生產l-穀氨醯胺的方法和生產l-穀氨醯胺的細菌的製作方法

2023-12-09 09:17:56 2

專利名稱：生產l-穀氨醯胺的方法和生產l-穀氨醯胺的細菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及屬於棒狀桿菌的產L-穀氨醯胺細菌，用於產生L-穀氨醯胺。本發明還涉及生產L-穀氨醯胺的方法。L-穀氨醯胺是在工業上有很多用途的胺基酸，可作為調味品的成分、肝功能提升試劑、胺基酸浸劑、複合胺基酸藥物等等。
除了上述提到的基因，胺基酸雜誌(Amino Acids，773-77，1963)中暗示了棒狀桿菌中存在涉及L-穀氨醯胺降解的酶。然而，銨離子和低PH可抑制此酶的活性，因此在穀氨醯胺發酵過程中存在胺離子，酶很少起作用。
穀氨醯胺酶(穀氨醯胺氨基水解酶)是已經報導了編碼穀氨醯胺酶的基因有Pseudomonas細菌(FEMS Microbol.Lett.，178(2)，327-325，1999)、米麴黴(Appl.Microbiol.Biotechnol.，54，59 68，2000)、Rhizobium etli(Biochim.Biophys.Acta，1444(3)，451-6，1999)、大鼠(J.Biol.Chem，266(28)，18792-18796，1991)等。另外報導在大腸桿菌中也存在穀氨醯胺酶活性(J.Biol.Chem，243(5)，853-878，1968)。但是，還沒有在棒狀桿菌中分離出穀氨醯胺酶基因，關於此基因的任何有效突變對穀氨醯胺產量的影響也未可知。
通過修飾目的基因的起始序列來增強基因表達的方法是已知的(日本專利特開(Kokai)No.2000-818935)。現在已知棒狀桿菌的編碼穀氨醯胺合成酶「glnA」)的基因(FEMS Microbiology Letters，154，81-88，1997)。而且已經分離出包括起始位點的基因翻譯起始區域(FEMS Microbiology Letters，205，361-367，2001)。然而以前沒有修飾起始位點來增強穀氨醯胺合成酶基因的表達的描述。
在發酵生產L-胺基酸中經常使用提高微生物的方法。也就是說，既然野生微生物L-胺基酸的產量都非常的低，那麼通過突變產生自養或者類似抗性、提高代謝調節或者兩者相結合。儘管通過這些方法都可以產生L-穀氨醯胺，目前的現有技術需要提要發酵產量以便有效而且經濟的生產L-穀氨醯胺發明概述本發明的發明人經過刻苦的研究獲得了本發明。本發明涉及棒狀桿菌中的一個新基因，以及利用重組技術提高L-穀氨醯胺產量的方法。首先，分離編碼穀氨醯胺酶的基因，同時發現在穀氨醯胺酶活性降低的菌株中L-穀氨醯胺的產生能力優於那些穀氨醯胺酶活性與野生菌相似的菌株。進一步發現降低穀氨醯胺酶活性的同時增強穀氨醯胺合成酶的活性更加有利於L-穀氨醯胺的產生。
本發明的目的是通過降低L-穀氨醯胺的降解來提高棒狀桿菌產L-穀氨醯胺的能力，因而提供利用這樣特性的菌株來生產L-穀氨醯胺的方法。
本發明進一步的目的是提供具有L-穀氨醯胺產生能力並且經過修飾以使胞內穀氨醯胺酶活性降低的棒狀桿菌。
本發明進一步的目的是提供上面所述的細菌，其中是通過斷裂染色體上的穀氨醯胺酶基因的方法降低胞內穀氨醯胺酶活性。
本發明更進一步的目的是提供上面所述的細菌，其中穀氨醯胺酶活性約0.1U/mg細胞蛋白。
本發明更進一步的目的是提供上面所述的細菌，其中當測定每單位質量細胞蛋白的酶活性時，穀氨醯胺酶活性與穀氨醯胺合成酶的活性相似或更低。
本發明更進一步的目的是提供上面所述的細菌，其中進一步修飾增強穀氨醯胺合成酶活性。
本發明更進一步的目的是提供上面所述的細菌，其中通過提高穀氨醯胺合成酶基因的表達來增強穀氨醯胺合成酶活性。
本發明更進一步的目的是提供上面所述的細菌，通過增加編碼穀氨醯胺合成酶基因的拷貝數或者修飾編碼穀氨醯胺合成酶基因的翻譯調控區來增強穀氨醯胺合成酶基因的表達，這樣增強細菌基因的表達。
本發明更進一步的目的是提供一種生產L-穀氨醯胺的方法，包括在培養基中培養上面所述的細菌以產生L-穀氨醯胺，並且從培養物中收集L-穀氨醯胺。
本發明更進一步的目的是提供一種棒狀桿菌的穀氨醯胺合成酶基因，其中基因的-35區(region)的序列替換成TrGCCA，-10區的序列替換成TATAAT。
根據本發明，棒狀桿菌的產L-穀氨醯胺的能力增強，因而有效而低成本的獲得高產量的L-穀氨醯胺。


圖1含穀氨醯胺酶基因的質粒pHMKGLS5的構建圖2在棒狀桿菌中無自我複製位點的質粒pNEL的構建圖3含斷裂的gls的質粒pNELAgls的構建圖4含增強表達的GS基因的質粒pNELglnA14的構建優選實施方案詳述本發明的棒狀桿菌在本發明中，棒狀桿菌包括但不限於被劃分為短桿菌屬和棒狀桿菌屬的那些細菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255，(1981))，這兩個菌屬的關係非常接近。這樣的棒狀桿菌包括嗜乙醯乙酸棒狀桿菌，醋谷棒狀桿菌，Corynebacteriumalkanolyticum，美棒狀桿菌，穀氨酸棒狀桿菌，百合花棒狀桿菌，Corynebacteriummelassecola，Corynebacterium thermoaminogenes，力士棒狀桿菌，分支短桿菌，黃色短桿菌，Brevibacterium immariophilum，乳發酵短桿菌，玫瑰色短桿菌，解糖短桿菌，生硫短桿菌，產氨短桿菌，白色短桿菌，蠟狀短桿菌，嗜氨微桿菌。
具體的說，包括了以下菌株嗜乙醯乙酸棒狀桿菌ATCC13870醋谷棒狀桿菌ATCC15806Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511美棒狀桿菌ATCC15991百合花棒狀桿菌ATCC13020，13032，13060分支短桿菌ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965CorynebacteriumthermoaminogenesAJ12340(FERMBP-1539)力士棒狀桿菌ATCC13868穀氨酸棒狀桿菌ATCC14020黃色短桿菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC14068乳發酵短桿菌ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240產氨短桿菌ATCC6871，ATCC6872白色短桿菌ATCC15111蠟狀短桿菌ATCC15112嗜氨微桿菌ATCC15354。
這些菌株可從例如美國典型培養物保藏中心獲得。每個菌株有其指定的保藏號，根據這個保藏號可以請求提供所需的菌株。美國典型培養物保藏中心的目錄中標明了每個菌株的保藏號。菌株AJ12340於1987年10月27日保藏於國家生命科學和人體技術研究院工業科學技術研究所(現在，獨立的行政機構，國家高級工業科學和技術研究院，國際專利生物保藏中心(Tsukuba cebtral6，1-1，higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，郵編305-5466))作為根據布達佩斯條約進行的國際保藏，保藏號為FERM BP-1539。菌株AJ12418於1989年1月5日保藏於國家生命科學和人體技術研究院工業科學技術研究所，作為根據布達佩斯條約進行的國際保藏，保藏號為FERM BP-2205。
在本發明中，「產L-穀氨醯胺的能力」是指當在培養基中培養本發明的棒狀桿菌時該細菌在該培養基中積累L-穀氨醯胺的能力。這種產L-穀氨醯胺的能力是野生型棒狀桿菌的特性，或者可以通過增殖被給予或增強。
為了通過增殖給予或增強產L-穀氨醯胺的能力，可以使用以下的方法獲得6-重氮-5-氧-正亮氨酸抗性菌株的方法(日本專利特開No.3-232497)，獲得嘌呤類似物和/或甲硫氨酸亞碸抗性菌株的方法(日本專利特開No.61-202694)，獲得α-酮丙二酸抗性的方法(日本專利特開No.56-151495)，獲得對含穀氨酸的肽的抗性的方法(日本專利特開No.2-186994)等等。具有產L-穀氨醯胺能力的棒狀桿菌的具體實例包括但不限於黃色短桿菌AJ11573(FERMP-5492，參見日本專利特開No.56-151495)黃色短桿菌AJ12210(FERMP-8123，參見日本專利特開No.61-202694)黃色短桿菌AJ12212(FERMP-8123，參見日本專利特開No.61-202694)
黃色短桿菌AJ12418(FERM P-2205，參見日本專利特開No.2-186994)黃色短桿菌DH18(FERM P-11116，參見日本專利特開No.3-232497)Corynebacterium melassecola DH344(FERM P-11117，參見日本專利特開No.3-232497)穀氨酸棒桿菌AJ11574(FERMP-5493，參見日本專利特開No.56-151495)另外，本發明的穀氨酸棒桿菌經過修飾以致其細胞內穀氨醯胺酶活性降低。「穀氨醯胺酶活性」(即GLS活性)是指酶催化L-穀氨醯胺轉化成L-穀氨酸的能力。GLS活性可通過下述方法或其他已知的方法測定。
將棒狀桿菌的粗製酶溶液中加入含100mMTris-HCl(pH8.0)和75mM L-穀氨醯胺的溶液中，30℃反應30或60分鐘，然後向反應混合物中加入SDS至終濃度為0.5％以終止反應，測定產生的L-穀氨酸的量。本發明中，在上述反應體系中每分鐘產生1μmol穀氨酸的穀氨醯胺酶活力定義為1U。粗製酶溶液中的蛋白的量也可根據已知的方法例如「Bio-Rad」法測定，以牛血清蛋白作為標準品。在本文中，GLS活性/mg蛋白以「U/mg」表示。
上述的粗製酶溶液可用以下方法製備。首先，製備細胞。所用培養基含30g葡萄塘，1.5g KH2PO4，0.4g MgSO4·7H2O，0.01g FeSO4.7H2O，100μg VB1·HCl，，3μg生物素，200mg大豆蛋白水解物，1.5g尿素，0.02ml消泡劑GD-113，加純水至1L(用NaOH調節pH6.8)。取20ml培養基加入500ml搖瓶中，高壓蒸汽115℃滅菌10分鐘，然後在31.5℃，115rpm振蕩培養菌株細胞。培養基中糖類被完全利用之前結束培養，並立即冷卻培養液。冷凍離心從培養液中分離細胞，用100mMTris-HCL(pH8.0)洗滌，超聲波破碎細胞。15000g離心15分鐘除去未裂解的細胞，就得到粗製酶溶液。該溶液使用前置於冰上保存。
根據上述方法，測定了已知的具有產L-穀氨醯胺能力的細菌的GLS活性，結果列於表8。
術語「修飾以致細胞內穀氨醯胺活性降低」是指棒狀桿菌經過修飾使每個細胞的GLS活性低於野生型或非修飾的棒狀桿菌。實例包括每個細胞中GLS(穀氨醯胺酶)分子的數量減少或每個GLS分子的活性降低等等。術語「降低」也包括活性的完全消失。作為對照的野生型或非修飾的棒狀桿菌，例如黃色短桿菌ATCC14067，由於GLS活性降低，使培養基中L-穀氨醯胺的積累量增加，副產物L-穀氨酸的量減少。
與野生型或非修飾的棒狀桿菌相比，本發明棒狀桿菌的GLS活性顯著降低。按照前文所述的測量方法測得GLS活力水平降至0.1U/mg或更低，優選0.02U/mg或更低，更優選降至0.01U/mg或更低。然而，本發明中GLS活性水平並不限於0.01U/mg或更低水平。
雖然以前沒有確定棒狀桿菌中編碼GLS的基因，本發明提供了一種從黃色短桿菌中分離得到的基因。根據公開的穀氨酸棒桿菌的基因組序列，尋找其與Rhizobium bacterium中已知的GLS基因(Biochim.Biophys.Acta，1444(3)451-6，Mar.19，1999)同源的基因，該基因即為穀氨酸棒桿菌的GLS基因。根據穀氨酸棒桿菌的推定GLS基因序列，從黃色短桿菌中也分離到GLS基因，並且該基因與Rhizobium bacterium的GLS基因同源。gls基因可通過PCR方法獲得(見White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185，(1989))，以例如SEQ ID NOS5和6所示序列為引物，棒狀桿菌染色體DNA為模板。其他微生物中編碼GLS的基因可以用類似的方法獲得。按照這種方法獲得的黃色短桿菌ATCC14067的gls基因的核酸序列如SEQ ID NO1所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO2所示。
採用Saito和Miura的方法從作為DNA供體的細菌中製備染色體DNA(見H.Saito和K.Miura，Bioehem.Biophys.Acta，72，619(1963)，《生物工程實驗手冊》生物科學和生物工程協會主編，日本，97-98頁，Baifukan，1992)。
降低棒狀桿菌GLS活性的方法有紫外線照射或用誘變劑處理細菌，篩選突變菌株。能用於本發明的誘變劑有N-甲基-N′硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸。除了使用誘變劑，還可以用基因斷裂的方法獲得GLS活性降低的棒狀桿菌。即，用含有缺失了部分序列的gls基因的DNA轉化棒狀桿菌，該gls基因的部分序列被刪除了以致GLS的功能被破壞(缺失型gls基因)。隨後發生的的缺失型gls基因與染色體gls基因的重組斷裂了染色體gls基因。這種通過同源重組發生基因取代導致的基因斷裂是已知的，利用線性DNA和含溫度敏感複製起始點質粒來斷裂基因的方法也是已知的。
將表達調控序列例如gls基因啟動子替換為一個較弱的啟動子也能降低GLS的活性(日本專利特開NO.2000-818935)。可聯合使用誘變和斷裂基因的方法。
採用如下方法將宿主染色體gls基因替換為缺失型gls基因。通過插入溫度敏感複製起始點、缺失型gls基因和抗藥標記基因如抗氯黴素基因製備重組DNA，然後用該重組DNA轉化棒狀桿菌。在含藥物的培養基中培養轉化體，而此時溫度敏感複製起始點不起作用，結果獲得了染色體DNA整合了重組DNA的轉化體。
可採用任意一種已知的轉化方法將上述重組DNA導入棒狀桿菌中。例如用CaCL2處理受體細胞以增加細胞對DNA的通透性，這一方法已報導用於大腸桿菌K-12(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。用對數生長期細胞製備感受態細胞，將DNA導入其中，這一方法已報導用於枯草桿菌(Duncan，C.H.，Wilson，GA.和Young，F.E.，基因，1，153，(1977))。或者製備易於接受重組DNA的原生質體型DNA受體細胞，再將重組DNA轉化到該DNA受體細胞中。這種方法已應用於枯草桿菌，放線菌和酵母中(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，OA.，Nature，274，398，(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。還可採用電穿孔的方法製備棒狀桿菌轉化體(Sugimoto et al.，日本專利特開No.2-207791)。
棒狀桿菌的溫度敏感質粒包括但不限於p48K和pSFKT2(見日本專利特開No.2000-262288)，pHSC4(見法國專利
發明者中村純, 秋山嘉代, 代 申請人:味之素株式會社