-2基因啟動子區-604C等位基因與降低的腦血栓形成性卒中患病風險相關，攜帶+1192T等位基因的個體和攜帶+1719T等位基因的個體腦出血的患病風險增加，單體型(-604/+1192/+1719)C/C/T對腦血栓形成有保護作用，而單體型(-604/+1192/+1719)T/T/T單體型攜帶者腦出血的患病風險增加。
本發明還涉及確定患者對腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在，其中，VEGFR-2基因啟動子區-604C等位基因與降低的腦血栓形成性卒中患病風險相關，攜帶+1192T等位基因的個體和攜帶+1719T等位基因的個體腦出血的患病風險增加，單體型(-604/+1192/+1719)C/C/T對腦血栓形成有保護作用，而單體型(-604/+1192/+1719)T/T/T單體型攜帶者腦出血的患病風險增加。
本發明還涉及分析從患者分離的離體生物樣品的方法，包括確定所述樣品中VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的核苷酸。優選地，該方法還包括確定所述患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性或者診斷患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)，其中，VEGFR-2基因啟動子區-604C等位基因與降低的腦血栓形成性卒中患病風險相關，攜帶+1192T等位基因的個體和攜帶+1719T等位基因的個體腦出血的患病風險增加，單體型(-604/+1192/+1719)C/C/T對腦血栓形成有保護作用，而單體型(-604/+1192/+1719)T/T/T單體型攜帶者腦出血的患病風險增加。
在上述方法中，可以使用以下任何的差異核酸分析技術來確定基因多態性用質譜對PCR產物直接質量分析、對侵入性切割產物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗、侵入者試驗、DNA晶片分析和限制性片段長度多態性。
本發明還涉及一種微陣列，其中本文所定義的VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多態性分型寡核苷酸。微陣列可以是DNA晶片的形式。
本發明還涉及檢測生物學樣品中VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在的物質用於製備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用於診斷患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)或者用於確定患者對腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性。其中所述物質可以選自本發明所述的工具；能夠特異識別VEGFR-2中Val297Ile突變和/或Gln472His突變的抗體；和能夠特異識別VEGFR-2基因VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的引物或者探針或者限制性內切酶等。
附圖簡述
圖1a.VEGFR-2基因rs7667298測序的基因分型圖+32AA多態。
圖1b.VEGFR-2基因rs7667298測序的基因分型圖+32AG多態。
圖1c.VEGFR-2基因rs7667298測序的基因分型圖+32GG多態。
圖2a.VEGFR-2基因rs9994560測序的基因分型圖-65TT多態。
圖2b.VEGFR-2基因rs9994560測序的基因分型圖-65CC多態。
圖3a.VEGFR-2基因rs2071559測序的基因分型圖-604TC多態。
圖3b.VEGFR-2基因rs2071559測序的基因分型圖-604CC多態。
圖3c.VEGFR-2基因rs2071559測序的基因分型圖-604TT多態。
圖4a.VEGFR-2基因rs2305948測序的基因分型圖+1192CC多態。
圖4b.VEGFR-2基因rs2305948測序的基因分型圖+1192TT多態。
圖4c.VEGFR-2基因rs2305948測序的基因分型圖+1192CT多態。
圖5a.VEGFR-2基因rs1870377測序的基因分型圖+1719TT多態。
圖5b.VEGFR-2基因rs1870377測序的基因分型圖+1719AA多態。
圖5c.VEGFR-2基因rs1870377測序的基因分型圖+1719AT多態。
圖6VEGFR-2基因rs2305948(+1192C/T)用內切酶BstZ171的RFLP分型結果。
圖7VEGFR-2基因rs2071559(-604T/C)用內切酶Bsm I的RFLP分型結果。
圖8VEGFR-2基因rs1870377(+1719A/T)用內切酶Alu I的RFLP分型結果。
圖9VEGFR-2基因啟動子-604野生型和突變型等位基因報告載體的螢光素酶活性分析。
**P＜0.001，pGL3/-604C與pGL3/-604T比較；相對螢光素酶活性單位(ratio firefly/renilla luciferase)用均數±標準差表示。
具體實施例方式
本發明涉及將VEGFR-2基因中的單核苷酸多態性和患者疾病(如腦血管疾病特別是擴張型心肌病)相關聯的方法。本發明還涉及確定患者對腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性或者診斷患者這些疾病的方法，此方法包括檢測VEGFR-2基因中的至少一個單核苷酸多態性。具體地，這種方法包括至少檢測所述樣品中VEGFR-2基因位點-604和/或+1192和/或+1719的核苷酸或者VEGFR-2蛋白質297位或者472位的胺基酸，並參照VEGFR-2基因中的多態性確定個體狀態。本發明還涉及在序列中包含在上面所限定位置上的多態性的分離的核酸，涉及能與這種核酸雜交的核酸引物和寡核苷酸探針和涉及包含一種或多種這樣的引物和探針用於檢測VEGFR-2基因中的多態性的診斷試劑盒。
VEGFR-2基因位於染色體4q11-q12，cDNA全長約5.8kb，NCBIRefSeq mRNA accession No.為NM_002253，由30個外顯子和29個內含子組成。編碼的多肽鏈由1356個胺基酸組成。在本文中，VEGFR-2基因序列和編碼的蛋白質序列按照常規方法進行編號。
本發明所提及的核酸序列和胺基酸序列中核苷酸和胺基酸殘基的編號是指與NCBI RefSeq mRNA accession No.為NM_002253的序列或其編碼的胺基酸序列相同位置(或編號)對應的核苷酸和胺基酸殘基。
「對應」是指本發明核酸分子或者蛋白質的序列在與參考序列如NM_002253的cDNA序列所示序列最佳比對(alignment)後與該參考序列某位置相對的位置。因此，本發明核酸分子或者蛋白質「對應位置」或者「對應核苷酸」或者「對應胺基酸」不一定是與參考序列編號相同的位置、或者核苷酸或者胺基酸。
VEGFR-2基因「-604T/C」是指該基因第-604位多態性T和C，「+1192C/T」是指第+1192位多態性C和T，「+1719A/T」是指第+1719位多態性A和T。
單核苷酸多態性及其檢測術語「患者」是指動物，優選哺乳動物，更優選靈長類動物，最優選人類。
術語「多態性」廣義上限定為包括已知發生在核苷酸序列中的所有變異，包括插入，缺失，置換和重複序列(包括二重重複)。
根據本發明的上述方法可通過使用用於檢測單核苷酸變異的任何合適方法而得以施用，比如用質譜對PCR產物的直接質量分析，對侵入性切割產物(invasive cleavage product)的直接分析，直接的序列分析，等位基因特異性擴增(即，ARMSTM-等位基因特異性擴增，ARMS指擴增受阻突變體系(amplification refractory mutationsystem))，ALEXTM(擴增受阻突變系統線性延伸(amplificationrefractory mutation system linear extension)和COPS(競爭性寡核苷酸引發系統)，等位基因特異性雜交(ASH)，寡核苷酸連接試驗(OLA)，侵入者試驗，DNA晶片分析和限制性片段長度多態性(RFLP)(綜述參見基因組研究(Genome Research)，1998年，8卷，769-776頁；Pharmacogenomics，2000年，1卷，95-100頁；人類突變(HumanMutation)，2001年，17卷，475-492頁)。
攜有所述多態性的核酸試樣方便地是從個體中獲得的血液、支氣管肺泡灌洗液、痰、尿液或其它體液或組織樣本。這些樣品可以預先進行純化，例如分離總DNA。可以明了，試樣同樣可以是對應於試樣中序列的核酸序列，也就是說，在等位基因變異分析前，核酸樣品中的全部或一部分區域可先用任何一種方便的技術如聚合酶鏈反應(PCR)或連接酶鏈反應(LCR)擴增。
VEGFR-2基因中的多態性可通過對患者的核酸樣品進行測序和將此序列與對照物比較來確定，或通過PCR擴增不同種族來源的無關個體的DNA中的400-600個鹼基對的片段(涵蓋VEGFR-2基因的編碼區和調節區)來確定。這些樣品中的片段可用正向和反向引物測序，多態性可用PolyPhred軟體(經華盛頓大學許可)檢測而變體的等位基因頻率可被確定(人類突變(Human Mutation)，2001年，17卷，243-254頁)。
顯然，對於對本領域技術人員來說有大量的分析方法可被用於檢測在本發明的一個或多個多態位置處變異核苷酸存在與否。一般來說，等位基因變異的檢測需要突變辨別技術，任選地擴增反應和任選地信號生成系統。國際專利申請WO00/06768列出了許多擴增技術和突變檢測技術，其中一些是基於PCR技術的。這些技術可和許多信號生成系統聯合使用，可選的信號生成系統也被列於WO00/06768。
用於檢測等位基因變異的許多現行方法綜述於Nollau等，臨床化學(Clin.Chem.)，1997年，43期，1114-1120頁；在標準教科書例如「突變檢測實驗指南」(Laboratory Protocols for MutationDetection)U.Landegren編輯，牛津大學出版社，1996年和「PCR」第二版Newton Graham編輯，BIOS Scientific Publishers Limited，1997年。
本發明涉及可被用做檢測VEGFR-2基因中多態性的診斷引物的等位基因特異性核酸引物，該診斷引物能夠與在序列內於VEGFR-2基因位點-604和/或+1192和/或+1719包含多態性(例如VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T或者其反向互補序列)的核酸雜交。
等位基因特異性引物通常與恆定引物一起用於諸如PCR反應等擴增反應中，通過對位於一個特定序列位置處的一個等位基因的選擇性擴增而使等位基因之間得以區分開來，例如用在ARMSTM試驗中的引物。等位基因特異性引物的長度優選17-50個核苷酸，更優選大約17-35個核苷酸，最優選大約17-30個核苷酸。
優選地，等位基因特異性引物與待檢測的等位基因完全地相對應，但是也可以考慮其衍生物，其中3』端大約有6到8個核苷酸與待檢測的等位基因對應而不超過10個，比如不超過8，6，4，2或者1個剩餘核苷酸在不顯著影響引物特性的情況下可以發生變化。常常在第2和/或第3位(相對於3』端)的核苷酸被錯配以優化差異引物結合和優先僅從正確的等位基因辨別引物延伸。
本發明還涉及用於檢測VEGFR-2基因中的多態性的寡核苷酸探針，該探針能特異地與在序列內包含位於VEGFR-2基因第-604和/或+1192和/或+1719位的多態性(例如VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T或者其反向互補序列)的核酸雜交。
術語「寡核苷酸探針」指長度至少有17個核苷酸的一種核苷酸序列，此序列與部分或全部的人類VEGFR-2基因，特別是表達多態性的人類VEGFR-2基因部分對應。優選長度17到50個核苷酸。一般來說這樣的探針包含與基因中相應的野生型或變體座位完全互補的鹼基序列。
然而，如果需要，可以引入一個或多個錯配，前提是寡核苷酸探針的辨別能力不被過度影響。本發明的探針可以攜有一個或多個標記以便於檢測，比如在Moleaular Beacons中。
本發明還包含一種診斷試劑盒，該試劑盒含有具有VEGFR-2基因單核苷酸多態性的一種或多種核酸引物和/或一種或多種寡核苷酸探針，所述多態性選自於VEGFR-2基因第-604和/或+1192和/或+1719位的多態性(例如VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T或者其反向互補序列)，以及它們的反向互補序列。
在一些實施方案中，一種組合物含有用於同時探測兩個或更多個多態性位點的寡核苷酸身份的兩個或更多個不同標記的基因分型寡核苷酸。也可考慮含有兩套或更多套等位基因特異性引物對以允許同時靶向和擴增含多態性位點的兩個或更多個區域的引物組合物。
本發明的VEGFR-2基因分型寡核苷酸也可以固定在固體表面或在固體表面合成，如晶片、珠或玻片(如見WO98/20020和WO98/20019)。這種固定的基因分型寡核苷酸可以用於各種多態性檢測試驗，包括但不限於探針雜交和聚合酶延伸試驗。本發明的固定的VEGFR-2基因分型寡核苷酸可以包括為同時快速篩選DNA樣品在多個基因中的多態性而設計的有序寡核苷酸陣列。
本發明等位基因特異性寡核苷酸引物優選具有與特定SNP的僅一種核苷酸互補的3』末端核苷酸，或優選地3』倒數第二個核苷酸，由此只有存在含該核苷酸的等位基因時其才可以用作聚合酶介導的延伸反應的引物。與編碼鏈或非編碼鏈雜交的等位基因特異性寡核苷酸引物包括在本發明中。使用本領域技術人員已知的技術可以開發檢測VEGFR-2基因多態性的ASO引物。
本發明其它基因分型寡核苷酸與位於這裡所述的多態性位點之一下遊一個至幾個核苷酸處的靶區域雜交。這種寡核苷酸可用於聚合酶介導的引物延伸方法中以檢測這裡所描述的多態性之一，因此這種基因分型寡核苷酸這裡稱作「引物延伸寡核苷酸」。在優選實施方案中，引物延伸寡核苷酸的3』末端是與多態性位點緊臨的核苷酸互補的脫氧核苷酸。
在另一個實施方案中，本發明提供了包括包裝在分開容器中的至少兩個基因分型寡核苷酸的試劑盒。該試劑盒也可以含有包裝在分開容器中的其它成分如雜交緩衝液(此時寡核苷酸待用作探針)。可供選擇地，當寡核苷酸待用於擴增靶區域時，該試劑盒可以含有包裝在分開容器中的聚合酶和用於聚合酶介導的引物延伸如PCR的經優化反應緩衝液。
上述寡核苷酸組合物和試劑盒在個體VEGFR-2基因的基因分型和/或單元型分型方法中有用。
本發明還涉及診斷患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在。
本發明還涉及確定患者對腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性的體外方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在。
本發明還涉及分析從患者分離的離體生物樣品的體外方法，包括確定所述樣品中VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的核苷酸。優選地，該方法還包括所述分析結果確定所述患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性或者診斷患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)。
在以上方法中，VEGFR-2基因啟動子區-604C等位基因的存在與降低的腦血栓形成性卒中患病風險相關，攜帶+1192T等位基因的個體和攜帶+1719T等位基因的個體腦出血的患病風險增加，單體型(-604/+1192/+1719)C/C/T對腦血栓形成有保護作用，而單體型(-604/+1192/+1719)T/T/T單體型攜帶者腦出血的患病風險增加。
在上述方法中，可以使用以下任何的差異核酸分析技術來確定基因多態性用質譜對PCR產物直接質量分析、對侵入性切割產物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗、侵入者試驗、DNA晶片分析和限制性片段長度多態性。
本發明還涉及檢測生物學樣品中VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在的物質在製備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用於診斷患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)或者用於確定患者對腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性。其中所述物質可以選自VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多態性分型寡核苷酸，優選地，所述多態性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的多態性，或者(2)用於檢測VEGFR-2基因中的多態性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多態性的核酸雜交，優選地，寡核苷酸探針的長度為17-50個核苷酸；能夠特異識別VEGFR-2中Val297Ile突變和/或Gln472His突變的抗體；和能夠特異識別VEGFR-2基因VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的引物或者探針或者限制性內切酶等。
本發明還涉及用於腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的診斷試劑盒，包含任何(一種或者多種)剛剛定義的檢測生物學樣品中VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在的物質。
如果適用的話，在所有方面，優選的是，所述VEGFR-2基因第-604和/或+1192和/或+1719位的多態性特別是VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T或者其反向互補序列。
以下實施例用於對本發明作進一步舉例說明，而不以任何方式限制本發明的範圍。
實施例一、腦卒中患者和對照人群的入選研究項目「高血壓易患腦卒中的分子機制」是國家科技部資助的國家重點基礎研究項目(973項目，課題號G200056901)，並獲得衛生部倫理委員會、各臨床中心倫理委員會的同意以及所有參加者的知情同意書。
從2000年11月到2001年11月期間，中國7個臨床中心北京、天津、武漢同濟、武漢協和、西安、重慶、山東兗州參加了大規模的病例對照研究，入選了2000例腦卒中患者，並相應在同一地區按照性別、年齡匹配的原則入選了2000例對照。病例入選的標準根據疾病國際分類標準第9版(the International Classification of Disease，ninth revision)，收集了三類亞型的腦卒中患者，包括腦血栓形成(cerebral thrombosis)、腔隙性腦梗塞(Lacunar infarction)、腦出血(intracerebral hemorrhage)。短暫性缺血性腦卒中發作、蛛網膜下腔出血、腦栓塞、腦腫瘤和腦血管動靜脈畸形等疾病被排除。腦卒中的診斷依據嚴格的神經學檢查、CT，和/或MRI檢查。對照人群的腦卒中排除標準與病例入選標準相同，無腦卒中症狀或腦卒中病史。進行數據分析時，共有1849名腦卒中患者(平均年齡60.4±9.23歲，男性佔63.4％)和1798名對照(平均年齡59.6+8.5歲，男性佔59.2％)。其中，腦卒中患者包括812例(43.9％)腦血栓形成，530例患者(28.7％)腔隙性腦梗塞，507例(27.4％)腦出血。
腦卒中患者與對照人群均進行心腦血管病的標準問卷調查，調查內容包括神經疾病史、高血壓史、糖尿病史、收縮壓、舒張壓、身高、體重、吸菸、飲酒等生活習慣。同時抽取外周靜脈血，進行各項血生化指標測定，包括血糖、總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、非高密度脂蛋白膽固醇(non-HDL-C)等。高血壓的診斷標準為3次血壓測量收縮壓≥140mmHg，或舒張壓≥90mmHg，或者服用降壓藥者。糖尿病的診斷標準為空腹血糖水平≥7.8mmol/L，或餐後2小時血糖≥11.1mmol/L。
問卷調查、血壓、身高、體重測量和抽血由經過培訓的專業人員按《心血管病流行病學調查手冊》規定方法完成，血生化指標檢測全部由中心實驗室完成。
二、基因組DNA的提取按照標準的苯酚-氯仿抽提法進行。
三、VEGFR-2基因SNPs的選擇VEGFR-2基因位於染色體4q11-q12，cDNA全長約5.8kb，NCBIRefSeq mRNA accession No.為NM_002253，由30個外顯子和29個內含子組成。編碼的多肽鏈由1356個胺基酸組成，是酪氨酸激酶受體。VEGFR-2蛋白的結構分為3部分胞外區，包括7個Ig-like結構域；跨膜區；胞內酪氨酸激酶結構域。第1-19個胺基酸編碼信號肽，第20-764個胺基酸編碼VEGFR-2蛋白的胞外結構域，第765-789個胺基酸編碼跨膜部分，第790-1356個胺基酸編碼胞漿內結構域。該基因啟動子區的特點是沒有TATA盒而富集GC，並具有5個Sp1調控元件及其他多個轉錄因子的結合位點如AP-2、GATA、NF-κB等。
我們首先分別選取24名腦卒中患者和對照作為研究對象，對VEGFR-2基因轉錄起始位點上遊約2.0Kb的核苷酸序列進行測序，以檢測中國人群中的單核苷酸多態性位點及其頻率(方法一)。我們在VEGFR-2基因5』-調控區發現3個單核苷酸多態性位點，-604 T→C和-65T→C位於轉錄起始位點上遊，+32 A→G位於5』-UTR，它們在dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)資料庫中分別命名為rs2071559，rs9994560和rs7667298(圖1-3)。其中rs9994560的稀有等位基因C的頻率為0.04，rs7667298的稀有等位基因G的頻率為0.02，rs2071559的的稀有等位基因C的頻率為0.28。對rs2071559位點進行生物信息學分析，利用ClustalW軟體比對人和小鼠包括rs2071559的核苷酸序列，發現該區域高度保守；用TranscriptionElement Search System(TESS)分析發現rs2071559多態性-604 T→C的改變導致轉錄因子CP-2的結合位點(gTtgg)缺失。因此在進一步的大規模病例對照研究中，我們對rs2071559進行了基因分型。
我們根據dbSNP資料庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)對VEGFR-2基因所有30個外顯子中的單核苷酸多態性位點進行了測序和篩選(方法二)。此外，Walter在15例青少年血管瘤患者中研究VEGFR-2基因的突變，發現1例患者的血管瘤組織中存在VEGFR-2基因的一個錯義突變P1147S，該突變位於VEGFR-2基因的激酶結構域，導致脯氨酸轉變為絲氨酸，而在血管瘤周圍的正常組織中沒有檢測到該突變(Genes Chromosomes Cancer 33295-303，2002)。我們對該突變也進行了篩查。我們在對12個SNPs通過直接測序進行篩查之後，發現僅存在2個多態性位點，分別是處於Exon 7中的rs2305948，在VEGFR-2基因轉錄起始位點下遊+1192 C/T，導致非同義突變Val297Ile(圖4)；Exon 11中的rs1870377，在轉錄起始位點下遊+1719 A/T，導致非同義突變Gln472His(圖5)。因此，我們選取rs2305948和rs1870377進行下一步病例對照的關聯研究。
方法一1.以下列引物對VEGFR-2基因5』-調控區進行測序
2.PCR(聚合酶鏈式擴增反應)體系，見下表
PCR參數
3.PCR產物純化(1)將25μl PCR反應產物同其6倍體積的無水乙醇與5M醋酸胺(5∶1)混合溶液混合，置於-80℃ 30分鐘以上；(2)14,000rpm，4℃離心15分鐘，棄去上清；(3)加入200μl的75％酒精，14,000rpm，4℃離心5分鐘，吸上清棄去；(4)室溫或冷凍乾燥後，加入20μl TE溶解；
(5)吸2μl點樣，2％瓊脂糖凝膠(0.5×TBE緩衝液配製)電泳定量。
4.末端雙脫氧法測序儀器ABI PRISM 377測序儀(美國Perkin Elmer公司)方法二VEGFR-2基因編碼區的單核苷酸多態性位點(根據dbSNP資料庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)
PCR擴增體系，反應參數，PCR產物的純化以及測序等均同方法一。
四、VEGFR-2基因中3個單核苷酸多態性位點rs2071559，rs2305948和rs1870377基因型的確定1.PCR擴增所用的引物
2.PCR(聚合酶鏈式擴增反應)體系，見下表
PCR參數 3.rs2071559(-604T/C)多態的檢測(圖6) 注括號內是內切酶的識別序列，箭頭和黑體字是SNP的等位基因。T/T基因型的擴增片段不存在Bsm I酶切位點，將出現一個290bp片段；C/C基因型存在Bsm I酶切位點，將出現232bp和30bp兩個片段；T/C基因型則產生290bp、232bp和30bp三個片段。
(2)PCR產物酶切體系如下(20μl)PCR產物 8.0μl10×NEBuffer 22.0μlBsm I(10U/μl)0.3μlddH2O 9.7μl(3)65℃溫育3h後，加入10×上樣緩衝液1μl終止反應；(4)取8μl上述產物，2％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。
4.rs2305948(+1192C/T)多態的檢測(圖7)
注括號內是內切酶的識別序列，箭頭和黑體字是SNP的等位基因。C/C基因型的擴增片段不存在BstZ17 I酶切位點，將出現一個262bp片段；T/T基因型存在BstZ17 I酶切位點，將出現232bp和30bp兩個片段；C/T基因型則產生262bp、232bp和30bp三個片段。
(2)PCR產物酶切體系如下(20μl)PCR產物 8.0μl10×NEBuffer 3 2.0μlBstZ171(5U/μl) 0.5μlddH2O9.5μl(3)37℃溫育3h後，加入10×上樣緩衝液1μl終止反應；(4)取8μl上述產物，4％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。
5.rs1870377(+1719A/T)多態的檢測(圖8) 注括號內是內切酶的識別序列，箭頭和黑體字是SNP的等位基因。A/A基因型的擴增片段不存在Alu I酶切位點，將出現一個404bp片段；T/T基因型存在Alu I酶切位點，將出現191bp和213bp兩個片段；T/A基因型則產生404bp、191bp和213bp三個片段。
(2)PCR產物酶切體系如下(20μl)PCR產物 8.0μl10×NEBuffer 2 2.0μlAlu I(10U/μl) 0.3μlddH2O9.7μl(3)37℃溫育3h後，加入10×上樣緩衝液1μl終止反應；(4)取8μl上述產物，2％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。
五、統計學分析採用SSPS 10.0統計軟體包，所有的統計的顯著性水平P值定為0.05(雙側)。
1.腦卒中病例組和對照組的臨床特徵比較(1)Mann-Whitney法血清總甘油三酯(TG)為偏態分布，分析前進行自然對數轉換，比較各組間差異。
(2)非配對student’s t檢驗年齡、血漿HDL-C、血漿non-HDL-C、血漿總膽固醇、血壓、體重指數、血糖等血生化指標的組間均數比較(平均值±標準差)。
(3)Chi square檢驗性別、吸菸、高血壓史和糖尿病史等分類資料的組間比較。
2.頻數統計單核苷酸多態位點SNPs的等位基因頻率和基因型頻率在病例和對照組的分布3.Chi square檢驗(1)判斷每個多態位點等位基因頻率和基因型頻率的分布有無地區、性別差異。
(2)判斷每個多態位點是否符合哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinbergequilibrium，HWE)，P＞0.05認為樣品符合HWE。
(3)每個位點的單位點關聯分析。
4.多元Logistic回歸(1)評價傳統的心腦血管病危險因素年齡、性別、吸菸、飲酒、血漿HDL、血漿總膽固醇、血壓、體重指數、血糖等與腦卒中的關係，(2)校正上述危險因素後，檢測VEGFR-2基因的SNPs與腦卒中的相關性。
(3)用比值比(odds ratio，OR)和95％可信區間(confidenceinterval，CI)來表示相關性。
5.遺傳標記間的連鎖不平衡分析和單體型的關聯分析遺傳標記之間的連鎖不平衡程度的衡量值D、D′、γ2值，通過2LD(http://www.iop.kcl.ac.uk/iop/departments/psychmed/gepibst/software/21d.stm)和EMLD(http://request.mdacc.tmc.edu/～qhuang/Software/pub.htm)軟體來計算。採用PHASE 2.0軟體[48]估計每種單體型的頻率(http://www.stat.washington.edu/stephens/phase.html)，並計算出病例組和對照組中單體型頻率的整體差異，P＜0.05作為統計學的顯著性差異。然後採用卡方檢驗比較每個單體型頻率在病例組和對照組的分布是否有顯著性差異。
六、VEGFR-2基因啟動子區SNP-604T/C對啟動子活性的影響啟動子區的遺傳變異可影響基因的轉錄活性。-604T/C位於VEGFR-2基因轉錄起始位點上遊的啟動子區，我們用Clustal W軟體比對人和小鼠的啟動子區序列，發現該位點所在區域高度保守。利用TranscriptionElement Search System(TESS)軟體包分析該多態位點所在序列可能結合的轉錄因子，發現該段序列可能與轉錄因子CP2、NF-1(nuclearfactor-1)和YY-1(Yin and Yang 1)結合。VEGFR-2基因-604鹼基T→C的改變，可能影響轉錄因子CP-2、NF-1或YY-1與該段序列的結合能力，或者通過轉錄因子間的相互作用，改變基因的啟動子活性和表達水平，從而影響VEGF的血管生物學效應。因此我們構建VEGFR-2基因啟動子/螢光素酶報告載體研究SNP-604T/C對基因轉錄活性的影響(見方法三)。
方法三、1.構建螢光素酶報告基因質粒pGL3/-604TT1.1 PCR法擴增VEGFR-2基因啟動子區序列選擇基因型為-604TT的個體DNA，用PCR法和Pyrobest Taq聚合酶擴增含有VEGFR-2基因全部啟動子區的DNA片段，包括轉錄起始位點和外顯子1(Genbank accession no.AC021220.7)。引物序列為上遊引物5』-tag cga gct ctg cca caa gaa gtc cac aca-3』(含有限制酶SacI識別序列GAGCTC)；下遊引物5』-cac ccg acc tgt ctg cct tcc-3』。擴增條件95℃變性10分鐘；隨後進行30個循環，每一循環包括94℃變性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸90秒；最後，72℃延伸10分鐘。擴增片段長度1.3Kb，具有SacI/XhoI雙酶切位點。
1.2 PCR產物純化(1)加入6倍體積的醋酸氨/乙醇(1∶5)，-70℃ 30分鐘。
(2)4,000rpm(轉/分)×10分鐘，12,000rpm×10分鐘。
(3)75％乙醇洗滌。
(4)待乙醇揮發完，加50μl滅菌水溶解。
1.3 PCR純化產物測序驗證含有野生基因型-604TT1.4構建螢光素酶報告基因質粒pGL3/-604T將上述測序驗證後的VEGFR-2基因啟動子區的PCR產物用1％的瓊脂糖切膠回收，經限制酶Sac I和Xho I雙酶切4小時(37℃)後，回收/純化目的片段(1182bp，-887～+295)，同時將pGL3-Basic螢光素酶報告載體進行Sac I和Xho I雙酶切並回收/純化大片段，最後將上述消化回收的片段在16℃水浴中用T4 DNA連接酶連接，轉化，挑取克隆，提取質粒。酶切再鑑定，陽性克隆測序確定插入目的片段的正確性。測序通用引物為T7引物5』TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3』；SP6引物5』ATT TAGGTG ACA CTA TAG AA 3』。
2.突變法製備螢光素酶報告基因質粒pGL3/-604CC2.1構建pGEM-T Easy/-604TT質粒將測序驗證後的VEGFR-2基因啟動子區的PCR擴增片段(含-604TT)用Takara Taq酶在3』加A尾，並連接入pGEM-T Easy載體，轉化，挑取克隆，提取質粒、酶切再鑑定。陽性克隆測序確定目的片段的插入方向。
3』加A尾反應70℃ 30分鐘10×Taq polymerase buffers1.0μldATP(2mM) 1.0μlTakara Taq(5U/μl)1.0μl純化後PCR產物 7.0μl連接反應4℃ 14-16小時
2×Rapid ligation buffer 5.0μlpGEM-T Easy Vector1.0μlT4 DNA連接酶 1.0μl加A尾的PCR產物3.0μl2.2突變法製備pGEM-T Easy/-604C亞克隆質粒(GeneEditor-in vitroSite-Directed Mutagenesis System，Promega)2.2.1突變引物的5』端磷酸化突變引物序列5』-cgg gaa tgC tgg cga ac-3』，其中C為-604突變位點。
磷酸化反應突變引物(200pmol)2.5μlT4 kinase 10×buffer 0.5μlT4 kinase(5U/μl)1.0μlATP(10mM)2.5μl滅菌蒸餾水 18.5μl上述反應體系37℃孵育30分鐘，70℃ 10分鐘滅活T4 kinase，-20℃保存。
2.2.2質粒pGEM-T Easy/-604T的鹼變性質粒DNA(2ng) 12.0μl2M NaOH，2mM EDTA 2.0μl滅菌蒸餾水 6.0μl上述反應體系室溫放置5分鐘，加入2M醋酸氨2μl和無水乙醇(4℃)75μl沉澱DNA，-70℃ 30分鐘，4℃離心13,000rpm×15分鐘，小心去除上清。然後用70％乙醇(4℃)洗滌，離心13,000rpm×15分鐘，去除上清，晾乾，加入50μl滅菌蒸餾水溶解。0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。
2.2.3突變引物與質粒DNA的雜交變性的質粒DNA10.0μl5』磷酸化的突變引物 3.0μl5』磷酸化的Selection引物 1.0μlAnnealing 10×buffer 2.0μl滅菌蒸餾水 4.0μl用PCR擴增儀控制雜交溫度的逐漸降低75℃變性5分鐘後，使溫度緩慢下降至37℃，平均每分鐘下降1.0℃，整個過程約40分鐘。
2.2.4突變鏈的合成與連接雜雜交反應液 20.0μlSynthesis 10×buffer 3.0μlT4 DNA Polymerase1.0μlT4 DNA Ligase1.0μl滅菌蒸餾水 5.0μl於37℃水浴90分鐘。
2.2.5轉化BMH 71-18 mutS感受態細胞BMH 71-18 mutS是錯配修復功能缺陷的大腸桿菌E.Coli菌株，可防止新合成的非甲基化DNA鏈的修復，從而提高突變產生的效率。將突變液轉化的BMH 71-18 mutS感受態細胞在含有GeneEditorAntibiotic Selection Mix的LB培養基中於37℃搖菌、培養16-18小時。
2.2.6轉化JM109感受態細胞和突變子的篩選鹼裂解法提取質粒，轉化JM109感受態細胞，在含有Amp抗性和Antibiotic Selection Mix的LB平板上篩選突變子。在37℃孵育14-16小時，挑取單克隆菌在含Amp抗性的LB培養液中培養12-14小時，收穫大腸桿菌，用鹼裂解法小量提取質粒，測序確定突變位點-604C的存在，以及插入目的片段的其他序列與野生型質粒pGL3/-604T的插入片段完全一致。
2.3構建螢光素酶報告基因質粒pGL3/-604CC將上述測序驗證後的pGEM-T Easy/-604C亞克隆質粒和pGL3-Basic螢光素酶報告載體分別用限制酶Sac I和Xho I雙酶切4小時(37℃)後，0.8％的瓊脂糖凝膠電泳並回收目的片段，在16℃水浴中用T4 DNA連接酶連接上述消化回收的目的片段，轉化，鹼裂解法小量提取質粒DNA。測序確定插入目的片段的正確性，得到突變基因型的螢光素酶報告基因質粒pGL3/-604C。
3.細胞培養3.1人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的原代培養。
3.1.1實驗步驟(1)打開無菌託盤，倒入無菌生理鹽水。將24小時內新生兒臍帶放入託盤漂洗數遍，衝淨血管中殘存血塊。
(2)剪掉臍帶兩端，一端接入三通注射器直口，另一端接入吸管-膠管-針頭三聯體，不斷抽動活塞，檢查是否漏氣，並將臍帶內殘存血趕出。
(3)將膠管-針頭二聯體連接入三通注射器側口，然後將針頭插入預熱的無菌PBS瓶中，虹吸入1×PBS，衝洗臍帶3～5次。
(4)將針頭拔出，插入室溫預熱的0.25％胰蛋白酶瓶中，臍帶另一端用血管鉗加緊，不斷抽動活塞，直至臍靜脈內完全充滿胰蛋白酶而無殘存空氣。夾緊側口膠管。將臍帶整體移入含37℃ 1×PBS的瓷缸內，水浴消化15分鐘。
(5)取出臍帶，將臍靜脈中的消化液收集於50ml離心管中，滴入數滴滅活血清，將消化液離心(＜1000rpm，5～10分鐘，室溫)。
(6)吸取細胞團沉澱至25cm2培養瓶中，加入適量的M199培養液(20cm臍帶細胞加3ml～5ml培養液，含15％FBS、150μg/ml ECGS、75μg/ml肝素鈉)，小心吹散，於37℃、95％O2、5％CO2培養箱中培養。
(7)細胞密度為70％～90％時傳代，加入0.125％胰蛋白酶、0.02％EDTA的細胞消化液，倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，待細胞與細胞分開，胞體變圓變亮，吸去消化液。
(8)加入含10％FBS的M199培養液，小心吹散細胞，接種新的培養瓶。
3.2 293S細胞的培養
3.2.1 293S細胞的復甦(1)將凍存細胞從液氮罐中取出，迅速放入40℃水浴鍋中，晃動，使之儘快完全融解(1～1.5分鐘)。
(2)離心，取上清；(3)加入5ml新鮮的DMEM培養基(含10％FBS)，接種至25cm2培養瓶中。
3.2.2 293S細胞的傳代培養(1)細胞密度為70％～90％時傳代，加入0.125％胰蛋白酶、0.02％EDTA的細胞消化液。
(2)倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況(約5分鐘)，待細胞與細胞分開，胞體變圓變亮，吸去消化液，去除大部分細胞。
(3)加入5ml含10％FBS的DMEM培養基，於37℃、95％O2、5％CO2培養箱中培養。
4.轉染和螢光素酶分析4.1實驗分組實驗組pGL3/-604T野生型質粒pGL3/-604C突變型質粒空載體組pGL3-Basic螢光素酶報告載體陽性對照組pGL3-Control螢光素酶報告載體。
上述各組同時共轉染pRL-CMV報告載體作為內參校正轉染效率。
4.2細胞轉染和螢光素酶分析(1)用Lipofectamine 2000，分別將20μg pGL3/-604T、pGL3/-604C報告載體或pGL3-Basic空載體、pGL3-Control陽性對照載體，與0.8μg內參pRL-CMV共轉染入HUVEC細胞或293S細胞。對於每種報告載體，重複進行三次獨立的轉染實驗。
(2)轉染24小時後，棄培養基，用PBS洗一次，去掉PBS。
(3)用雙螢光素酶報告分析系統檢測螢光素酶活性。加300μl 1×PLB，在搖床上室溫孵育15分鐘，使細胞完全裂解。
(4)將裂解液移入1.5ml離心管中離心，去掉沉澱。
(5)取100μl LAR II及20μl裂解液移至螢光管中，混勻；測量螢火蟲螢光素酶的活性。
(6)再加入100μl stop Gol Reagent，測量海膽螢光素酶的活性。
5.數據處理進行3次獨立的細胞轉染和螢光素酶活性分析，啟動子活性用相對螢光素酶活性單位(Relative luciferase unit，RLU)表示，即fireflyluciferase和renilla luciferase的比值。RLU用均數±標準差表示，非配對Student’s t檢驗比較組間的差異，P＜0.05作為顯著性水平。
七、結果一)腦卒中病例組和對照組的一般臨床資料傳統的心腦血管病的危險因素包括糖尿病史、高血壓史和吸菸者在病例組更常見。病例組收縮壓、舒張壓、空腹血糖水平、甘油三酯(TG)均顯著高於對照組，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)顯著低於對照組(表1)。
二)VEGFR-2基因多態與腦卒中相關VEGFR-2基因多態位點-604T/C、+1192C/T和+1719A/T在病例組和對照組的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，頻數分布無地區、性別的顯著性差異。每個多態位點的基因型及等位基因在病例組和對照組頻率分布如表2所示。
在腦血栓病例組中，多態位點-604等位基因C的頻率為0.27，顯著低於對照組(頻率為0.30，P＝0.001)，基因型TC/CC攜帶者的頻率也顯著低於對照組(分別是45.1％和52.1％，P＝0.004)。在腦出血病例組中，多態位點+1192等位基因T的頻率為0.18，顯著高於對照組(頻率為0.11，P＜0.0001)，基因型CT/TT攜帶者的頻率顯著高於對照組(分別是33.8％和20.5％，P＜0.0001)。在腦出血組，多態位點+1719等位基因T的頻率為0.43，顯著高於對照組(頻率為0.38，P＝0.004)；AA、AT、TT基因型頻率在腦出血組中分別為38.9％、45.4％、15.7％，在對照組中分別為31.8％、49.7％、18.5％，組間分布有顯著統計學差異(P＝0.01)。
為調整腦卒中環境因素和其他傳統血管危險因素的影響，以是否腦卒中為因變量，以VEGFR-2基因多態和傳統危險因素為自變量，進行多元非條件Logistic回歸分析。校正了年齡、性別、吸菸、血漿HDL、血漿總膽固醇、血壓、體重指數、血糖等傳統危險因素後，VEGFR-2基因啟動子區-604C等位基因與降低的腦血栓形成性卒中患病風險相關(OR＝0.78，95％ CI0.65-0.95；P＝0.025.)。攜帶+1192T和+1719T等位基因的個體腦出血的患病風險增加(OR＝2.25，95％ CI1.70-2.96，P＝0.0001；OR＝1.33，95％ CI1.03-1.73，P＝0.01)。
三)VEGFR-2基因單體型與腦卒中相關我們計算了VEGFR-2基因3個SNP位點之間的連鎖不平衡程度(表3)，發現-604T/C和+1192C/T之間，以及+1192C/T和+1719A/T之間存在著微弱的連鎖不平衡，它們的D』分別為0.1636和0.2663。利用這3個SNP位點構建單體型，關聯分析結果表明在腦梗塞組與對照組之間，以及腦出血組和對照組之間單體型頻率的分布都有顯著性的整體差異(腦梗塞組P＝0.01；腦出血組P＝0.01；表17)。
以野生單體型TCA(-604/+1192/+1719)作為參照，進一步比較每種單體型在不同組之間的頻率的區別(表4a，表4b)。我們發現單體型C-C-T在腦梗塞組的頻率(7.6％)顯著低於對照組中的頻率(10.8％)(OR0.67；95％ CI0.54～0.84；P＝0.0004)，Bonferroni’s多重檢驗校正後，仍有顯著性差異(P＝0.0021)。在腦出血組，含有+1192T等位基因的單體型T-T-A、T-T-T、C-T-A和C-T-T的頻率均顯著高於對照組中的頻率(P＜0.01)。其中單體型T-T-T在腦出血和對照組的頻率分別為4.5％和1.6％，與腦出血的發病風險有強的相關性，OR值為3.43(95％CI2.28～5.14；Bonferroni’s校正P＝2.7×10-9)；而單體型C-T-T與腦出血發病的相對危險度降低至2.30(95％CI1.39～3.79；Bonferroni’s校正P＝0.007)，在腦出血和對照組中的頻率分別是2.5％和1.3％。
四)-604T/C降低VEGFR-2基因啟動子區的轉錄活性由於VEGFR-2主要在血管內皮細胞表達，我們將構建的野生型和突變型報告基因質粒分別瞬時轉染入人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，在無血清培養基中培養24小時後，通過測定螢光素酶的活性，檢測了單核苷酸多態-604T/C是否影響VEGFR-2基因啟動子區的轉錄。同時，以293-S細胞作為對照，觀察VEGFR-2基因的該段啟動子序列在非內皮細胞中的啟動活性。結果如圖9所示，VEGFR-2基因啟動子序列(-887～+296)在293-S細胞中幾乎沒有啟動螢光素酶的表達活性；在HUVEC細胞中，與野生型-604T比較，-604C多態使螢光素酶的表達活性降低2.93倍(pGL3/-604C5.81±2.42；pGL3/-604T17.03±4.89；P＜0.001)。
八、結論VEGFR-2是VEGF的高親和力受體，是一種酪氨酸激酶受體。VEGF的多種生理、病理學作用包括促進血管內皮細胞分裂、增生、遷移以及增加血管通透性等主要是通過VEGFR-2的信號傳導通路來完成的。
VEGFR-2基因啟動子區的多態-604C等位基因與降低的腦血栓形成性卒中患病風險相關(OR＝0.78，95％ CI0.65-0.95)。細胞學實驗結果表明，突變型等位基因-604C的啟動子活性顯著低於野生型-604T等位基因，因此，VEGFR-2基因-604C等位基因可能通過減弱啟動子轉錄活性，降低VEGF的表達水平，減弱其在動脈粥樣硬化斑塊區域促進微血管形成的作用，從而影響到斑塊損傷的進展和穩定性。
關聯分析結果表明，攜帶+1192T和+1719T等位基因的個體腦出血的患病風險增加(OR＝2.25，95％ CI1.70-2.96；OR＝1.33，95％CI1.03-1.73)。我們對這兩個位點進行了生物信息學分析。多態+1192C/T位於VEGFR-2基因外顯子7，導致VEGFR-2 mRNA第297位的胺基酸殘基由纈氨酸(valine)變為異亮氨酸(isoleucine)。該胺基酸殘基的疏水性雖未發生改變，但由於它位於VEGFR-2基因胞外區的第2個Ig-like結構域內，而該結構域對VEGFR-2與其配體VEGF的結合至關重要(J BiolChem.1998；27311197-11204)。採用ExPASy蛋白分析系統的PROSITE資料庫分析，表明該位點處於蛋白質的骨架成分內，埋藏在蛋白質空間構象內部，是N-肉豆蔻醯化位點，突變後該位點仍存在。多態+1719A/T位於VEGFR-2基因外顯子11，導致VEGFR-2 mRNA第472位的胺基酸殘基由谷胺醯氨(glutamine)變為組氨酸(histidine)，胺基酸的性質由中性改變為鹼性。該位點在VEGFR-2基因胞外區的第5個Ig-like結構域內。採用ExPASy蛋白分析系統的PROSITE資料庫分析，表明該位點在蛋白質空間結構的表面，glutamine突變為histidine後，電荷的改變可能引起胺基酸之間靜電作用的改變，從而影響受體與配體的結合特性。因此，我們有理由推測VEGFR-2基因編碼區的胺基酸改變可能影響VEGFR-2的空間構象，從而改變配體與受體的結合特性，繼而影響下遊信號通路，最終改變VEGF促進血管增生、遷移和增加血管通透性等生理病理學效應。
單個遺傳標記進行遺傳分析的效力較小，由幾個連鎖位點組成的單倍型則能提供更多更可靠的信息，而且用單倍型來檢測連鎖不平衡常常比單位點更可靠。單體型的關聯分析進一步支持了上述單位點關聯分析的結論，即單體型C/C/T(-604/+1192/+1719)為low-riskhaplotype，對腦血栓形成有保護作用(OR＝0.59，95％CI0.43-0.82)，而T/T/T單體型攜帶者腦出血的患病風險增加(OR＝3.18，95％CI1.79-5.67)。
表1腦卒中病例組和對照組的一般臨床資料
*P＜0.05，P＜0.01 versus control.
表2VEGFR-2基因多態位點的基因型和等位基因在病例組和對照組的頻率分布
*P andP病例組和對照組間的卡方檢驗*多元Logistic回歸校正年齡、性別、吸菸、飲酒、血漿HDL、血漿總膽固醇、血壓、體重指數、血糖後，檢測VEGFR-2基因與腦卒中的相關性與腦卒中的相關性。
表3 VEGFR-2基因多態位點的連鎖不平衡
注D、D』和r2為衡量連鎖不平衡程度的指標；P值是根據D值計算而得。
表4a VEGFR-2基因各單體型(-604/+1192/+1719)在腦梗塞和腦出血組的分布
表4b VEGFR-2基因各單體型(-604/+1192/+1719)在腦出血組的分布
*Global P由PHASE 2.0軟體估計單體型頻率，並比較病例組和對照組中單體型頻率分布的整體差異*OR(95％CI)和P卡方檢驗比較每個特定的單體型在病例組和對照組間的分布(以野生單體型TCA為參照)；PcorrBonferroni’s多重檢驗校正後
權利要求
1.用於確定VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的遺傳多態性型式的工具。
2.權利要求1的工具，它是VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多態性分型寡核苷酸，優選地，所述多態性分型寡核苷酸是(1)等位基因特異性核酸引物，它能夠檢測VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的多態性，或者(2)用於檢測VEGFR-2基因中的多態性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多態性的核酸雜交，優選地，寡核苷酸探針的長度為17-50個核苷酸。
3.根據權利要求2的工具，其是限制性內切酶。
4.診斷試劑盒，包含權利要求1-3任一項的工具。
5.診斷患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在，其中，VEGFR-2基因啟動子區-604C等位基因與降低的腦血栓形成性卒中患病風險相關，攜帶+1192T等位基因的個體和攜帶+1719T等位基因的個體腦出血的患病風險增加，單體型(-604/+1192/+1719)C/C/T對腦血栓形成有保護作用，而單體型(-604/+1192/+1719)T/T/T單體型攜帶者腦出血的患病風險增加。
6.確定患者對腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品中VEGFR-2基因-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在，其中，VEGFR-2基因啟動子區-604C等位基因與降低的腦血栓形成性卒中患病風險相關，攜帶+1192T等位基因的個體和攜帶+1719T等位基因的個體腦出血的患病風險增加，單體型(-604/+1192/+1719)C/C/T對腦血栓形成有保護作用，而單體型(-604/+1192/+1719)T/T/T單體型攜帶者腦出血的患病風險增加。
7.分析從患者分離的離體生物樣品的方法，包括確定所述樣品中VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的核苷酸。
8.權利要求7的方法，還包括確定所述患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性或者診斷患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)，其中，VEGFR-2基因啟動子區-604C等位基因與降低的腦血栓形成性卒中患病風險相關，攜帶+1192T等位基因的個體和攜帶+1719T等位基因的個體腦出血的患病風險增加，單體型(-604/+1192/+1719)C/C/T對腦血栓形成有保護作用，而單體型(-604/+1192/+1719)T/T/T單體型攜帶者腦出血的患病風險增加。
9.權利要求5至8任一項的方法，其中使用包括選自以下的差異核酸分析技術的試驗用質譜對PCR產物直接質量分析、對侵入性切割產物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗、侵入者試驗、DNA晶片分析和限制性片段長度多態性。
10.一種微陣列，其中包含權利要求2中所定義的VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T多態性分型寡核苷酸。
11.權利要求10的微陣列，它是DNA晶片的形式。
12.檢測生物學樣品中VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的存在的物質用於製備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用於診斷患者腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)或者用於確定患者對腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性。
13.權利要求12的用途，其中所述物質選自權利要求1-4的工具；能夠特異識別VEGFR-2中Val297Ile突變和/或Gln472His突變的抗體；和能夠特異識別VEGFR-2基因VEGFR-2基因多態位點-604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的引物或者探針或者限制性內切酶。
全文摘要
本發明涉及確定患者對腦血管疾病(特別是包括腦血栓形成、腔隙性腦梗塞、腦出血在內的腦卒中)的遺傳易感性的方法。具體地，本發明方法包括確定VEGFR－2基因多態位點－604T/C和/或+1192C/T和/或+1719A/T的遺傳多態性型式。本發明還涉及用於該方法的物質、組合物、試劑盒及其用途。
文檔編號C12Q1/68GK1940086SQ20051010582
公開日2007年4月4日 申請日期2005年9月29日 優先權日2005年9月29日
發明者惠汝太, 張偉麗, 孫凱, 石毅, 汪一波, 楊曉敏 申請人:中國醫學科學院阜外心血管病醫院