寡糖轉移酶催化的天冬醯胺連接的糖基化的組分的合理設計的製作方法
2024-02-29 09:59:15
寡糖轉移酶催化的天冬醯胺連接的糖基化的組分的合理設計的製作方法
【專利摘要】本發明涉及用於鑑定或設計用於寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的(a)潛在寡糖供體、(b)潛在寡糖轉移酶(OST)、(c)潛在共有序列基序多肽和/或(d)潛在糖基化抑制劑的方法，其包括生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的催化結構域和/或多肽結合位點的三維模型和設計或選擇選自(a)至(d)的潛在組分(其優化所述一種或多種三維模型和潛在組分的立體化學互補性)的步驟。
【專利說明】寡糖轉移酶催化的天冬醯胺連接的糖基化的組分的合理設計
發明領域
[0001]本發明涉及用於鑑定或設計用於寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的(a)潛在寡糖供體、(b)潛在寡糖轉移酶(OST)、(C)潛在共有序列基序多肽和/或(d)潛在糖基化抑制劑的方法，其包括生成紅嘴鷗彎曲桿菌{Campylobacter lari)的寡糖轉移酶(OST)的催化結構域和/或多肽結合位點的三維模型和設計或選擇選自(a)至(d)的潛在組分(其優化所述三維模型和潛在組分的立體化學互補性)的步驟。
[0002]發明相關背景
據估計，所有真核細胞蛋白的超過一半是糖蛋白，這意味著特定胺基酸側鏈被碳水化合物化學修飾。這些修飾豐度最高的形式是天冬醯胺連接(「N-連接」)的糖基化，這影響範圍從蛋白摺疊、質量控制、分選和分泌到生物體發育和宿主-病原體相互作用的多種細胞功能。面向內質網(ER)內腔的天冬醯胺當位於共有「序列肽段」Asn-X-Ser/Thr(其中X可以是除脯氨酸以外的任何胺基酸)中時特別被糖基化。該反應發生在ER周圍的膜處，並且被嵌入在高等真核細胞的ER膜中的酶寡糖轉移酶(OST)異源寡聚蛋白複合體所催化(參見圖1b)。N-連接的糖基化的一個標誌是其對於多肽底物的廣泛特異性，這是短識別序列肽段的直接結果。該特徵使OST區別於糖基轉移酶，所述糖基轉移酶修飾絲氨酸或蘇氨酸殘基(O-連接的糖基化)，並且表現出對其蛋白底物的較高特異性。
[0003]OST-催化的糖基化中的關鍵步驟是在受體天冬醯胺的醯胺氮和脂質連接的寡糖(LLO)供體的第一糖部分的Cl碳之間形成N-糖苷鍵(參見圖1a)。這導致寡糖整體轉移到受體天冬醯胺上。潛在反應機制的詳細信息知之甚少。這不僅是由於缺乏在高解析度下對OST的結構深度理解所導致的，而且是由於LLO底物的複雜化學性質、其在生物樣品中的低豐度和其在水中的不溶性導致的。相比之下，已經公開了各種可溶性O-糖基轉移酶的晶體結構，並且詳細研究了它們的反應機制。對於0ST，目前接受的模型表明，糖基化序列肽段當位於未摺疊的蛋白區段中時被識別，這可以發生在蛋白易位到ER的過程中或易位完成後發生。OST內的核心催化活性組分是STT3亞基，而其他亞基被認為通過促進OST複合體裝配或通過與受體蛋白的子集或LLO底物相互作用，導致可進入和修飾的糖基化位點的數目增加，從而協助和改善該過程 。
[0004]N-連接的糖基化不限於真核生物。同源過程在古菌和變形菌的確定分類群中被發現。然而，原核生物和真核生物動粒含有單一亞基OST酶，其與高等真核生物的STT3亞基同源。研究最好的原核生物的N-糖基化過程由來自細菌空腸彎曲菌iPampylobacterjejuni)的蛋白糖基化基因座pgl所介導(Szymanski等人.(1999) MolecularMicrobiology 32，1022 - 1030)。該基因座包含與真核生物STT3共有明顯序列相似性的被稱為PgIB的內在膜蛋白，表明共同的膜拓撲結構和反應機理(參見圖lb)。該基因簇對於當轉移到大腸桿菌細胞中時催化蛋白糖基化是足夠的。含有序列肽段的蛋白底物的OST-催化的原核生物蛋白糖基化是糖基化重組產生的蛋白的經濟、有效和便捷的方式(Wacker等人(2002)，Science 298，1790-1793)。可以在大腸桿菌中用非空腸彎曲菌來源的不同O抗原脂多糖結構工程改造N-連接的蛋白糖基化(Feldman等人(2005) PNAS102(8)，3016-3021)，因此允許將真核細胞N-聚糖原核轉移至重組蛋白底物。Glover等人(2005, Chemistry & Biology 12, 1311-1315)首次證明使用包含過表達的PgIB和焦磷酸i 異戍二烯酯結合的寡糖的大腸桿菌細胞膜的體外蛋白糖基化。在2006年,Kowarik等人.(2006，EMBO J.25(9)，1957-1966)進一步定義了細菌N-糖基化位點共有序列肽段序列，其顯示細菌OST的底物特異性延伸到在受體天冬醯胺的-2位帶負電荷的胺基酸，導致共有序列肽段Asp/Glu-X1-Asn-X^Ser/Thr (其中X1和X2都不是脯氨酸；SEQ ID NO: 3)。通過使用肽底物文庫，Chen等人(2007，Biochemistry 46, 5579 -5585)驗證了受體天冬醯胺的-2位負電荷的必要性，並且將序列DQNAT (SEQ ID N0:4)鑑定為空腸彎曲桿菌PgIB的最佳底物。[0005]根據上述，結論就是原核生物寡糖轉移酶(OST)對於蛋白底物具有廣泛特異性(因為基於小序列肽段)，並且可以用來轉移真核、原核以及合成的N-聚糖。基本上，基於原核OST的N-糖基化系統需要三個組分，(a)寡糖供體，優選脂質或焦磷酸十一異戊二烯酯連接的寡糖供體、(b)原核寡糖轉移酶(OST)、(c)潛在共有序列基序多肽底物，和最後但並非不重要的合適的生理微環境，例如體外或體內的細胞膜。
[0006]作為本信息基礎的問題是，人們無法超越對於已知OST組分提供的信息預測或設計對於非常有效的基於原核OST的N-糖基化系統必需的組分。此外，沒有任何關於潛在OST糖基化抑制劑必須具有何種結構要求的線索。預計這種抑制劑將具有顯著的生物學效應，並且可能具有巨大的醫療、診斷和科學價值。另一個問題是，到目前為止，還不可能提供可以為科學界提供關於參與OST-介導的糖基化的組分的可能變化的深刻理解的OST的催化結構域和多肽結合位點的三維模型。
[0007]上述問題已經通過提供與受體六肽DQNATF (SEQ ID NO:5)複合的細菌OST(來自紅嘴鷗彎曲桿菌的PgIB蛋白(與空腸彎曲菌的PgIB共有56%序列同一性))的三維X射線結構而得到解決。紅嘴鷗彎曲桿菌PgIB當與空腸彎曲桿菌/^7簇在大腸桿菌細胞中共表達時是活性的，正如含有共有序列肽段的受體蛋白的糖基化所證明的(參見圖2)。對於其結構分析，紅嘴鷗彎曲桿菌PgIB與含有在體內分析中被糖基化的序列肽段的六肽DQNATF(SEQ ID NO:5)進行共結晶，所述六肽DQNATF (SEQ ID NO:5)已經被鑑定為紅嘴鷗彎曲桿菌PgIB的最佳受體序列(參見上文Chen等人)。紅嘴鷗彎曲桿菌PgIB (712個胺基酸殘基，SEQ ID NO:1)的結構使用實驗階段和分子替換的組合，利用先前確定的紅嘴鷗彎曲桿菌PgIB的周質結構域的結構進行確定。PgIB的共晶體是小的易碎的，並且各向異性地X射線衍射，最佳天然數據延伸到3.4 A解析度。該結構被定義為分別23.8和27.1 %的R/Rftee值(表2)。紅嘴鷗彎曲桿菌PgIB的結構的進一步詳情提供在下面的實驗部分。
[0008]這種新的三維結構為序列肽段識別提供分子基礎的深刻理解，並且揭示了蛋白的跨膜結構域和保守的特徵、酸性側鏈殘基和結合的二價陽離子形成的催化位點。這些結果首次表明醯胺氮活化和糖基化的機制，並且提供了用於鑑定和設計新的寡糖供體、新的寡糖轉移酶變體(OST)、新的共有序列基序多肽以及OST糖基化抑制劑(所有這些可用於重組糖蛋白生產、診斷、醫學和作為科學工具)的合理方法。
[0009]鑑於上述情況，本發明的第一個方面涉及用於鑑定寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的潛在組分的方法，所述潛在組分選自
(a)潛在寡糖供體，優選脂質-連接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一異戊二烯酯(undecaprenyl pyrophosphate)結合的寡糖供體，
(b)潛在寡糖轉移酶(OST)，
(c)潛在共有序列基序多肽，和
(d)潛在糖基化抑制劑，
所述方法包括步驟 (i)使用表1的原子坐標(距離骨架原子優選±2A、更優選±1.5A、最優選±1.0 A均方根偏差(rmsd))用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的催化結構域的三維模型，所述催化結構域包含胺基酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和H485中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、最優選所有胺基酸,和/或,優選並且
(?)使用表1的原子坐標(距離骨架原子優選±2A、更優選±1.5A、最優選±1.0 A均方根偏差(rmsd))用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型，所述多肽結合位點包含胺基酸1318、1?331、1463、1464、0465、和1572中的至少一個、兩個、三個、四個、五個、最優選所有胺基酸，
(iii)優選在(i)和/或(ii)的三維模型的胺基酸的坐標上進行全身平移和/或旋
轉，
(iv)使用所述(i)、(ii)和/或(iii)的三維模型用於設計或選擇潛在組分(a)至(d)中的至少一種，
(v)提供所述潛在組分(a)至(d)中的至少一種，和
(vi)將所述潛在組分(a)至⑷中的至少一種與對於寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化必需的進一步功能組分接觸，
(vii)鑑定選自以下的功能組分
(A)功能性寡糖供體，優選功能性脂質-連接的寡糖(LLO)供體或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體，
(B)功能性寡糖轉移酶(OST)，
(C)功能性共有序列基序多肽，和
(D)功能性糖基化抑制劑。
[0010]在一個優選的實施方案中，在步驟(ii)中，紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型包含胺基酸13183331、1463、胃464、0465和1572中的至少兩個、優選至少三個、更優選至少四個、最優選所有胺基酸。
[0011]用於本發明方法中的表1的原子坐標顯示在圖7中。紅嘴鷗彎曲桿菌的OST的X-射線坐標，特別是與優化多肽底物DQNAT (SEQ ID NO:4)複合的催化位點和/或多肽結合位點的X-射線坐標，為技術人員提供了對於鑑定對於OST催化和催化抑制的潛在組分必需的三維信息。參與催化作用和多肽結合的胺基酸的個別原子的空間限制組合化學功能性質，例如，電子密度、範德華力位置、離子相互作用、疏水性相互作用等為技術人員在以下的結構和空間先決條件的計算機輔助分子建模中提供了信息:(a)潛在寡糖供體，優選脂質連接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體；(b)潛在寡糖轉移酶(OST)，(c)潛在共有序列基序多肽，和/或(d)潛在糖基化抑制劑。[0012]如前所述，細菌OST對於寡糖供體分子具有廣泛特異性。使用本發明的坐標信息和方法，可以合理設計有用的寡糖供體的所有組成成分並且延伸，而不必回復到試驗和錯誤的合成策略。此外，在不使催化位點和多肽結合口袋變得沒有功能的情況下，OST本身可以合理變化。該OST變化是有用的，例如用於修飾OSTs的催化潛力、多肽的底物特異性和/或寡糖供體特異性。此外，多肽寡糖受體的共有基序可以合理變化並且進行設計，從而導致擴大OST實用性，諸如例如真核生物位點的糖基化。最後但並非最不重要的，本發明的三維X射線模型為設計潛在糖基化抑制劑提供了優異基礎，可以預期所述潛在糖基化抑制劑通過中斷、修飾或減慢OST活性而具有生理活性。這些抑制劑具有提供科學、診斷和治療工具的很大潛力。 [0013]術語「均方根偏差」或「 rms偏差」或「 rmsd」是指距離平均值的偏離的平方的算術平均值的平方根。在原子對象的背景下，數值可以以埃(A)給出。它是表達距離趨勢或對象的偏差或變化的一種方式。
[0014]本發明方法包括以下步驟:使用表1的原子坐標(距離骨架原子優選土2、更優選土1.5、最優選土1.0 A均方根偏差(rmsd))用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的催化結構域的三維模型，所述催化結構域包含胺基酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和H485中的至少一個、兩個或三個、優選至少四個、更優選至少五個或六個、最優選七個或所有胺基酸，和/或，優選並且
使用表1的原子坐標(距離骨架原子優選±2A、更優選±1.5A、最優選±1.0 A均方根偏差(rmsd))用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型，所述多肽結合位點包含胺基酸M318、R331 (或A331)、W463、W464、D465、和1572中的至少一個或兩個、優選至少三個、更優選至少四個或五個、最優選所有胺基酸。
[0015]在多肽結合位點，W463、W464和D465與結合的受體序列肽段中T的β -羥基形成強氫鍵。這些殘基強烈貢獻受體序列肽段結合，並且是為何S或T位於受體天冬醯胺(N-X-S/T)的+2位的原因。R331形成與受體多肽的帶負電荷D的鹽橋，並且因此貢獻受體序列肽段結合。R331負責受體天冬醯胺的-2位的帶負電荷的胺基酸的要求，並且負責延伸共有序列肽段用於細菌N-連接的蛋白糖基化(D/E-XfN-XfS/T; SEQ ID N0:3)(圖4a)。R331隻有在細菌OST中保守，並且可以充當用於將PgIB的底物特異性改變朝向識別真核細胞糖基化位點的目標。事實上，當R331被突變為A時，獲得的受體蛋白中的糖基化位點AQNAT (SEQ ID NO:8)，例如初始含有序列肽段DQNAT (SEQ ID NO:4)的修飾的scFv片段3D5可以被糖基化，而該位點不充當野生型酶的底物(圖4b)。
[0016]在催化位點，D56、D154和E319似乎負責協調對於催化關鍵的結合的二價金屬離子。更重要地，D56和E319與結合的受體序列肽段的天冬醯胺側鏈的醯胺基形成氫鍵。該相互作用引起醯胺基中C-N鍵的旋轉，這對於氮的親核活化是重要的。D156和R147穩定氫鍵鍵合網絡，並且R375複合結合的脂質連接的寡糖(LLO)的磷酸酯之一的負電荷。
[0017]例如，在多肽結合位點中，W463、W464和D456可以被兩個H和一個E替代(WffD —HHE) 0為了保持受體天冬醯胺的-2位中負電荷的要求，R331可以被K替代。為了在該位置產生正電荷的要求，R331可以被D或E替代。為了克服受體天冬醯胺的-2位中負電荷的要求，R331可以被A替代(圖4)。在催化位點，D154和D156可以各自被E替代。分別地，E319可以被D替代，並且D56可以被E替代(見下文)。為了修飾PgIB活性，例如，D56、D154和E319可以被丙氨酸或相應的氨基官能團(N或Q)替代。H485可以被W替代，因為W在真核生物OST的該位置處出現。
[0018]如圖7表1中列出的來自紅嘴鷗彎曲桿菌的PgIB的結構坐標對於技術人員而言可以從Pdb資料庫下載獲得。(結構生物信息學研究合作實驗室(RCSB)蛋白資料庫(PDB))。在計算機和可自由獲得的結構程序諸如PyMOL或商業上可獲得的結構程序的幫助下，技術人員可以很容易地生成可用於要求保護的方法的三維模型。
[0019]本領域技術人員將理解，蛋白、蛋白/底物或蛋白/抑制劑複合物或其部分的結構坐標集合是定義三維形狀的點的相對集合。因此，可能完全不同的坐標集可以定義相似或相同的形狀。出於這個原因，優選在從表1的原子坐標獲得的三維模型(i)和/或(ii)的胺基酸的坐標上進行全身平移和/或旋轉。這些坐標變化可以通過數學運算結構坐標，例如，通過晶體排列結構坐標而運算，部分或矩陣運算為結構坐標集或任何以上的組合而生成。
[0020]接下來，上述生成的三維模型用於設計或選擇OST糖基化的潛在組分中的至少一種或潛在抑制劑。各種計算機分析對於確定分子諸如特定寡糖供體、修飾的0ST、寡糖受體共有序列基序多肽或糖基化抑制劑是否充分設計以合理地預測它在OST-催化的反應中的功能性是必要的。將不得不進行空間、功能和化學考慮諸如性質、原子位置、合理的旋轉自由度、電子密度、空間位阻、範德華力、離子和疏水相互作用等。這種分析可以通過標準軟體應用諸如 CCP4 方便地實施(COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT, NUMBER 4.1994.The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography'J.Acta Cryst.D50，760-763.) o
[0021]現有計算機 分子相似性應用允許不同結構、相同結構的不同構象和相同結構的不同部分之間的比較。比較程序通常分為四個步驟:(I)加載結構信息，⑵定義這些結構上的原子等效物，(3)執行擬合(疊加)操作和(4)分析結果。各結構通過名稱標識。然後一個結構標識為潛在OST組分或OST抑制劑(即目標或固定結構)，所有剩餘的結構是工作結構(即移動結構)。當使用剛性擬合方法時，將工作結構平移和旋轉以獲得與目標結構的最佳擬合(空間和功能互補性)，例如，OST抑制劑是固定結構並且將OST胺基酸平移和旋轉以獲得最佳擬合。擬合操作使用一種計算出最佳平移和旋轉以應用到移動結構的算法，從而使得對等效原子的指定對的擬合的rmsd是絕對最小值。將兩種結構疊加後，可以計算出對於等效原子的特定集合的rmsd值。
[0022]如上所述根據本發明方法選擇或設計的OST反應的潛在功能組分或抑制劑將為技術人員當驗證其在常規OST活性測定中的功能性時提供合理的成功預期。出於所述目的，潛在組分必須通過購買、修改購買的材料、化學和/或重組合成等來提供。然後該潛在組分將必須與對於OST-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化必需的進一步功能組分接觸，當然在允許OST活性的條件下。優選OST活性測定描述於(I) 2005 Chemistry &Biology 12， 1311-1315， (2) 2006 Science 314， 1148-1150， (3) 2007 Biochemistry46， 5579-5585， (4) 2007 Glycobiology 11， 1175-1182 和(5) 2011 Glycobiology 5，575-583。潛在組分或抑制劑是否具有OST活性優選通過與陽性或陰性標準品比較來驗證。例如，OST測定的功能性使用已知寡糖受體多肽例如六肽DQNATF (SEQ ID N0:5)來建立，然後用潛在功能性共有序列基序多肽取代六肽，並且確定取代多肽的糖基化。該簡單OST測定系統可調整用於鑑定任何功能性OST組分，優選選自以下的OST組分:(A)功能性寡糖供體，優選功能性脂質連接的寡糖(LLO)或焦磷酸^^一異戍二烯酯連接的寡糖供體，(B)功能性寡糖轉移酶(OST)，(C)功能性共有序列多肽，和(D)功能性糖基化抑制劑。
[0023]在第二個方面，本發明涉及用於設計寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的潛在組分的方法，所述潛在組分選自(a)潛在寡糖供體，優選脂質-連接的寡糖(LLO)或焦磷酸^^一異戍二烯酯(undecaprenyl pyrophosphate)結合的寡糖供體，(b)潛在寡糖轉移酶(OST)，(c)潛在共有序列基序多肽，和(d)潛在糖基化抑制劑，其包括步驟
(i)使用表1的原子坐標(距離骨架原子優選土2、更優選±1.5、最優選±1.0A均方根偏差(rmsd))用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的催化結構域的三維模型，所述催化結構域包含胺基酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和H485中的至少一個、兩個或三個、優選至少四個或五個、更優選至少六個或七個、最優選所有胺基酸，和/或，優選並且
(ii)使用表1的原子坐標(距離骨架原子優選土2、更優選±1.5、最優選±1.0 A均方根偏差(rmsd))用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型，所述多肽結合位點包含胺基酸M318、R331、W463、W464、D465、和1572中的至少一個或兩個、優選至少三個、更優選至少四個或五個、最優選所有胺基酸，
(iii)優選在(i)和/或(ii)的三維模型的胺基酸的坐標上進行全身平移和/或旋
轉， (ii1.D使用所述和/或(iii)的三維模型用於評價所述三維模型和/或(iii)和選自寡糖供體、優選脂質連接的寡糖(LLO)供體或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體、共有序列基序多肽和潛在糖基化抑制劑的寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的已知或潛在組分之間的立體化學互補性，或者
(ii1.2)改變所述(i)、(ii)和/或(iii)的三維模型中的至少一個胺基酸並且使用所述改變的(i)、(?)和/或(iii)的三維模型用於評價所述三維模型(i)、(?)和/或
(iii)和選自寡糖(LLO)供體、優選脂質連接的寡糖(LLO)供體或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體、共有序列基序多肽和潛在糖基化抑制劑的寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的已知或潛在組分之間的立體化學互補性，
(iv)以迭代方法通過觀察(ii1.1)、(ii1.2)的三維模型或寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的組分的變化優化所述立體化學互補性，
(v)設計選自(a)至(d)的潛在組分，其優化所述三維模型和潛在組分的所述立體化學互補性，
(v1.1)任選地提供優化的潛在組分，和
(v1.2)將所述潛在組分(a)至(d)中的至少一種與對於寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化必需的進一步功能組分接觸，
(v1.3)鑑定選自以下的功能組分
(A)功能性寡糖供體，優選功能性脂質連接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體，(B)功能性寡糖轉移酶(OST)，(C)功能性共有序列基序多肽，和(D)功能性糖基化抑制劑。[0024]在一個優選的實施方案中，在步驟(ii)中，紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型包含胺基酸13183331、1463、胃464、0465和1572中的至少兩個、優選至少三個、更優選至少四個、最優選所有胺基酸。
[0025]該方法與第一個方面的方法基本上非常類似，除了在剛剛上面的方法中，潛在OST組分通過以下來設計:當改變至少一種所述三維模型中的至少一個胺基酸時，在有或沒有全身平移和旋轉的情況下以迭代方法通過觀察三維模型或寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的組分的變化來優化其與所述三維模型的立體化學互補性。
[0026]一旦基於其與所述三維模型的優化的立體化學互補性選擇設計的潛在OST組分，其可以任選在OST測定中進行驗證，優選通過提供優化的潛在成分(通過化學和/或重組合成、購買、修飾已知化合物等)，將所述優化的潛在組分與對於寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化必需的進一步功能組分接觸。在最後的任選步驟中，OST反應的功能性組分或其抑制劑通過其對OST反應的影響來鑑定。通常，陽性和陰性參考組分用來驗證OST測定活性。
[0027]在本發明用於鑑定或設計潛在OST組分的方法的優選的實施方案中，步驟(i)的特定三維催化位點模型進一步包含以下胺基酸的一個或多個，優選至少5個，更優選至少10個，最優選所有，所述胺基酸選自與SEQ ID NO:2的結合肽的範德華距離之內的殘基，優選選自與所述肽的距離在5 A之內的胺基酸，更優選選自T53、T54、N55、D56、N146、R147、Y152、E315、T316、I317、M318、E319、V320、N321、R331、L374、R375、Y433、S435、V438、W463、W464、D465、G482、H485、1572、V575。
[0028]在進一步方面，本發明涉及機器可讀介質，其包含，例如，存儲
α)表1的原子坐標(距離骨架原子優選±2A、更優選±1.5A、最優選±1.0 A均方根偏差(rmsd))，優選包含胺基酸 D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和 H485 中的至少一個、兩個或三個、優選至少四個或五個、更優選至少六個或七個、最優選所有胺基酸，和/或，優選和
(?)表1的原子坐標(距離骨架原子優選±2A、更優選土1.5A、最優選±1.0 A均方根偏差(rmsd))，其用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型，所述多肽結合位點包含胺基酸M318、R331 (或A331)、W463、W464、D465、和1572中的至少一個或兩個、優選至少三個、更優選至少四個或五個、最優選所有胺基酸。
[0029](iii)優選地通過在⑴或(ii)的原子坐標上進行全身平移和/或旋轉而修改的(i)或(ii)的原子坐標。
[0030]上述介質尤其可用於各種目的，諸如來自其他細菌的OSTs的計算機輔助的藥物設計、藥物發現和X射線晶體分析。
[0031]接下來，參照特定實施方案和實驗進一步說明本發明，它們不應被理解為限制由所附權利要求提出的本發明的範圍。
[0032]SEQ ID NO:1列出紅嘴鷗彎曲桿菌PgIB的寡糖轉移酶(OST)的712個胺基酸。
【權利要求】
1.用於鑑定寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的潛在組分的方法，所述潛在組分選自 (a)潛在寡糖供體，優選脂質-連接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體， (b)潛在寡糖轉移酶(OST)， (c)潛在共有序列基序多肽，和 (d)潛在糖基化抑制劑， 所述方法包括步驟 (i)使用表1的原子坐標，所述原子坐標距離骨架原子優選土2A、更優選±1.5 A、最優選土1.0 A均方根偏差(rmsd)，用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的催化結構域的三維模型，所述催化結構域包含胺基酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和H485中的至少三個、優選至少四個、更優選至少六個、最優選所有胺基酸，和/或，優選並且 (ii)使用表1的原子坐標，所述原子坐標距離骨架原子優選土2A、更優選±1.5 A、最優選土1.0 A均方根偏差(rmsd)，用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型，所述多肽結合位點包含胺基酸1318、1?331、1463、1464、0465、和1572中的至少兩個、優選至少三個、更優選至少四個、最優選所有胺基酸， (iii)優選在(i)和/或(ii)的三維模型的胺基酸的坐標上進行全身平移和/或旋轉， (iv)使用所述和/或(iii)的三維模型用於設計或選擇潛在組分(a)至(d)中的至少一種， (v)提供所述潛在組分(a)至(d)中的至少一種，並且 (vi)將所述潛在組分(a)至⑷中的至少一種與對於寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化必需的進一步功能組分接觸， (vii)鑑定選自以下的功能組分 (A)功能性寡糖供體，優選功能性脂質-連接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體， (B)功能性寡糖轉移酶(OST)， (C)功能性共有序列基序多肽，和 (D)功能性糖基化抑制劑。
2.權利要求1的方法，其中在步驟(ii)中，紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型包含胺基酸13184331、1463、胃464、0465和1572中的至少兩個、優選至少三個、更優選至少四個、最優選所有胺基酸。
3.用於設計寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的潛在組分的方法，所述潛在組分選自 (a)潛在寡糖供體，優選脂質-連接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體， (b)潛在寡糖轉移酶(OST)， (c)潛在共有序列基序多肽，和 (d)潛在糖基化抑制劑，所述方法包括步驟 (i)使用表1的原子坐標，所述原子坐標距離骨架原子優選土2 A、更優選±1.5 A、最優選土1.0 A均方根偏差(rmsd)，用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的催化結構域的三維模型，所述催化結構域包含胺基酸D56、R147、D154、D156、E319、R375、Y468、和H485中的至少三個、優選至少四個、更優選至少六個、最優選所有胺基酸，和/或，優選並且 (?)使用表1的原子坐標，所述原子坐標距離骨架原子優選±2Α、更優選±1.5Α、最優選±1.0 A均方根偏差(rmsd)，用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型，所述多肽結合位點包含胺基酸1318、1?331、1463、1464、0465、和1572中的至少兩個、優選至少三個、更優選至少四個、最優選所有胺基酸， (iii)優選在(i)和/或(ii)的三維模型的胺基酸的坐標上進行全身平移和/或旋轉， (ii1.D使用所述和/或(iii)的三維模型用於評價所述三維模型和/或(iii)和選自寡糖供體、優選脂質連接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體、共有序列基 序多肽和潛在糖基化抑制劑的寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的已知或潛在組分之間的立體化學互補性，或者 (ii1.2)改變所述(i)、(ii)和/或(iii)的三維模型中的至少一個胺基酸並且使用所述改變的(i)、(?)和/或(iii)的三維模型用於評價所述三維模型(i)、(?)和/或(iii)和選自寡糖(LLO)供體、優選脂質連接的寡糖(LLO)供體或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體、共有序列基序多肽和潛在糖基化抑制劑的寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的已知或潛在組分之間的立體化學互補性， (iv)以迭代方法通過觀察(ii1.1)、(ii1.2)的三維模型或寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化的組分的變化優化所述立體化學互補性， (v)設計選自(a)至⑷的潛在組分，其優化所述一種或多種三維模型和潛在組分的所述立體化學互補性， (v1.1)任選地提供優化的潛在組分，和 (v1.2)將所述潛在組分(a)至(d)中的至少一種與對於寡糖轉移酶(OST)-催化的天冬醯胺-連接(「N-連接」)的糖基化必需的進一步功能組分接觸， (v1.3)鑑定選自以下的功能組分 (A)功能性寡糖供體，優選功能性脂質-連接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體， (B)功能性寡糖轉移酶(OST)， (C)功能性共有序列基序多肽，和 (D)功能性糖基化抑制劑。
4.權利要求3的方法，其中在步驟(ii)中，紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型包含胺基酸13184331、1463、胃464、0465和1572中的至少兩個、優選至少三個、更優選至少四個、最優選所有胺基酸。
5.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中步驟(i)的特定三維催化位點模型進一步包含以下胺基酸的一個或多個，優選所有，所述胺基酸選自位於與SEQ ID N0:2的結合肽的範德華距離之內的殘基，優選選自 Thr53、Thr54、Asn55、Asp56、Asnl46、Argl47、Tyrl52、Glu315、Thr316、Ile317、Met318、Glu319、Val320、Asn321、Arg331、Leu374、Arg375、Tyr433、Ser435、Val438、Trp463、Trp464、Asp465、Gly482、His485、Ile572、Val575。
6.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中步驟(i)的特定三維催化位點模型進一步包含以下胺基酸的一個或多個，優選所有，所述胺基酸選自位於與SEQ ID N0:2的結合肽的範德華距離之內的殘基，優選選自 Thr53、Thr54、Asn55、Asp56、Asnl46、Argl47、Tyrl52、Glu315、Thr316、Ile317、Met318、Glu319、Val320、Asn321、Ala331、Leu374、Arg375、Tyr433、Ser435、Val438、Trp463、Trp464、Asp465、Gly482、His485、Ile572、Val575。
7.根據權利要求1-6中任一項的方法，其中所述潛在組分是寡糖供體(a)，優選脂質-連接的寡糖(LLO)或焦磷酸十一異戊二烯酯結合的寡糖供體。
8.根據權利要求1-6中任一項的方法，其中所述潛在組分是寡糖轉移酶(OST)(b)。
9.根據權利要求1-6中任一項的方法，其中所述潛在組分是功能性共有序列基序多肽(C)。
10.根據權利要求1-6中任一項的方法，其中所述潛在組分是糖基化抑制劑(d)。
11.機器可讀介質，其包含 (i)表1的原子坐標，所述原子坐標距離骨架原子優選±2A、更優選±1.5 A、最優選土1.0 A 均方根偏差(rmsd)，優選包含胺基酸 D56、R147、D154、D156、E319、R357、Y468、和H485中的至少一個、兩個或三個、優選至少四個或五個、更優選至少六個或七個、最優選所有胺基酸，和/或，優選和 (ii)表1的原子坐標，所述原子坐標距離骨架原子優選±2A、更優選±1.5 A、最優選±1.0 A均方根偏差(rmsd)，其用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型，所述多肽結合位點`包含胺基酸1318、1?331、1463、1464、0465、和1572中的至少一個或兩個、優選至少三個、更優選至少四個或五個、最優選所有胺基酸， (iii)優選地，通過在(i)或(ii)的原子坐標上進行全身平移和/或旋轉而修改的(i)或(ii)的原子坐標。
12.根據權利要求11的機器可讀介質，其包含 (ii)表1的原子坐標，所述原子坐標距離骨架原子優選±2A、更優選±1.5A、最優選土1.0A均方根偏差(rmsd)，其用於生成紅嘴鷗彎曲桿菌的寡糖轉移酶(OST)的多肽結合位點的三維模型，所述多肽結合位點包含胺基酸M318、A331、W463、W464、D465、和1572中的至少一個或兩個、優選至少三個、更優選至少四個或五個、最優選所有胺基酸。
【文檔編號】C12Q1/48GK103620053SQ201280021372
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年5月3日 優先權日:2011年5月4日
【發明者】M.阿伊比, K.洛徹爾, C.裡扎克 申請人:瑞士蘇黎世聯邦理工學院