基因表達的測定方法

2023-12-09 09:18:31 3

專利名稱：：基因表達的測定方法
技術領域：
：本發明涉及基因表達的測定方法，其中RNA向DNA的轉化並不是必需的。
背景技術：
：目前用以通過測量細胞群中的RNA產量評估基因表達的方法，例如通過利用晶片的微陣列表達譜(Schenaetal,1995，Science270:467-470;Cheeetal,1996,Science274:610-614)，或通過基因表達的系列分析(SAGE，Velculescuetal,1995，Science270:484-487)，或通過全基因表達分析(TOGA，Sutcliffeet42000,ProcNatlAcadSciUSA97:1976-1981)，或藉助隨機排列的可尋址高密度光學傳感器陣列(Michaeletal,1998,AnalChem70:1242-1248)，或藉助微珠陣列上的大規模平行指紋測序(MPSS，Brenneretal，2000，NatureBiotechnology18:630-634)，並不一定能夠提供基因表達的真實程度或數量的準確信息。所使用的許多方法都是間接法，因為這些方法首先需要反轉錄介導的由RNA到相應cDNA分子的轉化，然後對cDNA群進行擴增和標記。目前的這些方法最多僅提供了基因表達的指徵(indication)，但並未提供關於特定目標基因表達的準確測量值。困難之處非常明顯。例如，已經闡述了SAGE技術中的偏差(Stollbergetal,2000，GenomeResearch10:1241-1248)和晶片的偏差(Chudinetal，2001，GeneBiology3:0005.1-0005.10;Kothapallietal，2002,BMCBioinformatics3:1-10;Workmanetal,2002，GenomeBiology3:0048.1-0048.16)。已對當前方法中的問題進行了闡述(MartinandPardee,2000，ProcNatlAcadSciUSA97:3789-3791;Wangetal，2000,ProcNatlAcadSciUSA97:4162-4167)。由於此前的變性RNA分子自發快速形成穩定的二級結構，所以難以通過與適當的特異探針的直接雜交來測定RNA。本發明人現己開發出改良的測定方法，其能夠更準確地評估生物體中、細胞群中或組織樣品中的基因表達。
發明內容第一方面，本發明提供了基因表達的測定方法，其包括(a)用基本除去RNA二級結構的試劑處理RNA;禾卩(b)檢測經處理的RNA是否存在或其存在量，從而得到基因表達的指標。第二方面，本發明提供了基本除去RNA的二級結構並穩定RNA的試劑在評估或測量基因表達的測定方法中的應用。第三方面，本發明提供了具有所選化學組成的探針在通過檢測RNA來測定基因表達中的應用。優選地，所述探針主要由鹼基A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)和C(胞嘧啶)組成，並且不含顯著量的G(鳥嘌呤)。優選地，所述探針基本不含G(鳥嘌呤)。本發明還涉及寡核苷酸、PNA、LNA或INA探針在使用基本除去RNA二級結構的試劑的基因表達測定方法中的應用。第四方面，本發明提供了基因表達的測定方法，其包括:(a)用基本除去RNA二級結構的試劑處理RNA;和(b)利用能夠與RNA的互補序列結合的引物反轉錄並擴增所述RNA;禾口(c)檢測經處理和擴增的RNA是否存在或其存在量，從而得到基因表達的指標。在優選實施方式中，所述RNA來自真核生物或原核生物，包括微生物、一個或多個細胞或細胞群。在優選實施方式中，所述RNA為mRNA。在優選實施方式中，所述RNA來自微生物。可以通過任何適合用於從微生物、細胞或細胞群或其他組織或生物來源分離RNA的方法獲得所述RNA。此類方法在本領域中是熟知的，參見，例如Sambrooketal,"MolecularCloning,ALaboratoryManual"seconded.，CSHPress，ColdSpringHarbor,1989。實例包括但不限於寡聚-dT包被的磁珠或樹脂。RNA結合樹脂的具體實例包括以下RNeasyTM和Oligotex(Qiagen)、StrataPrepTMtotal(Stratagene)、NucleobondTM(Clontech),、RNAgentsTM和PolyATractsystems(Promega)等。還可以利用密度梯度離心技術分離RNA。RNA可以來自真核生物或原核生物(例如細菌和病毒)。所述測定方法可以用於監測藥物治療、病毒荷量，以及測定樣品中各種病毒的表達陣列(expressionarray)等。優選地，使用能夠修飾胞嘧啶鹼基的試劑處理RNA，從而通過消除胞嘧啶減少C:G鹼基對，由此減弱RNA互補區之間的結合強度。所產生的修飾消除了二級結構並基本穩定了以單鏈存在的RNA。優選地，所述試劑選自亞硫酸氫鹽、羥胺、乙酸鹽或檸檬酸鹽。所述試劑更優選為亞硫酸氫鹽或乙酸鹽試劑。所述試劑還優選為亞硫酸氫鈉，亞硫酸氫鈉試劑可以在水的存在下將胞嘧啶修飾成尿嘧啶。亞硫酸氫鈉(NaHS03)容易與胞嘧啶的5,6-雙鍵反應，從而形成反應中間產物磺化胞嘧啶，該中間產物易於脫氨基，並在水的存在下生成尿嘧啶亞硫酸鹽。如果需要，可以在溫和的鹼性條件下除去亞硫酸鹽基團，從而形成尿嘧啶。因此，幾乎所有的胞嘧啶都將被轉化為尿嘧啶。由於尿嘧啶鹼基與任何互補鹼基僅能形成兩個氫鍵，而不象胞嘧啶能形成三個氫鍵，因此RNA重新形成複雜的二級結構的趨勢大大減小。由此處理的修飾RNA可以順利無礙地與特定的互補探針進行相互作用。在本發明的某些實施方式中，不再需要像現有操作那樣，在測定樣品中目標序列的含量之前將RNA轉化為相應的互補DNA(cDNA)，這一點非常重要。由於不需要反轉錄酶和聚合酶鏈式反應(PCR)擴增步驟，本發明的方法更簡單、更直接，且因此而使由標準方法中涉及的酶的序列複製偏差引起錯誤的可能性減小。可以通過任何合適的方法對目標(經修飾)RNA的存在量進行測量。例如，靶向目標RNA的特異探針可以來源於相應目標轉錄單元的全部或一部分。或者，所述探針可以來源於任何其他具有鹼基-序列特異性的物質，例如適當的抗體或抗體片段或單域抗體，適當序列的寡核苷酸或肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)或插入核酸(Intercalatingnucleicacid，INA)探針。可以將本發明的探針設計成與待測RNA"基本"互補。當所述探針本質上是PNA、LNA、寡核苷酸或INA時，它們可以僅包含A(腺嘌呤)、T(胸腺嘌呤)或C(胞嘧啶)鹼基，這是因為所述經修飾的RNA基本不包含未經修飾的C殘基。所述探針可以為任何適合的配體，例如寡核苷酸探針或PNA、LNA或INA探針。例如，可以使用聚合-TDNA或聚合-TPNA或LNA探針或聚合-TINA探針，它們將與來自細胞且均具有聚合-A"尾巴"的經處理全RNA結合，並允許測量細胞、細胞群或組織中的全基因表達。或者，耙向目標RNA的特異探針可以用於測量給定細胞或組織中的特異基因表達。為破壞RNA中隨機形成的二級結構的穩定性而將胞嘧啶替換成尿嘧啶或其亞硫酸氫鹽加合物將顯著降低特異寡聚探針、PNA探針、LNA探針或INA探針與所述經修飾RNA的結合強度。經適當設計將插入基團限制到其末端位置的INA分子與互補序列結構的RNA的結合特性增強。為了進一步對此進行補償，優選使用2,6-二氨基嘌呤(AP)取代探針中的腺嘌呤鹼基，2,6-二氨基嘌呤可以與任何互補RNA鏈中的胸腺嘧啶形成三個氫鍵(而腺嘌呤可以形成兩個氫鍵)，並由此增強探針和RNA間的結合。通過在"正常"或"經修飾、"核苷酸序列的各種位置連接能夠插入到鹼基序列具有互補性的DNA或RNA的相鄰鹼基之間的插入分子來構建INA探針。利用這種DNA分子，無論插入基團連接到INA探針內的哪個位置，這些插入部分的存在都在很大程度上穩定了探針和目標核酸間的相互作用。以下對INA的顯著特性進行闡述。當INA探針被設計用於結合RNA分子時，所述插入基團優選設置於INA的末端或接近末端以增強結合。出人意料的是，將插入基團設置於內部可能對RNA與互補DNA的雜交產生不利的影響，並會破壞雜交結構的穩定，而不是穩定雜交結構。以下對INA探針的構建方法進行闡述。本發明的重點涉及特別構建的INA探針高度特異地且非常牢固地與經處理使所有胞嘧啶殘基轉化成尿嘧啶殘基的目標RNA分子相結合的驚人能力。因此，本發明涉及能夠避免目前使用的多個方法的間接過程引入的錯誤或偏差的方法。如上所示，雖然可以在該測定方法中使用多種其他特異探針，但優選使用INA探針，其原因體1L於有關其應用的詳細闡述中。'優選使用能夠與RNA的互補序列結合的INA引物進行所述RNA的擴增。通常使用基於反轉錄酶的PCR方法進行所述擴增。對於能夠在高嚴謹條件下與本發明使用的核酸分子雜交或者與本發明使用的核酸分子具有高度序列相似性的等效序列，"在高嚴謹條件下……雜交"可以與"嚴謹雜交條件"同義，是本領域熟知的術語，參見，例如Sambrook,"MolecularCloning,ALaboratoryManual"seconded.,CSHPress,ColdSpringHarbor,1989;"NucleicAcidHybridisation,APracticalApproach",HamesandHigginseds.，IRLPress,Oxford,1985。本發明的優點是能夠實現RNA的直接測定而無需將RNA轉化為cDNA。所述測定方法可以真實測定細胞群中的基因活性，而沒有通過需要將RNA轉化或擴增為cDNA的現有方法所引入的潛在錯誤。可以利用本
技術領域：
己知的任何合適的方法製備PNA或寡核苷酸探針。可以通過本
技術領域：
己知的任何合適的方法製備INA探針。也可以在利用合適的探針進行雜交試驗前，利用INA引物對少量經處理RNA進行擴增。本發明適合用於目前的陣列技術中，例如晶片或隨機尋址的高密度光學陣列，從而可以快速測定大量基因。在這種實施方式中，可以在一次實驗中測定數以萬計的基因的活性。本發明還適合於，例如利用珠技術對少量基因進行測定的方法。經修飾的RNA分子可以以陣列的形式點在或塗覆到合適的基板上，且可以由多種探針測定所述陣列。在一個優選的實施方式中，本發明特別利用了PNA分子沒有淨電荷而RNA分子由於其磷酸酯骨架而帶有大量負電荷這一事實。可以利用如帶正電荷的螢光染料的簡單分子檢測所結合的PNA探針，將與核酸長度成比例的多個所述分子與核酸特異結合併能夠被直接檢測。已知有多種此類合適的螢光染料。所述檢測系統還可以是具有帶正電荷部分的酶，其將選擇性地結合核酸分子並可以利用酶促實驗進行檢測，或者可以是帶正電荷的放射性分子，其選擇性地結合所捕獲的核酸。可以理解，也可以使用納米晶體。另一個合適的檢測系統是使用量子點生物結合物(quantumdotbioconjugates)(ChanandNie1998Science282:2016-2018)。或者，也可以使用結合有序列特異性探針和多個螢光染料分子的微球。所述微球可以直接與耙向特定RNA分子的探針結合，或者通過RNA的二級非特異組成部分(例如聚腺嘌呤尾)與靶向特定RNA分子的探針結合。在後一種情況中，可以通過聚胸腺嘧啶序列(例如INA、PNA、LNA或寡核苷酸部分)結合微球信號檢測系統。由於攜帶螢光染料標記的微球可產生多種顏色或光譜，可在單個試驗中測定存在於單個細胞樣品的多個不同RNA分子中的每一種的量。另外，由於經過如此標記的單個微球易於觀察和計數，因此可以相當準確地測定不同RNA分子間的微小表達差異。檢測與經修飾的目標RNA結合的配體的其他方法，例如用合適的放射性化合物或能夠與底物反應從而形成有色產物的酶進行標記，也可以用於直接與所捕獲的RNA或探針或底物結合的特定應用。與使用寡核苷酸探針相比，利用INA或PNA或其他寡核苷酸探針作為該過程中的配體之一具有非常明顯的優勢。INA或PNA的結合達到平衡較快，並具有較高的序列特異性。PNA分子不帶電荷，並且可以以高於常規寡核苷酸探針的結合常數與經修飾的目標RNA分子結合。特別地，INA探針增強了A-T和A-U鹼基間的結合。對於經處理而將其胞嘧啶鹼基轉化為尿嘧啶鹼基從而消除二級結構的RNA，這一點非常重要。作為RNA處理的結果，G-C鹼基相互作用減少，而A-T和A-U鹼基相互作用的數量則相應增加。由於本發明可以使用直接檢測法，所述測定方法可以真實而準確地測定樣品中目標RNA的量。該測定方法沒有受到依賴信號擴增過程(例如PCR，其中，常用於這種過程的酶可以通過對不同序列的擴增差異速率而引入系統偏差)的方法所固有的潛在偏差的不利影響。本發明尤其適合檢測疾病狀況、幹細胞和衍生細胞群的分化狀況，檢測或測量藥物治療對基因表達或細胞功能的影響，以及使用基因表達的準確指標的任何其他情況，例如，有助於為感染諸如C型肝炎病毒(HCV)和人免疫缺陷病毒(fflV)的患者確定正確的用藥方案的病毒荷量監測。在說明書全文中，除非文章內容另有需要，術語"包括"或"包含"、"含有"應理解為表示具有所述要素、整體或步驟，或要素、整體或步驟的組合，但不排除任何其他要素、整體或步驟，或要素、整體或步驟的組合。對於已經包含在本說明書中的文獻、操作、材料、裝置和文章等的任何討論僅用於為本發明提供背景。儘管其在本發明優先權日期之前在澳大利亞己經存在，但並不就此而承認任何或全部這些內容構成部分現有技術基礎或9者是本發明相關領域中的公知常識。為了可以更清楚的理解本發明，參考以下附圖和實施例對所述優選方式進行闡述。圖1A為基於微陣列的典型測定方法的示意圖，其中暗點表示在特定RNA群中被上調的基因，亮點表示在同一群中被下調的基因。暗箭頭和亮箭頭分別表示在經亞硫酸氫鹽處理的RNA中被測定為上調和下調的基因，而在傳統方法中，這些基因由於二級結構阻礙了傳統系統中的檢測分子與其靶標結合而不能被檢出。圖1B顯示了與圖1A類似的基於微陣列的測定方法，暗箭頭和亮箭頭分別表示在經亞硫酸氫鹽處理的RNA中被測定為上調和下調的基因，而在傳統方法中，這些基因由於表達分析前RNA酶處理過程中產生的偏差而導致RNA表達水平的測定不正確。酶處理可能引起令人誤解的結果，並且在某些基因顯示被上調或下調時，它們實際上並沒有受到這樣的調控。圖1C顯示了與圖1A類似的基於微陣列的測定方法，暗箭頭和亮箭頭分別表示由於檢測分子的特異性提高而在經亞硫酸氫鹽處理的RNA中被測定為上調和下調的基因，而在傳統方法中則不能被檢出。提高檢測分子的特異結合強度可以檢測到由於缺乏特異性而不能利用傳統方法檢測的RNA分子。圖2顯示了對經亞硫酸氫鹽處理的RNA進行PCR擴增後的凝膠分離結果。分離孔M:100-1000bp標準物；第5道野生型肌動蛋白引物外顯子3a-3b;第6道野生型肌動蛋白引物外顯子3a-4;第7道經亞硫酸氫鹽轉化的肌動蛋白引物外顯子3a-3b;第8道野生型肌動蛋白引物外顯子3a-4。圖3表示肌動蛋白RNA的序列分析。A.經亞硫酸氫k處理轉化的肌動蛋白RNA(SEQIDNO.l)和B.野生型肌動蛋白RNA(SEQIDNO.2)。圖4顯示了基於線性檢測凝膠色譜(linearityperformancegel)得到的C型肝炎病毒(HCV)的結果。圖5顯示了C型肝炎病毒(HCV)RNA線性檢測(linearitypanel)的實時PCR定量結果。圖6顯示了C型肝炎病毒(HCV)動態範圍(dynamicrange)的實時PCR定量結果。具體實施例方式定義核酸術語"核酸"包括天然存在的核酸、DNA和RNA。術語"核酸類似物"包括天然存在的核酸、DNA和RNA的衍生物，以及天然存在的核酸的合成類似物。合成類似物包括一種或多種核苷酸類似物。術語核苷酸類似物包括所有本質上與天然存在的核苷酸類似、能夠引入到核酸骨架中並能夠進行特異性鹼基配對(參見下文)的核苷酸類似物，。因此，術語"核酸"或"核酸類似物"指實質上由多個核苷酸和/或核苷酸類似物和/或插入假核苷酸(intercalatorpseudonucleotide)構成的任何分子。用於本發明的核酸或核酸類似物可以包含具有不同骨架單體單元的多個不同核苷酸。優選地，單鏈核酸或核酸類似物能夠與基本互補的單鏈核酸和/或核酸類似物雜交，形成雙鏈核酸或核酸類似物。更優選地，此類雙鏈類似物能夠形成雙螺旋。優選地，所述雙螺旋由氫鍵形成，更優選地，所述雙螺旋是選自由A型雙螺旋、B型雙螺旋、Z型雙螺旋和其中間體構成的組的雙螺旋。因此，用於本發明的核酸或核酸類似物包括但不限於DNA、RNA、LNA、PNA、MNA、ANA、HNA以及其混合物和其雜交物(hybrids)，以及其磷原子修飾物，包括但不限於硫代磷酸酯、磷酸甲酯、亞磷醯胺、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸三酯和硼代磷酸酯(phosphoboranoates)。另夕卜，也可以將不含磷的化合物用於與核苷酸連接，例如但不限於甲基亞氨基甲基、formacetate、thiofomiacetate和包含醯胺的連接基團.。特別地，核酸和核酸類似物可以包含一種或多種插入假核苷酸。在本文中，"混合物"意在包括含有不同種類的核苷酸或核苷酸類似物的核酸或核酸類似物。另外，在本文中，"雜交物"意在包括下述核酸或核酸類似物其所包含的一條鏈包含核苷酸或核苷酸類似物並具有一種或多種骨架，另一條鏈包含核苷酸或核苷酸類似物並具有不同種類的骨架。11HNA表示如VanAetschotetal.,1995闡述的核酸。MNA表示Hossainetal:1998闡述的核酸。ANA指Allertetal,1999闡述的核酸。LNA可以是如WO99/14226(Exiqon)中闡述的任何LNA分子，優選地，LNA選自WO99/14226摘要中描述的分子。更優選地，LNA為如Singhetal，1998，Koshkinetal，1998或Obikaetal.,1997闡述的核酸。PNA指如Nielsenetal,1991闡述的肽核酸。術語核苷酸指核酸或核酸類似物的構成組件(buildingblocks),術語核苷酸包括天然存在的核苷酸和其衍生物，以及能夠發揮與天然存在的核苷酸或其衍生物基本相同的功能的核苷酸。天然存在的核苷酸包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其中脫氧核糖核苷酸包含四種主要核酸鹼基腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)或胞嘧啶(C)之一，而核糖核苷酸包含四核酸鹼基腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、鳥嘌呤(G)或胞嘧啶(C)之一。核苷酸類似物可以是能夠併入到核酸骨架並能夠進行特異性鹼基配對的任何核苷酸樣分子。非天然存在的核苷酸包括，但不限於DNA、RNA、PNA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'陽NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、oc-L-木糖-LNA、(3-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環-DNA、6-氨基-雙環-DNA、5-表-雙環-DNA、a-雙環-DNA、三環-DNA、雙環[4.3.0]-DNA、雙環[3.2.1]-DNA、雙環[4.3.0]醯胺-DNA、卩-D-吡喃核糖基-NA、a-L-卩比喃來蘇糖基-NA、2，-R-RNA、a-L-RNA或a-D-RNA、卩-D-RNA中包含的核苷酸。核苷酸和核苷酸類似物的功能是能夠通過與互補核苷酸的核酸鹼基形成氫鍵而與互補核苷酸發生特異的相互作用，並能夠併入到核酸或核酸類似物中。天然存在的核苷酸以及一些核苷酸類似物能夠通過酶促作用(例如通過RNA或DNA聚合酶)併入核酸或核酸類似物中。然而，也可以通過化學作用將核苷酸或核苷酸類似物併入核酸或核酸類似物中。另外，可以通過使兩條較小的核酸或核酸類似物相互連接而製備核酸或核酸類似物，例如可以通過連接酶的酶促作用完成，或者通過化學作用完成。核苷酸或核苷酸類似物包含骨架單體單元和核酸鹼基。所述核酸鹼基可以是天然存在的核酸鹼基或其衍生物，或者其能夠發揮基本相同的功能的類似物。核酸鹼基的功能是能夠通過氫鍵與一種或多種其他核酸鹼基特異結合。因此，核酸鹼基的重要特性是其僅能夠與一種或少數其他核酸鹼基形成穩定的氫鍵，但其不能與通常包括該鹼基本身在內的多數其他核酸鹼基形成穩定的氫鍵。一種核酸鹼基與另一種核酸鹼基間的特異性相互作用通常被稱為"鹼基配對"。鹼基配對導致指定核苷酸和互補核苷酸間的特異性雜交。互補核苷酸是包含能夠進行鹼基配對的核酸鹼基的核苷酸。在天然存在的常見核酸鹼基中，腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配對；而鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C)配對。因此，包含A的核苷酸與包含T或U的核苷酸互補，而包含G的核苷酸與包含C的核苷酸互補。核苷酸可以經進一步衍生而包含附加的分子。可以在核酸鹼基或骨架單體單元上對核苷酸進行衍生。鹼基上的優選衍生位置包括腺嘌呤的8-位、尿嘧啶的5-位、胞嘧啶的5-位或6-位，以及鳥嘌呤的7-位。雜環修飾可以分成三個結構類型增強鹼基堆疊、附加氫鍵和這些類型的組合。通過擴大平面系統的兀-電子云而增強鹼基堆疊的修飾表示為嘧啶5-位和7-脫氮-嘌呤的共軛親脂修飾。嘌呤修飾物5-位上的取代包括丙炔、己炔、噻唑和簡單的甲基基團；7-脫氮嘌呤的7-位上的取代基包括碘代、丙炔基和氰基基團。也可能將胞嘧啶的5-位從丙炔修飾成5-元雜環和源自4-位和5-位(胞嘧啶夾(cytosineclamp))的三環稠合系統。第二類型的雜環修飾的代表為2-氨基-腺嘌呤，其中附加的氨基基團為A-T鹼基對提供另一個氫鍵，其類似於G-C鹼基對中的三個氫鍵。產生組合作用的雜環修飾的代表為2-氨基-7-脫氮-7修飾腺嘌呤和具有雜雙鏈的乙氧基氨基官能團的三環胞嘧啶類似物。另外，N2-修飾的2-氨基腺嘌呤修飾的寡核苷酸也屬於常規修飾。核糖或脫氧核糖部分上的優選衍生位置為非連接碳C-2'和C-4'位的修飾，連接碳C-l'、C-3'和C-5'的修飾，糖氧(0-4')的取代，脫水糖的修飾(構象限定)，環糖修飾(構象限定)，呋喃核糖基環大小的變化，連接位置——糖與糖，(C-3'與C-5'/C-2'與C-5')，雜原子環——修飾的糖，和以上修飾的組合。然而，其他位置也可以被衍生，只要不破壞核酸或核酸類似物的整體鹼基配對特異性。最後，當骨架單體單元包含磷酸酯基團時，一些骨架單體單元的磷酸酯基團也可以被衍生。本發明使用的寡核苷酸或寡核苷酸類似物為基本由核苷酸和/或核苷酸類似物和/或插入假核苷酸的序列組成的分子。優選地，寡核苷酸或寡核苷酸類似物包含5-100個單核苷酸。寡核苷酸或寡核苷酸類似物可以包括DNA、RNA、LNA、2'-0-甲基RNA、PNA、ANA、HNA和其混合物，以及任何其他核苷酸和/或核苷酸類似物和/或插入假核苷酸。RNA本發明所使用的RNA包括任何來源(如細胞)的信使RNA(mRNA)、未成熟RNA(miRNA)、轉移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)，來自病毒或其他微生物的基因組RNA，來自DNA的轉錄RNA，和相應DNA的RNA拷貝等。相應的核酸當核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠雜交時，認為它們是相應的。優選地，相應的核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠在低嚴謹條件下雜交，更優選地，相應的核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠在中嚴謹條件下雜交，更優選地，相應的核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸類似物能夠在高嚴謹條件下雜交。本發明使用的高嚴謹條件應表示通常在例如SouthernE.M.,1975,J.Mol.Biol.98:503-517闡述的Southern印跡和雜交中使用的嚴謹度。出於這種目的，常規操作中包括預雜交和雜交的步驟。如1989年Sambrooketal.在"MolecularCloning/ALaboratoryManual",ColdSpringHarbor中的闡述，此步驟通常利用包含6xSSPE、5%Denhardt's、0.5%SDS、50%甲醯胺、100嗎/ml變性的鮭魚睪丸DNA的溶液進行(在42。C溫育18hr)，然後用2xSSC和0.5%SDS洗滌(室溫和37°C)，並用O.lxSSC和0.5%SDS洗滌(在68。C溫育30分鐘)。本發明使用的中嚴謹條件應表示在包含1mMEDTA、10mMNa2HP(VH20、140mMNaCl、pH7.0的緩衝液中的雜交。優選地，提供約1.5)iM的各種核酸或核酸類似物的鏈。或者，中嚴謹條件也可表示在包含50mMKCl、lOmMTRIS-HCl(pH9.0)、0.1%TritonX-IOO、2mMMgCl2的緩衝液中的雜交。低嚴謹條件表示在由1MNaCl、10mMNa3PO4構成的pH7.0的緩衝液中的雜交。或者，相應的核酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸、核酸類似物、寡核苷酸或寡核苷酸在給定序列上彼此基本互補，例如大於70%的互補，例如大於75%的互補，例如大於80%的互補，例如大於85%的互補，例如大於90%的互補，例如大於92%的互補，例如大於94%的互補，例如大於95。/。的互補，例如大於96%的互補，例如大於97%的互補。優選地，所述給定序列的長度為至少10個核苷酸，例如至少15個核苷酸，例如至少20個核苷酸，例如至少25個核苷酸，例如至少30個核苷酸，例如10-500個核苷酸，例如10-100個核苷酸長度，例如10-50個核苷酸長度。更優選地，相應寡核苷酸或寡核苷酸類似物在其全長上基本互補。交叉雜交術語交叉雜交包括至少兩個核酸或核酸類似物間的非預期雜交。因此，術語交叉雜交可以用於描述，例如核酸探針或核酸類似物探針序列與除其預期靶標序列之外的其他核酸序列或核酸類似物序列的雜交。交叉雜交通常發生在探針和一個或多個相應非靶標序列之間，只是比所述探針和其相應靶標序列的互補程度低。這種不良作用可能是由於探針對耙標而言大大過量和/或快速退火動力學。極少核酸鹼基對(例如PCR反應中的引物)間的氫鍵也會發生交叉雜交，導致引物二聚體的形成和/或非特異PCR產物的形成。包含與同一類型的核苷酸類似物具有高親和力的一種或多種核苷酸類似物的核酸易於基於鹼基配對而形成二聚體或更高級的複合物。包含核酸類似物(例如但不限於LNA、2'-0-甲基RNA和PNA)的探針通常對與包含同一類型的骨架單體單元的其他寡核苷酸類似物的雜交具有高親和力。因此，即使探針分子個體僅具有低互補程度，其也易於雜交。自雜交術語自雜交包括以下過程核酸或核酸類似物分子通過向其本身摺疊而與其自身退火產生二級結構，例如髮夾結構。在多數應用中，避免自雜交是非常重要的。二級結構的產生可能抑制與預期核酸靶標序列的雜交。這在多數測定方法中都是不期望的，例如當核酸或核酸類似物用作PCR反應中的引物或者用作核酸外切酶試驗的螢光團/淬滅劑標記的探針的情況下。在兩種試驗中，自雜交都將抑制與靶標核酸的雜交，另外，外切酶試驗中螢光團的淬滅程度降低。包含與同一類型的核酸類似物具有高親和力的一種或多種核酸類似物的核酸易於發生自雜交。包含核苷酸類似物(例如但不限於LNA、2'-0-甲基RNA和PNA)的探針通常對自雜交具有高親和力。因此，即使探針分子個體僅具有低互補程度，其也易於自雜交。解鏈溫度核酸的解鏈(mdting)表示雙鏈核酸分子兩條鏈的分離。解鏈溫度(TJ表示出現50%的螺旋形式(雜交)與50%的盤繞形式(未雜交)時的攝氏溫度。高解鏈溫度表示複合物是穩定的，並由此表示單個鏈之間具有高親和力。類似地，低解鏈溫度表示單個鏈之間的親和力相對較低。因此，兩條鏈間的強氫鍵通常可以產生高解鏈溫度。另外，雙鏈核酸的核酸鹼基間插入的插入物也可以穩定雙鏈核酸，並由此產生較高的解鏈溫度。另外，解鏈溫度依賴於環境的物理/化學狀況。例如，解鏈溫度依賴於鹽濃度和pH。可以通過多個實驗進行測定解鏈溫度，例如其可以利用UV光譜確定雜交的形成和降解(解鏈)從而進行測定。INA/IPN定義插入核酸(INA)為一類獨特的DNA結合分子。INA由核苷酸和/核苷酸類似物、和插入假核苷酸(IPN)單體構成。INA與互補DNA具有非常高的親和力，IPN位於內部時具有高達10級的穩定性，IPN位於末端位置時穩定性高達11級。如果設計得當，INA自身可以稱為與DNA的雜交性優於互補RNA的選擇性分子。已經證明，如果EPN被置於分子內部，則INA與RNA結合的效率比與寡核苷酸引物的結合效率小約25倍。然而，傳統的寡核苷酸、寡核苷酸類似物和PNA對RNA和DNA具有相等的親和力。因此，INA是首個真正的選擇性DNA結合劑。另夕卜，INA對互補DNA的特異性和親和力高16於其他天然DNA分子。另外，在富含AT的環境中IPN對DNA的穩定作用最佳，這使在表觀遺傳學研究領域中特別有用。IPN通常作為凸出物(bulge)或末端插入物而被置於INA分子中。IPN本質上是能夠與核酸雙鏈中的核酸鹼基共堆疊的平面的(雜)多環芳族化合物。還證明INA分子耐受核酸外切酶的攻擊。這使這些分子特別適合在利用諸如pM29的酶擴增中作為引物使用。PW29具有內在的核酸外切酶活性，用作擴增模板的引物必須在其3'末端進行特異修飾以防止酶降解。然而，可加入INA分子而無需進一步修飾。INA可以用在傳統的PCR擴增反應中，並作為傳統引物發揮作用。然而，INA對DNA或RNA模板具有較高特異性，從而使其對於模板有限且反應敏感性至關重要的情況下的應用特別理想。在富含AT的環境中INA對DNA的穩定作用最佳，這使其在對經亞硫酸氫鹽處理的DNA序列的擴增中特別有用。這是由於在亞硫酸氫鹽轉化後，所有胞嘧啶鹼基都被轉化為尿嘧啶，隨後在PCR或其他擴增後被轉化成胸腺嘧啶的事實。因此，經亞硫酸氫鹽處理的DNA富含大量T。提高INA分子中的IPN分子數量可以提高INA/DNA雙鏈的穩定性。INA中的IPN越多，INA/DAN雙鏈的解鏈溫度就越高。本申請人之前已經開發出一類插入假核苷酸，當其併入到寡核苷酸或寡核苷酸類似物中時，形成插入核酸(INA)(WO03/051901、WO03/052132、WO03/052133和WO03/052134),所述插入核酸具有作為寡核苷酸的補充或替代而具有新的有用特性。所述插入假核苷酸優選選自l-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-芘甲氧基-2-丙醇的亞磷醯胺。優選地，所述插入假核苷酸選自(S)-l-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-芘甲氧基-2-丙醇的亞磷醯胺或(R)-l-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)-3-芘甲氧-基2-丙醇的亞磷醯胺。寡核苷酸或寡核苷酸類似物可以選自DNA、RNA、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、MNA、阿卓糖醇核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、插入核酸(INA)、環己基核酸(CNA)及其混合物和其雜交物，以及其磷原子修飾物，例如但不限於硫代磷酸酯、磷酸甲酯、亞磷醯胺、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、磷酸三酯以及硼代磷酸酯。非天然存在的核苷酸包括，但不限於以下核苷酸，包括DNA、RNA、PNA、INA、麗A、畫A、ANA、LNA、CAN、CeNA、TNA、(2'-NH)-TNA、(3'-NH)-TNA、a-L-核糖-LNA、a-L-木糖-LNA、p-D-木糖-LNA、a-D-核糖-LNA、[3.2.1]-LNA、雙環-DNA、6-氨基-雙環-DNA、5-表-雙環-DNA、a-雙環-DNA、三環-DNA、雙環[4.3.0]-DNA、雙環[3.2.1]-DNA、雙環[4.3.0]醯胺-DNA、p-D-吡喃核糖基-NA、a-L-吡喃來蘇糖基-NA、2'-R-RNA、a-L-RNA或a-D-RNA、|3-D-RNA。另外，也可以將不含磷的化合物用於與核苷酸連接，例如但不限於甲基亞氨基甲基、formacetate、thioformacetate以及包含醯胺的連接基團。特別地，核酸和核酸類似物可以包含一種或多種插入假核苷酸。本發明人發現當將IPN置於INA分子中以用於特異地檢測甲基化位點時，避免將IPN置於潛在的CpG位點是有用的。這是由於當利用IPN割裂CpG位點時，所產生的INA的特異性降低這一事實。肽核酸(PNA)肽核酸是能夠與序列特異的核酸(DNA和RNA)雜交的非天然存在的聚醯胺。(參見美國專利第5,539,082號和Egholmetal.,Nature(1993)365,566-568)。因為具有多個合乎需要的性質，所以PNA是基於探針的雜交試驗中核酸探針的候選替代物/取代物。PNA是非手性聚合物，其與核酸雜交從而形成在熱力性學上比相應的核酸/核酸複合物更穩定的雜交物。由於是非天然存在的分子，所以其不是降解肽或核酸的已知酶的底物。因此，PNA在生物樣品中穩定，且具有長保存期。與非常依賴於離子強度的核酸雜交不同，PNA與核酸的雜交完全不依賴於離子強度，並且可受益於非常不利於核酸與核酸雜交的低離子強度條件。離子強度對PNA複合物的穩定性和構象的影響已經得到了廣泛的研究。與DNA對DNA的識別相比，PNA對DNA或RNA的序列識別更加有效。然而，與DNA探針相比，在雜交試驗中PNA探針的單個鹼基改變、插入或缺失(insertionordeletion,indel)或多態性區別的優點在某種程度上似乎依賴於序列。另一個優點是，PNA可在平行和反平行兩個方向上與核酸雜交，但優選反平行方向。通過對目前商業可得的標準肽合成過程進行適應性改造，以此來合成PNA。(關於PNA單體和寡聚體的製備，請參見綜述Dueholmetal.,NewJ.Chem.(1997),21,19-31orHyrupetal.,Bioorganic&Med.Chem.(1996)4，5-23)。可購買(參見PerSeptiveBiosystemsPromotionalLiterature:BioConcepts.PublicationNo.NL612，PracticalPNA,ReviewandPracticalPNA,Vol.1,Iss.2)或利用可商購的產品製備標記和未標記的PNA寡聚體。PNA探針和標準的核酸探針間確實存在許多差異。這些差異可以方便地分為生物差異、結構差異和物理化學差異。如上下文中的討論，當試圖在通常使用核酸的應用中使用PNA探針時，這些生物差異、結構差異和物理化學差異可能產生不可預測的結果。這種不同組成的非等價性通常可在化學領域中觀察到。關於生物差異，作為基因傳遞和表達的工具，核酸是在活生命體中起重要作用的生物物質。核酸的體內特性已經得到相當充分的了解。然而，PNA是最近開發出的一種完全人造的分子，由化學家構思並通過有機化學合成製備。它還沒有巳知的生物功能。PNA在結構上也與核酸顯著不同。雖然兩者都能使用常規的核酸鹼基(A、C、G、T和U)，但兩種分子的骨架在結構上有所不同。RNA和DNA的骨架由重複的核糖磷酸二酯和2-脫氧核糖單元組成。與之相比，PNA的骨架由N-(2-氨基乙基)甘氨酸單元構成。另外，在PNA中，核酸鹼基通過另外的亞甲基羰基單元與骨架相連。儘管具有如此命名，但PNA並不是酸，且不包含任何如DNA和RNA中存在的那些帶電酸性基團。由於缺少形式電荷，PNA通常比其等價的核酸分子更疏水。PNA的疏水特性可允許在核酸中不能觀察到的非特異性(疏水/疏水相互作用)相互作用的可能性。另外，PNA是非手性的，使其具有在RNA/DNA領域中並不存在的等同的結構構象。PNA和DNA或RNA間的物理/化學差異也是重要的。PNA與其互補核酸結合的速度比核酸探針與相同靶標序列結合的速度更快。人們認為這種特性至少部分是由於PNA骨架上缺乏電荷這一事實。另外，最近的出版物證明，向PNA中引入帶正電荷的基團將改進雜交的動力學。由於骨架上缺乏電荷，PNA/核酸複合物的穩定性高於類似的DNA/DNA或RNA/DNA複合物。在某些情況，PNA將形成高度穩定的三螺旋複合物，或者通過所謂的"鏈置換"過程形成小環。在DNA7RNA領域中，尚未發現類似的鏈置換過程或結構。總之，由於PNA與具有序列特異性的核酸雜交，PNA是用於開發基於探針的測定方法的有用候選者。重要的是，PNA探針不是核酸探針的等效物。然而，即使在最嚴謹的條件下，精確的靶標序列和密切相關序列(例如具有單點突變的非靶標序列(單個鹼基對錯配))間也經常存在可用標記的核酸或標記的PNA探針檢測到的相互作用。與密切相關的非靶標序列的任何雜交都將導致不良背景信號的產生。由於所述序列的相關度非常密切，所以點突變是在所有核酸修飾中最難於利用基於探針的測定實驗檢測到的一類。多種疾病(例如鐮狀細胞血症和囊性纖維化)有時是由基因組核酸的單點突變引起的。因此，可提高基於探針檢測的特異性、靈敏度和可信度的任何方法、試劑盒或組合物都可用於含DNA樣本的檢測、分析和定量。亞硫酸氫鈉利用亞硫酸氫鈉處理核酸的方法可見於多種參考文獻，包括Frommeretal1992，ProcNatlAcadSci89:1827-1831;GriggandClark1994BioAssays16:431-436;Shapiroetal1970,JAmerChemSoc92:422to423;WatayaandHayatsu1972，Biochemistry11:3583—3588。本發明人還開發出了提高或增強亞硫酸氫鹽處理核酸的成效的方法。以下列出了對核酸進行有效亞硫酸氫鹽處理的示例性方案。該方案可以保留幾乎所有處理的DNA。本文中該方法也被稱為人類遺傳印記(HumanGeneticSignatures,HGS)法。可以理解，可以改變樣品或試劑的體積或用量。優選的亞硫酸氫鹽處理方法可見於US10/428310或PCT/AU2004/000549。向2嗎DNA(如果需要可以用適當的限制性酶進行預消化)中加入2^1(1/10體積)的3MNaOH(6g/50ml水，新鮮製備)，終體積為20pl。因為亞硫酸氫鹽試劑優選與單鏈分子反應，該步驟將雙鏈DNA分子變性為單鏈形式。將混合物在37"C溫育15分鐘。可用高於室溫的溫度進行溫育，以提高變性效率。溫育後，接連加入208(il2M焦亞硫酸鈉(7.6g/20ml水和416ml的10NNaOH;BDHAnalaR存10356.4D;新鮮製備)以及12(J的10mM對苯二酚(0.055g/50ml水，BDHAnalR#103122E;新鮮製備)。對苯二酚是還原劑，並有助20於降低試劑的氧化作用。還可以使用其他還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙醇、醌(氫醌)或其他合適的還原劑。用200^1礦物油覆蓋樣品。礦物油覆蓋可以防止試劑的蒸發和氧化，但並非必不可少的。隨後將樣品在55X:溫育過夜。或者，也可以使該樣品在熱循環儀中進行如下循環如下^M育約4小時或溫育過夜第一步，在PCR儀中循環55'C/2小時；第二步，95。C/2分鐘。第一步可以在從約37。C至約90'C之間的任何溫度進行，時間長度可以從5分鐘至8小時之間變化。第二步可以在從約70。C至約99'C之間的任何溫度進行，時間長度可以從1秒至60分鐘或者更長之間變化。用焦亞硫酸鈉處理後，除去油，若DNA濃度低則加入tRNA(20mg/ml)或2pl糖原。這些添加劑是可選的，並且可以用來通過與靶標DNA共沉澱而提高所獲得的DNA產量，尤其是DNA以低濃度存在時。當核酸量<0.5)ig時，則通常需要使用作為載體的添加劑以更加有效地沉澱核酸。異丙醇提純處理如下進行將80(^1水加入樣品中，混勻，然後加入lml異丙醇。水或緩衝液將反應管中的亞硫酸氫鹽濃度降低到該鹽不隨目的靶標核酸一起沉澱的水平。稀釋度通常為約1/4至1/1000，只要將鹽濃度稀釋至低於如本文所公開的預期範圍即可。將樣品重新混勻，並於4"C至少靜置5分鐘。將樣品在微型離心機中離心10-15分鐘，並將沉澱用70%ETOH洗滌2次，每次均渦旋。該洗滌處理除去任何與核酸一起沉澱的殘餘鹽。將沉澱乾燥，然後重懸於pH7.0-12.5的適當體積(例如50^l1)的！VE(IOmMTris/0.1mMEDTA)中。已經發現pH10.5的緩衝液特別有效。出於懸浮核酸的需要，將樣品在37。C至95。C溫育1分鐘至96小時。基本除去RNA二級結構的試劑適合用於本發明的試劑包括亞硫酸氫鹽、羥胺、乙酸鹽或檸檬酸鹽。優選亞硫酸氫鹽試劑，其包括亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉和亞硫酸氫胍，如WO2005054502中所述。在這方面，可以進行如下的RNA處理其中使用亞硫酸氫胍製備含胍離子和亞硫酸根離子的溶液並隨後處理RNA。細胞系表l.用於RNA分析的細胞系21tableseeoriginaldocumentpage22從細胞提取RNAI.除去培養液後向細胞(90%融合度)中直接加入lmlTrizol。II.充分混合樣品並室溫下靜置5分鐘以分解核蛋白複合物。III.向不含Rnase的1.5ml潔淨離心管中加入0.5ml上述混合樣品。IV.然後將樣品在4°C以12，000Xg離心10分鐘，以除去高分子量的DNA和其他汙染物。V.將上清移入到潔淨試管中，加入100^1100%氯仿並手動劇烈混合樣品15秒，然後在室溫溫育2-3分鐘。VI.然後在4"C以12,000Xg離心IO分鐘，以分離各個相。VII.將上部的水相移入到潔淨試管中，並保證移液管頭不與界面接觸，然後加入lpl20mg/ml糖原，並對樣品進行渦旋。VIII.向渦旋的試管中加入等體積100。/。異丙醇(0.25ml)，然後在室溫下靜置10分鐘。IX.然後在4°C以12,000Xg離心樣品10分鐘，以沉澱RNA。X.除去上清，並用0.75ml80Q/。的乙醇洗滌沉澱以除去cDNA合成反應的抑制劑，短暫渦旋，隨後在4"C以7，500Xg離心樣品5分鐘，以沉澱RNA。XI.再次重複步驟X。XII.然後在微量離心機中旋轉10秒，除去殘留的乙醇並立即將沉澱重懸在25^不含Rnase的水中。注意如果沉澱過幹，將難以重懸RNA且260/280比例將小於1.6。XIII.然後記錄OD26。/28。腦值，並將RNA貯存在-70。C直至使用。RNA的製備從所需細胞或組織中提取RNA後，將RNA樣品重懸在20pl不含核酶的水中。將樣品在6CTC-10(TC加熱2-3分鐘，以分解二級結構並立即用於亞硫酸氫鹽反應中。亞硫酸氫鹽的處理以下闡述的示例方法用於證明本發明用亞硫酸氫鹽處理RNA的有效性。該方案可以成功地保留幾乎所有處理的RNA。本發明的這個方法也被稱為人類遺傳印記(HumanGeneticSignatures,HGS)法。可以理解，可以改變樣品或試劑的體積或用量。將2)igRNA重懸在總計20pl的不含Rnase的水中。然後將樣本在65°C溫育2分鐘，以除去二級結構。溫育後，接連加入pH為5.0的208pl2M的焦亞硫酸鈉(7.6g/20ml水或10mMTris/1mMEDTA與416ml10NNaOH;BDHAnalaR弁10356.4D;新鮮製備)。此時也可以根據生產商的說明加入Rnase抑制劑，例如RNaseOUT(Invitrogencat#10777-019)。用200iil礦物油覆蓋所述樣品。礦物油覆蓋可以防止試劑的蒸發和氧化，但並非必不可少的。隨後將樣品在55。C溫育過夜。這種溫育可以在從約37'C至約9CTC的任何溫度下進行，時間長度可以在從5分鐘至16小時之間變化。用焦亞硫酸鈉處理後，除去油，若DNA濃度低則專門加入1)!l糖原(20mg/ml)。這些添加劑是可選的，並且可以用來通過與耙標DNA特異共沉澱而提高所獲得的RNA產量，尤其是RNA以低濃度存在時。當核酸量<0.5嗎時，則通常需要使用作為載體的添加劑以更有效地沉澱核酸。異丙醇清除處理可以如下進行將800^1不含RNase的水加入樣品中，混勻，然後加入lml異丙醇。水或緩衝液將反應管中的亞硫酸氫鹽濃度降低到該鹽不隨目的耙標核酸一起沉澱的水平。稀釋度通常為約1/4至1/1000，只要將鹽濃度稀釋至低於如本文所公開的預期範圍即可。將樣品重新混勻，並4"C靜置至少5分鐘，但可以達60分鐘。將樣品在微型離心機中離心10-15分鐘，並將沉澱用80。％ETOH洗滌2次。該洗滌處理除去任何與核酸一起沉澱的殘餘鹽。可以輕微千燥沉澱以除去殘留的乙醇，但要保證沉澱沒有完全乾燥，因為這樣會降低RNA的終產量，然後將沉澱重懸在合適體積(例如50pl)的pH說明書第21/29頁為7.0-12.5的T/E(10mMTris/0.1mMEDTA)中。已經發現pH10.5的緩衝液特別有效。出於懸浮核酸的需要，將樣品在37。C至95'C溫育1分鐘至96小時。cDNA的合成針對每個cDNA合成反應，在0.5ml不含Rnase的薄壁試管中製備以下試劑。RNA(1嗎)3,5jil隨機六聚體(10pM)去離子水2.5^1將上述內容物混合併在微量離心機中短暫離心。將樣品在7(TC溫育3分鐘從而使RNA變性。在RNA變性時製備以下通用混合物(MasterMix):Perrxn5x第一鏈緩衝液2^DTT(20mM)1pl50xdNTP混合物1ul總體積4pi將試管從PCR儀上取出，並在冰上冷卻2分鐘，然後短暫離心以收集內然後將樣品在42。C溫育2分鐘。向每個反應(1.75ilU)中加入0.5^Powerscript反轉錄酶，通過移液管吹打將通用混合物混合均勻。向各個樣品和對照試管中加入4.5^完全通用混合物，然後將樣品在42"溫育60分鐘，隨後將樣品轉移到冰上。向各個樣品中加入40plpH為7.6的10mMTris/1mMEDTA。將試管在72。C加熱7分鐘，然後在-70。C下保存直至使用。PCR擴增對1pl經亞硫酸氫鹽處理的RNA進行PCR擴增在含1pl經亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA的25^反應混合物中，使用PromegaPCR通用混合物和弓I物(每種引物6ng小l)進行PCR擴增。將lnl第一輪擴增產物轉移到第二輪擴增反應混合物中。將PCR產物的樣本在ThermoHybaidPX2熱循環儀中按Clarke"a/.闡述的條件進行擴增。表2.用於擴增肌動蛋白基因的引物tableseeoriginaldocumentpage25利用每50ml瓊脂糖含一滴溴化乙錠(CLP#5450)的1%TAE製備瓊脂糖凝膠(2%)。將5^1源自PCR的產物與l)Lil5X瓊脂糖上樣緩衝液混合，並利用潛入式水平電泳槽在X1TAE中以125mA進行電泳。標準物為100-lOOObp(低型，lowtype)。利用KodakUVIdocEDAS2卯系統在UV照射下目測觀察凝膠。利用珠子的檢測系統爐磁豫可以以多種方式修飾用於與磁珠結合的INA。在本實施例中，包含5'氨基或3'氨基基團的INA使用諸如EDC的雜-雙功能連接子使INA和珠子共價連接。然而，還可以用諸如生物素的5'基團對INA進行修飾，此後，所述生物素可以被動地與用親和素或鏈黴親和素(Streptavidin)基團修飾的磁珠結合。將10pi羧酸鹽修飾的MagnabindTM珠子(Pierce)或100piDynabeadsTM鏈黴親和素(Dynal)轉移到1.5ml的潔淨試管中，並加入90piPBS溶液。混合珠子，然後磁化並棄去上清。在PBS中洗滌珠子兩次(每次洗滌100Hl)，並最終重懸在90pipH為4.5的50mMMES中或者重懸在製造商說明書中確定的另一緩衝液中。向樣品中加入1^1250pMINA(其濃度依賴於通過寡聚雜交試驗測定的所選INA的特異活性)，然後渦旋試管並在室溫下靜置10-20分鐘。然後加入10jil新製備的10mg/mlEDC溶液(Pierce/Sigma)，渦旋樣品並在室溫或4°C的溫度下溫育達60分鐘。然後磁化樣品，棄去上清並可以通過加入100^0.25MNaOH或0.5MpH8.0的Tris來封閉珠子。然後用PBS溶液洗滌珠子2次，並最終重懸在100^PBS溶液中。浙雄鄉效將INA包被的10^1MagnabindTM珠子轉移到潔淨的試管中，然後加入40[il純的或用蒸餾水以l:l稀釋的ExpressHybTM緩衝液(Clontech)，或純的或用蒸餾水以1:1/1:2或1:4稀釋的UltrahybTM緩衝液(Ambion)，或者自配的雜交緩衝液。所述緩衝液還可以含有濃度已知的陽離子/陰離子或兩性洗滌劑(zwittergents)或其他諸如肝素和聚胺基酸的添加劑。然後向上述溶液中加入l-5plRNA樣品並渦旋試管，隨後在根據所選INA/RNA雜交物的解鏈溫度在55'C或其它溫度下溫育20-60分鐘。使樣品磁化並棄去上清，在上個步驟的雜交溫度下用0.1XSSC/0.1%SDS洗滌珠子2次，每次5分鐘，在兩次洗滌之間磁化樣品。及微記遊澄,遊縱可以用諸如氨基基團、巰基基團或生物素的分子，對INA或寡聚分子進行3'或5'標記。所述經過標記的分子還可以具有第二標記，例如引入到所述分子的第一標記的相反端的P"或I125。目前，可以利用雜-雙功能連接子(例如EDC)將該雙標記檢測分子共價連接到羧酸鹽或尺寸已知的經修飾乳膠珠上。然後可以通過洗滌除去未結合的分子，留下被大量特異檢測分子/信號放26大分子包被的珠子。然後，這些珠子可以與目標核酸樣品雜交，從而產生信號放大作用。微絲微,/鄉劍備可以用諸如氨基基團、巰基基團或生物素的分子，對INA或寡聚分子進行3'或5'標記。所述經標記的分子還可以具有引入到分子的第一標記的相反端的第二標記，例如Cy-3、Cy-5、FAM、HEX、TET、TAMRA或任何其他合適的螢光分子。目前，可以利用雜-雙功能連接子(例如EDC)將該雙標記檢測子分子共價連接到羧酸鹽或尺寸已知的經修飾乳膠珠子上。然後可以通過洗滌除去未結合的分子，留下被大量特異檢測分子/信號放大分子包被的珠子。然後，這些珠子可以與目標RNA樣品雜交，從而產生信號放大作用。條記縱鄉遊縱可以用諸如氨基基團或巰基基團的分子，對INA或寡聚分子進行3'或5'標記。所述經標記的分子還可以具有通過雜-雙功能連接子結合到分子第一標記的相反端的第二標記，例如生物素或其他分子(例如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶)。目前，可以利用雜-雙功能連接子(例如EDC)將該雙標記檢測子分子可以共價連接到羧酸鹽或尺寸已知的經修飾乳膠珠子上。然後可以通過洗滌除去未結合的分子，留下被大量特異檢測分子/信號放大分子包被的珠子。然後，這些珠子可以與目標核酸樣品雜交，從而產生信號放大作用。然後，可以通過與如鏈黴親和素的分子結合或通過涉及顯色底物的酶促反應獲得信號放大作用。細敘激遊齢27初始雜交優選涉及使用由與目標RNA互補的INA包被的磁珠。通過需要，第二雜交可以涉及上述任何檢測方法。可以利用與目標核酸互補的第二INA或者與目標RNA互補的寡聚體或經修飾寡聚體完成該雜交反應。樹狀物(dendrimer)和適體(aptamer)樹狀物是分枝的樹狀分子，其能夠以可控的方式化學合成從而可以產生用特異分子標記的多個層。它們可以從內向外逐步合成，反之亦然。控制樹狀物結構及其產生的最重要參數之一是各步驟產生的分枝數量，這決定構建預期分子所需要的重複步驟數。可以合成樹狀物，使其包含諸如I125或P32的放射性標記或諸如Cy-3、Cy-5、FAM、HEX、TET、TAMRA或其他任何合適螢光分子的螢光標記，以增強信號放大作用。或者，可以合成樹狀物，使其包含羧酸鹽基團(carboxylategroup)或可用於結合經修飾的INA或DNA分子的任何其他反應性基團。利用陣列的檢測系統經處理的RNA可以應用於任何合適的基板，從而形成陣列，例如可以篩選基因活性或目標表達單元的微陣列。本領域技術人員熟悉用於製備合適陣列的適當技術。實施例圖1A、圖1B和圖1C顯示了利用典型微陣列的基於實驗對本發明(經亞硫酸氫鹽處理的RNA)與現有技術的比較。圖1A為基於微陣列的典型測定方法的示意圖，其中暗點表示在特定RNA群中被上調的基因，亮點表示在同一群中被下調的基因。暗箭頭和亮箭頭分別表示在經亞硫酸氫鹽處理的RNA中被測定為上調和下調的基因，而在非傳統方法中，這些基因由於二級結構阻礙了傳統系統中的檢測分子與其靶標結合而不能被檢出。圖1B顯示了與圖1A類似的基於微陣列的測定方法，暗箭頭和亮箭頭分別表示在經亞硫酸氫鹽處理的RNA中被測定為上調和下調的基因，而在傳統方法中，這些基因由於表達分析前RNA酶處理過程中產生的偏差而導致RNA表達水平的測定不正確。酶處理可能引起令人誤解的結果，並且在某些基因顯示被上調或下調時，它們實際上並沒有受到這樣的調控。圖1C顯示了與圖1A類似的基於微陣列的測定方法，暗箭頭和亮箭頭分別表示由於檢測分子的特異性提高而在經亞硫酸氫鹽處理的RNA中被測定為上調和下調的基因，而在傳統方法中則不能被檢出。提高檢測分子的特異結合強度可以檢測到由於缺乏特異性而不能利用傳統方法檢測的RNA分子。肌動蛋白根據上述，提取RNA並純化，然後用亞硫酸氫鹽處理並擴增。在擴增後，根據生產商的說明利用MarligenPCR清理試劑盒對PCR產物進行純化，並重懸在20pl水中。向10plPCR產物中加入100ng反向引物，並將樣本送往Supermac(Camperdo糧，Sydney)進行DNA測序。圖2表示利用經亞硫酸氫鹽修飾的來自細胞系材料的總RNA的反轉錄PCR。從圖中可以看出，當使用靶向肌動蛋白基因的外顯子3a-4或外顯子3a-3b的野生型引物(未經亞硫酸氫鹽轉化)時，在兩種情況下都沒有得到擴增產物。這表明RNA的轉化非常有效，從而不能檢測到任何野生型序列。相反，如果在相同的樣品上使用經亞硫酸氫鹽轉化的靶向外顯子3a-4或外顯子3a-3b的引物，則產生獨特的PCR條帶，這表明可能從經亞硫酸氫鹽轉化的材料擴增特異的mRNA。圖3顯示對經亞硫酸氫鹽轉化的RNA產生的PCR產物的直接測序。從測序圖譜可以看出，由於產物的序列攜帶了外顯子3和4之間的剪切位點，所以PCR產物源自RNA，而非DNA汙染物。另外，從圖3可以看出，由於樣品中的所有起源C殘基都轉化成了T殘基，所以PCR產物已被完全轉化。C型肝炎病毒C型肝炎病毒(HCV)RNA樣品從Acrometrix(OptiQualHCV高陽性對照)或BBIdiagnostics(HCVRNA線性檢測樣品板(linearitypanel))獲得，並根據生產商的說明用UltrasensViral純化試劑盒進行純化。用亞硫酸氫鈉處理樣品，並按如下所述使用SuperscriptIII反轉錄酶(Invitrogen)反轉錄經轉化的HCVRNA樣品。llpl轉化的RNA模板1W隨機引物(300ng/pl)1pldNTPs(10mM)在65"加熱樣品5分鐘，然後立即置於冰上至少1分鐘，之後加入以下試劑4(il5x第一鏈緩衝液1piRNaseOUT(40U/|nl)1plDTT(100mM)1piSuperscriptIII(200U/pl)利用以下條件對樣品進行反轉錄25°C，12分鐘27°C，2分鐘29°C，2分鐘3TC，2分鐘33°C，2分鐘35°C，2分鐘37°C，30分鐘45°C，15分鐘50°C，5分鐘75°C，5分鐘然後，利用HCV5'NTR特異性引物和探針對2plcDNA進行PCR擴增。(正向引物-ttatgtagaaagtgtttagttatggtgt(SEQIDNO:9);反向弓I物-acccaaatytccaaayattaaacaaat(SEQIDNO:10);探針-tcCacAaaCcaCtaTaaCtcTcc(SEQIDNO:11)，(其中大寫字母表示存在LNA)在Corbett6000RotorGene中利用以下試劑盒和循環條件SigmaJ腿pstart2x通用混合物12.5pi30正向引物50ng反向引物50ng25mMMgCl23.5pi400nM探針(終濃度)x|il加水至23iilxpl95°C，10分鐘95°C，10秒(50x)53°C，90秒(50x)60°C，30秒結果示於圖4，其中從圖中可以看出所述測定方法的檢測極限約為2.5IU病毒。表3.圖4中所示結果的總結樣品號IU/PCR拷貝/PCR樣品#IU/PCR拷貝/PCR11.2xl053.2xl0573.81022xl045.3xl04812.731.2xl043.2xl0490.3142.5xl036.7xl0310001.4xl023.7xl021100611.831圖4的凝膠結果表明，亞硫酸氫鹽法可用於在寬靶標濃度範圍內(低至2.5IUHCV)監測HCV的表達水平。nc^陰性對照圖5顯示HCV線性檢測樣品板滴定的實時qPCR結果。該圖的標準曲線是線性的，R值為0.99947，R"直為0.9989。表4.圖5中分析的經處理HPV的樣品。31tableseeoriginaldocumentpage32圖6顯示在動態滴定範圍內，HCV定量報告的qPCR結果。該圖的標準曲線是線性的，R值為0.99856，112值為0.99713。表5.圖6中分析的經處理HCV的樣品tableseeoriginaldocumentpage32線性檢測樣品板和動態範圍內樣品的結果顯示出在實時PCR過程中產生的定量曲線。曲線的線與閾值相交的點被稱為Ct值，其用於對樣品進行定量。對每組樣品，將跨越3個數量級的一系列濃度已知的病毒純化、由亞硫酸氫鹽轉化和擴增，所產生的標準曲線顯示反應的效率是恆定的，並且在所檢測濃度範圍內都為線性，例如W值接近1。這些結果和圖4的結果證明利用端點PCR和利用病毒特異性探針的實時PCR對HCR病毒RNA(範圍為156250IU至1.5IU)的檢測都具有敏感性和特異性，說明所述測定方法可以在很寬的濃度範圍內檢測病毒基因的表達。本領域的技術人員可以理解，對如在具體實施方案中所示的本發明進行多種變化和/或更改並不脫離經廣義描述的本發明的精神或範圍。因此，應認為本實施方案在所有方面是說明性的而非限制性的。權利要求1.一種基因表達的測定方法，其包括用基本除去RNA二級結構的試劑處理所述RNA；和檢測經處理的RNA是否存在或其存在量，以獲得基因表達的指標。2.根據權利要求l所述的測定方法，其中利用寡核苷酸、PNA、LNA或INA探針檢測所述RNA。3.根據權利要求2所述的測定方法，其中所述探針主要包含鹼基腺嘌吟A、胸腺嘧啶T和胞嘧啶C。4.根據權利要求2或3所述的測定方法，其中所述探針為INA探針。5.根據權利要求1-4中任一項所述的測定方法，其中所述RNA為mRNAo6.根據權利要求1-4中任一項所述的測定方法，其中所述RNA來自動物、植物、微生物、一個或多個細胞、或細胞群。7.根據權利要求6所述的測定方法，其中所述微生物為病毒或細菌。8.根據權利要求1-7中任一項所述的測定方法，其中所述試劑選自亞硫酸氫鹽、羥胺、乙酸鹽或檸檬酸鹽。9.根據權利要求8所述的測定方法，其中所述試劑是亞硫酸氫鈉。10.—種基因表達的測定方法，其包括用基本除去RNA二級結構的試劑處理所述RNA;利用能夠與RNA的互補序列結合的引物反轉錄並擴增所述RNA;禾口檢測經處理和擴增的RNA是否存在或其存在量，以獲得基因表達的指標。11.根據權利要求IO所述的測定方法，其中所述RNA是mRNA。12.根據權利要求11所述的測定方法，其中所述RNA來自動物、植物、微生物、一個或多個細胞、或細胞群。13.根據權利要求12所述的測定方法，其中所述微生物為病毒或細菌。14.根據權利要求13所述的測定方法，其中所述試劑選自亞硫酸氫鹽、羥胺、乙酸鹽或檸檬酸鹽。15.根據權利要求14所述的測定方法，其中所述試劑是亞硫酸氫鈉。16.寡核苷酸、PNA、LNA或INA探針在基因表達的測定方法中的應用，其中所述測定方法使用基本除去RNA二級結構的試劑。17.根據權利要求16所述的應用，其中所述探針主要包含鹼基腺嘌呤A、胸腺嘧啶T和胞嘧啶C。18.根據權利要求16所述的應用，其中所述探針基本不含鳥嘌呤G。19.根據權利要求16-18中任一項所述的應用，其中所述試劑選自亞硫酸氫鹽、羥胺、乙酸鹽或檸檬酸鹽。20.根據權利要求18所述的應用，其中所述試劑是亞硫酸氫鈉。全文摘要本發明包括基因表達的測定方法，其包括利用能夠基本除去RNA二級結構的諸如亞硫酸氫鹽的試劑處理RNA，並測量經處理的RNA的存在或數量，從而得到基因表達的指標。本發明還包括寡核苷酸、PNA、LNA或INA探針在所述測定方法中的應用。文檔編號C12Q1/68GK101680033SQ200880015799公開日2010年3月24日申請日期2008年3月14日優先權日2007年3月16日發明者傑夫雷·W·格裡格,約翰·R·梅爾基,道格拉斯·斯潘塞·米勒申請人:人類遺傳標記控股有限公司