一種拮抗放線菌及其應用的製作方法

2024-03-27 21:31:05

本發明屬於微生物領域，具體涉及一種拮抗放線菌及其應用。

背景技術：

禾穀絲核菌，拉丁名rhizoctoniacerealis，屬無孢黴目真菌類。可引起小麥、大麥、玉米、水稻的紋枯病，是我國小麥種植區普遍發生、危害嚴重的一種土傳性真菌病害。

禾穀絲核菌侵染引起的小麥紋枯病是一種世界性病害。在我國近20個省（市）都有不同程度的發生和危害，以江蘇、浙江、安徽、山東、河南、陝西、貴州、湖北及四川等省麥區發生普遍，危害嚴重，輕者產量損失5%-10%，重者減產20%-40%。甚至造成枯孕（白）穗而顆粒無收。近年來，由於小麥品種、栽培措施和肥水條件的改變，紋枯病危害逐漸加重，己成為影響小麥穩產高產的重要障礙。目前對小麥紋枯病的防治是在農業防治的基礎上進行藥劑防治，藥劑防治主要用三唑類殺菌劑迸行「一噴一拌」。由於紋枯病發生在小麥莖基部，防治方法不當則效果不理想。而且長期連續地使用化學農藥，易導致一系列嚴重後果：使病菌產生抗藥性、農藥殘留造成環境汙染以及威脅人類的健康等。生物防治則是利用生物及其代謝產物防治植物病蟲害，可避免化學農藥使用帶來的一系列環境和能源方面的問題，促進農業的可持續發展。小麥紋枯病的生物防治研究目前還處於開始階段，篩選有效控制小麥紋枯病的生防菌、研究生防菌的控病機理將為小麥紋枯病的生物和生態防治提供一定的理論基礎，使其成為小麥紋枯病綜合治理中的重要環節。

平臍蠕孢菌（bipolarissorokiniana）和黃色鐮孢菌（fusariumculmorum）不僅可以引起小麥的根腐病，還可以侵染玉米、水稻、多種蔬菜甚至牧草，引起根腐病。近些年小麥根腐病發生嚴重，小麥種子的帶菌率比較高，一般病田發病率為1%~5%，較重病田發病率在10%左右。小麥根腐病對小麥產量的影響比較大，一般病田減產10%~30%，嚴重地塊會減產30%~70%（李可凡等，2003）。在我國，防治小麥根腐病比較常用的農藥有三唑酮、三唑醇、克菌丹、福美砷、退菌特、賽力散等，一般採用藥劑拌種的方法，採用藥劑拌種與田間藥劑噴施相結合的方法，能更有效的減輕小麥根腐病的為害程度。李可凡等（2003）小麥開花始期施用噴灑25%粉鏽寧可溼性粉劑或50%的福合劑，每公頃用商品藥量1500g，可控制葉部病害的發展，有較好的防病增產的效果。朱統泉等（2005）研究發現，使用立克秀、禾果利拌種對小麥紋枯病和根腐病的防治效果較好。化學農藥的使用會造成環境汙染、農藥殘留，同時化學農藥的長期並且超標使用，嚴重危害甚至破壞農業生態系統，同時殺死了環境中的有益微生物，提高了植物病原菌的抗藥性，最終致防治效果下降甚至防治失敗。發展生物防治是當前研究的一大趨勢。

技術實現要素：

為解決現有技術上的不足，本發明目的是提供一種拮抗放線菌，可用於禾穀絲核菌、平臍蠕孢菌和/或黃色鐮孢菌引起的多種農作物病害的生物防治。

本發明的技術方案如下：

一種拮抗放線菌，保藏編號為cgmccno.9793的海棠鏈黴菌(streptomycesspectabilis)fx-h-51。

優選的，所述放線菌培養溫度為28℃，搖床轉速為200r/min，培養時間為7d。

所述的放線菌在生物防治中的應用。

優選的，所述的放線菌在防治禾穀絲核菌、平臍蠕孢菌和/或黃色鐮孢菌引起的病害中的應用。

優選的，所述的放線菌在防治小麥紋枯病、小麥根腐病中的應用。

所述放線菌可以製備放線菌菌劑。

優選的，拮抗放線菌菌劑，其活性成分為如下(a)、(b)、(c)、（d）和（e）中的至少一種：

（a）權利要求1所述放線菌；

（b）權利要求1所述放線菌的發酵上清液；

（c）權利要求1所述放線菌的發酵培養物；

（d）權利要求1所述放線菌的發酵上清液的提取物；

（e）權利要求1所述放線菌的發酵培養物的提取物。

優選的，通過以下方法提取活性物質:溶媒萃取、旋轉蒸發、柱層析、薄層層析等技術對發酵液中的抑菌活性物質進行分離提純。

優選的，萃取劑為乙酸乙酯。

優選的，以氯仿︰甲醇=20︰1進行層析。

本發明的有益效果是：本發明是一種高效拮抗禾穀絲核菌、平臍蠕孢菌和/或黃色鐮孢菌等多種農作物病害的放線菌，放線菌及其發酵上清液、發酵培養物、相關提取物，在小麥、玉米、水稻等多種病害的生物防治上具有重要意義，本發明的應用可以減輕化學防治帶來的生態環境汙染、人畜危害等問題，降低農業生產投入，減輕環境壓力。

生物樣品保藏信息如下：

海棠鏈黴菌(streptomycesspectabilis)fx-h-51，於2014年10月17日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中科院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.9793。

附圖說明

圖1是土壤分離的部分放線菌。

圖2是拮抗放線菌fx-h-51菌株的菌絲、孢子形態；其中左圖是菌絲形態；右圖是菌絲與孢子形態。

圖3是拮抗放線菌fx-h-51菌株生理生化特性測定結果。其中a是明膠液化實驗結果;b是牛奶凝固與腖化實驗結果;c是澱粉水解實驗結果;d是纖維素水解實驗結果。

圖4是拮抗放線菌fx-h-51菌株16srdna擴增結果。

圖5是拮抗放線菌fx-h-51菌株與相關菌株的系統發育樹。

圖6是溫度對放線菌fx-h-51菌株發酵產物抑菌活性的影響結果。

圖7是初始ph對放線菌fx-h-51菌株發酵產物抑菌活性的影響結果。

圖8是搖床轉速對放線菌fx-h-51菌株發酵產物抑菌活性的影響結果。

圖9是發酵培養基裝液量對放線菌fx-h-51菌株發酵產物抑菌活性的影響結果。

圖10是不同發酵時間對放線菌fx-h-51菌株發酵產物抑菌活性的影響結果。

圖11是發酵培養條件趨勢圖。

圖12是放線菌對小麥紋枯病、根腐病的防治效果圖。其中1代表fx-h-71；2代表fx-h-51；3代表fx-s-178；4代表fx-s-114；5代表fx-h-51和fx-h-71混合；6代表fx-h-71和fx-s-178混合；7代表fx-h-51和fx-s-178混合；8代表fx-h-51、fx-h-71、fx-h-178混合；9代表空白對照。

圖13是放線菌防治禾穀絲核菌（wk-207）引起小麥紋枯病效果（左：對照右：fx-h-51處理）。

圖14是放線菌防治鐮孢菌（wf25）引起的小麥根腐病結果（左：對照右：fx-s-178處理）。

圖15是防治蠕孢菌引起的小麥根腐病結果（左：對照右：fx-h-51、fx-h-71、fx-s-178混合處理）。

圖16是發酵液熱穩定性試驗。

圖17是發酵液酸鹼穩定性試驗圖。

圖18是發酵液紫外線穩定性試驗圖。

圖19是溶媒萃取結果。

圖20是薄層層析結果。

圖21是薄層層析結果。

圖22是色譜條帶抑菌活性。

圖23是第二次矽膠層析的tlc結果圖。

圖24是樣品對禾穀絲核菌的拮抗作用。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述：

實施例1拮抗放線菌來源和篩選

1.樣本採集

2012～2013年，分別從陝西、山西、甘肅等地的蘋果園以及山東各地小麥田中採集土樣50多份，其中蘋果園中採集的為果樹根際重茬土，小麥田中採集的為根際土。共計分離得到217株放線菌，見圖1（僅為部分分離菌株）。

2.放線菌的分離純化

採用稀釋塗布法，選用高氏1號培養基進行分離，抑菌劑為重鉻酸鉀（80mg/l）。取10g土樣，加入到90ml滅菌水中，搖瓶30min，靜止20min，取上清液，用無菌水分別稀釋到10-2、10-3、10-4，用移液槍取0.1ml稀釋後的菌液到高氏1號培養基平板上，然後用無菌塗布器進行平板塗布，25℃倒置培養兩周。用接種環挑取形態各不相同的單菌落接種到不含重鉻酸鉀的高氏1號培養基平板上培養，再經過多次挑取單菌落到培養基平板上進行純化，將純化後的菌株進行試管斜面4℃編號保存。

3.拮抗放線菌的初步篩選

將純化後的放線菌進行拮抗活性測定，記錄具有較好抑制效果的菌株。採用平板對峙法（王蘭英等，2006）：將分離到的放線菌接種到高氏1號培養基上，供試靶標真菌接種到pda平板上，分別培養。7d後用直徑5mm的打孔器打取靶標菌菌餅，接種在pda平板中央，同樣方法取放線菌菌餅，等距離接種在靶標菌兩側，以不接放線菌，只接種靶標菌作為對照，25℃培養4～7d，每處理重複3次。觀察放線菌各菌株對靶標菌的抑菌效果，選取有明顯抑菌圈的菌株作為復篩菌株。

表1拮抗放線菌對禾穀絲核菌的抑制作用

表2拮抗放線菌對小麥根腐病菌的抑制作用

試驗結果表明，184株放線菌對峙小麥紋枯病致病菌禾穀絲核菌（wk-207，rhizoctoniacerealis），其中抑菌圈半徑超過5mm的放線菌48株，其中拮抗效果最明顯的放線菌為fx-h-51，抑菌半徑達16.75mm，見表1。選取對小麥紋枯病菌抑菌半徑達8mm以上的放線菌對小麥根腐病致病菌黃色鐮孢菌（wf25，fusariumculmorum）、平臍蠕孢菌（wb112，bipolarissorokiniana）進行拮抗試驗，抑菌圈半徑超過5mm的放線菌分別有5株、7株，見表2。

4.拮抗放線菌的復篩

利用灰色關聯度分析法對初步篩選得到的4株放線菌菌株的生防效果及其耐性進行綜合評判（徐文鳳等，2011；郭建博等，2007；徐文鳳等，2012）。生防效果測定以禾穀絲核菌（wk-207，rhizoctoniacerealis）屬agd融合群為靶標菌，進行平板對峙時,不同放線菌的抑菌效果作為判定依據。耐性試驗主要包括不同放線菌對溫度、酸鹼性、抗生素等耐受能力，其中放線菌的耐低溫性是以10℃條件下培養6d的菌落直徑表示，耐高溫性是以40℃條件下培養6d的菌落直徑表示；耐酸性以ph=3時，菌株在25℃條件下培養6d的菌落直徑表示；耐鹼性是以ph=11時，菌株在25℃條件下培養6d的菌落直徑表示；對鏈黴素的耐性測定是以菌株在含鏈黴素為1mg/l的高氏1號培養基上培養6d後的菌落直徑表示。

根據灰色系統理論，將所有供試菌株視為一灰色系統，每一菌株都是系統中的單一的灰因素，作為參考數列χ0的是「理想菌株」各項性狀性質指標構成的數列，作為比較數列χi（i=1、2、3…7）是供試菌株各項性狀性質指標構成的數列，將參考數列χ0與比較數列χi進行數據量化處理，求出各供試菌株與參考菌株的關聯度，並按關聯度大小排出關聯序。

綜合初篩結果選取4株放線菌菌株fx-h-51、fx-h-71、fx-s-114、fx-s-178，進行灰色關聯度分析，結果如表3所示：在對靶標菌的抑制作用、對鏈黴素的抗性上菌株fx-h-51的效果較好；在耐高溫性、耐酸鹼性上菌株fx-s-114的耐受性較好；在耐低溫性上菌株fx-s-178的耐受性較好。

表3四株放線菌的生防性狀測定結果

表4供試菌株的灰色關聯度及排序

根據灰色關聯分析，關聯度越大的菌株，其與參考菌株越接近，綜合性能越好。由表4中可以看出，菌株fx-h-51的灰色關聯度r0i=0.9025最大，表明菌株fx-h-51的綜合性狀與構建的理想菌株最接近，是比較理想的拮抗絲核菌的放線菌菌株。其次是菌株fx-s-114、fx-s-178，而菌株fx-h-71的灰色關聯度最小，表明其菌株的綜合性狀與構建的理想菌株相差最大。

實施例2拮抗放線菌fx-h-51的鑑定

參照《鏈黴菌鑑定手冊》（周德慶等，1986）和《微生物學實驗手冊》（中科院微生物研究所，1975）的相關內容進行形態學特徵、生理生化鑑定。培養特徵觀察培養基包括高氏1號培養基、伊莫松培養基、、察氏培養基、葡萄糖-天門冬素培養基、無機鹽澱粉培養基、馬鈴薯塊培養基。生理生化特徵試驗培養基包括明膠液化培養基、牛奶凝固腖化培養基、澱粉水解培養基、纖維素水解培養基、硝酸鹽還原培養基、格裡斯氏試劑a液、格裡斯氏試劑b液、硫化氫產生培養基。

1.形態特徵觀察

通過復篩，篩選出生防效果好、耐性較強的菌株fx-h-51。採用插片法、載片培養法觀察菌株fx-h-51形態。插片法：主要觀察菌株的氣生菌絲和基內菌絲的形態結構、生長狀況。將拮抗放線菌fx-h-51菌株在高氏1號培養基平板上劃線，然後將蓋玻片45°斜插在培養基上，使菌絲能夠沿著蓋玻片與培養基交界處生長並附著於蓋玻片上，25℃恆溫培養7d，置於光學顯微鏡下觀察並記錄菌落的形態結構、氣生菌絲和基內菌絲的結構、生長狀況以及有無可溶性色素及其顏色。載片培養法：用於觀察菌株的孢子和孢子絲形態。將高氏1號培養基滴在載玻片上，接種菌株，蓋上蓋玻片，25℃恆溫培養7d後，置於光學顯微鏡下觀察孢子絲和孢子的形態。

拮抗放線菌fx-h-51菌株在高氏1號培養基上25℃恆溫培養7d後觀察形態特徵，見圖2。試驗結果表明，該菌株菌落生長繁茂，邊緣不規則向四周擴散，菌落呈現橙紅色，表面絨狀隆起且乾燥不透明。氣絲直杆狀，淺粉色，基絲橙紅色，無橫隔，孢子橢圓形，表面光滑。

2.培養特徵觀察

將菌株fx-h-51分別接種在高氏1號、伊莫松、察氏、葡萄糖-天門冬素、無機鹽澱粉及馬鈴薯塊培養基上（劉姝等，2007），25℃恆溫培養，分別在7、14、28d觀察菌株的培養特徵和顏色變化。觀察並記錄氣生菌絲和基內菌絲的生長狀況及其顏色、有無可溶性色素等特徵。

表5拮抗放線菌fx-h-51菌株的培養特徵

25℃恆溫培養7d後觀察拮抗放線菌fx-h-51菌株的培養特徵。試驗結果表明，拮抗放線菌fx-h-51在伊莫松、葡萄糖-天門冬素、馬鈴薯塊培養基上生長狀態良好，在高氏1號、察氏、無機鹽澱粉培養基上生長狀況很好，菌落圓形、隆起、粉狀、在培養基上不產生可溶性色素。fx-h-51菌株在6種不同培養基上的培養特徵見表5。

3.生理生化特徵測定

（1）明膠液化

放線菌能夠分泌明膠酶，這種酶可以分解明膠，使其無法凝固從而呈現液體狀態。將菌株fx-h-51接種於裝有明膠的試管中，25℃恆溫培養，以未接種菌株的明膠培養基作為空白對照，分別在5、10、20d觀察液化程度。觀察前應冷卻30min後，查看明膠的液化程度，若試管中明膠出現液體，說明明膠已液化或部分液化，反之說明明膠未液化。

（2）牛奶凝固與腖化

將菌株fx-h-51接種於裝有牛奶的試管中，25℃恆溫培養，以未接種菌株為空白對照，分別在3、6、10、20、30d，觀察牛奶是否出現凝固、腖化。若牛奶呈現透明或半透明狀，為腖化現象(denisek.zinnieletal，2014)，測定的是菌株產生蛋白酶的能力。

（3）澱粉水解

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌塊，接種於澱粉水解培養基平板上，25℃恆溫培養7d，以未接種菌塊的培養基為空白對照。7d後，在菌落周圍滴加盧戈氏碘液，鋪滿平板，幾分鐘後將多餘的碘液倒出，若在菌塊周圍培養基出現透明圈，說明菌株fx-h-51產生澱粉酶；若菌塊周圍培養基沒有透明圈，說明菌株fx-h-51不產生澱粉酶。透明圈的大小表示該菌株產生澱粉酶能力的強弱或水解澱粉能力的強弱。

（4）纖維素水解

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌塊，接種於纖維素水解培養基上，25℃恆溫培養7d，以未接種該菌株的培養基作空白對照。7d後，在培養基上加入1mg/ml剛果紅溶液，10～15min後，倒去剛果紅溶液，再加入1mol/l的nacl溶液，15min後倒掉nacl溶液。若在菌塊周圍培養基出現透明圈，說明該菌株產生纖維素酶，透明圈的大小表示該菌株分解纖維素的能力的強弱。

（5）硝酸鹽還原反應

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌塊，接種於硝酸鹽還原培養基上，25℃恆溫培養7d，以未接菌種的硝酸鹽還原培養基為空白對照。檢測時，取1ml菌液加到試管中，格裡斯氏試劑a、b液各加2滴，若有亞硝酸鹽存在會使菌液呈現紅色、棕色或橙色等，為陽性反應。若無紅色出現，則再加2滴二苯胺試劑，若菌液呈藍色，表示無亞硝酸鹽存在，標定為陰性，不成藍色標定為陽性。

（6）硫化氫產生試驗

用5mm的打孔器取菌株fx-h-51的菌塊，接種於硫化氫產生培養基上，25℃恆溫培養7d，已未接菌種的培養基為空白對照，觀察菌落周圍培養基是否變黑。若菌落周圍變黑，說明該菌株能夠產生硫化氫；反之，則表示該菌株不能產生硫化氫。

生理生化測定結果表明，拮抗放線菌fx-h-51菌株能使明膠全部液化，牛奶凝固且腖化，能夠水解澱粉跟纖維素，但水解纖維素能力較弱，硝酸鹽不還原，不產生硫化氫。見表6及圖3。

表6拮抗放線菌fx-h-51菌株的生理生化特性測定結果

註：+代表發生；—代表不發生。

4.分子生物學鑑定

放線菌fx-h-51菌株總dna的提取方法參考徐平等人的方法（徐平等，2003；姜淑梅等，2007）但有所改進。提取步驟如下：

（1）將菌株fx-h-51接種到鋪有玻璃紙的高氏1號培養基平板上，在25℃恆溫培養5d左右，待菌落形成後，刮取菌落於離心管中。

（2）加入300μl～500μlte，振蕩懸起沉澱並充分混勻反應液。

（3）加入1/100體積濃度10mg/ml的溶菌酶，1/100體積濃度20mg/ml的蛋白酶k，倒管並充分混勻反應液，37℃反應30min。

（4）加入1/10體積的10%sds和0.5mol/ledta，倒管充分混勻，55℃反應1h。

（5）加入2/3體積7mol/l預冷乙酸銨溶液，倒管充分混勻，10000r/min，保留上清。

（6）加入2倍體積無水乙醇-20℃醇沉30min，12000r/min離心5min，棄上清。

（7）加入70%乙醇倒管洗沉澱2次，每次1ml，12000r/min離心5min，小心棄上清。

（8）真空抽乾沉澱並溶入50μlte，4℃保存備用。

取提取dna5μl上樣，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀測所提取dna的質量。

目的片段pcr擴增

根據16srdna的結構特點及其保守區使用特異引物，序列為：

正向引物27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′

反向引物its4：5′-tacggctaccttgttacgactt-3′

pcr擴增選用50μl反應體系，反應程序如下：

表7pcr反應程序

擴增反應條件：

用於pcr擴增的各種試劑（dntpmixture、l0×buffer、taqdna聚合酶）由北京全式金生物技術有限公司提供，擴增引物由上海生工生物技術有限公司。

擴增結果用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，1倍tbe為電泳緩衝液，上樣量5μl。通過凝膠成像系統觀察並拍照。

使用takaraminibestdnafragmentpurificationkitver.4.0試劑盒純化回收擴增片段。

1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩衝液為1倍tbe，加樣3μl進行回收產物檢測。

特異擴增片段的克隆

克隆載體採用peasy-t3載體，由北京全式金生物技術有限公司提供，克隆感受態細胞為大腸桿菌dh-5α。

（1）克隆反應體系的建立

在微型離心管中加入pcr回收產物3.7μl、peasy-t3載體0.3μl，輕輕混勻，室溫反應10min，冰浴5min。

（2）轉化

a、加連接產物於33μldh-5α感受態細胞中，混勻，冰浴反應25min。

b、42℃熱激90s，立即置於冰上5min。

c、加入800μllb液體培養基，200rpm，37℃孵育1h。

d、8000rpm離心2min，去除部分上清，保留100~150μl，輕彈懸浮菌體，取全部菌液均勻塗布含氨苄青黴素lb平板，培養過夜。

（3）單克隆檢測

挑取平板上長出的單克隆於lb/amp+液體培養基中，200rpm，37℃培養過夜。以培養的菌液為模板，進行pcr檢測。

（4）序列測定及分析

將含有目的片段的克隆委託鉑尚生物技術（上海）有限公司進行測序。用dnaclub軟體對每一序列的正向(5′-3′)和反向(3′-5′)進行核對，並生成5′-3′的完整序列。利用blast，從genbank、ncbi等公共資料庫中進行相似性查詢，選出同源性最高且有效發表的典型菌株序列，用clustalx進行序列比對，最後用mega4.0構建系統進化樹，來確定放線菌的親緣關係和分類地位。

拮抗放線菌fx-h-51菌株分子生物學鑑定如下：

通過pcr方法克隆拮抗放線菌fx-h-51菌株的16srdna，並進行基因測序，獲得16srdna序列，共1447bp,16srdnapcr擴增序列見seqidno:1。電泳結果見圖4。

在ncbi資料庫中查詢與菌株fx-h-51相近的16srdna序列，與其同源性較高的菌株均屬於鏈黴菌屬；最後利用mega4.1軟體構建系統發育樹，見圖5。通過blast相似性分析，放線菌fx-h-51菌株與海棠鏈黴菌（streptomycesspectabilis）的16srdna序列同源性最高，並且在系統發育樹中聚於同一分枝中。

實施例3菌株fx-h-51發酵條件優化

微生物的發酵除了受到培養基的氮、碳以及微量元素影響之外，還要受到培養時間、ph、搖床轉速、裝液量、溫度等因素的影響，是一個十分繁雜的過程（王永宏等，2006）。因此，需要把優化的各種因素充分組合在一起才能發揮菌種的生產潛力。

1實驗材料

（1）供試菌種

放線菌fx-h-51菌株，經過分離、篩選獲得

供試病原菌：絲核菌wk207由本實驗室提供

（2）培養基

活化培養基：高氏1號培養基

發酵培養基：麥芽糖50.3g、胰蛋白腖9.6g、nacl2.5g、caco32.0g、蒸餾水1000ml。

2單因素試驗初步優化放線菌fx-h-51菌株的發酵條件

（1）溫度對發酵濾液抑菌作用的影響

溫度對菌株的發酵有很大的影響，尤其是在改變發酵過程中酶的活性上，並且溫度還能夠改變氧的溶解度和傳遞速率（田黎等，2003）。

本實驗將ph為7的100ml發酵培養基裝入250ml三角瓶中，分別置於22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃，160r/min振蕩培養6d後，測定發酵液對小麥紋枯病菌的抑制效果，以測定菌株最佳的發酵溫度。

結果顯示（圖6），當發酵溫度在28℃時，對禾穀絲核菌的抑制作用相對最高，抑菌直徑達到34.67mm。當溫度為22℃、37℃時，對禾穀絲核菌的抑制作用相對較低，抑菌直徑分別為23.67mm、26.50mm。

（2）初始ph值對發酵濾液抑菌作用的影響

將100ml發酵培養基裝入250ml三角瓶中，ph值分別調成4、5、6、7、8、9、10、11，25℃、160r/min振蕩培養6d後，測定發酵液對小麥紋枯病菌的抑制效果，以測定菌株發酵的最佳初始ph。

結果表明（圖7），當ph為8時，對禾穀絲核菌的抑制作用最好，抑菌直徑達37.17mm，當ph為4時，抑菌作用最小，直徑為23.17mm。由此可見，該菌在初始ph為3時，產生抑菌活性物質的能力較弱。

（3）搖床轉速對發酵濾液抑菌作用的影響

將ph為7的100ml發酵培養基裝入250ml三角瓶中，搖床轉速分別設置為160r/min、180r/min、200r/min、220r/min、240r/min，25℃振蕩培養6d後，測定發酵液對小麥紋枯病菌的抑制效果，以測定菌株發酵的最佳搖床轉速。

結果表明（圖8），當轉速為200r/min時，對禾穀絲核菌的抑菌作用最大，抑菌直徑可達34.50mm；當轉速為240r/min時，抑菌作用較差，抑菌直徑為28.50mm。

（4）裝液量對發酵濾液抑菌作用的影響

將ph為7的發酵培養基裝入250ml三角瓶中，裝液量分別設置為50ml、75ml、100ml、125ml、150ml，25℃、160r/min振蕩培養6d後，測定發酵液對小麥紋枯病菌的抑制效果，以測定菌株發酵的最佳裝液量。

結果表明（圖9），當裝液量為100ml時，對禾穀絲核菌的抑菌作用最大，抑菌直徑可達33.67mm；當轉速為150ml時，抑菌作用較差，抑菌直徑為28.84mm。

（5）發酵時間對發酵濾液抑菌作用的影響

將ph為7的100ml發酵培養基裝入250ml三角瓶中，25℃、160r/min振蕩培養，發酵時間分別設置為3d、5d、7d、9d、11d，測定發酵液對小麥紋枯病菌的抑制效果，以測定菌株的最佳發酵時間。

結果表明（圖10），當發酵時間為7d時，對禾穀絲核菌的抑菌作用最大，抑菌直徑可達34.00mm；當發酵時間為3d時，抑菌作用較差，抑菌直徑為20.00mm。

3菌株fx-h-51發酵條件的正交試驗

通過對前面單因素的試驗，確定了三個單因素為主要影響條件：發酵溫度、搖床轉速和發酵時間，進行l9（34）正交試驗，各個因素水平如下表：

表8因素水平表

根據正交試驗，來確定最優發酵培養條件。見表9-11和圖11。

表9中的9個處理結果表明，第5個處理的抑菌直徑最大，為34.6mm，說明抑菌效果較好，相應的水平組合為a2b2c3，培養條件是28℃、7d、220r/min。從圖11的趨勢圖可以看出，最佳組合是a2b2c2，培養條件是28℃、7d、200r/min。這組試驗並沒有包括在正交試驗設計表中，為了檢驗一下真實結果是否與試驗推測的結果相吻合，所以又追加了a2b2c2試驗處理，追加的a2b2c2試驗處理的抑菌直徑為35.7mm，發酵菌液表現出較高的抑菌效果。

表9正交設計表l9（34）

表10正交試驗方差分析表

表11極差分析表

表10表明，培養溫度和培養轉速的水平間存在顯著差異，而培養時間三個水平間不存在顯著差異。從表11中還可以看出，溫度在各因素中影響最大，其次是轉速、時間。因此，通過正交設計試驗優化的最佳發酵培養條件是28℃、200r/min，7d。

實施例4拮抗放線菌防治小麥紋枯病、根腐病的溫室實驗

選取4株對小麥紋枯病菌（wk-207）、根腐病病原菌（wb112、wf25）有較好抑制效果的放線菌菌株fx-h-51、fx-h-71、fx-s-114、fx-s-178，對其各自及組合的菌液進行溫室盆栽試驗，測定不同放線菌菌株對小麥紋枯病、根腐病的生防效果。

具體方法：4株放線菌菌株劃線接種在高氏1號培養基上，25℃培養7d，然後打取菌塊接種於裝有100ml液體發酵培養基的250ml的錐形瓶中，200r/min振蕩培養7d，以小麥紋枯病致病菌禾穀絲核菌（wk-207，rhizoctoniacerealis）和小麥根腐病致病菌菌平臍蠕孢菌（wb112，bipolarissorokiniana）、黃色鐮孢菌（wf25，fusariumculmorum）作為靶標菌，取3種病原真菌分別接種在麥粒培養基中，25℃培養7d，進行擴大繁殖，作為病原菌接種體。將供試小麥種子播於裝有土壤的盆中，每盆10粒，小麥種子均勻分布於盆中，每粒小麥種子附近接入1粒接種體，然後用土壤覆蓋。取5ml放線菌菌液均勻灑入盆中。以不接放線菌菌液的為對照，每個處理3個重複，每隔3～4d定量澆水，30d後調查發病情況。

小麥紋枯病嚴重度分級標準（徐娜娜等，2014）：

0級：不發病

1級：小麥植株葉鞘外部發病，且病斑長度小於葉鞘1/2

3級：小麥植株葉鞘外部發病，且病斑長度大於葉鞘1/2

5級：小麥植株葉鞘外部發病，並侵入莖，且病斑長度環莖不足1/2

7級：小麥植株葉鞘外部發病，並侵入莖，且病斑長度環莖超過1/2

9級：植株枯死

小麥根腐病嚴重度分級標準（李鵬昌等，2014）：

0級：不發病

1級：小麥植株莖基部外部葉鞘變黑褐色，且病斑長度小於葉鞘的1/2

3級：小麥植株莖基部外部葉鞘變黑褐色，且病斑長度大於葉鞘的1/2

5級：小麥植株莖基部內部葉鞘變黑褐色，且病斑長度小於葉鞘的1/2

7級：小麥植株莖基部內部葉鞘變黑褐色，且病斑長度大於葉鞘的1/2

9級：根部腐爛，植株死亡

從圖12可以看出，每個處理對小麥紋枯病、根腐病都有一定的防治效果，在防治小麥紋枯病上處理2防治效果最好，達到81.20%，即菌株fx-h-51防治效果最好；在平臍蠕孢菌引起的小麥根腐病的防治上，處理8即fx-h-51、fx-h-71、fx-h-178組合防治效果最好達到75.10%；在黃色鐮孢菌引起的小麥根腐病防治上，處理3即fx-s-178的防治效果最好，達到76.53%。防治效果如圖13-15所示。

實施例5放線菌fx-h-51菌株發酵液穩定性實驗

農用抗生素不管是施用在作物表面，還是深入到土壤中，都要受到陽光、溫度以及土壤酸鹼度的影響，因此，農用抗生素在不同環境下的穩定性成為了評價其是否有開發利用價值的一個重要指標（朱昌雄等，2002）。另外，在活性物質的提取、精製以及加工過程中，也需要對其有效成分進行光、熱、ph條件下穩定性的測定（nobilimdcetal，2001）。

按照實施例3試驗優化後的發酵條件獲得放線菌fx-h-51的發酵液，再經過離心、過濾得到上清液，然後測定發酵液的穩定性。

1.發酵液對熱的穩定性測定

取5份發酵液，分別置於10℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃處理60min後，待自然冷卻到室溫（張玲玲等，2009）。以無菌水作為空白對照，絲核菌wk-207作為靶標菌，採用抑制菌絲生長速率法測定生物活性（慕立義等，1994），試驗重複3次，25℃培養箱中培養4d後，觀察並測量菌絲直徑，從而確定其熱穩定性。

試驗結果表明，溫度對發酵液的穩定性有較大的影響。低溫時發酵液的抑菌活性比較穩定，抑菌效果較好，抑菌直徑達到35.33mm；40℃以後，隨著溫度的升高，抑菌效果降低，但到100℃，抑菌效果仍未完全喪失。見圖16，因此，該發酵液的抑菌活性物質不耐熱，保存溫度不宜高於40℃。

2.發酵液對酸鹼的穩定性測定

取5份發酵液，分別用1mol/lhcl和1mol/lnaoh調ph至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0靜置2h後，再分別用1mol/lnaoh和1mol/lhcl調至中性，以無菌水為對照，重複3次，方法同上，確定其ph穩定性。

試驗結果表明，發酵液的抑菌活性在ph值為3～11的條件下抑菌效果變化不大，但在ph值為7時的抑菌效果最好，抑菌直徑達到31.50mm。因此，說明該發酵液的抑菌活性物質在酸鹼環境下有較高的耐受性。見圖17。

3.發酵液對紫外線的穩定性測定

取5份發酵液，在紫外線下分別處理0min、5min、15min、25min、35min、45min後，以無菌水為對照，重複3次，方法同上，確定其光穩定性。

試驗結果表明，發酵液在受到紫外線不同時間照射後，對禾穀絲核菌抑菌效果有影響，發酵液的抑菌活性隨紫外線照射時間的延長逐漸降低。發酵液經紫外線照射5min後，對禾穀絲核菌的抑菌直徑為39.67mm，照射45min後，對供試菌的抑菌直徑為35.83mm，與照射5min時的抑菌活性相比，有所下降。見圖18。

實施例6放線菌fx-h-51菌株發酵產物抑菌活性成分分離純化和抑菌實驗

一般情況下，發酵液中含有一些菌體代謝副產物，這些雜質的含量會遠遠高於活性物質千百倍，尤其是這些雜質的理化性質與活性物質極其相似（高群等，2007），因此，清除發酵液中的雜質是後續工作順利進行的前提。

1材料

（1）培養基

活化培養基：高氏1號；發酵培養基：優化後的發酵培養基；生物活性測定培養基：pda。

（2）主要試劑儀器

石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、甲醇、碘、柱層析矽膠、薄層層析板、梨形漏鬥、旋轉蒸發儀、離心機。

2．發酵液的製備

用實施例5的方法製備發酵上清液。

3．萃取劑的選擇

分別選用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇四種有機溶劑作為發酵液的萃取劑，將發酵上清液和不同的萃取溶劑置於分液漏鬥內，上下顛倒、使其充分接觸混合，萃取3次，分離有機相、水相。取各有機溶劑萃取劑，以絲核菌wk207作為靶標菌，採用抑制菌絲生長速率法進行生物活性測定，以未經溶劑萃取的發酵液和無菌水作為對照，25℃恆溫培養5d，試驗重複3次，觀察並記錄菌絲生長直徑，對結果進行差異顯著性和相關性分析，比較各萃取溶劑間的抑菌效果，選取最佳的溶媒萃取劑。

試驗結果表明，以乙酸乙酯為萃取劑的抑菌效果直徑最大，達32.50mm，這表明乙酸乙酯中活性物質含量最高，見圖19。同時說明拮抗放線菌fx-h-51菌株發酵代謝產生的抑菌活性物質極性較高。

4.粗提物的製備

用乙酸乙酯對發酵上清液按照少量多次的原則進行萃取，收集有機相，使用旋轉蒸發儀對有機相進行濃縮，將濃縮物蒸乾獲得膏狀物，即為抑菌組分粗提物。

5.抑菌活性物質粗提物的薄層層析檢測

(1)點樣

首先將膏狀粗提物溶入乙酸乙酯中，點樣與距底邊2cm處的直線上，點的擴散直徑不能超過3mm，如果在一個點上需要重複多次點樣，需等待上一次點樣的溶劑完全揮發後再進行。點樣完成後，室溫下將薄層板晾乾進行展層。

(2)展層系統的選擇

薄層層析檢測的關鍵在於展開劑的選擇，展開劑的選擇要從樣品的極性、揮發性、溶解度等方面綜合考慮。通常展開劑的展開能力與溶劑極性成正比，rf值在0.3～0.5之間比較合適（王豔紅等，2006）。本著展開劑極性大，加大極性低溶劑的比例或選用極性小的溶劑的原則試驗，反之亦然。

本試驗選用正丁醇︰甲醇︰水=4︰1︰2、石油醚︰環己烷=10︰1、氯仿︰甲醇=30︰1、氯仿︰甲醇=20︰1四種展開體系進行展開劑的選擇。

不同極性的溶劑系統展層後，碘燻蒸法顯色見圖20。試驗結果表明，一種溶劑比例的rf值過高，一種溶劑比例的rf值過低，其中以氯仿︰甲醇=20︰1層析效果較好，碘燻蒸後可以看到4個較為理想的斑點，rf值分別為0.49、0.39、0.23、0.09。

(3)展層

展層採用上行法，將點樣後的薄層層析板放入充滿飽和展開劑蒸氣的層析缸中，一段時間後，用鉛筆標記展開劑前沿位置，利於計算rf值。展開劑不要過多，應在點樣線以下，以免影響展開效果。展層結束後，將薄層層析板拿出，室溫自然風乾，進行下一步檢測。

(4)檢測

檢測方法常用螢光顯影和碘燻蒸顯色法，本試驗檢測使用碘燻蒸顯色法。將風乾的薄層層析板置於充滿飽和蒸氣的碘缸中，待顯色後，標記棕黃色斑點位置，測量並計算相對遷移率rf值。

6.抑菌活性物質粗提物的矽膠柱層析

(1)預處理

將濃縮後的粗提物與適量的200～300目的矽膠混合均勻，待有機溶劑揮發完全後，備用。

(2)上樣洗脫

稱取矽膠幹法裝柱，加入粗提物幹法拌樣。然後依次經石油醚、石油醚︰氯仿(1︰1)、氯仿、氯仿︰乙酸乙酯(1︰1)、乙酸乙酯、丙酮和甲醇梯度洗脫。用的離心管或試管收集洗脫液，一管約收集12ml，共收集70管。tlc檢測分析洗脫液，展開劑為氯仿︰甲醇（20︰1），從第一管開始檢測，每隔一管點樣。檢測完畢後，合併rf值相同或相近的組分，旋轉蒸發濃縮。使用抑制菌絲生長速率法，測定濃縮後不同組分的生物活性。

(3)色譜條帶的活性跟蹤

將具有高生物活性的組分在薄層層析板上點樣，以氯仿︰甲醇（20︰1）作為展開劑，碘燻蒸染色，將相應的條帶刮取下，用少量的乙酸乙酯溶解，檢測條帶的抑菌活性。

發酵粗提物經過一次矽膠柱層析、tlc檢測結果如圖21，共有4個較為明顯的條帶，rf值分別為rf1=0.53、rf2=0.45、rf3=0.19、rf4=0.08。

表12色譜條帶活性跟蹤結果

分別將rf1、rf2、rf3編號為樣品1、樣品2、樣品3，相應條帶刮下，以禾穀絲核菌為靶標菌，對其進行抑菌試驗，培養5天後，測定其抑菌效果，結果如圖22、表12所示，從表12可以看出，樣品2的抑菌作用相比其他樣品效果更好，抑菌直徑達到35.00mm，在5%的顯著水平上，樣品2與樣品1,3存在顯著差異。

(4)二次矽膠柱層析

以具有高生物活性的組分作為樣品，進行二次矽膠柱層析純化，方法同上，收集洗脫液。tlc檢測分析洗脫液，合併rf值相同或相近的組分，旋轉蒸發濃縮。

(5)抑菌活性物質的純度檢測

將分離純化得到的化合物單體，用tlc檢測，在碘缸中顯色進行觀察，檢測其純度，若為單一斑點則為純化合物。

(6)放線菌fx-h-51菌株發酵產物中活性化合物抑菌活性測定

使用抑制菌絲生長速率法，絲核菌wk-207為靶標菌，以加無菌水的培養基作為空白對照，25℃恆溫培養4d，觀察並測量菌絲直徑，進行抑菌活性檢測。

樣品2經過二次矽膠柱層析、薄層製備以及tlc檢測，獲得抑菌效果良好的活性物質a，經碘燻蒸法檢測，活性物質a純度較好。以禾穀絲核菌為靶標菌，對活性物質a進行抑菌試驗。結果見圖23和圖24，96h後純化產物的抑菌率達到76.47%。

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山東農業大學

一種拮抗放線菌及其應用

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海棠鏈黴菌（streptomycesspectabilis）的16srdna

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