檢測農藥的方法、生物微傳感器及降低電流噪聲的方法

2024-03-30 08:23:05

專利名稱:檢測農藥的方法、生物微傳感器及降低電流噪聲的方法
技術領域：
本發明涉及一種農藥檢測方法、生物微傳感器及降低電流噪聲的方法。
背景技術：
為了增加產量及保持農作物的美觀，通常施用大量的農藥，其中有機磷農藥(organophosphorous compounds；OPCs)由於具有低生物累積性及高生物可分解性的優點，目前已取代有機氯農藥成為最普遍使用的農藥種類。有機磷農藥雖具有上述優點，但在大量使用的情況下，可能導致在土壤、作物、表面水及工業廢水中殘留，對人體健康與自然環境造成相當大的威脅。世界各國已對有機磷農藥的管制詳加注意，針對飲用水、食品及工業廢水中頒布制定相當嚴格的管制標準。
一旦有機磷進入生物體內後，它會跟膽鹼酯酶(cholineesterase；ChE)的活性位置形成不可逆的結合，進而抑制該酶活性，延緩生物體內乙醯膽鹼(acetyl choline；ACh)的水解速率，幹擾神經傳輸。根據農藥本身的毒性、劑量與接觸時間的差異，所導致的症狀包括疲倦、噁心、嗜睡、視覺模糊，嚴重時甚至會死亡。
傳統上，農藥的分析主要採用化學方法(包括高效液相色譜法HPLC、氣相色譜法GC、氣相色譜-質譜法GC-Mass、電感耦合等離子體-質譜法ICP-Mass等)。傳統的實驗室化學儀器分析方法雖可對環境樣本提供精確的檢測，但前處理及分析步驟極為冗長，加以儀器本身價格昂貴、體積龐大，且需要經過專業訓練的人員才能操作，導致檢測成本過高，基本上並不符合汙染現地即時監測的要求。對即將上市的農產品而言，這些傳統的化學分析方法對於農藥的即時檢測與篩選並無法提供任何的幫助。
有鑑於此，開發一個能夠快速篩檢汙染物濃度，同時兼具可攜帶、操作簡便與廉價特性的微傳感器(Micro-sensor)，成為當前檢測監測技術的研發重點。
生物傳感器(biosensor)由於具有下列諸多的優點，可克服傳統分析方法的缺失，深具發展潛力(1)經由固定化技術的應用，生物元件可重複使用，降低成本；(2)生物辨認元件專一性高，可避免非目標物幹擾；(3)操作簡易；(4)靈敏度高，所需樣品量低；(5)應答快速，降低分析時間；(6)數位訊號輸出，達到微小化，易攜帶，可用於現場檢測。
由於信號傳輸元件本身傳輸能力的差異，各生物傳感器的可檢測範圍有所不同。傳統的電化學生物傳感器的檢測極限只能達到ppm級，是所有信號傳輸元件中最差的。然而電化學生物傳感器由於操作簡便、設備成本與檢測成本低廉，同時針對有顏色及高濁度的樣品仍可做準確的檢測，因此仍是發展最早且最完善的，無論國內外均有相當多的研究結果提出。目前電化學生物微傳感器之所以無法達到普遍使用的程度，主要的困難點包括(1)操作時氧化電位過高，易同時氧化環境中的幹擾物質，導致噪聲產生；(2)檢測時間相較其他形式的生物傳感器為長；(3)檢測極限太高，無法針對低濃度的汙染物做檢測，應用面過於狹窄。若能克服這些缺點，將可加速此類生物傳感器商業化的速度，同時擴大其在環境汙染檢測的應用面。

發明內容有鑑於此，本發明的目的在於提供一種檢測農藥的方法，包括提供一樣本；使該樣本與至少一電極接觸；以及檢測產生的電流信號，其中該電極表面有酶、金納米顆粒及無機催化劑固定其上。
本發明的檢測農藥的方法中，該酶為乙醯膽鹼酯酶或膽鹼氧化酶。
本發明的檢測農藥的方法中，該無機催化劑為普魯士藍。
本發明的檢測農藥的方法中，該電極表面是以電聚合方法固定。
本發明的檢測農藥的方法中，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，固定酶、金納米顆粒及無機催化劑於聚吡咯層上。
本發明的檢測農藥的方法中，該金納米顆粒的濃度為0.5-2.0ppm。
本發明的檢測農藥的方法中，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
本發明的檢測農藥的方法中，該電極為白金電極。
本發明的檢測農藥的方法中，其還包括使該樣品與一溫度感應器接觸，檢測該樣品溫度。
本發明的檢測農藥的方法中，該電流信號以樣品溫度進行溫度補償處理。
本發明的檢測農藥的方法中，該農藥為有機磷或氨基甲酸鹽。
本發明的檢測農藥的方法中，該電極與溫度感應器設置在一平板上。
本發明的另一目的在於提供一種生物微傳感器，包括至少一電極，用以檢測電流信號；一處理單元，用以接收處理該電流信號，且轉換該電流信號成為一濃度數據；以及一顯示單元，用以顯示該濃度數據；其中該電極表面以酶、金納米顆粒以及無機催化劑固定。
本發明的生物微傳感器中，該酶為乙醯膽鹼酯酶或膽鹼氧化酶。
本發明的生物微傳感器中，該無機催化劑為普魯士藍。
本發明的生物微傳感器中，該電極表面是以電聚合方法固定。
本發明的生物微傳感器中，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，固定酶、金納米顆粒及無機催化劑於聚吡咯層上。
本發明的生物微傳感器中，該金納米顆粒濃度為0.5-2.0ppm。
本發明的生物微傳感器中，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
本發明的生物微傳感器中，該電極為白金電極。
本發明的生物微傳感器，還包含一溫度感應器，用以檢測溫度並傳送至該處理單元。
本發明的生物微傳感器中，該電流信號以該檢測溫度進行溫度補償處理。
本發明的生物微傳感器用於檢測農藥。
本發明的生物微傳感器中，該農藥為有機磷或氨基甲酸鹽。
本發明的生物微傳感器中，該電極與溫度感應器同時在一平板上。
本發明的生物微傳感器，還可包括至少一電極，一溫度感應器，以及一數據處理顯示儀，其中該電極表面有酶、金納米顆粒及無機催化劑固定其上，用以檢測農藥。
本發明的另一目的進一步提供一種降低電流噪聲的方法，包括將金納米顆粒及無機催化劑固定在一酶固定的電極表面。
本發明的降低電流噪聲的方法中，該無機催化劑為普魯士藍。
本發明的降低電流噪聲的方法中，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
本發明的降低電流噪聲的方法中，該金納米顆粒濃度為0.5-2.0ppm。
本發明的降低電流噪聲的方法中，該電極表面是以電聚合方法固定金納米顆粒及無機催化劑。
本發明的降低電流噪聲的方法中，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，使金納米顆粒及無機催化劑固定於聚吡咯層上。
本發明的降低電流噪聲的方法中，該酶為乙醯膽鹼酯酶或膽鹼氧化酶。
本發明在生物微傳感器的開發上，除了需保有傳統生物傳感器的優點之外，還要能克服環境因子幹擾，保持生物辨認元件活性，縮短檢測時間，同時還要能降低檢測極限，才能擴大應用範圍。欲達到這些目標，整個微傳感器開發需建立包括電極製備、生物辨認元件固定、電流信號放大、噪聲消除與信號數位化、傳感器微小化等平臺技術。
在電極的製備方面，材質的選擇包括玻璃、金、白金、鈀、石墨及碳黑，電極結構無論是平板電極、針狀電極(實心或鏤空)均可使用。電極表面處理可以酸、鹼、物理研磨或超音波處理，得到乾淨的電極表面。在生物辨認元件固定方面，可使用物理包埋或化學共價鍵結達到固定的目的，但在固定的過程中，需考量生物辨認元件流失與失活的問題。
此外，要縮短檢測時間，同時改善檢測極限，需通過降低環境因子所產生的噪聲及放大輸出信號加以達成。除了電子媒介物的使用之外，在固定的過程中採用導電聚合物(例如聚吡咯及丙二胺)進行生物辨認元件固定亦可適當降低檢測時所需的氧化電位值，避免環境樣本中的雜質同時被氧化，減低環境因子的幹擾的程度。
另外，納米材料的研究成果顯示物質一旦進入納米規格，不論在強度、導電度與導熱能力等材料性質均會大幅提升。在生物辨認元件的固定過程中使用納米材料，將有助於傳感器輸出信號的放大，進而提升微傳感器的檢測速度、準確性與靈敏度。
欲使使用者便於上手，同時可用於現場監測，除了儀器本身需輕薄短小之外，檢測的結果最好能直接顯示在傳感器的面板上，此部分則有賴信號數位化與傳感器微小化來達成。
本發明嘗試將酶生物傳感器與納米科技的概念結合，開發一種生物微傳感器檢測水中的農藥，利用金納米粒子所具有的高比表面積與高導電度的特殊性質並組合無機催化劑，用以降低氧化電位電子轉移，同時達到放大電流的輸出信號與避免噪聲產生，提升本發明的生物微傳感器的S/N值。因此，本發明的生物微傳感器可降低生物傳感器的檢測極限與環境中自然物質的幹擾，同時縮短檢測時間，達到現地即時檢測的目的。
圖1為本發明的生物微傳感器的一具體實施形態。
圖2說明本發明的電極系統的背景電流(未添加H2O2)的變化。
圖3說明系統中批次添加2μM的H2O2溶液的電流信號輸出變化。
圖4說明H2O2添加前後輸出電流值變化與H2O2濃度的變化。
圖5A～圖5E說明直接添加酶(未固定酶)前，有機磷農藥對酶活性的抑制情形。圖5A為未固定酶以及無農藥添加的空白試驗；圖5B為未固定酶前，添加對氧磷濃度0.47ppm的電流變化；圖5C為未固定酶前，添加對氧磷濃度4.7ppm的電流變化；圖5D為未固定酶前，添加對氧磷濃度47ppm的電流變化；以及圖5E為未固定酶前，添加對氧磷濃度470ppm的電流變化。
圖6說明當乙醯膽鹼酯酶(AChE)、膽鹼酯酶(ChE)與膽鹼氧化酶(ChO)添加量(酶未固定)為1mM、0.004Unit(酶活力單位)及0.2Unit時，對於不同對氧磷濃度(47ppm、4.7ppm、0.47ppm)及作用時間靈敏度的變化。
圖7顯示在固定對氧磷濃度(4.7ppm)下，懸浮酶(未固定酶)在不同抑制時間與電流抑制率的關係。
圖8顯示以溶膠-凝膠(sol gel)法將酶固定於白金電極表面前後的電極靈敏度。欄(a)使用以溶膠-凝膠法固定酶的白金電極表面；欄(b)為使用酶未固定、懸浮於樣本中的標準白金電極；欄(c)為使用酶未固定、懸浮於樣本中的1公分白金電極；及欄(d)為使用以溶膠-凝膠包埋酶後，直接置於水中，不將其固定於電極表面的電極。
圖9顯示酶經電聚合固定前後的電流輸出信號的關係。欄(a)使用未固定酶的電極；欄(b)使用固定吡咯(pyrrole)單體/酶乙醯膽鹼酯酶(AChE)與過氧化酶(HRP)為20μl/1000U的電極；欄(c)使用固定吡咯單體/酶AChE與二茂鐵(ferrocene)為20μl/1000U的電極；欄(d)使用固定吡咯單體/酶AChE為0.013mg/1000U的電極；及欄(e)使用固定吡咯單體/酶AChE為20μl/1000U的電極。
圖10顯示在無機催化劑(普魯士藍Fe(CN)63-)有無存在下的氧化電位下降效應；實線表示無Fe(CN)63-；虛線表示Fe(CN)63-存在。
圖11顯示不同外加電壓下抗壞血酸的氧化電流值。
圖12為本發明使用的金納米顆粒的電子掃描顯微照片。
圖13A顯示固定或未固定酶與納米金顆粒的電極與電極靈敏度的關係；正方形標記代表使用未固定酶與納米金顆粒的電極；三角形標記代表使用固定酶與金納米顆粒的電極。圖13B顯示使用固定酶與納米金顆粒的電極時，納米金顆粒添加濃度與電極靈敏度的關係。
圖14顯示納米金顆粒的體積與電極敏感度的關係。
圖15說明本發明生物微傳感器使用的酶活性回復性。
圖16說明本發明生物微傳感器在不同檢測溫度下電極靈敏度的變化。
圖17顯示本發明生物微傳感器在不同pH值下檢測，電流輸出信號的變化情形。
圖18A顯示甲醇與本發明生物微傳感器的酶活性的關係；圖18B顯示乙醇與本發明生物微傳感器的酶活性的關係；圖18C顯示丙酮與本發明生物微傳感器的酶活性的關係。
圖19A顯示鎘離子與本發明生物微傳感器的酶活性的關係；圖19B顯示鐵離子與本發明生物微傳感器的酶活性的關係；圖19C顯示銅離子與本發明生物微傳感器的酶活性的關係；圖19D顯示鉛離子與本發明生物微傳感器的酶活性的關係。
圖20顯示硫酸根SO42-與本發明生物微傳感器的酶活性的關係。
圖21說明檢測時間10分鐘25℃下對氧磷濃度與本發明生物微傳感器的電流抑制率的關係。
圖22說明本發明的生物微傳感器電流抑制率與對氧磷的線性範圍。
圖23顯示本發明的生物微傳感器檢測番茄汁原液及添加對氧磷農藥的番茄汁的數據及比較。欄(a)使用番茄汁原液；欄(b)使用添加30ppb對氧磷農藥的番茄汁液；欄(c)使用稀釋10倍的番茄汁原液；及欄(d)使用稀釋10倍的添加30ppb對氧磷農藥的番茄汁原液。
具體實施方式為讓本發明的上述目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下生物微傳感器的構成如圖1所示，本發明的一具體實施形態包括三個電極101、103及105，分別為對電極、工作電極以及參考電極，各工作電極固定有酶、金納米顆粒以及普魯士藍(Fe(CN)63-)，用以測量樣本中產生的電流信號S1，將所檢測的電流信號輸出至一處理單元120。
如圖1所示，本發明的生物微傳感器還包括一溫度感應器110，用以檢測樣本溫度，並將檢測的溫度信號S2輸入一處理單元120。該處理單元120內依下列式(4)將檢測的電流信號經過下述的溫度補償處理後轉成為一濃度數值，並輸入一顯示單元122，在該顯示單元122上顯示樣本中所含的農藥濃度，即檢測出樣本中農藥含量。
電流輸出信號檢測機制本發明的生物微傳感器的整個電化學檢測機制可分為三個步驟，首先利用乙醯膽鹼酯酶(AChE)(1000Unit/mg固體；Sigma)對乙醯膽鹼(ACh)(99％，Sigma)行水解作用，所產生的膽鹼再通過膽鹼氧化酶(ChO)(100Unit/mg固體，Sigma)作用，產生過氧化氫，最後再以外加電壓對過氧化氫進行氧化作用，使反應放出電子，如此通過電位計可測量到酶反應過程電流輸出信號的變化。整個酶反應與電流信號檢測機制可以下列的方程式來加以表示
由於有機磷與氨基甲酸鹽農藥均會與乙醯膽鹼酯酶上的活性位置相結合，造成酶的活性抑制，進而降低上列式(1)、(2)及(3)的連續反應的反應速率，而使電流輸出信號變小。
將電流輸出信號與抑制劑(待測農藥)的濃度相對關係，定義如下式的電流抑制率(RI)，則可通過電流輸出信號，依式(4)確認分析水樣中有機磷的濃度。
RI(%)=dIt/dt-dI1/dtdI1/dt100%---(4)]]>其中dI1/dt為酶未受抑制前的輸出電流變化速率(或靈敏度)；dIt/dt為酶經過一定時間t抑制後的電流變化速率(或靈敏度)。
金納米顆粒的生產方法取247.5ml的去離子水煮沸後，加入1％的檸檬酸鈉溶液15ml，煮沸5分鐘，加入HAuCl4溶液2.5ml，溶液逐漸由淡黃色轉變為灰色、深褐色後，持續90℃加熱攪拌15分鐘，將溶液置於室溫中冷卻，溶液相會還原出暗紅色的金納米粒子，儲存於4℃冰箱。以檸檬酸鈉作為還原劑，其羧基(COO-)會將三價金離子還原至一價金離子，同時生成丙酮二羧酸(acetonedicarboxylate)，再由一價金離子還原成金原子。整個反應式如下所示
若欲製備不同粒徑大小的金納米粒子，可通過改變四氯金酸與檸檬酸鈉的比例來達成。調整檸檬酸鈉與四氯金酸的比例為7、1.75、3.75或14，分別製備出平均粒徑為25nm、36.3nm、16.5nm或19.4nm的金納米顆粒。
酶固定方法在酶固定之前，電極表面分別以超音波震蕩及濃硝酸清潔白金電極表面。以下分別以溶膠-凝膠固定方法(sol-gel)及電聚合方法將酶固定於白金電極表面。
(a)溶膠-凝膠固定方法(sol-gelimmobilization)取10μL TEOS(原矽酸四乙酯，tetraethyl orthosilicate；Aldrich Chemicals)、200μL去離子水、30μL乙醇以及1μL 0.1M的HCl於塑膠小試管中，以超音波震蕩一小時，在室溫放置2-3小時，溶膠-凝膠(sol gel)溶液的p H值維持在6。取0.1mg的AChE與ChO及金納米粒子溶液1μL(對照組則不添加)溶解於100μL pH值7的PBS溶液(磷酸緩衝液，phosphate buffersolution)中。取25μL溶膠-凝膠(sol gel)溶液加入前述的酶溶液中，充分混合。取出50μL，與白金電極一起置入另一小塑膠試管中，在4℃風乾24小時，以PBS溶液充分洗淨再儲存於4℃乾燥的環境。
(b)電聚合固定方法(electropolymerization)-使用聚吡咯(polypyrrole)利用循環伏安法(cyclic voltammetry；CV)在0-1V間，以10mV/sec的速度掃描，將酶電聚合於白金電極表面。先於白金電極表面聚合上一層聚吡咯(如下式(7))作為預備層，以避免酶直接附著於電極表面。再以表1的條件進行酶電聚合。在電極的保存方面，需先以去離子水衝洗後，在將其保存於4℃的0.1M PBS中。
表1聚吡咯電聚合所採用的物質與條件
電位計電流輸出信號初步測試在實驗進行之初先以白金電極作為工作電極，經由外加電壓+700mV(亦即H2O2的氧化電位)，測試電位計電流輸出信號對H2O2濃度變化的反應結果如圖2所示。圖2為系統的背景電流值變化，由圖可看出當測試樣本中未添加H2O2時系統的背景電流值約在300秒的後達到穩定值0。
圖3為批次添加2μM的H2O2溶液於測試瓶中，系統的電流信號輸出變化圖。由圖3可明顯看出隨著H2O2溶液的添加，電流值呈批次下降，顯示電位計可對樣本中H2O2的濃度作準確的檢測。
將每一區間H2O2添加前後輸出電流值變化與H2O2的濃度作圖結果如圖4所示。由圖4可看出本系統的電流輸出信號與所添加的H2O2的濃度成一正比關係，尤其在H2O2濃度在0.002-0.006mM之間時，因此可用於本實驗設計所產生的H2O2的檢測，進而經由酶活性抑制，確認樣本中有機磷農藥的濃度。
有機磷農藥對懸浮態酶活性的抑制情況先添加0.1ml 500mM的乙醯膽鹼(acetylcholine；ACh)於含0.1M PBS與0.1M KCl的測試瓶中，而後在測試電流變化期間添加乙醯膽鹼酯酶(acetylcholinesterase；AChE)3.75Unit與膽鹼氧化酶(choline oxidase；CHO)2Unit，同時外加電壓+700mV，再添加不同濃度(0、0.47、4.7、47及470ppm)的對氧磷(paraoxon，屬於有機磷農藥的一種)，觀察電流輸出信號的變化，結果如圖5A-圖5E所示。由圖5A-圖5E可明顯看出一直到對氧磷濃度提升至470ppm時，電流輸出信號才有較明顯的變化，推測其可能原因為實驗中乙醯膽鹼酯酶(AChE)添加量太多，以致於加入抑制劑對氧磷後，殘餘的酶活性仍然可使乙醯膽鹼(ACh)反應，故電位變化並沒有減弱的現象。
修改酶作用底物與酶的添加量，AChE、ChE與ChO添加量各為1mM、0.004Unit及0.2Unit，可將檢測極限下降至4.7ppm(如圖6所示)。依此結果進行在固定對氧磷濃度4.7ppm下，不同對氧磷抑制時間對電流輸出信號(抑制率)影響的實驗，結果如圖7所示。由圖7可明顯看出，隨著抑制時間延長，酶受對氧磷抑制的程度越高，因此電流輸出信號的抑制率越大，亦即電流輸出信號除了受抑制劑(對氧磷)濃度的影響之外，亦與抑制時間密切相關。
酶固定後的活性表現根據上述酶固定方法，分別以溶膠-凝膠固定法及電聚合法將酶固定於電極表面上。結果發現以溶膠-凝膠法固定酶具有膠化縮合過程不易掌控，脫水乾燥時間過長，膠體易脆酶易流失，屏蔽效應阻礙分子擴散與電子傳遞等缺點，導致酶固定後，電流輸出信號較未固定前小甚多，感測靈敏度亦隨的下降。如圖8所示，以溶膠-凝膠法將酶固定於白金電極表面(圖8(a))，相較於直接將酶懸浮於樣本(圖8(b)、(c))中，電極靈敏度下降約4-10倍。同時若將酶以溶膠-凝膠包埋後，直接置於水樣中，而不將其固定於電極表面(圖8(d))，則由於質傳阻力的存在，導致靈敏度較酶直接固定於電極表面者更差，幾乎沒有電流信號發生。
而以電聚合法-聚吡咯(polypyrrole)將酶固定於白金電極表面，不僅可通過導電單體與酶比例調控，達到膜狀固定(filmimmobilization)，避免因酶固定層太厚，造成質量傳輸阻力，同時由於電聚合單體本身為可導電的物質，以電聚合固定後電極的靈敏度反而較懸浮態酶為高，而酶活性在固定的過程中雖有些許失活，但活性殘餘率仍高達90％。圖9是不同吡咯單體/酶量值電聚合完成後電流輸出信號的變化。由圖9可看出當吡咯單體/AChE酶量為0.013mg/1000U時(圖9(d))，酶固定完成後的電極電流輸出信號約為懸浮態酶(圖9(a))的兩倍。這種情況發生主要是因為吡咯本身即為導電性物質。以PTC(丙醯硫代膽鹼，propionylthiocholine)套組(CACTA service srl.)測定酶固定後的活性，發現酶活性殘餘率仍高達未固定前(懸浮態)的89％。
噪聲排除與電流輸出信號放大生物微傳感器的靈敏度若要提升，則信號與噪聲的比值(S/N)必須增大。要達到這個目的，可從兩個方向著手，(1)避免環境樣本中其他物質在檢測過程中被氧化，降低噪聲；(2)放大電流信號。在開發的過程中，將無機催化劑普魯士藍Fe(CN)63-連同AChE及CHO酶一起固定於白金電極表面，通過普魯士藍(PB)與普魯士白(PW)的自催化反應，可將原本氧化H2O2所需的外加電壓由700mV降低至0左右(如圖10所示)。能夠降低應用電位是由於普魯士藍(PB)提供一個很好的催化角色，使H2O2原本需較高電位(700mV)的氧化反應轉換成低電位的還原反應，此還原反應的驅動者為普魯士藍(PB)的還原態普魯士白(PW)所扮演。
首先普魯士白(PW)電催化(electrocatalytic)H2O2的還原，之後再通過電極提供的還原應用電位(0mV)，促使普魯士藍(PB)再度還原成普魯士白(PW)，因此得到一還原電流信號。如此可使電極檢測到的信號為表面修飾的普魯士藍(PB)自我氧化還原改變而非溶液中發生的H2O2氧化還原反應，進而增進電極對H2O2靈敏度。
因此在此幾乎不外加電壓的情況下，原本在現地檢測過程中可能會同時被氧化的物質(如腐植酸、抗壞血酸、NH4+-N等)不再被氧化，可大幅降低電流噪聲的產生。圖11表示抗壞血酸在不同外加電壓下被氧化的情況。由圖11可知，隨著外加電壓上升，因抗壞血酸氧化所產生的電流值越大，而當外加電壓趨近於0時，氧化電流便消失，換句話說，此電流噪聲將不會產生。
另一方面，利用化學合成的金納米粒子優良的導電及巨大的比表面積特性(如圖12的電子掃描顯微照相所示)，將其連同酶與無機催化劑以電聚合的方法一起固定於白金電極表面上，發現由於電子傳輸阻力大幅下降及催化能力大幅上升，電流輸出信號相對提升甚多，亦即傳感器的靈敏度提升，使得傳感器整體檢測極限可下降至ppb級。若考量檢測時間與檢測極限的關係，則可在兩者之間作一折衷，使其不僅檢測的靈敏度可達到要求，同時檢測時間亦可縮短。有一個特別值得注意的地方，如圖13A，當酶與金納米粒子均為懸浮狀態時，金納米粒子添加越多，電極的靈敏度亦越高。然而在固定的狀態下，如圖13B，傳感器的靈敏度會先隨著金納米粒子的添加而升高，而後若金納米粒子過量添加，電極的靈敏度會隨之下降，較佳為電聚合溶液中含0.5-2.0ppm金納米顆粒，最佳添加量為0.7ppm。這種現象主要在於懸浮狀態下，金納米顆粒添加量相較於測試樣本的體積可視為少量，添加越多，導電性理應越好；而當酶與金納米粒子呈膜固定的狀態下，酶、無機催化劑、電聚合單體與金納米粒子的量存在一最佳的配比，當金納米粒子添加過量，不僅粒子容易凝集分散不易，且因為排擠效應，導致固定層當中酶與無機催化劑的含量過低，使得電流輸出信號下降。圖13A中另外可看出，若適當添加金納米粒子量，則固定態的傳感器靈敏度將遠高(約5倍)於懸浮狀態下的靈敏度(固定狀態曲線的波峰)。
本發明中另以不同的四氯金酸/檸檬酸鈉配比合成不同體積的金納米顆粒，將其固定於電極表面上，結果發現當所添加的金納米粒子直徑小於20nm(約16.5-20nm)時，電流信號放大效應才會出現(如圖14所示)。
酶再活化AChE受到有機磷農藥抑制後，可以2-PAM(吡啶-2-醛肟氯甲烷，pyridine-2-aldoxime methochloride)將其活性加以恢復。其作用機制是與乙醯膽鹼酯酶表面磷酸化的磷酸結合，使乙醯膽鹼酯酶恢復活性。氮上的正電荷與穀氨酸(glutamateacid)間有庫倫吸引力，使得具很強親核力的氧原子可攻擊與絲氨酸(serine)結合的磷原子，酶活性因而恢復。本發明中以不同濃度的2-PAM作用於受有機磷農藥抑制後的電極，測量酶活性的恢復率及電流輸出信號變化，結果如圖15所示。圖15中，A0表示標準值；A1表示0.126ppm對氧磷處理10分鐘，A2表示以2-PAM再活化10分鐘，A3表示2-PAM再活化後的30分鐘後(測試1)；B1表示對氧磷處理10分鐘，B2表示以2-PAM再活化15分鐘，B3表示從7月8日製備後，於7月12日使用(測試2)；C1表示對氧磷處理10分鐘，C2表示以2-PAM再活化10分鐘，C3表示2-PAM再活化後的30分鐘後，C 4表示從7月12日製備後，於7月16日使用(測試3)；D1表示對氧磷處理10分鐘，D2表示不使用2-PAM，D3表示以2-PAM再活化10分鐘，D4表示2-PAM再活化後的30分鐘後(測試4)。由圖15可看出經過0.126ppm對氧磷溶液抑制過後的電極，可在30分鐘之內通過2-PAM的作用將其恢復約70％的活性，經過抑制-恢復連續四次的測試發現酶活性並沒有明顯下降，顯示以2-PAM作為酶活性劑是適當的，而電極有極大重複使用的潛力。
環境幹擾因子探討針對環境中可能存在的幹擾因子可能造成酶失活，或存在易被氧化的物質造成電流噪聲產生。本發明針對溫度、pH、重金屬及有機溶劑對酶活性的影響加以探討。圖16表示在不同溫度下酶活性的變化，橫座標代表測量溫度與25℃之差(T-25)，縱座標以電流變化表示抑制率。由圖16可看出當測量溫度在10-40℃之間(橫座標數值-15～15)時，酶活性隨著溫度上升而提高，顯示當傳感器在現地使用時，溫度補償是必須的。本研究針對不同溫度下的酶活性表現作探討，選定25℃為基準點，測量不同溫度下抑制率的變化情形，在10-40℃的範圍之間，發現不同溫度下酶活性表現呈一線性關係(如圖16所示)。
圖17顯示不同pH值下電流輸出信號的變化情形。由圖17可看出在pH8-9間電流輸出信號有明顯上升的情況發生。之所以有這種情況乃是因為當pH過高時，R-膽鹼(R-Choline)會自動被化學水解，導致電流輸出信號急速變大，造成誤判。由此可知本電極的適用範圍只在pH趨近於中性的情況下。
圖18及圖19分別表示有機溶劑及重金屬對酶活性的影響。由圖18A-圖18C可看出不論哪種有機溶劑對酶活性均或多或少有抑制性。針對在目前的放流水標準下(黑色長條所示的濃度)，各有機溶劑對酶的活性抑制率均高。較幸運的是丙酮(圖18C)最常的使用濃度僅約0.2％，而在此情況下丙酮幾乎對酶無任何活性抑制，顯示丙酮是農藥萃取量測較適合的有機溶劑。在圖19A-圖19C中則可看出各種重金屬對酶活性均有影響，其中以銅離子(圖19C)對酶活性的抑制最為嚴重，當水樣本中銅離子濃度達1ppm時，酶活性僅剩約一半。至於鉛(圖19D)、鐵(圖19B)、及鎘(圖19A)離子對酶活性的影響則明顯較小，影響程度的順序為銅＞鎘＞鐵＞鉛。當電極在實場運用時，水中所含重金屬的情況是必須加以注意的。
至於SO42-對酶活性的影響可由圖20來表示。由圖20可看出在現行放流水標準之下，硫酸根的存在對酶幾乎沒有任何影響。
固定測量時間下電流抑制率與有機磷濃度的關係式與可應用範圍傳統上，電化學生物傳感器的檢測極限往往落於ppm等級。如此高的檢測極限導致此類生物傳感器僅能用於高濃度的量測，對於現場汙染物的監控無法提供任何的幫助。通過上述諸多平臺技術的建立，本研究所開發的生物傳感器檢測極限可在極短的檢測時間上延伸至ppb等級。如此低的檢測極限遠小於現行法規管制標準，因而可用於現地汙染物監控之用。圖21為檢測時間10分鐘25℃下有機磷濃度與電流抑制率的關係圖。由圖21可發現電流抑制率起初隨著有機磷濃度增加而呈線性上升，但當有機磷農藥濃度超過130ppb，電流抑制率增至70％附近便不再改變。此現象暗示(1)有機磷農藥可抑制的酶(或有機磷農藥可接觸到的酶活性位置)僅佔全部固定酶的70％；其餘的30％的固定酶可能由於太深或立體方位的影響導致有機磷農藥無法靠近；(2)130ppb的有機磷農藥便足以抑制所有可接觸的酶活性位置，因而導致電流抑制率在高有機磷濃度下也不再升高。
將圖21中的線性範圍(畫圈處)重新繪圖示於圖22中。由圖22可看出本發明的生物微傳感器的有機磷農藥可測定的範圍為10-130ppb。此可應用範圍可通過增加酶固定量來加以擴大。然而此時無機催化劑、金納米顆粒、吡咯單體與酶的最佳配比需針對不同電極大小(表面積)再次加以確認。
電極表現的溫度補償針對電極於不同溫度下的表現進行溫度補償測試。以25℃為基準點，配合圖22中所得的電流抑制率與有機磷農藥關係，選定已知有機磷濃度的標準溶液進行測量，以測量結果進行兩階段的溫度補償。第一階段為單一濃度的溫度補償；第二階段則為全濃度範圍(0-100ppb)的溫度補償。測量的有機磷濃度包括20、40、60、80及100ppb；溫度範圍則涵蓋10、18、25、32及40℃，結果如表2所示。表2中P1為通過圖22關係式換算所得的原始(未經溫度補償)測量結果；P2為經過單一濃度溫度補償後所得的結果；P3則為經過全濃度範圍溫度補償所得的結果。以實際測量結果為基準，將針對各有機磷濃度及全範圍有機磷農藥所得的溫度補償方程式歸納於表3。進行全濃度範圍的溫度修正時，當低於100ppb時，由式1c得出P3′，再由式1b得出Coeff.，最後由式1a得出P3；當100ppb以上時，由式2c得出P3′，再由式2b得出Coeff.，最後由式2a得出P3。由表2可看出(比較標準溶液濃度與P2)，除了高濃度有機磷(100ppb)之外，通過單一濃度溫度補償方程式修正後的結果，無論環境溫度如何，其SD(標準差)均可小於2％；若通過全濃度範圍方程式來進行溫度補償(比較標準溶液濃度與P3)，可看出當環境溫度越偏離25℃，補償效果越差。當環境溫度介於18-32℃時，全有機磷濃度補償後的結果，其SD＜7％；當環境溫度低至10℃或高至40℃時，其SD有時會高達15％。當進行真實樣品真測試，可通過電流抑制率與濃度關係式及全範圍溫度補償方程式，得到樣品中有機磷的含量。若樣品溫度過高或過低，超出溫度補償範圍，建議應回溫後再行測量。
表2各有機磷(對氧磷)濃度不同溫度條件下電極測量的原始數據與溫度補償後的結果
表3單一濃度與全濃度範圍的溫度補償方程式
電流輸出信號數位化通過一連串的實驗結果，建立固定測量時間下電流抑制率與有機磷濃度的關係式。將此相關式燒入晶片，建立信號擷取系統的連接，完成信號數位化，作為生物微傳感器的數位訊號傳輸系統。基本上此數位訊號傳輸系統的開發，主要分為軟、硬體兩部分進行。硬體部分包括有掌上型電位計、信號傳輸線(RS232排線)、信號分析與記錄器(微處理器)等。而軟體主要是使用LabVIEW(Laboratory Virtual Instrument EngineeringWorkbench)套裝程序語言來控制硬體間的信號擷取、傳輸、分析與記錄等工作。LabVIEW是由National Instrument公司於1986年發展出的一種圖像式的程序語言，其主要用途是可以完全整合控制的通訊接口，例如GPIB、VXI、PXI、RS232，以及支持數據呈現(data presentation)、數據儲存(data storage)、數據分析(data analysis)、數據擷取(data acquisition)、環境控制(serial instrument control)等功能。因為LabVIEW中模塊化儀器Express VIs可使原型製作及測試混合信號設計及自動產生測試程序碼；可確保Real-Time Desktop PC功能將在任何基於PC(PC-based)測試系統能最佳化系統穩定度及績效；快速PDA數據擷取效能及DMM支持，建立客制化的可攜式數據擷取系統；藍牙支持-運用無線藍牙科技與其他設備做溝通；50種全新數學函數功能-運用增大LAPACK/BLAS基礎函數庫，增加精準度及速度最高可達200％；超線程(Hyper-Threading)科技來增加最高至100％系統執行力。在檢測的過程中，除了可得到汙染物的濃度之外，亦可針對檢測條件，包括抑制時間、氧化電位、電流紀錄頻率作改變，可謂相當便利。
真實樣品檢測為了確認本研究所開發的生物微傳感器的實用性，針對市售蕃茄汁進行初步測試，結果如圖23所示。在實驗過程中先行對蕃茄汁原液進行有機磷農藥的測量，而後在原液中摻入(spike)30ppb的對氧磷農藥，觀察傳感器是否能對此做出準確的測量。在另一個實驗中，則先將蕃茄汁原液稀釋十倍，進行有機磷農藥測量，而後同樣地於此稀釋液中摻入30ppb的對氧磷農藥，觀察傳感器的測量情況。實驗中整體農藥抑制時間為10分鐘。由圖23可清楚看出，蕃茄汁原液的有機磷農藥濃度為25.6ppb，當摻入30ppb對氧磷農藥後，測量值變為54.9ppb，而在另一實驗中，稀釋十倍後，稀釋液中農藥濃度已低於可測量範圍，而後再摻入30ppb後，稀釋液中的有機磷農藥，又變成可測量其值為39.6ppb。由此結果可知本研究所開發的生物微傳感器可準確地測量果汁中有機磷農藥的殘留量，同時果汁中的幹擾物質，例如糖分、色素、懸浮固體與抗氧化劑等，並不會對測量結果有任何的影響。顯示此系統可用於真實樣品的量測。
產業可利用性本發明結合生物技術與納米科技，開發以酶反應為基礎的電化學生物微傳感器，可針對現地水環境中的汙染物作快速且靈敏的檢測，相對於傳統實驗室的化學分析方法，不僅可達到省時省錢的目的，同時在使用的方便性上更大幅提升。
以電聚合固定方法將酶，連同無機催化劑與金納米粒子一起固定於電極表面上，由於無機催化劑的存在，可降低檢測進行時所需施加的電壓值，因而大幅縮小環境樣本中其他物質被氧化所產生的噪聲。另外，通過金納米粒子的高比表面積與高導電性的特質，可放大酶反應所產生的電流信號，因此可大幅提升生物微傳感器的靈敏度，同時改善檢測極限，縮短檢測時間。依實驗的結果建立電流輸出信號及分析物濃度二者之間的關係，配合電流信號輸出數位化系統的建立，所開發出流的生物微傳感器將兼具靈敏、快速、準確、成本低廉與易上手的特點。
本發明生產的生物微傳感器重量小於1公斤，可在10分鐘的檢測時間內，準確檢測水樣本中的農藥至10ppb以下，與傳統的生物傳感器相比，本發明的生物傳感器不但體積及重量較小，檢測極限下降兩個數量級，檢測時間縮短，且檢測成本僅需約10元，在汙染檢測的應用面上將大幅提升。
以上所述僅為本發明較佳實施例，然其並非用以限定本發明的範圍，任何熟悉本項技術的人員，在不脫離本發明的精神和範圍內，可在此基礎上做進一步的改進和變化，因此本發明的保護範圍當以本申請的權利要求
書所界定的範圍為準。
附圖中符號的簡單說明如下101電極103電極105電極110溫度感應器120處理單元122顯示單元S1電流信號S2溫度信號
權利要求
1.一種檢測農藥的方法，其特徵在於，包括提供一液體樣品；使該樣品與至少一電極接觸，其中該電極表面有酶、金納米顆粒及無機催化劑固定其上；以及檢測由該電極輸出的電流信號。
2.根據權利要求
1所述的檢測農藥的方法，其特徵在於，該酶為乙醯膽鹼酯酶或膽鹼氧化酶。
3.根據權利要求
1所述的檢測農藥的方法，其特徵在於，該無機催化劑為普魯士藍。
4.根據權利要求
1、2或3中任一項所述的檢測農藥的方法，其特徵在於，該電極表面是以電聚合方法固定。
5.根據權利要求
4所述的檢測農藥的方法，其特徵在於，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，固定酶、金納米顆粒及無機催化劑於聚吡咯層上。
6.根據權利要求
5所述的檢測農藥的方法，其特徵在於，該金納米顆粒的濃度為0.5-2.0ppm。
7.根據權利要求
1所述的檢測農藥的方法，其特徵在於，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
8.根據權利要求
1所述的檢測農藥的方法，其特徵在於，該電極為白金電極。
9.根據權利要求
1所述的檢測農藥的方法，其特徵在於，其還包括使該樣品與一溫度感應器接觸，檢測該樣品溫度。
10.根據權利要求
9所述的檢測農藥的方法，其特徵在於，該電流信號以樣品溫度進行溫度補償處理。
11.根據權利要求
1所述的檢測農藥的方法，其特徵在於，該農藥為有機磷或氨基甲酸鹽。
12.根據權利要求
9所述的檢測農藥的方法，其特徵在於，該電極與溫度感應器設置在一平板上。
13.一種生物微傳感器，其特徵在於，包括至少一電極，用以檢測電流信號；一處理單元，用以接收處理該電流信號，且轉換該電流信號成為一濃度數據；以及一顯示單元，用以顯示該濃度數據；其中該電極表面以酶、金納米顆粒以及無機催化劑固定。
14.根據權利要求
13所述的生物微傳感器，其特徵在於，該酶為乙醯膽鹼酯酶或膽鹼氧化酶。
15.根據權利要求
13所述的生物微傳感器，其特徵在於，該無機催化劑為普魯士藍。
16.根據權利要求
13、14或15中任一項所述的生物微傳感器，其特徵在於，該電極表面是以電聚合方法固定。
17.根據權利要求
16所述的生物微傳感器，其特徵在於，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，固定酶、金納米顆粒及無機催化劑於聚吡咯層上。
18.根據權利要求
17所述的生物微傳感器，其特徵在於，該金納米顆粒濃度為0.5-2.0ppm。
19.根據權利要求
13所述的生物微傳感器，其特徵在於，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
20.根據權利要求
13所述的生物微傳感器，其特徵在於，該電極為白金電極。
21.根據權利要求
13所述的生物微傳感器，其特徵在於，其還包含一溫度感應器，用以檢測溫度並傳送至該處理單元。
22.根據權利要求
21所述的生物微傳感器，其特徵在於，該電流信號以該檢測溫度進行溫度補償處理。
23.根據權利要求
13所述的生物微傳感器，其特徵在於，該生物微傳感器用於檢測農藥。
24.根據權利要求
23所述的生物微傳感器，其特徵在於，該農藥為有機磷或氨基甲酸鹽。
25.根據權利要求
21所述的生物微傳感器，其特徵在於，該電極與溫度感應器同時在一平板上。
26.一種降低電流噪聲的方法，其特徵在於，該方法包括將金納米顆粒及無機催化劑固定在一電極表面，其中該電極表面有酶固定。
27.根據權利要求
26所述的降低電流噪聲的方法，其特徵在於，該無機催化劑為普魯士藍。
28.根據權利要求
26所述的降低電流噪聲的方法，其特徵在於，該金納米顆粒粒徑為16.5-20nm。
29.根據權利要求
26所述的降低電流噪聲的方法，其特徵在於，該金納米顆粒濃度為0.5-2.0ppm。
30.根據權利要求
26所述的降低電流噪聲的方法，其特徵在於，該電極表面是以電聚合方法固定金納米顆粒及無機催化劑。
31.根據權利要求
30所述的降低電流噪聲的方法，其特徵在於，該電聚合固定方法是在電極表面聚合一層聚吡咯，使金納米顆粒及無機催化劑固定於聚吡咯層上。
32.根據權利要求
26所述的降低電流噪聲的方法，其特徵在於，該酶為乙醯膽鹼酯酶或膽鹼氧化酶。
專利摘要
本發明涉及一種農藥檢測方法、生物微傳感器及降低電流噪聲的方法。本發明提供一種檢測農藥的方法及生物微傳感器，是利用表面固定酶、金納米顆粒及無機催化劑的電極檢測樣本的電流變化，並利用溫度補償調整所檢測的數據。本發明的生物微傳感器可降低生物傳感器的檢測極限與環境中自然物質的幹擾，同時縮短檢測時間，達到現地即時檢測的目的。
文檔編號C12Q1/00GK1991353SQ200510135222
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月27日
發明者巫鴻章, 李宜忠, 施錫璋, 張富龍, 林畢修平 申請人:財團法人生物技術開發中心導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan