基於基因組外顯子晶片的數量性狀基因位點定位新方法

2024-04-05 15:20:05

專利名稱：基於基因組外顯子晶片的數量性狀基因位點定位新方法
技術領域：
本發明屬生物技術與基因工程領域，涉及一種基於基因組或部分染色體的基因外顯子晶片數據進行數量/複雜性狀基因位點(QTL)定位和克隆的新方法，適用於所有生物數量性狀或複雜性狀(疾病)基因定位。
但是，由於分子標記數量的局限，通過上述方法定位的QTL往往只能給出一個相對很大的基因組區段，無法克隆到那些已定位的QTL。通過再進一步的精細定位也存在不少技術難題，所以目前尚沒有真正通過QTL定位克隆到功能基因，這也是大多數分子生物學家對QTL定位產生疑問的一個主要原因。
隨著人類全基因組測序的完成，DNA上豐富的SNPs(single-nucleotidepolymorphism)被發現，這種新型分子標記由於它只有兩種表型，所以無法應用於QTL定位，而只能通過其他途徑來應用SNP查找人類的一些致病基因(Zhao等，1998，Am.J.Hum.Genet.，63225-240；Eden等，2000，Am.J.Hum.Genet.，67383-394)。對於另一種目前大量出現的數據——基因晶片數據，研究人員一直想利用這些數據進行功能基因研究，大量方法集中在如何處理差異顯示、數據分解等方面，如利用Bayes分析方法進行基因表達差異和顯著表達差異的判別等，但在QTL定位方面一直來沒有提出一個利用方法。
基因晶片技術是大規模和高通量研究基因表達的重要工具，它產生了大量並行的基因表達數據，對這些數據進行合理的儲存和統計分析已有大量研究報導(Lockhart和Winzeler，2000，Nature 405827-36；Long等，2001)，同時大量研究進行優化基因晶片實驗設計(Mills和Gordon，2001，Nucleic Acids Res29e72)。但是由於這些數據自身的特點，其序列信息(探針序列)的應用價值無法得到充分利用。2001年2月Nature人類基因組專刊上發表了利用基因外顯子(exon)晶片技術進行人類基因組基因的「實驗鑑定」(experimentalannotation)的文章，該文章為我們展現了基因晶片技術利用基因組序列數據的巨大威力(Shoemaker等，2001，Nature，409922-927)。
實現本發明方法採用以下步驟第一步構建植物遺傳群體(如DH群體、F2群體、近等基因系、重組自交系等)或動物家系；第二步構建分子標記圖譜，通過公共分子資料庫(GenBank等)收集並確定相關物種的所有已知和注釋獲得的基因序列數據以及在染色體上的位置數據，建立群體的分子標記圖譜；第三步製作全基因組或特定染色體外顯子序列晶片；第四步在一定時期內對研究群體的個體進行DNA取樣和晶片雜交實驗，獲得晶片信號數據；第五步對晶片數據進行表達差異和差異顯著性分析，確定表達差異顯著的外顯子；第六步建立各個個體的分子標記基因型；第七步測定各個個體的形態或生理等表型數據；第八步用QTL定位方法進行定位，可採用單標記分析法、區間作圖法、復區間作圖法、多區間作圖法和基於混合線性模型的復區間作圖法等QTL定位方法；第九步分析和定位功能基因。
由於人類、水稻等全基因組測序已基本完成，全基因組的所有基因序列均已基本預測出來(包括一部分實驗證實)，它們的外顯子序列已明確；同時，目前基於全基因組外顯子序列的基因晶片正在研製中，其中整條染色體外顯子序列的基因晶片已研製成功，且已在人類基因組基因功能注釋中應用。其實，基因外顯子序列與其他分子標記序列一樣，完全可以作為一種新型分子標記，全基因組外顯子序列的基因晶片數據則實際為我們提供了全基因組基因分子標記全圖，其標記密度(人為32000個/基因組，水稻50000-60000個/基因組等)正好覆蓋了所有基因。由於所用分子標記數量和分布完全反映的是基因組的實際基因狀況(可能的誤差可能來自基因組的注釋結果，但這一誤差比率對本方法影響不大)，所以定位QTL的分子標記(外顯子)實際就是影響研究的某一性狀功能基因或基因之一，這樣就可以直接確定功能基因(QTL)的序列。
全基因組外顯子序列晶片(exon array)是指根據全基因組或某些染色體(或區段)的所有基因(包括實驗證實和預測出來的)的外顯子序列(或其中的一個外顯子序列)點製成的基因晶片。
本發明適用於生物所有數量性狀或複雜性狀(疾病)基因定位；研究群體包括植物DH群體、F2群體、近等基因系(NIL)、近等基因導入系(NIIL)、重組自交系(RIL)等，動物家系等。
本發明可以對生物數量/複雜性狀(疾病)基因進行精細定位，並直接獲得定位的功能基因序列。同時，本發明可定位和克隆重要基因，具有廣泛的應用價值。
實施例2水稻控制株高的基因定位與克隆第一步構建遺傳群體一個水稻DH群體，群體中共有96個個體。建立該群體的目的是進行水稻株高性狀QTL的定位第二步構建分子標記圖譜通過公共分子資料庫(GenBank等)收集並確定水稻的所有已知和注釋獲得的基因序列數據(目前已知50000-60000個)以及基因的外顯子在染色體上的位置數據，建立水稻的分子標記圖譜。
本例有21個外顯子(Marker#)，它們在三條染色體(ch1/ch2/ch3)的物理位置(外顯子5』端第一個鹼基到染色體啟始鹼基的鹼基總數，本例數據均已除100000)見下表。由於多拷貝等原因，一些外顯子在多條染色體上均有分布。在同一條染色體上出現的同一個外顯子(位置不同)可按不同的分子標記(外顯子)進行處理。
*MapBegin*Marker# ch1 ch2 ch310 00219.23612.9949 7.7618316.2488 5.3402 13.251844.855222.2875 6.923954.804727.7327 9.8037615.3881 6.3438 2.7929715.5969 29.4517 17.5239815.0048 10.2825 41.754593.83758.9339 37.303610 3.274712.824 15.839411 34.4392 8.4598 18.7639122.5322 5.16832.51211323.797910.1262 5.0168148.2644 5.289628.94051513.348313.2089 1.91091633.531922.7256172.5622 15.2455189.2129 32.4819 7.148320 9.492421 18.718*MapEnd*以上所有不同位置的外顯子依次(從第一條染色體的第一個外顯子到第三條染色體的第15個外顯子)稱為M1、M2、......M54。
第三步製作外顯子序列晶片根據收集和確定的外顯子序列數據(本例為21條序列)進行點樣製作外顯子序列晶片。具體製作方法參見Shoemaker DD，Schadt EE，Armour CD，et al，2001，Experimental annotation of the human genome using microarraytechnology，Nature，409922-927。
第四步收集晶片數據在一定時期內(可分不同時期分別測定，以確定基因不同時間表達的狀況)對水稻DH群體的個體進行DNA取樣和晶片雜交實驗，獲得晶片信號數據。具體檢測實驗過程參照Newton MA，Kendziorski CM，Richmond FR，Blattner FR andTsui KW，2001，On differential variability of expression ratiosImprovingstatistical inference about gene expression changes from microarray data.Journal Computational Biology，837-52和Mills JC，Gordon JI，2001，A newapproach for filtering noise from high-density oligonucleotide microarraydatasets.Nucleic Acids Res 2972等。
第五步晶片數據處理對晶片數據進行表達差異和差異顯著性分析，確定表達差異顯著的外顯子。具體確定方法可使用Ratio method、T-statistic、ANOVA等方法。本例使用一種貝葉斯方法。
利用Bayes分析方法進行基因表達差異和顯著表達差異判別過程基因表達水平的變異主要有兩個來源一是所謂的測量誤差，是由於mRNA等樣品製備、螢光信標、交叉雜交等造成的；二是由於基因的不同造成的，每個基因自身的螢光反應不同，本身就有高低。對於這兩個來源的變異，本研究應用Γ分布(Gamma distribution)模型進行分析。對於每個測量點，我們假設紅光光強(R)是來自Γ分布G(α，θR)的一個樣本，即R∽G(α，θR)；同樣，綠光G是來自Γ分布G(α，θR)的一個樣本，即G∽G(α，θR)。對於θR和θR是來自一個共同的Γ分布G(α0，υ)，即θR，θR∽G(α0，υ)。根據上述Gramma-Gramma模型，可以得到真實差異表達(true differentialexpression)的後驗分布為，其中，未知參數通過最大似然法估計。Bayes估計值界於該分布的平價值和眾值之間，作為真實差異表達的估計值。由於R和G的測量變異均有可能來自兩個變異源(測量誤差和基因差異表達)，所以對於表達比率(R/G ratio)顯著性的確定，本研究使用Bernoulli隨機變量Z當Z＝1，說明兩者的表達有真實差異(θR不等於θR)，反之，Z＝0，說明兩者的表達無真實差異。
由此可以獲得本群體中96個個體植株的外顯子是否表達的數據(見下步)。
第六步確定分子標記基因型根據上一步可以建立各個個體的分子標記基因型。本示例中21個外顯子在96個個體中的均有差異表達。
個體(Ind#，左列)依次為1-96，M1-M54是否表達依次分別用「1」(表達)和「2」(不表達)或「.」(缺失)表示，每個個體間用分號隔開。
*MarkerBegin*Ind#M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 M26 M27 M28 M29 M30 M31 M32 M33 M34M35 M36 M37 M38 M39 M40 M41 M42 M43 M44 M45 M46 M47 M48 M49 M50 M51M52 M53 M54 ；1 2 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 12 2 2 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 .
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2 ；30 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 22 1 1 1 1 1 1 1 . 1 1 2 2 2 2 2 2 22 2 1 1 1 2 2 . 2 2 2 1 1 1 1 1 11 2；31 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 . 2 . 2 1 2 2 2 2 2 2 2 . 1 1 11 . 1 . 1 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 . . 2；32 2 2 . 1 2 . 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 . 1 1 1 . 1 1 . 1 1 . 1 1 1 1 22 2 2 2 2 1 . 1 1 1 1 1 2 2 2 2 . 2. 2；33 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 2 2 2 22 2 2 2 1 1 1 . 1 1 1 1 2 2 2 1 1 12 2 2 2 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 1 1 11 ；34 . 2 2 . 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 11 1 1 . 1 1 2 2 2 2 2 2 2 . 2 . 11 1 1 . 1 . 2 1 1 1 1 1 2 2 2 2 22 . 2 ；35 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 . 1 1 21 1 . 2 2 1 2 . 1 1 2 1 1 2 2 2 2 22 2 2 2 1 1 . 1 1 2 2 2 2 2 2 2 . 2；36 1 1 . 1 1 1 1 1 1 1 2 . 2 2 1 2 22 . 2 2 2 . 2 1 . 1 1 . 1 1 1 1 11 1 . 2 2 2 . 1 1 1 1 1 2 2 2 . 22 . 1 ；37 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 2 2 2 1 1 11 1 1 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 . 2；38 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 11 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 11 . 1 ；39 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 . 2 2 12 2 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 . 2 22 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2. 2；40 1 1 1 1 1 1 . 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 22 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 . 1 1 1 2 2
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2 ；43 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 22 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 ；44 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 12 2 2 2 1 1 1 . 1 1 1 1 1 1 1 1 .
1 1 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 ；45 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 11 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1；46 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 . 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 22 ；47 . 1 . 2 . 2 2 2 1 2 . 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 1 1 . . 1 2 2 . 1 1 1 2 22 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 . 1 1 1 .
2 ；48 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 2 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 22 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 22 2 ；49 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 11 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 22 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 21 ；50 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 12 2 2 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 ；51 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 11 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 252 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 21 1 1 1 . 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 ；53 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 12 2 1 1 . 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2；54 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 21 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 . 21 1；55 1 1 1 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 . 1 1 1 1 1 . 1 1 1 . 2 22 2 2 2 1 2 2 2 2 . . 2 2 2 2 1 1 .
1 ；56 1 1 1 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 22 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1；57 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 . 1 11 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 22 2 2 2 . 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 . 2；58 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 1 22 2 2 2 2 2 . 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 11 1；59 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 2 2 2 2 22 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1. 1；60 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 12 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 2 2 2 11 1 1 ；61 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 11 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 22 ；62 2 2 2 . 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 1 1 1 1 . 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 11 1 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2
. 1；63 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 1 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 22 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2. 2；64 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 . . 1 1 1 . 22 2 2 2 . 1 1 1 1 1 1 1 . 2 . 1 22 2 2 2 2 2 2 2 . 2 1 2 2 1 1 1 11 . 1 ；65 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 11 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1. 1；66 2 2 2 2 . . 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 . 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 . . . 1 .
. ；67 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 11 2 2 2 2 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 . 1 2 .
2 ；68 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 11 2 2 2 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 12 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 22 ；69 1 1 1 . 2 2 2 2 2 2 2 . 2 2 2 2 22 1 2 2 2 . 2 2 2 2 2 . 2 2 . . 2 22 2 . 2 2 1 1 1 2 . . 2 2 2 2 2 . .
1 ；70 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 11 2 2 2 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 ；71 1 2 2 . 2 2 2 2 2 . 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1；72 1 1 1 . 1 1 1 1 1 1 2 2 2 1 . . 1 12 2 2 1 . 1 2 . 2 2 2 2 2 2 . 1 1 11 1 1 1 1 2 2 1 1 1 . 2 2 2 1 1 .
1 ；73 1 1 1 . 1 2 2 2 2 . 1 . . 1 1 2 2 21 2 2 2 1 1 1 . 1 1 1 1 1 1 . 1 2 22 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 .
2 ；74 2 2 2 . 2 2 2 2 2 . 1 1 1 1 1 1 11 2 2 2 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 21 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1. 1；75 1 1 1 1 1 1 2 2 2 . 1 1 1 1 1 1 1 12 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2；76 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 1 1 1 1 11 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 .
2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1. 1；77 2 1 2 . 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 11 1 1 1 1 . 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 1 11 1；78 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 . 11 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 22 2 2 2 2 . 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 .
2 ；79 1 1 1 2 1 2 2 2 2 2 1 1 1 2 2 2 2 22 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 22 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1；80 2 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 12 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 22 2 2 2 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 . 1；81 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 . 2 1 11 1；82 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 . 1 1 1 11 1 1 1 1 . 1 1 . 1 1 1 1 1 1 . 11 1 . 2 2 1 2 1 1 1 . 1 1 1 . 1 . 2. 2；83 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 1 . . 1 1 2 2 21 2 2 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 . 2 2 22 2 2 2 2 1 1 1 . 1 1 1 2 1 1 1 2 2；84 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2
2 ；85 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 11 1 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 22 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 11 2；86 2 2 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 12 2 . 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 22 ；87 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 . . 2 22 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 22 2 2 1 2 2 1 1 1 1 . 1 2 1 1 1 11 ；88 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 11 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 22 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 11 1 1 ；89 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 12 2 2 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 . 2 2 1；90 1 1 2 . 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 . 2 2 2 2 2 2 2 2 2 . 22 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 1. 1；91 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 11 1 1 1 . 1 2 2 2 2 2 2 2 2 . 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 . 2 . 1 1 1 1 1 . 192 2 2 2 . 2 2 2 2 . 2 1 1 . 2 . 2 2 21 1 1 1 . 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 11 1 1 2 2 2 1 1 1 1 1 . 1 1 1 2 2. 2；93 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 . . 2 21 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 . 1 .
2 2 2 2 2 2 2 2 2 . 2 . 1 2 1 1 1. 1；94 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 22 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 1 1 2 1 . 2 22 ；95 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 11 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 1 .
1 ；96 1 1 1 1 1 1 1 2 2 . 2 2 1 1 1 1 1 22 . 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 12 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 . 1 1 1. 2；*MarkerEnd*第七步獲得表型數據測定各個個體的形態或生理等表型數據，獲得如下水稻株高數據。不同環境(Env#)下進行試驗結果分別用1和2等表示，株高(SH5)單位為cm.*TraitBegin*Env# Ind#SH5； 1 31 80.9；1 1 52.5；1 32 88.4；1 2 62.5；1 33 79.2；1 3 77.9；1 34 77.1；1 4 57.2；1 35 72.7；1 5 51.7；1 36 78.6；1 6 62.5；1 37 65.1；1 7 56； 1 38 48.8；1 8 62.7；1 39 65.5；1 9 62.1；1 40 79.3；1 10 76.2；1 41 81.8；1 11 69.1；1 42 63.8；1 12 68.4；1 43 96.6；1 13 45.4；1 44 67.2；1 14 68.4；1 45 55.5；1 15 83.9；1 46 44.2；1 16 81.5；1 47 80.1；1 17 74.4；1 48 75.9；1 18 73.9；1 49 77.6；1 19 58.7；1 50 50.4；1 20 64.5；1 51 60；1 21 61.2；1 52 68.6；1 22 48.5；1 53 58；1 23 48.2；1 54 67.2；1 24 83.5；1 55 65.2；1 25 55.2；1 56 66.7；1 26 49.6；1 57 67.1；1 27 77.3；1 58 59.6；1 28 78.5；1 59 67.5；1 29 71； 1 60 67.7；1 30 67.2；1 61 60.3；1 62 70.9；2 10 65.6；1 63 78.8；2 11 53；1 64 70.9；2 12 58.4；1 65 52.2；2 13 40.2；1 66 70.7；2 14 59.1；1 67 66.3；2 15 67.7；1 68 55； 2 16 67.7；1 69 75.3；2 17 63.7；1 70 75.5；2 18 68；1 71 57.5；2 19 48.7；1 72 49.7；2 20 51.8；1 73 75.5；2 21 49.9；1 74 52.5；2 22 41.1；1 75 64.6；2 23 34.1；1 76 57.2；2 24 71.4；1 77 52.1；2 25 44.6；1 78 53.9；2 26 47；1 79 72； 2 27 62.3；1 80 70； 2 28 60.8；1 81 52.3；2 29 64.1；1 82 55.5；2 30 62.3；1 83 63.7；2 31 67.6；1 84 62.1；2 32 77.3；1 85 61； 2 33 66.1；1 86 71.8；2 34 58.6；1 87 76.6；2 35 57.9；1 88 55.4；2 36 60.3；1 89 60.9；2 37 55.1；1 90 58.9；2 38 44.3；1 91 44.4；2 39 47.1；1 92 73.6；2 40 71.4；1 93 73.8；2 41 70.1；1 94 82.4；2 42 57.4；1 95 53.7；2 43 76；1 96 64.2；2 44 56.7；2 1 43.8；2 45 46.1；2 2 39.5；2 46 28.3；2 3 57.8；2 47 67.7；2 4 44.9；2 48 66.7；2 5 41.9；2 49 66.7；2 6 44.2；2 50 50.1；2 7 46.8；2 51 56.7；2 8 51.4；2 52 56.4；2 9 46.4；2 53 53.3；2 54 58.4；2 55 60.1；2 56 57.2；2 57 53.1；2 58 54.9；2 59 56；2 60 52.6；2 61 52；2 62 57；2 63 65；2 64 59；2 65 46.3；2 66 55.3；2 67 58.4；2 68 48.9；2 69 59.6；2 70 56.8；2 71 43.4；2 72 42.5；2 73 66.5；2 74 40.1；2 75 57.3；2 76 52.8；2 77 43.4；2 78 46.8；2 79 63.1；2 80 57.8；2 81 43.2；2 82 43.3；2 83 48.3；2 84 57.5；2 85 50.2；2 86 59.9；2 87 58.6；2 88 44.1；2 89 43.6；2 90 44.7；2 91 37；2 92 56.3；2 93 63.6；2 94 69.8；2 95 41.8；2 96 55.4；
第八步QTL定位本例使用基於混合線性模型的復區間作圖法等進行QTL定位。
具體方法描述見Wang DL，Zhu J，Li ZK，Paterson AH，1999，Mapping QTLswith epistatic effects and QTLxenvironment interactions by mixed modelapproaches.Theor.Appl.Genet.，991255-1264。相關軟體QTLMapper(version1.0)。
第九步分析和定位功能基因通過QTLMapper(version1.0)可以獲得多方面數據，其中主效QTL定位結果如下//Result file created by QTLMapper V1.0(本結果由QTLMapper V1.0產生)//Contentsfiltrated putative main-effect QTLs(內容通過主效QTL篩選)// Original result fileD\QTLMAPER\simu.qtl(原始結果文件D\QTLMAPER\simu.qtl)// BGV control methodA(control main interaction markers)(背景遺傳變異控制方法A(控制主效和互作標記)// Threshold probability0.0050(臨界概率0.0050)// LR Threshold value7.8798(似然比LR臨界值7.8798)#Date2002-03-09Time103905(運行日期和時間)Trait 1simTt(性狀1株高)ChromIntervalSitel(M)Site2(M) LR LOD A Prob染色體 區間 標記位點1 標記位點2 LR似然比值 LOD似然比值 A值概率1MK2-MK3 0.098 0.000 18.26 3.96 0.7869 0.00172MK25-MK26 0.594 0.000 150.78 32.72-0.99420.67112MK32-MK33 1.262 0.040 247.09 53.623.6980 0.0000End從該結果可以得出，在第一和二條染色體上共有3個主效QTL控制水稻株高，它們分別位於M2-M3、M25-M26和M32-M33之間。M2和M3是同一基因中的不同外顯子，則可得出該基因就為控制水稻株高的主效QTL；M25和M26是同一基因中的不同外顯子，則同樣可得出該基因也是控制水稻株高的主效QTL；M32和M33不是同一基因中的外顯子，而分別是相鄰基因的外顯子，則這兩個相連的基因均可能是控制水稻株高的主效QTL。如果有更多的達到顯著的區間，可依次類推確定其他QTL。由此便可以定位和獲得相關功能基因的具體位置和序列。
權利要求
1.基於基因組外顯子晶片的數量性狀基因位點定位新方法，其特徵是將基因組或部分染色體的基因外顯子序列作為一種分子標記，利用人類、水稻等基因組外顯子序列晶片(exon array)的檢測數據作為定位群體的分子標記數據，然後通過QTL統計定位方法進行基因定位。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是先構建植物遺傳群體或動物家系，通過公共分子資料庫(GenBank等)收集並確定相關物種的所有已知和注釋獲得的基因序列數據以及在染色體上的位置數據，建立該群體的分子標記圖譜。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵是根據收集和確定的外顯子序列數據進行點樣製作全基因組或特定染色體外顯子序列晶片。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵是對研究群體的個體進行DNA取樣和晶片雜交實驗，獲得晶片信號數據。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵是對晶片數據進行表達差異和差異顯著性分析，確定表達差異顯著的外顯子。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵是根據外顯子差異表達數據，建立群體中各個個體的分子標記基因型。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵是測定各個個體的形態或生理等表型數據。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵是QTL定位方法可採用單標記分析法、區間作圖法、復區間作圖法、多區間作圖法和基於混合線性模型的復區間作圖法等。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵是定位後進行分析和定位功能基因。
10.根據權利要求1所述的方法，其特徵是可直接獲得定位的功能基因序列。
全文摘要
本發明是一種基於基因組外顯子晶片的數量性狀基因位點(QTL)定位的新方法，是將外顯子序列作為一種分子標記，利用人類、水稻等全基因組或部分染色體的外顯子序列晶片(exon array)的檢測數據作為定位群體的分子標記數據，然後通過QTL統計定位方法進行基因定位。本發明可直接獲得定位的功能基因序列。適用於生物所有數量性狀或複雜性狀(疾病)；研究群體包括植物DH群體、F2群體、近等基因系(NIL)、近等基因導入系(NIIL)、重組自交系(RIL)等，動物家系等。
文檔編號C12Q1/68GK1448515SQ0211128
公開日2003年10月15日 申請日期2002年4月2日 優先權日2002年4月2日
發明者樊龍江 申請人:浙江大學