ELISpot結核感染診斷試劑盒及其應用的製作方法

2024-04-05 14:24:05 1

專利名稱：ELISpot結核感染診斷試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及ELISpot結核感染診斷試劑盒及其應用，它屬於醫學免疫學 診斷技術領域，具體是關於ELISpot結核感染診斷試劑盒及其在結核菌感染 檢測中的應用。
技術背景在全世界結核病依然是危害人類健康的主要傳染病之一，1985年以來愛滋 病的流行、結核感染的移民和部分人群生活貧困等原因使美國等歐美發達國家結 核病發病率呈回升趨勢，尤其是結核菌耐藥問題和非結核分枝桿菌病的發病率逐年上升使結核病治療更是雪上加霜。目前全世界有結核病人約2000萬，每年新 增結核病人800 1000萬，每年死亡人數約300萬。1993年世界衛生組織(WHO) 史無前例地宣布"全球結核病緊急狀態"，1998年又重申遏制結核病的行動刻不 容緩。我國的結核病疫情和結核菌感染情況都相當嚴重，是全球22個結核病高負 擔國家之一，結核病人數位居世界第二，僅次於印度。2000年第四次全國結核病 流行病學抽樣調査初步結果表明，我國有5.5億人感染了結核菌；現有肺結核病 人451萬，其中傳染性肺結核病人196萬；每年死亡人數約13萬，在傳染病中 居第一位。面對這種嚴峻的形勢，結核病的預防和控制已引起國內外政府及學者 的高度重視。因此，結核病的早期診斷、鑑別診斷和流行病學調查對結核病的早 期、有效化療和控制結核菌傳播都有極其重要的意義。機體的抗結核免疫主要是細胞免疫應答。舊結核菌素、純蛋白衍化物(PPD) 是結核分枝桿菌培養濾液蛋白，其作用於人體會激發已致敏機體產生細胞免疫反 應，激活T淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞，釋放大量細胞因子，並使這些細胞 增殖、聚集，包裹抗原形成結節，這就是遲髮型變態(DTH)反應，其反應強度 與細胞免疫呈平行關係。舊結核菌素不易標準化和易發生非特異性反應，目前已 經很少使用。PPD皮膚試驗己成為目前臨床上最常用且最簡便的一種結核菌感染 診斷方法，反應越強，表示結核感染可能性越大，中國一直使用硬結》5mm為 陽性，》20mm或有水泡、壞死、淋巴結炎等為強陽性，3歲以下兒童》15mm 為強陽性的標準。但由於PPD中含有許多分枝桿菌(包括致病性分枝桿菌、環境 中非致病性分枝桿菌和卡介苗)共同的抗原，PPD皮試陽性並不能鑑別是因為結核分枝桿菌複合群感染，還是接觸環境中非結核分枝桿菌或卡介苗接種後造成的致敏，診斷的特異性差，只能根據皮膚的反應強弱輔助診斷，其靈敏度只有70-80 %。1983年建立的酶聯免疫斑點實驗(Enzyme-linked I咖unospot ，簡稱 ELISPOT)技術具有高度的敏感性和應用的廣泛性，已成為近年來最吸引人的免 疫監測候選方法之一，在疫苗的研發、臨床診斷以及基礎研究等多個方面得到廣 泛應用。ESAT6和CFP10蛋白由結核分枝桿菌、牛分枝桿菌和少數致病性分枝桿菌 基因組的RD1區域編碼，但所有卡介苗菌株及絕大部分環境分枝桿菌基因組均丟 失該區域，不表達ESAT6和CFP10蛋白，這兩個蛋白均含有多個T淋巴細胞抗原表 位，其蛋白或多肽可作為T細胞刺激抗原。結核感染者或結核病患者外周血中T淋 巴細胞在結核特異性抗原的激活下，可釋放不同水平的Y幹擾素，與正常人或非 結核患者具有顯著差異。英國牛津免疫技術公司應用ELISpot技術研發了一個T SPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒，是通過ESAT6多肽和CFP10多肽分別刺激 外周血中T淋巴細胞，然後檢測分泌IFN-Y的外周血T淋巴細胞。該實驗不受卡介 苗接種和環境分枝桿菌感染的影響，其檢測的靈敏度和特異性高，但其採用2種 抗原的一系列合成多肽作為刺激抗原，使試劑盒的成本高，檢測費用高，而難以 廣泛推廣應用。本發明與其不同，是採用結核分枝桿菌特異性CFP10—ESAT6融合 抗原刺激受檢者外周血T淋巴細胞，使其分泌特異性IFN-Y ，然後通過ELISpot檢 測，整個過程需2天時間，可了解受檢者是否感染結核菌，並輔助結核病診斷。 其檢測結核菌感染的靈敏度和特異性均顯著高於PPD皮試法，與英國的T SPOT-TB 相當，但其CFP10—ESAT6融合抗原為基因工程重組蛋白，製備簡便、價廉，並使 檢測孔數減少，檢測費用較低。 發明內容本發明的目的之一是為克服已有技術的不足，提供靈敏度高、特異性強的重 組融合蛋白抗原作為細胞刺激劑，組成ELISpot結核感染診斷試劑盒，用於檢測 外周血中分泌結核特異性IFN-Y的T淋巴細胞，提高結核感染檢測的靈敏度和特 異性，輔助結核病的診斷和鑑別診斷。本發明的目的是通過以下技術方案達到的—種ELISpot結核感染診斷試劑盒，含有96孔濾膜板、IFN-r捕獲抗體、牛 血清白蛋白(BSA) 、 CFP10—ESAT6融合蛋白、生物素標記的IFN-r檢測抗體、親和素-鹼性磷酸酶結合物、底物液氮藍四唑和5-溴-4-氯-3』引哚磷酸，其特徵在 於所述CFP10—ESAT6融合抗原的胺基酸序列如下AAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATEL麗ALQNLARTISEAGQAMASTEGNVT GMFA。本發明的另一 目的是提供ELISpot結核感染診斷試劑盒在檢測結核感染的應用。本發明的上述目的是通過以下技術方案達到的一種ELISpot結核感染診斷試劑盒在檢測結核感染的應用，其特徵在於，包 括以下步驟(一) 、包被(1) 96孔濾膜板中加入1 : 60稀釋的IFN-r捕獲抗體100pL/孔，加蓋，37'C孵 育l一2h或4'C過夜；(2) 棄包被液，用無菌的磷酸鹽緩衝液(PBS)洗板3次，3min/次；(3) 每孔加200 nL含l^一3X牛血清白蛋白的PBS，加蓋，37。C孵育l一2h;(4) 棄上清液，將板直接用於檢測；或放於密封袋中，置4'C保存，l周內使 用；(二) 、檢測(1) 取4-5ml血液加入含肝素鈉或檸檬酸鈉的採血管，在採集血液後顛倒 混勻5次以上，得到抗凝血；(2) 實驗前將含抗凝血的釆血管顛倒混勻5次以上避免血液分層，按1:1-1:3的比例將抗凝血緩緩加入到含淋巴細胞分層液的無菌離心管中，形成明顯界面, 在室溫下2000-3000rpm離心20-30min;(3) 可見外周血單個核細胞(PBMC)存在於雲霧狀層中，用無菌滴管吸 取淋巴細胞層至一乾淨的離心管中；(4) 加入8ml預熱至37'C的無血清1640培養液，混懸後，於室溫2000rpm離 心10min;(5) 棄去上清培養液，加入6ml預熱至37'C的無血清1640培養液重懸沉澱細胞，於室溫1500rpm離心8min;(6) 棄去上清洗液，加入400^il預熱至37。C的含10^小牛血清的1640培養液 重懸沉澱細胞，取10 pl細胞懸液加入40pl臺酚藍，取10pl臺酚藍混合細胞液加入 血球計數板，在顯微鏡下計數，計數每ml懸液細胞數量，用預熱至37"C的含10X 小牛血清的1640培養液稀釋細胞懸液至2xl(^細胞/ml;(7) 在上述包被的96孔濾膜板中加入下列試劑50 pl培養液至每個陰性對 照孑U 50 pl 60pg/mL的植物血凝素至每個陽性對照孑L; 50 pl 30pg/mL至12(^g/mL 的CFP10—ESAT6融合蛋白至每個檢測孔；(8) 每孔加入10(Hil細胞懸液；(9) 將96孔濾膜板放入溼潤的培養箱在37。C、 5%C02培養18—24小時；(10) 將96孔濾膜板取出，棄培養上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板 後鬼幹；(11) 在每個孔中加入IOO pl用含l一3X牛血清白蛋白的PBS稀釋成1:60的 生物素標記的IFN-r檢測抗體，置37。C孵育1小時；(12) 孵育後用PBS洗板3次，3min/次，洗板後甩幹，加入IOO pl用PBS 1:1000 倍稀釋的親和素-鹼性磷酸酶結合物，置37。C孵育2小時；(13) 每孔加入100pl底物液氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-n引哚磷酸，放置於室溫 閉光顯色；(14) 在96孔濾膜板中加入純淨水終止反應，室溫下過夜或37。C烤箱中2-3 小時烘乾96孔濾膜板；(15) 使用放大鏡或倒置顯微鏡計數每個反應空孔中紫色的斑點，每一個點 代表一個分泌Y幹擾素的T細胞；或將96孔濾膜板放入ELISpot分析儀中，對實驗 結果進行掃描和分析；(16)結果判定如果陰性對照孔斑點數為0 — 5個斑點，檢測孔斑點數減 去陰性對照孔斑點數26判定為陽性；如果陰性對照孔斑點數26個斑點，測試孔斑 點數必須22倍的陰性對照孔斑點數才判定為陽性。本發明的特點及技術效果本發明通過基因工程技術克隆、表達、純化結核 分枝桿菌重組CFP10-ESAT6融合蛋白，作為細胞刺激劑，製備ELTSpot結核感染診斷試劑盒。而現有技術則無此類抗原試劑盒。英國牛津免疫技術公司應用 ELISpot技術研發的T SPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒，是通過ESAT6多肽和CFP10多肽分別刺激外周血中T淋巴細胞，然後檢測分泌IFN-y的外周血 T淋巴細胞。該試劑盒採用2種抗原的一系列合成多肽作為刺激抗原，而且需用 2個檢測孔，使試劑盒的成本高，檢測費用高，而難以廣泛推廣應用。本發明與 其不同，是採用結核分枝桿菌特異性CFP10—ESAT6融合蛋白刺激受檢者外周血 T淋巴細胞，使其分泌特異性IFN-y，然後通過ELISpot檢測，整個過程需2天 時間，可用於結核病細胞免疫診斷，了解受檢者是否感染結核菌，並輔助結核病 診斷和鑑別診斷。本發明檢測結核菌感染的靈敏度和特異性均顯著高於PPD皮試 法，靈敏度高於英國的T SPOT-TB試劑盒，特異性與英國的T SPOT-TB相當。 本發明的關鍵試劑結核分枝桿菌CFP10—ESAT6融合蛋白是通過基因工程技術 克隆、篩選高表達的基因工程菌株表達、純化所獲得，製備簡便、價廉，可大規 模生產，成本相對較低，而且只需1個檢測孔，檢測費用較低。CFP10—ESAT6 融合蛋白在CFP10和ESAT6的胺基酸之間連接了一段由12個甘氨酸和3個絲氨 酸組成的連接臂，使CFP10—ESAT6融合蛋白中的CFP10和ESAT6肽段能保持 相對獨立的空間構象，能更好地曝露CFP10和ESAT6各自的抗原決定簇，維持原有蛋白特異的抗原性。下面通過附圖和具體實施方式
對本發明做進一步說明，但並不意味著對本發 明保護範圍的限制。


圖1為對比例1應用T SPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒檢測志願者 李某的結果。圖2為本發明的CFP10-ESAT6融合蛋白在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE結果。 圖3為本發明的CFP10-ESAT6基因工程菌超聲破碎後的上清液和包涵體的 SDS-PAGE結果。圖4為本發明的純化的CFP10-ESAT6融合蛋白的SDS-PAGE結果。 圖5為本發明實施例1中應用ELISpot結核感染診斷試劑盒檢測志願者李某 的結果。圖6為對比例2應用T SPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒檢測王某的 結果。圖7為本發明實施例2中應用ELISpot結核感染診斷試劑盒檢測王某的結果。 圖8為對比例3中應用T SPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒檢測吳某 的結果。圖9為本發明實施例3中應用ELISpot結核感染診斷試劑盒檢測吳某的結果。 圖10對比例4中應用T SPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒檢測章某的結果。圖11為本發明實施例4中應用E:LISpot結核感染診斷試劑盒檢測章某的結果。
具體實施方式
具體實施方式
對比例l採用英國牛津免疫技術公司的T SPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒和 PPD皮膚試驗檢測來自解放軍總醫院第二附屬醫院健康的志願者李某，男，25歲。一、 採用英國牛津免疫技術公司的T SPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑 盒進行檢測1. 人外周血單個核淋巴細胞的分離和培養抽取志願者李某靜脈血4ml， 放入肝素抗凝管中，輕輕顛倒混勻後，加在淋巴細胞分離液上方，於3000rpm離 心20分鐘；吸取白色的單個核細胞層，用8ml預熱至37。C的無血清1640培養液， 混懸後，於室溫2000rpm離心10min;重複l次；棄去上清液，加入400ri預熱至37'C 的含10%小牛血清的1640培養液重懸沉澱細胞，計數細胞數後，用含10%小牛血 清的1640培養液調整細胞至2xle細胞/ml。2. 在96孔濾膜板的陰性對照孔內加入50 iiL無血清培養液；在陽性對照 孔內加入50 wL陽性對照試劑；在A測試孔內加入結核桿菌混合多肽A;在B測試 孔內加入結核桿菌混合多肽B。3. 每份樣品在陰性對照、陽性對照、測試孔A和測試？LB內分別加入IOO uL含有2xl5個外周單核細胞。4. 將96孔濾膜板放入5% C02培養箱在37。 C培養18小時。5. 每孔加入200 y LPBS洗板4次。6. 加入50 u L新鮮配製的工作濃度標記抗體。7. 在4 ° C孵育60分鐘。8. 每孔加入200 u LPBS洗板4次。9. 加入50 y L氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸底物液。10. 室溫避光反應7分鐘。11. 用雙蒸水洗漆細胞培養孔。12. 將板放在37。 C烘箱中乾燥。13. 將96孔濾膜板放入美國CTL公司的ELISpot分析儀中，對實驗結果進行 掃描和分析。14. 結果顯示檢測孔A和檢測孔B的斑點數均為1，為陰性，說明無結核菌感 染，見圖l。圖1中的數字表示96孔濾膜板中的酶聯免疫斑點數目(下同)。二、 PPD皮膚試驗1. 吸取結核PPD試劑O.lml，皮內注射於志願者李某前臂掌側中央；2. 注射後72小時測量、記錄注射部位皮下硬結的縱、橫直徑，並記錄有 無異常反應；3. 結果皮膚反應硬結平均直徑〈5mra，為陰性反應，說明無結核菌感染。 實施例1一、 一種ELISpot結核感染診斷試劑盒的製備方法(一)通過基因工程技術製備CFP10—ESAT6融合蛋白1、 引物設計與合成 cfplO引物設計Pl(上遊)5， -CCGGATCCATGGCAGAGATGMGAC-3， P2(下遊)5' -GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACC GMGCCCATTTGCGAGGACAGCGCCT-3 ， 擴增片段353 bp esat6引物設計 P3(上遊)5' -GGTGGCGGTGGMGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCATGACAGAGCAGCAGTGGMTTTCGCGG-3' P4(下遊)5， -CC AAGCTTTGCGAACATCCCAGTGA-3， 擴增片段338bp2、 PCR擴增cfp10和esat6基因分別用Pl、 P2和P3、 P4引物，在Taq plti s I DNA聚合酶的作用下，以 結核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，擴增CFP10和ESAT6基因。PCR反應程 序95°C 5min; 94°C 20sec， 60°C 20sec， 72°C 2min，循環25次；最後72°C 延伸7min。於1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定353 bp (cfp10)、 338bp (esat6)的擴增 DNA片段；回收這2個片段，分別取lul回收片段作為模板，以P1和P4為引 物擴增，於1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定681bp的擴增咖A片段。3、 回收目的基因片段瓊脂糖凝膠電泳結束後，在長波紫外線照射下，用乾淨的手術刀片在膠上切 下要回收DNA的瓊脂塊，放入無菌的離心管中。參照瓊脂糖DNA回收試劑盒中的 說明書回收目的基因片段，具體方法如下向管中加入等體積的溶膠液(約0.4ml)，直至瓊脂糖完全融化；向管中加 入0.6ml瓊脂糖DNA純化樹脂，充分混勻；將注射器插入微量離心柱擰緊，拔出 注射器活塞，將樹脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，緩慢用力向下壓，排 出所有的液體和氣體；從微量離心柱上拔掉注射器，拔出注射劑活塞，將注射器 插入微量離心柱擰緊，將2ml I型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞緩慢用 力向下壓，排出所有的液體和氣體；取下微量離心柱，將微量離心柱插入一個新 的1.5ral離心管擰緊，向離心柱中加入150WII型柱子清洗液，離心1200rpm 2-3min以清洗和乾燥樹脂；將微量離心柱插入一個新的1. 5ml離心管擰緊，向 離心柱中加入40W TE緩衝液，靜置一分鐘，12，000rpm離心20s;回收DNA洗 脫液，定量，濃度約為50ng/W。貯存於-2(TC備用。4、 目的基因與pGEM-T載體連接參照Promega公司pGEM-T vector System- I產品說明，將50ng純化後的 PCR產物與克隆載體pGEM-T連接，目的基因片段與載體片斷按摩爾比3:1混合， 10 ul反應體系如下2X連接緩衝液 5H1pGEM-T載體PCR產物 0. T4 DNA連接酶 1W無菌水補至 10 w混勻後置於4'C冰箱反應12h， 75'C滅活10min，冰浴後直接進行轉化。 5.大腸桿菌DH5a和大腸桿菌BL21( DE3)感受態細胞的製備 挑取大腸桿菌DH5a (或BL21)單菌落接種於5ml LB培養液中，置37。C振 蕩培養箱中於200rpm培養過夜；次晨按1/100轉種於100ml LB培養液中，置37'C 振蕩培養箱中於200rpm繼續培養2-3h,待菌濃度OD柳為0.6-0.8時，放入用冰 預冷的大離心管中，於4°C、 4000rpra、離心10min，棄上清；20 ml冰預冷的 0. lmol/LCaQ2重懸菌沉澱，冰浴30min; 4。C、 6000rpm、離心10min，棄上清； 用4ml 0. lmol/L CaC12重懸菌沉澱，置4'C冰箱放置過夜；次晨加入1 ml無菌 甘油，吹打混合均勻，每分裝於一個1. 5ml的離心管中，置-70'C保存備用o° 6.連接產物的轉化將目的基因片段與PGEM-T的連接產物各分別加入含有大腸桿菌 DH5a感受態細胞的離心管中，冰浴0.5h;放入42'C水浴箱熱休克90s，迅速取 出冰浴2 min;加入LB培養液400W， 37'C恆溫搖床培養1 h;加入X-Gal 60W， IPTG 414，混勻，取出200—400W塗布於含有60ii g/ml氨苄青黴素的LB平板 上。倒置平板，放37'C恆溫培養箱培育14 h。 7.質粒的提取根據藍白斑篩選，隨機挑取白色菌落5個，分別接種於5 ml含有60Pg/ml 氨苄青黴素的LB培養基中，置37。C振蕩培養過夜；根據《分子克隆》鹼裂解方 法，小量提取質粒。(1) 質粒小量提取試劑的配製 溶液I : 50 ramol/L葡萄糖25隨1/L Tris CL ( pH 8. 0 ) 10咖ol/L EDTA ( pH 8. 0 )在10 lbf/in2 ( 6.895X104 Pa )高壓下蒸汽滅菌15分鐘；儲存於rc備用。溶液II: 0.2 mmol/L NaOH， 1% SDS 臨用前配製 溶液III: 5 mol/L乙酸鉀60 iml 冰乙酸 11.5 ml去離子水 28. 5 ml' 貯存於4。C,備用。(2) 小量提取質粒分別取約3.0 ml菌液置離心管中，於12， OOOrpm離心1 min，棄上清；細 菌沉澱重懸於200 W溶液I中，冰浴10min;加400 W新配製的溶液II ，冰浴 5 min;力H 300 W溶液III，冰浴10 min;於4'C 12， OOOrpm離心10 min;上清液移入乾淨的離心管中，加等體積酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍體積的無 水乙醇充分混合，於-20'C放置2h沉澱DNA;於4。C 12， 000rpra離心10 min，棄 上清；用lml 70%乙醇洗滌沉澱一次，室溫充分乾燥；將沉澱溶於20W TE緩衝 液中，加入無DNA酶的胰RNA酶，使其終濃度為2(Hig/ml，於37'C水浴30 min， 消化RNA;取2 進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、定量，置一20'C儲存備用。8.鑑定重組質粒(1) PCR擴增鑑定以挑選的菌落質粒DNA為模板，以Pl和P4引物進行 PCR擴增，擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，陽性重組質粒命名為 PGEM-CFP10-ESAT6。(2) 酶切鑑定取重組質粒5Ml，分別用限制性內切酶BamH I和Hind III 雙酶切2h;於1%瓊脂糖凝膠中電泳。以DNA分子量標準及擴增產物為對照，酶 切後的片斷與擴增片斷一致。(3)序列測定直接挑選一個克隆送測序。測序結果與報導的基因組序列一致。9. 重組表達質粒的構建用限制性內切酶BamH I及HindUI雙酶切pGEM-CFP10-ESAT6重組質粒DNA 和表達載體pET28a質粒DNA，於1%瓊脂糖凝膠中電泳，切取630bp的CFP10-ESAT6 基因片段和5. 344kb的pET28a質粒DNA片段，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒純 化。定量後，CFP10-ESAT6基因片段與pET28a質粒DNA片段按2 : 1的摩爾比混 合，在L DNA連接酶催化下，於16。C連接過夜，次日取連接產物轉化大腸 桿菌DH5a感受態細胞，置37。C恆溫箱孵育14h。挑選4個克隆分別轉種於5ml 含50ng/nil硫酸卡那黴素的LB培養液中，置37。C恆溫振蕩器培養過夜，用鹼裂 解法提取質粒。10. 重組表達質粒的鑑定分別用牙籤隨機調取7個克隆，提取質粒，採用PCR擴增和雙酶切鑑定方法 挑選重組子；鑑定正確的陽性克隆命名為pET28a-CFP10-ESAT6。 11、 pET28a-CFP10-ESAT6工程菌的誘導表達及鑑定將pET28a-CFP10-ESAT6質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑單克隆轉種於 5ml含50ug/ml硫酸卡那黴素的LB培養液中，置37'C恆溫振蕩器培養過夜，然 後按1%轉種到10 ml含5(^g/ral硫酸卡那黴素的LB培養液中，置37'C恆溫振 蕩器培養至0D6。。為0.6 — 0.8時，加入:[PTG，誘導3—4hr。將1X載樣緩衝液15(mi加入來自linl菌液的沉澱樣本二混懸後，置IOO'C 沸水浴5min，於12000rpm離心10 min,,取上清液40 Pl進行SDS-PAGE，電泳條 件為積層膠恆流lOmA，分離膠恆壓15mA，待溴酚藍電泳至凝膠底部，停止電 泳。用考馬斯亮藍R250染色液染色6h;用脫色液脫色至條帶清晰，觀察是否有 目的蛋白表達條帶。應用0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0和1.2mM濃度的IPTG誘導， pET28a-CFP10-ESAT6大腸桿菌工程菌的蛋白表達量無明顯區別(見圖2)。與對 照菌pET28a-BL21(DE3)相比，pET28a-CFPIO-ESAT6-BL21 (DE3)菌體在相對分子 質量28kDa位置附近有濃重的表達條帶出現，誘導3-4h表達量最多。將誘導菌超聲破碎後的上清液和沉澱部分進行SDS-PAGE,重組蛋白均出現 在破碎的上清中，沉澱極少，說明該重組蛋白主要以可溶性形式表達(圖3)。圖2中的1表示含pET-28a載體質粒的大腸桿菌IPTG誘導後；2 —8表示含 pET28a-CFPIO-ESAT6重組質粒的大腸桿菌IPTG誘導濃度分別為0. 1、 0. 2、 0. 4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2mM; 9表示蛋白分子量標準(175、 83、 62、 48、 33、 25、 17、 7kDa )。圖3中的1表示含pET-28a質粒細菌IPTG誘導；2表示含 pET28a-CFPIO-ESAT6重組子細菌未誘導；3表示pET28a-CFP10-ESAT6重組子細 菌IPTG誘導；4表示CFPIO-ESAT6基因工程菌超聲破碎後上清液；5、 6表示 CFPIO-ESAT6基因工程菌超聲破碎後包涵體；7、 8表示純化的CFPIO-ESAT6融合 蛋白；9表示蛋白分子量標準(175、 83、 62、 48、 33、 25、 17、 7kDa )。12. CFPIO-ESAT6重組蛋白的純化採用Novagen公司生產的His. Bind蛋白純化試劑盒按試劑盒說明書直接純 化CFPIO-ESAT6融合蛋白，SDS-PAGE電泳可見純化的CFPIO-ESAT6融合蛋白呈一條帶，未見其他雜蛋白(見圖4)。圖4中，1表示IPTG誘導的含pET-28a質粒的大腸桿菌；2表示IPTG誘導的含 pET28a-CFP10-ESAT6重組質粒的大腸桿菌；3表示未誘導的含pET28a-CFP10-ESAT6 重組質粒的大腸桿菌；4表示純化的CFP10-ESAT6融合蛋白。 二、應用ELISpot結核感染診斷試劑盒進行檢測採用本發明提供的ELISpot結核感染診斷試劑盒檢測來自解放軍總醫院第二 附屬醫院健康的志願者李某，男，25歲。 (一)包被1. 96孔濾膜板中加入l : 60稀釋的IFN-r捕獲抗體100Wy L，加蓋，置 4'C過夜。2. 棄包被液，無菌PBS洗板3次，3min/次；3. 每孔加200叱含1X牛血清白蛋白的PBS，加蓋，37。C孵育l h。4. 棄上清液，將板直接用於檢測。1. 取4ml血液加入含肝素鈉的釆血管，在採集血液後和實驗前顛倒混勻5次 以上避免血液分層；2. 按l:l的比例將抗凝血緩緩加入到含淋巴細胞分層液的無菌離心管中， 形成明顯界面，在室溫下3000rpm離心20min;3. 可見外周血單核細胞存在於雲霧狀層中，用無菌滴管吸取淋巴細胞層至 一乾淨的離心管中；4. 加入8ml預熱至37。C的無血清1640培養液，混懸後，於室溫2000 rpm離心 10min;5. 棄去上清培養液，加入6ml預熱至37t:的無血清1640培養液重懸沉澱細胞， 於室溫1500 rpm離心8min;6. 棄去上清洗液，加入400W預熱至37t:的含10X小牛血清的1640培養液重 懸沉澱細胞，取IO W細胞懸液加入40W臺酚藍，取10W臺酚藍混合細胞液加入 血球計數板，在顯微鏡下計數，計數每ml懸液細胞數量，用預熱至37'C的含10X 小牛血清的1640培養液稀釋細胞懸液至2xl6細胞/ml;7. 在上述包被的96孔濾膜板中加入下列試劑50 W培養液至每個陰性對照 孔；50 Pl 60^/mL的植物血凝素至每個陽性對照孔；50 W 304g/mL的CFP10 — ESAT6融合蛋白至每個檢測孔；8. 每孔加入100W細胞懸液；9. 將96孔濾膜板放入溼潤的培養箱在37。 C、 5 % C02培養18小時。10. 將96孔濾膜板取出，棄培養上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板後甩幹；11. 在每個孔中加入100 W用含"/。牛血清白蛋白的PBS稀釋成1:60的生物素 標記的IFN-r檢測抗體，置37° C孵育l小時；12. 孵育後用PBS洗板3次，3min/次，洗板後甩幹，加入IOO W用PBS 1:1000 倍稀釋的親和素-鹼性磷酸酶結合物，置37° C孵育2小時；13. 每孔加入IOO W底物液氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置於室溫 閉光顯色；14. 在96孔濾膜板中加入純淨水終止反應，置37° C烤箱中2小時烘乾培養板； 15.將96孔濾膜板放入ELISpot分析儀中，對實驗結果進行掃描和分析。結果顯示檢測孔斑點數為3，為陰性，說明無結核菌感染，見圖5。 對比例2採用英國牛津免疫技術公司的T SP0T-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒檢 測來自解放軍總醫院第二附屬醫院消化內科住院患者王某，女，36歲，住院號 241298，診斷幽門不完全梗阻。一採用英國牛津免疫技術公司的T SPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒 進行檢測1. 人外周血單個核淋巴細胞的分離和培養抽取王某靜脈血5ml，放入肝素 抗凝管中，輕輕顛倒混勻後，加在淋巴細胞分離液上方，於3000rpm離心 20分鐘；吸取白色的單個核細胞層，用8ml預熱至37。C的無血清1640培養 液，混懸後，於室溫2000rpm離心10min;重複l次；棄去上清液，加入400W 預熱至37。C的含10X小牛血清的1640培養液重懸沉澱細胞，計數細胞數 後，用含10%小牛血清的1640培養液調整細胞至2><106細胞/1111。2. 在96孔濾膜板的陰性對照孔內加入50 uL無血清培養液；在陽性對照孔 內加入50 nL陽性對照試劑；在A測試孔內加入結核桿菌混合多肽A;在B 測試孔內加入結核桿菌混合多肽B。3. 每份樣品在陰性對照、陽性對照、測試 LA和測試孔B內分別加入IOO uL 含有2xl5個外周單核細胞。4. 將96孔濾膜板放入5% C02培養箱在37。 C培養24小時。5. 每孔加入200 ii LPBS洗板4次。6. 加入50 ixL新鮮配製的工作濃度標記抗體。7. 在4 ° C孵育60分鐘。8. 每孔加入200 u LPBS洗板4次。9. 加入50 uL底物液氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。10. 室溫避光反應7分鐘。11. 用雙蒸水洗滌細胞培養孔。12. 將板放在37。 C烘箱中乾燥。13. 將96孔濾膜板放入美國CTL公司的ELISpot分析儀中，對實驗結果進行 掃描和分析。14.結果顯示檢測孔A和檢測孔B的斑點數均為1，為陰性，說明無結核菌感染，見圖6。 實施例2應用ELISpot結核感染診斷試劑盒進行檢測採用本發明提供的ELISpot結核感染診斷試劑盒檢測來自解放軍總醫院第二 附屬醫院消化內科住院患者王某，女，36歲，住院號241298，診斷幽門不完 全梗阻。(一) 包被1. 96孔濾膜板中加入1 : 60稀釋的IFN-r捕獲抗體100叱/孔，加蓋，37°C 孵育lh;2. 棄包被液，用無菌的磷酸鹽緩衝液(PBS)洗板3次，3min/次；3. 每孔加200叱含3X牛血清白蛋白的PBS，加蓋，37。C孵育2h;4. 棄上清液，將板放於密封袋中，置4'C保存1天；(二) 檢測1. 取5ml血液加入含肝素鈉的採血管，在採集血液後和實驗前顛倒混勻5次以上避免血液分層；2. 按1:3的比例將抗凝血緩緩加入到含淋巴細胞分層液的無菌離心管中， 形成明顯界面，在室溫下2500rpm離心25min;3. 可見外周血單核細胞(PBMC)存在於雲霧狀層中，用無菌滴管吸取淋巴 細胞層至一乾淨的離心管中；4. 加入8ml預熱至37。C的無血清1640培養液，混懸後，於室溫2000 rpm離心 10min;5. 棄去上清培養液，加入6ml預熱至37'C的無血清1640培養液重懸沉澱細胞， 於室溫1500 rpm離心8min;6. 棄去上清洗液，加入400W預熱至37。C的含1Q^小牛血清的1640培養液重 懸沉澱細胞，取IO W細胞懸液加入40W臺酚藍，取10W臺酚藍混合細胞液加入 血球計數板，在顯微鏡下計數，計數每ml懸液細胞數量，用預熱至37'C的含10X 小牛血清的1640培養液稀釋細胞懸液至2xl6細胞/ml;7. 在上述包被的96孔濾膜板中加入下列試劑50 W培養液至每個陰性對照 孔；50 W 60Pg/mL的植物血凝素至每個陽性對照孔；50 W 12(mg/mL的CFP10 — ESAT6融合蛋白至每個檢測孔；8. 每孔加入100W細胞懸液；9. 將96孔濾膜板放入溼潤的培養箱在37。 C、 5 % C02培養24小時。10. 將96孔濾膜板取出，棄培養上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板後甩幹；11. 在每個孔中加入IOO W用含2X牛血清白蛋白的PBS稀釋成1:60的生物素 標記的IFN-r檢測抗體，置37° C孵育l小時；12. 孵育後用PBS洗板3次，3min/次，洗板後甩幹，加入IOO W用PBS 1:1000 倍稀釋的親和素-鹼性磷酸酶結合物，置37° C孵育2小時；13. 每孔加入IOO W底物液氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置於室溫 閉光顯色；14. 在96孔濾膜板中加入純淨水終止反應，室溫下過夜涼幹96孔濾膜板；15. 將96孔濾膜板放入ELISpot分析儀中，對實驗結果進行掃描和分析。 結果顯示檢測孔斑點數為l，為陰性，說明無結核菌感染，見圖7。 對比例3採用英國牛津免疫技術公司的T SPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒和 結核PPD皮膚試驗檢測來自解放軍總醫院第二附屬醫院神經內科住院患者吳某， 男，81歲，住院號108764，診斷L腦梗塞；2.高血壓病III級。一、 採用英國牛津免疫技術公司的T SP0T-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒進 行檢測1. 人外周血單個核淋巴細胞的分離和培養抽取吳永福靜脈血4ml，放入肝 素抗凝管中，輕輕顛倒混勻後，加在淋巴細胞分離液上方，於3000rpm離心20分 鍾；吸取白色的單個核細胞層，用8ml預熱至37。C的無血清1640培養液，混懸後， 於室溫2000rpm離心10min;重複l次；棄去上清液，加入400W預熱至37'C的含10 0%小牛血清的1640培養液重懸沉澱細胞，計數細胞數後，用含10%小牛血清的 1640培養液調整細胞至2xle細胞/ml。2. 在96孔濾膜板的陰性對照孔內加入50 yL無血清培養液；在陽性對照孔 內加入50 uL陽性對照試劑；在A測試孔內加入結核桿菌混合多肽A;在B測試孔 內加入結核桿菌混合多肽B。3. 每份樣品在陰性對照、陽性對照、測試孔A和測試孑LB內分別加入IOO uL 含有21105個外周單核細胞。4. 將96孔濾膜板放入5% C02培養箱在37。 C培養20小時。5. 每孔加入200ixLPBS洗板4次。6. 加入50 uL新鮮配製的工作濃度標記抗體。7. 在4° C孵育60分鐘。8. 每孔加入200 u LPBS洗板4次。9. 加入50 UL底物液氮藍四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。10. 室溫避光反應7分鐘。11. 用雙蒸水洗滌細胞培養孔。12. 將板放在37。 C烘箱中乾燥。13. 將96孔濾膜板放入美國CTL公司的ELISpot分析儀中，對實驗結果進行 掃描和分析。H. 結果顯示檢測孔A的斑點數為44，檢測孔B的斑點數為107，為陽性，說明 有結核菌感染，見圖8。二、 PPD皮膚試驗I. 吸取結核PPD試劑0. lml，皮內注射於吳某前臂掌側中央；2. 注射後72小時測量、記錄注射部位皮下硬結的縱、橫直徑，並記錄 有無異常反應；3. 結果皮膚反應硬結平均直徑18mm，為陽性反應，說明有結核菌感染。 實施例3應用ELISpot結核感染診斷試劑盒進行檢測採用ELISpot結核感染診斷試劑盒檢測來自解放軍總醫院第二附屬醫院神經 內科住院患者吳某，男，81歲，住院號108764，診斷l.腦梗塞；2.高血壓病 III級。(一) 包被1. 96孔濾膜板中加入1 : 60稀釋的IFN-r捕獲抗體100叱/孔，加蓋，37'C 孵育2h;2. 棄包被液，用無菌的磷酸鹽緩衝液(PBS)洗板3次，3min/次；3. 每孔加200叱含2X牛血清白蛋白的PBS，加蓋，37。C孵育2h;4. 棄上清液，將板放於密封袋中，置4。C保存1周；(二) 檢測1. 取4ml血液加入含肝素鈉的採血管，在採集血液後和實驗前顛倒混勻5次 以上避免血液分層；2. 按1:2的比例將抗凝血緩緩加入到含淋巴細胞分層液的無菌離心管中， 形成明顯界面，在室溫下3000rpm離心25min;3. 可見外周血單核細胞(PBMC)存在於雲霧狀層中，用無菌滴管吸取淋巴細胞層至一乾淨的離心管中；4. 加入8ml預熱至37t:的無血清1640培養液，混懸後，於室溫2000 rpra離心 10min;5. 棄去上清ii養液，加入6ml預熱至37。C的無血清1640培養液重懸沉澱細胞， 於室溫1500 rpm離心8min;6. 棄去上清洗液，加入400W預熱至37'C的含10X小牛血清的1640培養液重 懸沉澱細胞，取IO W細胞懸液加入40Pl臺酚藍，取10W臺酚藍混合細胞液加入 血球計數板，在顯微鏡下計數，計數每ml懸液細胞數量，用預熱至37"的含10% 小牛血清的1640培養液稀釋細胞懸液至2xl06細胞/ral;7. 在上述包被的96孔濾膜板中加入下列試劑50 W培養液至每個陰性對照 孔；50 W 60Pg/mL的植物血凝素至每個陽性對照孔;50 W 60Pg/mL的CFP10 — ESAT6融合蛋白至每個檢測孔；8. 每孔加入100W細胞懸液；9. 將96孔濾膜板放入溼潤的培養箱在37。 C、 5 % C02培養20小時。10. 將96孔濾膜板取出，棄培養上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板後甩幹；11. 在每個孔中加入IOO 14用含2X牛血清白蛋白的PBS稀釋成1:60的生物素 標記的IFN-r檢測抗體，置37° C孵育l小時；12. 孵育後用PBS洗板3次，3min/次，洗板後甩幹，加入IOO W用PBS 1:1000 倍稀釋的親和素-鹼性磷酸酶結合物，置37° C孵育2小時；13. 每孔加入IOO Pl底物液氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置於室溫 閉光顯色；14. 在96孔濾膜板中加入純淨水終止反應，置37° C烤箱中3小時烘乾96孔濾 膜板；15.將96孔濾膜板放入ELISpot分析儀中，對實驗結果進行掃描和分析。 結果顯示檢測孔斑點數為28，為陽性，說明有結核菌感染，見圖9。 對比例4採用英國牛津免疫技術公司的T SPOT-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒檢 測來自解放軍總醫院第二附屬醫院結核2科住院患者章某，男，43歲，住院號 801202，診斷月市結核。採用英國牛津免疫技術公司的T SP0T-TB結核感染T細胞斑點實驗試劑盒 進行檢測1. 人外周血單個核淋巴細胞的分離和培養抽取章某靜脈血5ml，放入肝 素抗凝管中，輕輕顛倒混勻後，加在淋巴細胞分離液上方，於3000rpm離心20分 鍾；吸取白色的單個核細胞層，用8ml預熱至37'C的無血清1640培養液，混懸後， 於室溫2000rpm離心10rain;重複l次；棄去上清液，加入400W預熱至37'C的含10 %小牛血清的1640培養液重懸沉澱細胞，計數細胞數後，用含10%小牛血清的 1640培養液調整細胞至2xl0e細胞/ml。2. 在96孔濾膜板的陰性對照孔內加入50 HL無血清培養液；在陽性對照 孔內加入50 uL陽性對照試劑；在A測試孔內加入結核桿菌混合多肽A;在B測試 孔內加入結核桿菌混合多肽B。3. 每份樣品在陰性對照、陽性對照、測試孔A和測試孔B內分別加入IOO y L含有2xl5個外周單核細胞。4. 將96孔濾膜板放入5% C02培養箱在37。 C培養22小時。5. 每孔加入200 u LPBS洗板4次。6. 加入50 u L新鮮配製的工作濃度標記抗體。7. 在4 ° C孵育60分鐘。8. 每孔加入200 u LPBS洗板4次。9. 加入50 uL氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸底物液。10. 室溫避光反應7分鐘。11. 用雙蒸水洗滌細胞培養孔。12. 將板放在37。 C烘箱中乾燥。13. 將96孔濾膜板放入美國CTL公司的ELISpot分析儀中，對實驗結果進行 掃描和分析。14. 結果顯示檢測孔A的斑點數為66，檢測孔B的斑點數為ll，為陽性，說 明有結核菌感染，見圖io。實施例4應用ELISpot結核感染診斷試劑盒進行檢測採用ELISpot結核感染診斷試劑盒檢測來自解放軍總醫院第二附屬醫院結核 2科住院患者章某，男，43歲，住院號801202，診斷肺結核。(一)包被-1. 96孔濾膜板中加入l : 60稀釋的IFN-r捕獲抗體100叱/孔，加蓋，置 4'C過夜。2. 棄包被液，無菌PBS洗板3次，3min/次；3. 每孔加200叱含3X牛血清白蛋白的PBS，加蓋，37。C孵育l h;4. 棄上清液，將板放於密封袋中，置4'C保存1天； (二)檢測1. 取5ml血液加入含肝素鈉的採血管，在釆集血液後和實驗前顛倒混勻5次以上避免血液分層；2. 按1:2的比例將抗凝血緩緩加入到含淋巴細胞分層液的無菌離心管中， 形成明顯界面，在室溫下3000rpm離心30min;3. 可見外周血單核細胞存在於雲霧狀層中，用無菌滴管吸取淋巴細胞層至 一乾淨的離心管中；4. 加入8ml預熱至37。C的無血清1640培養液，混懸後，於室溫2000 rpm離心 10min;5. 棄去上清培養液，加入6ml預熱至37'C的無血清1640培養液重懸沉澱細胞， 於室溫1500 rpm離心8min;6. 棄去上清洗液，加入40(^1預熱至37°(:的含10%小牛血清的1640培養液重 懸沉澱細胞，取IO W細胞懸液加入4(Htl臺酚藍，取10W臺酚藍混合細胞液加入 血球計數板，在顯微鏡下計數，計數每ml懸液細胞數量，用預熱至37匸的含10% 小牛血清的1640培養液稀釋細胞懸液至2xl6細胞/ml;7. 在上述包被的96孔濾膜板中加入下列試劑50 W培養液至每個陰性對照 孔；50 W 60Hg/mL的植物血凝素至每個陽性對照孔；50 Pl 100Pg/mL的CFP10 — ESAT6融合蛋白至每個檢測孔8. 每孔加入100W細胞懸液；9. 將96孔濾膜板放入溼潤的培養箱在37。 C、 5 % C02培養22小時。10. 將96孔濾膜板取出，棄培養上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板後甩幹；11. 在每個孔中加入IOO W用含3X牛血清白蛋白的PBS稀釋成1:60的生物素 標記的IFN-r檢測抗體，置37° C孵育l小時；12. 孵育後用PBS洗板3次，3min/次，洗板後甩幹，加入IOO W用PBS 1:1000 倍稀釋的親和素-鹼性磷酸酶結合物，置37° C孵育2小時；13. 每孔加入IOO W底物液氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置於室溫 閉光顯色；14. 在96孔濾膜板中加入純淨水終止反應，置37° C烤箱中2小時烘乾培養板; 15.將96孔濾膜板放入ELISpot分析儀中，對實驗結果進行掃描和分析。 結果顯示檢測孔斑點數為42，為陽性，說明有結核菌感染，見圖ll。
權利要求
1. 一種ELISpot結核感染診斷試劑盒，含有96孔濾膜板、IFN-r捕獲抗體、牛血清白蛋白(BSA)、CFP10-ESAT6融合蛋白、生物素標記的IFN-r檢測抗體、親和素-鹼性磷酸酶結合物、底物液氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，其特徵在於所述CFP10-ESAT6融合抗原的胺基酸序列如下MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGFGGGGSGGGGSGGGGSMTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA。
2、 一種ELISpot結核感染診斷試劑盒在檢測結核感染的應用，其特徵在於， 包括以下步驟(一) 、包被(1) 96孔濾膜板中加入1 : 60稀釋的IFN-r捕獲抗體100pL/孔，加蓋,37r孵 育1—2h或4X:過夜；(2) 棄包被液，用無菌的磷酸鹽緩衝液(PBS)洗板3次，3min/次；(3) 每孑L加200nL含1^—3X牛血清白蛋白的PBS,加蓋，37。C孵育1 —2h;(4) 棄上清液，將板直接用於檢測；或放於密封袋中，置4'C保存，l周內使 用；(二) 、檢測(1) 取4-5ml血液加入含肝素鈉或擰檬酸鈉的採血管，在釆集血液後顛倒 混勻5次以上，得到抗凝血；(2) 實驗前將含抗凝血的採血管顛倒混勻5次以上避免血液分層，按1:1-1:3 的比例將抗凝血緩緩加入到含淋巴細胞分層液的無菌離心管中，形成明顯界面, 在室溫下2000-3000rpm離心20-30min;(3) 可見外周血單個核細胞(PBMC)存在於雲霧狀層中，用無菌滴管吸取淋巴細胞層至一乾淨的離心管中；(4)加入8ml預熱至37'C的無血清1640培養液，混懸後，於室溫2000rpm離心10min;(5) 棄去上清培養液，加入6ml預熱至37'C的無血清1640培養液重懸沉澱細 胞，於室溫1500rpm離心8min;(6) 棄去上清洗液，加入400nl預熱至37。C的含10X小牛血清的1640培養液 重懸沉澱細胞，取IO nl細胞懸液加入40pl臺酚藍，取10pl臺酚藍混合細胞液加入 血球計數板，在顯微鏡下計數，計數每ml懸液細胞數量，用預熱至37'C的含10X 小牛血清的1640培養液稀釋細胞懸液至2xlS細胞/ml;(7) 在上述包被的96孔濾膜板中加入下列試劑50pl培養液至每個陰性對 照孔；50pl60pg/mL的植物血凝素至每個陽性對照孔；50 pl 30嗎/mL至120嗎/mL 的CFP10—ESAT6融合蛋白至每個檢測孔；(8) 每孔加入100pl細胞懸液；(9) 將96孔濾膜板放入溼潤的培養箱在37。C、 5%C02培養18—24小時；(10) 將96孔濾膜板取出，棄培養上清液，用PBS洗板4次，3min/次，洗板後甩幹；(11) 在每個孔中加入ioo h1用含1一3X牛血清白蛋白的pbs稀釋成1:60的 生物素標記的IFN-r檢測抗體，置37。C孵育1小時；(12) 孵育後用PBS洗板3次，3mirV次，洗板後甩幹，加入IOO pl用PBS 1:1000 倍稀釋的親和素-鹼性磷酸酶結合物，置37。C孵育2小時；(13) 每孔加入100nl底物液氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，放置於室溫 閉光顯色；(14) 在96孔濾膜板中加入純淨水終止反應，室溫下過夜或37。C烤箱中2-3 小時烘乾96孔濾膜板；(15) 使用放大鏡或倒置顯微鏡計數每個反應空孔中紫色的斑點，每一個點 代表一個分泌Y幹擾素的T細胞；或將96孔濾膜板放入ELISpot分析儀中，對實驗結果進行掃描和分析；(16)結果判定如果陰性對照孔斑點數為0 —5個斑點，檢測孔斑點數減 去陰性對照孔斑點數26判定為陽性；如果陰性對照孔斑點數26個斑點，測試孔 斑點數必須22倍的陰性對照孔斑點數才判定為陽性。
全文摘要
本發明涉及一種ELISpot結核感染診斷試劑盒及其應用，採用基因工程技術從結核分枝桿菌克隆、表達、純化獲得CFP10-ESAT6融合蛋白抗原，作為結核特異的細胞刺激劑用於刺激受檢者外周血T淋巴細胞，使其分泌特異性IFN-γ，然後通過ELISpot檢測，整個過程需兩天時間。利用本發明，根據產生的藍紫色斑點數用肉眼或用儀器判讀結果，可用於檢測受檢者是否感染結核菌，輔助結核病診斷和鑑別診斷。
文檔編號G01N33/543GK101221173SQ20071006269
公開日2008年7月16日 申請日期2007年1月12日 優先權日2007年1月12日
發明者吳雪瓊, 張俊仙, 娟 李, 李嶠坷, 豔 梁, 陽幼榮 申請人:中國人民解放軍總醫院第二附屬醫院