一種抗人降鈣素原蛋白N末端抗原表位的單克隆抗體7H8的製備的製作方法
2024-04-01 04:53:05
本發明屬於生物技術領域，涉及一種單克隆抗體，具體涉及一種分泌抗人PCT蛋白N末端抗原表位的單克隆抗體的雜交瘤細胞及其特異性單克隆抗體的製備。
背景技術：
降鈣素原（procalcitonin, PCT）來源於人第11 號染色體上的降鈣素I基因，該基因在甲狀腺C細胞內翻譯表達降鈣素原前體（proprocalcitonin）後，被內源性多肽酶剪切掉N端25個胺基酸的信號肽，成為含有116個胺基酸的無激素活性的降鈣素前肽物質，即為降鈣素原（PCT）。PCT由N末端（1-57aa）-降鈣素（60-91aa）-鈣抑肽（96-116aa）三部分組成，分別由2肽（-Lys-Arg-）及4肽（-Gly-Lys-Lys-Arg-）連接，相對分子質量約為13 KDa，PCT再經過一系列細胞內蛋白酶加工水解成包含32個胺基酸的具有激素活性的多肽，即為降鈣素（calcitonin, CT）。目前為止，關於降鈣素原的基礎研究很少，其來源和病理生理作用仍未明確，在體內的生物學功能也不得而知。但是，根據PCT在血清中的含量變化與炎症反應的相關性，PCT被應用於多種臨床檢測和觀察中。
在正常生理情況下，甲狀腺外的降鈣素I基因表達受到抑制，僅限於在甲狀腺和肺細胞中表達，因此，在健康人血中PCT含量極少，通常低於0.10 ng/mL。嚴重真菌、細菌、寄生蟲感染以及膿毒症和多臟器功能衰竭等會誘導全身多種組織和細胞中的降鈣素I基因表達，導致血清中PCT的含量會迅速升高，PCT濃度甚至會躥升至正常水平的數百至萬倍，但CT的含量則保持不變或略有增高。然而，過敏和病毒感染以及自身性免疫疾病不會引起血液中PCT升高，局部細菌感染和慢性炎症同樣不會導致PCT水平的明顯變化。因此，PCT是重要的炎症標誌物，能夠區分細菌感染與病毒感染、自身免疫疾病引起的炎症反應。並且，與其他的炎症指示因子相比，PCT具有更好的靈敏性和特異性。PCT在感染後2小時即可以檢測到，感染後6-12小時達到峰值，12-24h為平臺期，24h後濃度下降，半衰期較長，為20-24小時，能在一段時間維持在高水平。同時PCT水平與感染程度正相關，PCT濃度越高意味著受感染程度越嚴重，因此PCT水平對炎症的發生發展的診斷以及治療預後等方面都具有重要意義。其他炎症因子如IL-6、IL-10、TNF-α在感染後2小時達到峰值，並迅速下降，不易被檢測到；而C反應蛋白（CRP）在感染後24-48小時才達到峰值，且炎症控制後濃度仍保持較高水平，不利於早期診斷和治療評價。在臨床診斷治療中，傳統檢測指標如體溫、白細胞計數（WBC）的靈敏性和特異性均不高，而PCT與過去的生物學標記物相比，其具有較為理想的準確性和特異性，是一個理想的感染檢測標誌物，有助於臨床的早期診斷和制定合理的治療方案。
PCT檢測炎症的方法已獲得美國食品藥品管理局（FDA）的許可。早期，檢測PCT主要使用凝膠層析分析法和高效液相色譜法，這兩種方法不僅費時，且操作要求高，不易自動化。近年來，PCT的檢測多採用免疫學方法進行，具有特異性強、靈敏度高和容易操作等優點，包括雙抗夾心免疫化學發光法、膠體金法和放射免疫法等。所有這些免疫學方法的前提都是製備針對PCT的特異性單克隆抗體，在健康人血漿中PCT含量極低，在 0.2 ng/mL 以下，因此，對所製備抗體的親和力等參數要求很高。且目前檢測體系所用的抗體均來自國外大公司，價格昂貴。因此，製備 PCT 特異性單克隆抗體，為 PCT 的免疫檢測提供關鍵原料，對於擴大其臨床應用，降低醫療成本，具有重要意義。
技術實現要素：
目前，國內自主研發的針對PCT蛋白的單克隆抗體，主要是使用合成的預測表位肽段作為抗原免疫小鼠，經過雜交瘤技術獲得的，使用的抗原肽段分別是34-60aa以及75-88aa序列，均與降鈣素序列（60-91aa）存在交叉，因此不能夠區分PCT及CT。本發明的目的是篩選出特異性識別PCT蛋白N末端的胺基酸序列的單克隆抗體，減少交叉反應，使其可以廣泛的應用於PCT的臨床檢測及基礎研究中。
針對現有技術的不足，本發明經過反覆試驗，利用原核表達技術，表達並純化人PCT全長蛋白，純化後的人PCT蛋白具有很高的純度，Western blot實驗顯示該蛋白具有很強的免疫反應性。純化後的人PCT蛋白免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選到13株分泌抗人PCT蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞，經鑑定，其中1株識別的位點位於PCT蛋白N末端4-18aa序列。本發明對這株雜交瘤細胞（雜交瘤細胞株7H8）進行了生物學特性鑑定。
本發明提供的技術方案是：篩選一種分泌抗人PCT蛋白N末端抗原表位的單克隆抗體的雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞（雜交瘤細胞株7H8）已於2015年 9 月 15 日為中國典型培養物保藏中心（武漢）CCTCC所保藏（保藏地址是：中國武漢武漢大學，郵編：430072），其保藏號為CCTCC NO:C2015155，經檢測存活。該細胞是圓形的半貼壁細胞（用彎管可以將細胞從瓶壁上吹下來，收集細胞不需要胰酶消化，如果有細胞懸浮存在也是正常），細胞分裂倍增的時間是16-18小時。
同時，本發明還提供一種抗人PCT蛋白N端胺基酸序列的單克隆抗體的雜交瘤細胞的製備方法，該方法包括如下步驟：
（1）將人PCT蛋白與弗氏完全佐劑充分乳化，採用皮下免疫方法，以每隻小鼠免疫蛋白濃度分別為30 µg、50 µg、100 µg和150 µg四個梯度的劑量，每個梯度免疫3隻6~8周齡BALB/c雌性小鼠；
（2）兩周後進行第2次免疫，將人PCT蛋白與弗氏不完全佐劑充分乳化，採用與步驟（1）中同樣的劑量和方法加強免疫BALB/c小鼠；
（3）2周後進行第3次免疫，免疫劑量與方法同第2次免疫；
（4）融合前3 d用不加佐劑的人PCT抗原，採用脾下加強免疫，每隻劑量為100 μg；
（5）融合前1 d用不加佐劑的人PCT抗原加強免疫，每隻劑量50 μg；
（6）小鼠斷尾進行尾尖採血，4 ℃，4000 g離心5 min，取上清，間接ELISA法檢測血清效價，選取血清效價大於1,000,000 的小鼠準備進行細胞融合試驗；
（7）選擇生長狀態良好的SP2/0骨髓瘤細胞與免疫小鼠的脾臟細胞以1:5~1:10混合，1500 g離心5 min，棄上清；
（8）輕搖離心管使細胞均勻分散，緩緩加入1 mL 37 ℃預熱的PEG 1500並輕輕混勻1.5 min，然後加入20 mL 1640培養基；
（9）800 g離心5 min後棄上清，細胞中加入含有20%血清的HAT-1640培養基並混勻；
（10）將混勻的細胞均勻鋪於96孔板中，在37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中培養5~7 d後觀察融合效果並換液；
（11）換液後第4 d用間接ELISA方法檢測雜交瘤細胞上清液，選擇陽性值高且細胞集落數目少的孔，通過有限稀釋法進行亞克隆，每孔細胞數目理論值為1~2個；
（12）經過3~4次亞克隆後，即獲得能夠穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株，篩選出的陽性雜交瘤細胞可用於製備抗人PCT蛋白單克隆抗體。
(13) 進一步篩選和鑑定能夠分泌識別的表位位於PCT蛋白的N末端胺基酸，而不識別降鈣素（CT）的胺基酸序列的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
本發明還提供所述的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。
本發明還提供所述的單克隆抗體在製備PCT蛋白檢測的試劑盒中的應用。
所術的應用，其中檢測PCT蛋白的方法採用雙抗夾心ELISA法。
本發明提供一種針對降鈣素原PCT蛋白N末端抗原表位的單克隆抗體的製備方法。本發明所獲得的單克隆抗體是使用全長PCT蛋白作為抗原免疫小鼠後通過雜交瘤技術篩選得到的，經鑑定其識別的表位位於PCT蛋白的N末端胺基酸，不識別降鈣素（CT）的胺基酸序列，因此能夠有效避免與降鈣素之間的交叉反應性，特異性識別PCT蛋白，為雙抗夾心免疫化學發光法檢測PCT蛋白提供一種新的配對單克隆抗體，對降低PCT檢測的假陽性率、提高檢測的特異性具有重要的意義。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
（1）本發明人通過在大腸桿菌中原核表達密碼子優化後的人PCT全基因序列，使其表達於胞漿上清中，通過本實驗室的特異性親和純化等技術，可以簡化人重組PCT蛋白的純化過程，純化後人PCT蛋白保持其天然活性，最大限度保證了蛋白空間構象的完整性，將其作為抗原免疫BALB/c小鼠，篩選獲得的抗體可以更好的識別臨床血清中天然PCT蛋白。
（2）經過細胞融合及亞克隆篩選，獲得了7H8單克隆抗體，通過使用PCT全胺基酸序列截短合成的肽段，利用ELISA法對獲得的單克隆抗體進行表位鑑定，精準的確定了該抗體識別的序列是人PCT蛋白N末端（4-18aa）表位序列，Western blot和ELISA檢測結果顯示，7H8單克隆抗體具有很好的特異性、穩定性和靈敏度。
（3）對7H8抗體進行HRP酶標記，建立雙抗夾心ELISA法，對臨床血清樣品進行檢測，能捕獲血清樣品中的天然PCT蛋白，表明用自主研發的抗體用於臨床檢測具有可行性，為開發PCT診斷試劑盒提供了一種很好的新材料。
附圖說明
圖1. 原核表達的人PCT融合蛋白質譜鑑定，軟體分析結果顯示，Protein score為282，與PCT蛋白匹配度很高，結果可靠。
圖2. PCT蛋白純化後鑑定，lane M：蛋白質相對分子質量標準品； lane 1：30% 硫酸銨沉澱樣品；lane 2 ~ 5：Ni-IDA resin 純化後的蛋白；Lane 6：分子篩層析純化後的蛋白。
圖3. PCT蛋白純化後鑑定，圖3(A)：SDS-PAGE鑑定結果；圖3 (B)：Western blot鑑定結果，lane M：蛋白質相對分子質量標準品； Lane 1：分子篩層析純化後的蛋白。
圖4. 7H8單克隆抗體亞型鑑定，7H8單克隆抗體亞型為 IgG1 亞類。
圖5. 單克隆抗體純化後鑑定，圖5(A)：SDS-PAGE 鑑定圖，lane M：蛋白質相對分子質量標準；lane 1：未煮沸的純化前腹水；lane 2：煮沸的純化前腹水；lane 3：未煮沸的純化後單克隆抗體；lane 4：煮沸的純化後單克隆抗體；圖5(B):免疫特異性鑑定，lane M：蛋白質相對分子質量標準；lane 1：重組 PCT蛋白。
圖6. 7H8抗體穩定性檢測，將純化後的單抗 7H8 分別置於-80 ℃、 -20 ℃、4 ℃和37℃的環境中，於1、2、3、9、27、60天取樣，間接 ELISA 檢測其效價變化，結果顯示：放於37℃的7H8抗體在一個月後效價才開始下降，4℃條件下60天依然穩定。
具體實施方式
下面通過具體實施方式的詳細描述來進一步闡明本發明，但並不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。
本實施例所用材料如下：
(1)菌種、序列和細胞株：大腸桿菌E.coli Top 10、ER2566菌株由本實驗室保存，密碼子優化的PCT全基因序列、SP 2/0小鼠骨髓瘤細胞由廈門大學公共衛生學院夏寧邵教授惠贈。
(2)主要試劑：HRP-羊抗兔由廈門大學夏寧邵教授惠贈；標準PCT多克隆抗體購自Proteintech公司；蛋白質相對分子質量標準購自Thermo公司；弗氏佐劑購自美國sigma公司；HT、HAT培養基添加劑購自美國sigma公司；1640培養基購自Gibco公司。
（3）臨床血清樣品：由湖南省人民醫院檢驗科收集。
本發明通過以下方法製備得到分泌抗人PCT蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞：
（1）基因序列
由廈門大學惠贈的人PCT全基因序列，是將基因密碼子置換為大腸桿菌偏愛的密碼子，使其更加容易在大腸桿菌中表達，優化後的核苷酸序列為如SEQ ID NO: 1所示；
表位定位的 4-18 aa 多肽序列為如SEQ ID NO：2所示。
（2）重組PCT蛋白菌株誘導表達
挑取篩選的單克隆菌株，接種到5 mL LB液體培養基中（含有100 μg/mL硫酸卡那黴素（Kan+）37 ℃培養至OD600值達到0.6，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進行誘導表達，同時以轉化空質粒的菌株進行誘導作為陰性對照，其它培養條件與試驗組一致。37 ℃誘導培養4 h，室溫12000 g離心1min，收集菌體。分別製備蛋白樣品，用12%的SDS-PAGE分析重組蛋白的表達情況。結果顯示：在試驗組中可以觀察到一條相對較粗的蛋白條帶，其大小與理論基本一致，而在對照組中沒有出現這一條帶，說明重組人PCT蛋白在重組菌株中可能獲得了高效表達。
（3）質譜法檢測重組蛋白性質
重組蛋白經過質譜儀分析後，將得到的數據輸入資料庫進行匹配分析，結果顯示檢測蛋白與資料庫中PCT蛋白相符。軟體分析結果顯示，Protein score為282，說明匹配度很高，結果可靠；質譜結果還顯示PCT重組蛋白的相對分子質量約為13kD，與天然PCT蛋白的相對分子質量大小符合，這也進一步提高了PCT重組蛋白的可信度（圖1）。
（4）目的蛋白大量表達與蛋白純化
從平板上挑取單菌落接種到50 mL LB（Kan+）培養基中培養12 h，然後接種1% 的重組菌到2 L LB培養基（Kan+）中培養。待菌液OD600值達到0.6後，加入IPTG進行誘導表達（終濃度為0.4 mmol/L）。37℃培養4 h後，12000 g離心10 min收集菌體。加入100 mL裂解液（50 mmol/L Tris·HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH 8.0），10 mm 探頭200 W功率在冰上超聲破碎菌體。將離心收集的上清放入燒杯，按公式V3=V*(100-Q1)/(Q1-Q2)（V代表上清體積；Q1 代表此次的硫酸銨濃度；Q2代表前一次硫酸銨濃度；V3代表加入的飽和硫酸銨體積）緩慢滴入飽和硫酸銨（pH 7.4），在冰上攪拌30 min，4 ℃靜置2 h。4 ℃，12 000 g，離心10 min，用PBS（pH 7.4）將沉澱溶解。依次做20%到80%七個梯度初步純化重組PCT蛋白，收集樣品SDS-PAGE鑑定。
用5到10倍柱體積的 buffer 0（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，pH 8.0）以1 mL/min的速度平衡His-taq柱，然後PBS溶解的重組PCT蛋白以相同速度過柱，再用buffer 0溶解的20、50、100、250 mM 咪唑梯度洗脫重組蛋白，洗脫液於4 ℃用 PBS（pH 7.4）透析去除咪唑，收集樣品 SDS-PAGE 鑑定。
以0.5 mL/min的流速，用10倍柱床體積的流動相PBS（pH 7.0）平衡TSK-GEL G3000 SW層析柱至280 nm吸收值無明顯變化，將檢測器吸收值歸零，在上樣環中注入樣品2 ml，以0.5 mL/min的流速過柱，收集280 nm處吸收值大於0.5 AU的蛋白峰。SDS-PAGE分析收集的蛋白峰（圖2）。
純化後人PCT蛋白樣品經過電泳後，SDS-PAGE檢測結果顯示目的蛋白主要溶解在上清中，沉澱於30%的飽和硫酸銨中。人PCT蛋白經過His-taq柱和TSK-GEL G3000 SW層析柱純化後，在SDS-PAGE電泳圖上只觀察到一條蛋白條帶（圖3A），說明純度有了極大的提高，用Bandscan軟體分析蛋白的純度超過了99%。
對純化後蛋白進行Western blot分析。將純化蛋白轉膜後，用含5%的脫脂奶的TN（50 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl， pH7.5）緩衝液封閉2 h。加入按1:2000的比例用脫脂奶稀釋PCT多克隆抗體，37℃反應2 h。用TNT緩衝液（50 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH7.5）洗膜三次，每次10 min，加入HRP酶標羊抗兔，室溫反應2 h。用TNT洗膜三次，每次10 min，用HRP-DAB顯色試劑盒顯色。Western blot結果顯示，表達的重組蛋白與Proteintech公司的PCT兔源多克隆抗體發生特異性反應（圖3B），進一步說明人PCT基因在大腸桿菌中獲得了高效表達，而且具有良好的抗原性。
（5）動物免疫與血清效價檢測
將純化後的PCT蛋白用PBS緩衝液透析後，稀釋至每隻小鼠免疫蛋白濃度分別為30 µg、50 µg、100 µg和150 µg四個梯度，每個梯度免疫3隻小鼠，1:1加入弗氏完全佐劑充分乳化。採用皮下多點免疫的方法，對每隻小鼠分別以每隻500 µl的劑量進行初次免疫；兩周後，進行再次免疫時1: 1加入蛋白溶液和弗式不完全佐劑，充分乳化後以同樣劑量免疫小鼠，一共加強免疫2次，每次間隔2周。在每次免疫的前一天收集小鼠血清進行間接ELISA，以檢測PCT重組蛋白的免疫原性及血清抗體效價。
第三次免疫8 d後，小鼠尾靜脈採血，4 ℃，4 000 g離心5 min，取上清，間接ELISA法檢測血清效價，選取血清效價高於1, 000, 000的小鼠，在融合前4 d再加強一次免疫，在脾臟注射30 µg PCT蛋白，2 d後尾靜脈注射20 µg蛋白。
（6）細胞融合、陽性雜交瘤細胞篩選與亞克隆
選擇生長狀態良好的SP2/0骨髓瘤細胞與免疫小鼠的脾臟細胞以1:5~1:10混合，1500 g離心5 min，棄上清。輕搖離心管使細胞均勻分散，緩緩加入1 mL 37 ℃預熱的PEG 1500並輕輕混勻，融合90s後加入20 mL 1640培養基終止。800 g離心5 min後棄上清，在細胞沉澱中加入20%血清的HAT-1640培養基並混勻。
混勻細胞均勻鋪於96孔板中，在37 ℃，5% CO2 培養箱中培養5~7 d後觀察融合效果並換液。換液後第4 d用間接ELISA方法檢測雜交瘤細胞上清液，選擇陽性值高且細胞集落數目少的孔，通過有限稀釋法進行亞克隆，每孔細胞數目理論值為1~2個。經過3~4次亞克隆後，即獲得能夠穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株，將此細胞株部分用於單克隆抗體的生產，部分於液氮罐內凍存。
融合7 d後通過觀察和計算得到本次細胞的融合率為80.1%，融合10 d後通過間接ELISA法測得陽性克隆率為31.2%。採用間接ELISA和有限稀釋法篩選陽性雜交瘤細胞，經過3~4次亞克隆後，獲得了13株能夠穩定分泌抗人PCT蛋白單克隆抗體的細胞株。
（7）單克隆抗體的產生與純化
取 8-10 周齡 BALB/c 小鼠，先腹腔注射無菌石蠟油，每隻 0.5 mL。7 d 後向腹腔內注入雜交瘤細胞，調整細胞密度為 1×106 - 2×106 /mL，每隻小鼠大約注射 0.5mL。8-10 d 後即開始採集腹水。將採集好的腹水 1:1（V/V） 緩慢加入飽和硫酸銨，冰上攪拌 30 min，4 ℃，12000 g 離心 10 min 後棄上清。沉澱用一定體積的 PBS 溶解，移至透析袋中透析平衡至 20 倍體積的 Binding buffer（Protein A Sefinose Kit 中提供）中以除去高濃度的離子，然後用蛋白 A 柱純化。將純化前與純化後的腹水抗體經 SDS-PAGE電泳，純化後的抗體，出現了三條帶：50kDa 的重鏈、25kDa 的輕鏈和約 100kDa 大小的條帶，但不煮沸時主要為 100 kDa 的條帶，煮沸後重鏈條帶明顯變強，100 kDa 的條帶變弱，且大小是重鏈的兩倍，煮沸前後輕鏈條帶強弱相差不大（圖5），因此，100 kDa 的條帶為重鏈與重鏈的聚合體，原因是兩條重鏈間的二硫鍵沒有完全破壞。從凝膠上看不到其它雜蛋白條帶，這說明經親和柱層析後，單克隆抗體達到了相當高的純度，可以用於後續實驗。
（8）單抗抗原表位的分析
對原核表達的 PCT 全胺基酸序列的N-端進行截短合成，每15個胺基酸一條肽鏈，每條肽鏈與前一條肽鏈重複5個胺基酸，全長共合成12條肽鏈，截短合成蛋白分別命名為1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R、8R、9R、10R、11R、12R，利用間接 ELISA 對單克隆抗體的表位進行定位。
將截短合成的12條多肽鏈用 CB 液（15mmol/L Na2CO3，35mmol/L NaHCO3）稀釋至濃度為 100ug/mL，包被 ELISA 板，37℃4h，再4℃ 過夜。洗板一次，加入 ED 封閉液37℃孵育2h後，洗板5次，加入100 ug/ml的單克隆抗體，37℃ 孵育 60min 後，洗板 5 次，加入HRP-羊抗鼠二抗，37℃ 孵育30 min，洗板5次，最後加入TMB底物顯色劑，37℃ 反應 10 min，加入終止液，450nm/630nm 雙波長檢測。通過篩選，7H8與第2條肽鏈反應明顯，與其他肽鏈都未能出現特異性，說明 7H8 識別的表位為人PCT蛋白N端4-18aa之間，即成功獲得針對人PCT蛋白N末端抗原表位的單克隆抗體。篩選的其他株抗體主要是針對43-69aa和75-88aa表位。
（9）單克隆抗體亞型鑑定
將純化的 PCT 蛋白用1× CB 緩衝液（15mmol/L Na2CO3，35mmol/L NaHCO3）稀釋至濃度為 1ug/mL，包被 ELISA 板，4℃ 過夜。洗板一次後，加入 ED 封閉液，37℃ 2h 後，洗板 5 次，加入雜交瘤細胞上清，37℃ 孵育 30min 後，洗板 5 次，加入 HRP-羊抗鼠二抗（IgG、 IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM），37℃ 孵育 30min，洗板 5 次，最後加入 TMB 底物顯色劑，37℃ 反應 10min，加入終止液，450/630nm 雙波長檢測。結果顯示：7H8單克隆抗體為 IgG1 亞類（圖4）。
（10）雜交瘤細胞系與單克隆抗體穩定性的鑑定
對7H8分別進行體外傳20代和液氮凍存3個月後再復甦處理，間接ELISA檢測培養上清中抗人PCT McAb的效價。腹水單抗分別置於37 ℃、4 ℃、-20℃和-80℃的環境中。於1、2、3、9、27、60天取樣，間接 ELISA 檢測其效價變化。以-20 ℃保存的樣品作為陽性對照，小鼠血清作為陰性對照。
本發明篩選獲得的雜交瘤細胞體外傳20代後，採用間接ELISA檢測細胞上清中單克隆抗體的效價，其效價基本保持不變，仍然可以達到1×104。將凍存於液氮中的雜交瘤細胞復甦培養來生產單克隆抗體，結果也發現，凍存3個月後其效價也基本沒變，可以達到1×104，說明獲得的雜交瘤細胞系穩定性好。腹水單抗分別置於37 ℃、4 ℃、-20℃和-80℃的環境中，37℃的7H8抗體在一個月後效價才開始下降，4℃條件下60天依然穩定（圖6）。說明單抗的穩定性好，完全符合商用抗體的貨架期穩定性要求，具有良好的應用前景。
（11）單克隆抗體的效價、特異性及適用範圍的鑑定
用1 μg/mL的人PCT蛋白包被96孔酶標板，用間接ELISA方法檢測純化抗體效價。以陽性值與陰性值的比值大於2.0的最大抗體稀釋倍數確定為抗體效價。結果表明，雜交瘤細胞培養上清液的抗體效價為1×104，腹水的抗體效價為1×106，腹水效價明顯高於上清效價。
為了研究7H8的適用範圍，用重組PCT蛋白、重組Cys蛋白、重組NGAL蛋白、P27蛋白、重組GAPDH蛋白、pp65蛋白和重組HFABP蛋白作為抗原，PBS緩衝液作為陰性對照，進行ELISA檢測，一抗7H8抗體孵育的最終濃度為100 ng/mL。結果顯示7H8單抗只與PCT蛋白發生特異性反應，而且反應值特別明顯，說明7H8具有高度的特異性。
（12）單抗相對親和力測定
以 PCT 抗原競爭結合 7H8 抗體測定親和力常數（1） ①反應系統中抗PCT單抗7H8 的初始濃度為1 ug/mL，PCT 抗原的初始濃度從 1 ug/mL往下倍比稀釋， 形成8個反應系統，在 37 ℃反應1 h； ②以每孔100 uL將反應液以雙孔加入到包被了 PCT 抗原的免疫反應板，37 ℃孵育1 h後洗板5次； ③加入100 uL羊抗鼠二抗酶結合物溶液37℃反應1 h，洗板5次，加入底物顯色 10 min後加入終止液，測定OD = 450 nm/630 nm 計算各個反應系統的抗原結合率推算親和力常數。（2）改變條件重複（1）實驗測定親和力常數。
將實驗方法中的抗體初始濃度改成 2 ug/mL ，抗原的初始濃度從 10 ug/ml往下倍比稀釋， 建立反應系統，按照⑴中的步驟②、③檢測抗原結合率，並推算親和力常數。從實驗結果顯示需要抗原遠遠過量才能對抗體形成競爭抑制，可以直接用抗原初始濃度i0對B/(1-B)作圖求得斜率(親和力常數)為 k = 1.43 ( r = 0.8702)，具有作為免疫診斷試劑原材料的潛力。改變條件按照形成反應系列測得的結果，直接用抗原初始濃度i0對B/(1-B)作圖求得斜率（親和力常數），得出Kd值為0.4461，實驗結果比抗原、抗體濃度未提高時降低了近 4 倍。
（13）HRP酶標抗體與雙抗夾心ELISA法檢測人PCT蛋白
① 7H8的HRP酶標：純化後的單克隆抗體透析，4℃攪拌透析2h，換液2次；將HRP平衡到室溫，取HRP和NaIO4 分別加水溶解後，再將NaIO4溶液緩慢加入HRP溶液中，溶液由棕色轉變成綠色，置於4℃避光活化30 min；將乙二醇加入HRP和NaIO4 混合液中，室溫避光終止30 min，至溶液由綠色變為棕色；將活化的HRP加入透析的抗體中，4℃避光透析2h，換液2次；配製20mg/ml的硼酸氫鈉溶液，加入HRP酶體積1/10的NaBH4 溶液，4℃放置 2h，每隔30min混勻一次；用等體積的飽和硫酸銨沉澱HRP標記抗體離心10min後瀝乾； 50％甘油溶解沉澱蛋白，-20℃保存。間接 ELISA 法測定HRP標記抗體活性。結果顯示：7H8抗體的酶標效果很好，顯色明顯。
② 雙抗夾心ELISA法檢測人PCT蛋白：將Proteintech公司的PCT多克隆抗體作為捕獲抗體包被，HRP標記7H8抗體作為二抗，檢測人重組PCT蛋白。每孔中加入100 ul多克隆抗體溶液(10ug/ml，溶於PBS)，將捕獲抗體包被在酶標板表面。37℃孵育2h或4℃過夜。洗板 1 次；加入 200 µL ED封閉液（0.25% Casein），37 ℃放置2 h，洗板5次；加入純化的人PCT蛋白和臨床血清樣品，人PCT重組抗原用1×PBS（pH 7.45）稀釋至濃度為100 µg/mL，再按1:10，1:100，1:1000，1:10000，1:100000梯度稀釋，PBS緩衝液為陰性對照，設置雙孔對照，每孔加入樣品100 µL，37 ℃放置2 h，洗板5次；用ED封閉液按 1: 5000稀釋HRP標記7H8單抗，每孔加入100 µL稀釋後的HRP-7H8，37 ℃ 孵育30 min，洗板5次；加入100 µL TMB 底物顯色液，37 ℃避光顯色10 min；加入50µL終止液終止反應；酶標儀上使用450 nm/630 nm雙波長檢測各孔的OD值。結果顯示，雙抗夾心ELISA法檢測血清樣品中PCT陽性與醫院檢測結果一致，且對純化的人PCT蛋白可達檢測到0.1µg/mL，陰性對照OD450低於0.1，表明7H8抗體對PCT有很好的識別作用，靈敏度高，為後續PCT診斷試劑盒的研究提供了很好的材料。
自1982年Fukushi H首次製備了AIV亞型單克隆抗體以來，單克隆抗體技術以其特有的高靈敏性和特異性而得到了廣泛的應用。單克隆抗體技術中影響細胞融合的因素有很多，免疫效果尤為重要。將純化後的人PCT蛋白用皮下多位點免疫刺激小鼠的免疫系統。三次皮下免疫後，小鼠血清稀釋百萬倍的效價仍可明顯檢測為陽性，隨後進行脾臟注射免疫和尾靜脈注射免疫，這樣就使得小鼠體內的B淋巴細胞保持一種高度活躍的狀態。本發明通過動物免疫這一關鍵步驟的把握，保證了較好的陽性克隆率。細胞融合後生長到孔底面積的1/2~1/3時進行亞克隆，避免了陽性細胞漏檢和染色體丟失情況的發生。採用操作簡便的有限稀釋法，確保了雜交瘤細胞系的穩定性和抗體分泌效價高的特點。經過4次克隆化後，獲得的雜交瘤細胞陽性率均為100%。在進行細胞亞克隆時最好在HT-1640培養基中添加飼養細胞或細胞生長因子，以防雜交瘤細胞在培養過程中因狀態不好而死亡。
目前，單克隆抗體的純化方法有很多，如辛酸-硫酸銨法、親和層析、離子交換層析、凝膠過濾法及高效液相層析法等。本發明採用先飽和硫酸銨分級沉澱初步純化再用Protein A柱純化抗體，純化後的單抗腹水抗體效價達1×106。而雜交瘤細胞培養的上清經硫酸銨沉澱後就可以達到很高的純度，完全可以滿足實驗室使用要求和商品化要求，因為細胞分泌的主要是單克隆抗體。由於細胞培養血清價格比較高，產生的抗體效價又比較低，因此在生產抗體的過程中，可以採取先培養一定量的雜交瘤細胞，然後利用小鼠誘導腹水生產抗體，這樣生產抗體不但效價高，而且生產成本可以大大降低。本實驗篩選得到的7H8單克隆抗體能特異性識別人PCT蛋白N末端4-18aa序列，且能捕獲血清樣品中天然PCT蛋白，這為後續臨床炎症感染中PCT的檢測提供了一個新的材料。雜交瘤細胞系及單抗穩定性檢測結果說明，單抗的雜交瘤細胞系和單抗的穩定性好，長期保存不會使抗體效價降低。多項數據表明7H8分泌的單克隆抗體能廣泛應用於多種生物和組織的細胞生物學和免疫學試驗，具有良好應用前景和商業價值。
湖南師範大學
一種抗人降鈣素原蛋白N末端抗原表位的單克隆抗體7H8的製備
2
1
378
DNA
1
ATGCACCACCACCCCCACCACGGATCTGCACCATTCCGTTCTGCCCTGGAGAGCTCTCCAGCAGATCCGGCAA
CACTGAGTGAAGACGAAGCGCGCCTTCTGCTGGCTGCACTGGTGCAGGACTATGTGCAGATGAAGGCCAGTGA
GCTGGAGCAGGAGCAAGAGCGTGAGGGTTCCAGCCTGGATAGCCCACGTTCTAAGCGTTGCGGTAATCTGAGT
ACCTGCATGCTGGGCACCTACACGCAGGACTTCAACAAGTTCCACACGTTCCCACAAACTGCAATCGGTGTTG
GTGCACCTGGTAAGAAGCGTGACATGTCCAGCGACCTGGAGCGTGACCATCGCCCTCATGTTAGCATGCCACA
GAATGCCAACTAA
2
15
多肽
2
PFRSA LESSP ADPAT