從木糖母液以及生物質酸水解液中提取l-阿拉伯糖的方法

2024-04-05 23:01:05

專利名稱：從木糖母液以及生物質酸水解液中提取l-阿拉伯糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術領域的糖的提取方法，具體地，涉及一種從木糖母 液以及生物質酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法。
背景技術：
L-阿拉伯糖又稱果膠糖，以L-阿拉伯聚糖、L-阿拉伯-木聚糖、L-阿拉伯-半 乳聚糖等半纖維素的形式大量存在於植物果漿、半纖維素、果膠酸中，很少以遊 離的形式存在。L-阿拉伯糖屬於新型的功能性糖，目前大量研究證明它具有抑制 機體腸道內蔗糖酶的活性，能夠大大減低對攝入蔗糖的吸收以及減低胰島素的分 泌從而減低肥胖以及糖尿病發生，在蔗糖裡添加3-4%的L-阿拉伯糖即能在食後 30分鐘內極顯著的減低血糖的含量(Metabolism, Vol 45,No 11, 1996:pp 1368-1374; Journal of Nutrition, Vol 131，No 3, 2001 :pp 796-799; Journal of Japanese Society of Nutrition and Food Science, Vol 53, No 6,2000:pp 243-247)。日 前由哥本哈根大學與世界糖醇最大生產商Danisco公司聯合進行的人體臨床試驗 表明，食入含有一定量L-阿拉伯糖的富含蔗糖的飲料能極顯著的降低血糖的濃 度與胰島素的分泌(The Effects of Increasing Doses of L-Arabinose in a Sucrose Rich Meal on Intestinal Sucrase Activity in Man, 2005年9月開始進行該項試驗， 臨床試驗批准號為NCT00302302)。
除了在食品中具有重要的功能外，L-阿拉伯糖還在醫藥上具有重要的作用。 L-阿拉伯糖可以用來合成多種核苷酸類似物等抗病毒藥物，用於治療白血病、癌 症的化療藥物。由韓國Bukwang公司研發的抗B肝病毒新藥克拉夫定 (Clevudine， 1陽(2誦fluoro-5-methyl-beta國L-arabino-furanosyl)uracil ， 2'-氟f^-5-甲基 -卩-L-阿糖呋喃糖基尿嘧啶，L-FMAU)的合成即用到L-阿拉伯糖(AntivirTher， Vol 3 (suppl 3), 1998:pp 113-121; Journal of Medical Chemestry, Vol 40, 1997: pp 2750-2754)。 L-FMAU能夠大大減低B肝病毒在體內的水平。L-FMAU作為抗乙 肝病毒新藥已經在世界範圍內申請了專利保護(中國專利號CN03821877.1、國
際公布W02004/006843)。除了L-FMAU外，目前已經合成了許多含阿糖的衍生 物均表現出很好的抗病毒能力，比如衍生物2，-deoxy-2，-fluoro- e -L-arabinofhranosylcytosine (L-FAC) 、 5陽iodocytosine衍生物 (L-FIAC ) 、 9-(2-deoxy-2-fluoro- 0 -L-arabinoforanosyl)purine等都被證明具有很好的抗B肝病 毒的活性(JournalofMedicalChemestry, Vol 40， 1997: pp 2750-2754)。含L-阿拉 伯糖的核苷類似物除了具有良好的抗B肝病毒活性外，還具有良好的抗EB病毒、 單純皰疹病毒、流感病毒的活性(Journal of Medical chemistry, Vol 43, No 13, 2000:pp 2538-2546; Journal of Agricuture Food Chemistry, Vol 55, No 25, 2007: pp 10194-10199)。 L-核糖也是一種重要的醫藥中間體，可以由L-阿拉伯糖在含鉬化 合物(Mo03 、 H2Mo04， (NH4) 2Mo04等)的催化下異構合成(專利 WO/2000/029417、 Organic Letters, Vol 1, No 10,1999:卯1517-1519)。
經對現有技術文獻的檢索發現，美國專利US4816078 (1989年公開)與 US6506897 (2003年公開)描述了從甜菜粕中分別採用鹼提取含阿拉伯聚糖的半 纖維素，然後釆用稀酸水解半纖維素的方法使得L-阿拉伯糖游離出來。在前者 的實施例一中採用氫氧化鈣在高溫下(140°C)將含阿拉伯糖的半纖維素溶出， 用硫酸中和，濃縮到含乾物質45%，再通過鈣離子螯合的陽離子吸附樹脂將阿拉 伯聚糖分離出來，再用硫酸將阿拉伯聚糖水解，再用碳酸鈣中和，過濾，再將澄 清的濾液濃縮到含乾物質45%，再通過鈣離子螯合的陽離子吸附樹脂將L-阿拉 伯糖分離，進一步濃縮，結晶乾燥得到純度95%的L-阿拉伯糖。後者的實施例 一中採用的方法基本與前者相同，只是鹼提取阿拉伯聚糖的溫度為100°C而不是 140°C，採用的吸附樹脂為鈉型而不是鈣型。該方法都需要經過水解的方法，由 於水解除了游離出L-阿拉伯糖外還有很多其它的單糖(比如葡萄糖、半乳糖、 木糖等)也游離出來，採用色譜分離具有難度大，需要經過幾步色譜分離才能將 L-阿拉伯糖與其它單糖分離開來使得生產成本高。
英國專利GB2408262 (2005年公開)描述了另一種從甜菜粕中提取L-阿拉 伯糖的方法，同樣用氫氧化鈣進行高溫蒸煮，得到含阿拉伯聚糖的鹼液，再通入 C02生成碳酸鈣沉澱，過濾去除不溶性鹽以及雜質並濃縮，加入硫酸水解該阿拉 伯聚糖，超濾並中和，再通過陰陽離子交換去除離子，結晶，可得到純度97%
以上的L-阿拉伯糖。該方法雖然不用色譜分離，但對鹼提取的要求高，若控制 不當，除了阿拉伯聚糖被提取外，阿拉伯木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖也會被提取， 影響後續酸水解L-阿拉伯糖的純度，進而影響產品的純度。
上述方法都需要分別採用鹼液蒸煮以及硫酸水解，耗能大，汙染大，不適合 大規模工業化生產。
由日本三和興產株式會社申請的中國發明專利CN99805686.3(2001年公開) 公布了一種只採用酸水解的方法，使植物纖維與酸接觸，使包含於植物纖維中的 L-阿拉伯糖在選擇性條件下水解釋放。但在實施例中，除了 L-阿拉伯糖被游離 釋放外，尚有含量為L-阿拉伯糖10-80%的木糖被游離釋放。在0.05N的硫酸水 解條件下，雖然水解游離出的L-阿拉伯糖要遠大於木糖，但在這樣低的酸濃度 下水解效率很低，但當將硫酸濃度提高到0.2N以上時有約超過L-阿拉伯糖含量 10%以上的木糖也游離釋放出來。在實際生產時較難控制酸的濃度與水解時間， 而且要得到高純度的L-阿拉伯糖，同樣需要經過色譜分離的方法，大大增加了 生產成本。
上面所述方法都需要採用高溫水解的方法來游離釋放L-阿拉伯糖，需要消 耗大量的能源，而釆用酶水解的方法則不需要。由日本尤尼蒂卡株式會社申請的 中國發明專利CN01800804.6 (2002年公開)公布了一種採用酶處理阿拉伯聚糖、 阿拉伯-木聚糖以及阿拉伯-半乳聚糖的方法，採用果膠酶、纖維素酶或者蔗糖酶 將含有上述聚糖的果渣、甜菜粕、玉米粕等廢棄物酶解，使L-阿拉伯糖從中遊 離釋放出來。但是該方法存在酶的成本高以及酶水解的效率低下的缺點，而且酶 解過程中木糖與葡萄糖也會同時被酶解釋放出來，後續分離純化比較困難，難以 工業化生產。
中國發明專利CN200710119843.3 (2008年公開)公布了一種採用澱粉酶處 理、酸水解以及酵母發酵相結合的方法從玉米皮中提取L-阿拉伯糖的方法。該 方法先用澱粉酶將玉米皮中的含有的澱粉水解以去除大部分葡萄糖，再採用 1-5%的硫酸、鹽酸或者乙酸水解澱粉酶處理過的玉米皮，再中和以及通過離子 交換柱去除離子，再在上述水解液中接種麵包酵母或者啤酒酵母將木糖、葡萄糖 以及半乳糖等雜糖消耗，結晶得到純度97%以上的L-阿拉伯糖。該方法由於需
要採用澱粉酶預先處理，增加了操作步驟與生產成本，而且水解後存在一定量的 木糖，所使用的麵包酵母或者啤酒酵母本身不能代謝消耗木糖。但是，該發明中 並沒有註明所使用的麵包或者啤酒酵母是否為能代謝木糖的基因工程麵包酵母。
總之，依靠現有技術來生產L-阿拉伯糖都存在生產成本過高，對環境不友 好以及提取純度不高的缺點，因此開發一種經濟高效的提取方法對降低生產成本 非常重要。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種從木糖母液以及生物質酸
水解液中提取L-阿拉伯糖的方法。本發明的方法通過特定酵母消耗除L-阿拉伯 糖以外的雜糖，從木糖母液以及生物質酸水解液中高效提取L-阿拉伯糖。本發 明的提取方法無汙染、生產成本低，適合工業規模化生產的從生產木糖的木糖母 液以及生物質酸水解液中分離提取L-阿拉伯糖。
本發明是通過以下技術方案實現的
本發明菌株的獲得本發明所用的酵母菌菌株由酵母菌菌種庫中經過篩選分 離並經過馴化而得到。分離方法為將保存在石蠟油裡面的酵母菌先接種到YPD 固體平板上活化，然後逐一接種含P/。木糖的YNB、 1%卜阿拉伯糖的YNB、 1%半乳 糖的YNB、 W木糖醇的YNB固體平板上，得到一株除了不能在含1%L-阿拉伯糖的 YNB上生長但能在其它三種培養基上旺盛生長的酵母Y161，經鑑定為微生物菌株 德巴利酵母屬(Debaryomyces， spp)的酵母。
本發明包括以下步驟
第一步、木糖母液和生物質的預處理
(1) 木糖母液的預處理將木糖母液用蒸餾水稀釋3-10倍，加入氮源和
無機鹽，氮源的添加質量為稀釋後木糖母液質量的0.2%到3%;無機鹽的添加質 量為稀釋後木糖母液質量的0.05%到0.3%;
(2) 生物質的預處理將生物質用體積百分比為0.5%-4%的酸液進行水 解；將水解液中和至pH4.5-6.0，收集上清液；將上清液通過離子交換樹脂以脫 除水解液裡的陰陽離子；然後將脫除離子後的水解液濃縮至折光率大於15;加 入氮源和無機鹽，氮源的添加質量為生物質酸水解液質量的0.2%到3%;無機鹽
的添加質量為生物質酸水解液質量的0.05%到0.3%;
第二步、將經過預處理的木糖母液和生物質酸水解液進行蒸汽溼熱滅菌製成 無菌培養基；
第三步、製備酵母一級種子液將保存在試管斜面上的德巴利酵母CGMCC 2480細胞接種到液體發酵培養基的試管中，在26-36。C下進行培養，按照 150-350rpm的攪拌速度，培養12-36小時；
第四步、製備酵母二級種子液將一級種子液全部加入到含一定量液體發酵
培養基的500ml搖瓶中，接種量按照5-20%的比率。培養條件同第三步；
第五步、製備酵母三級種子液將二級種子液全部加入到含一定量的液體發
酵培養基的2000ml的搖瓶中，接種量按照5-20%的比率。培養條件同第三步；
第六步、將第五步中製備的酵母三級種子液接種到第二步中得到的無菌發酵 培養基中發酵培養，酵母三級種子液的接種量按照體積比為5-20%，發酵溫度為 25-35°C，發酵時間為36-120小時，發酵攪拌電機轉速在100轉/分-600轉/分； 發酵過程中每間隔一定時間取樣並且檢測發酵液裡各種糖的含量與相對純度，當 L-阿拉伯糖的相對純度大於80%時即可停止發酵；
第七步、發酵結束後去除酵母菌，發酵上清液進行活性炭或者大孔樹脂進行 脫色、離子交換樹脂進行脫鹽、濃縮處理，得到澄清無色的發酵液；
第八步、在淨化後的發酵液中加入無水乙醇，加入無水乙醇的體積為淨化後 發酵液體積的2-8倍，再加入L-阿拉伯糖晶種後在4'C-3(TC下結晶，L-阿拉伯糖 晶種的添加質量為淨化後發酵液的質量的10%;
第九步、將含晶懸液離心，用體積百分比為95%的乙醇洗滌晶體，乾燥後得 到L-阿拉伯糖晶體。
所述第一步中的木糖母液用蒸餾水稀釋是指為了提高酵母的發酵效率，使 得酵母能在最少的時間內將除L-阿拉伯糖以外的單糖代謝，需要對木糖母液進 行一定倍數的稀釋，本發明優選對木糖母液稀釋4-6倍。如果稀釋倍數過低，酵 母發酵時間長，而且雜糖代謝不完全；稀釋倍數過高，雖然能減少發酵時間，雜 糖代謝完全，但是增加了後續濃縮的倍數，增加了能源的消耗。
所述第一步中的氮源為酵母粉、酵母膏、酵母抽提物、豆餅粉、玉米漿、棉
籽粉、硫酸銨、尿素。但是由於酵母膏與玉米漿顏色深而且本身除了含有氮源外 還含有很多其它雜質，而且粘度大增加了操作的難度，增加了後續分離純化的負 荷。在本發明中優選酵母粉、酵母抽提物、豆餅粉以及棉籽粉添加適量的硫酸銨。 所述第一步中的無機鹽為硫酸鎂以及磷酸氫二鉀，其中硫酸鎂的添加質量為 生物質酸水解液質量的0.01-0.04%，磷酸氫二鉀的添加質量為生物質酸水解液質 量的0.05-0.2%。
所述第一步中的生物質包括玉米皮、麥麩、玉米芯、甘蔗渣、稻殼、棉籽殼、 甜菜粕、酒糟等富含阿拉伯聚糖任何植物纖維。由於玉米皮、甜菜粕、稻殼中阿 拉伯聚糖含量比較高(可以達到15%以上)，所以優選玉米皮、甜菜粕與稻殼， 而且這些原料來源廣泛。先將上述生物質用清水洗淨除去表面的灰分，用0.2% 的硫酸在115'C條件下預水解60分鐘，放出預水解液。然後在2%的硫酸或者鹽 酸在120'C條件下繼續水解2小時，將水解液中和至pH4.5以上。過濾得到透明 淡黃色的水解液。對於玉米芯、甘蔗渣、酒糟等預水解是必需的，能夠降低後續 水解液的雜質的成分含量，提高後續發酵的效率。
所述第一步中的離子交換樹脂為鈉型離子交換樹脂，可以交換去除水解液中 絕大部分鈣離子，因為採用的中和劑是氧化鈣，中和後鈣離子在水解液中的含量 達到飽和，大量的鈣離子存在會嚴重抑制酵母的發酵效率，所以必須經過離子交 換將大部分鈣離子去除。經過一步鈉型陽離子交換樹脂去除鈣離子，可以再經過 陰離子交換樹脂去除硫酸根離子。
所述第一步中的氮源可以是單一的氮源，也可以是兩種以上的氮源的混合， 比如同時添加酵母粉和棉籽粉、同時添加酵母粉、豆餅粉和硫酸銨，也可以只添 加酵母粉，但是混合氮源的發酵效果要好於單一氮源。混合氮源的質量比為酵
母粉和棉籽粉的質量比為h 1;酵母粉、豆餅粉和硫酸銨的質量為1: 1: 0.2 。
所述第一步中的無機鹽是指硫酸鎂與磷酸二氫鉀，其含量分別是0.02%與 0.2%。
所述第二步中的滅菌方法採用蒸汽溼熱滅菌，在108"C下滅菌20分鐘，不
宜採用115r以上的溫度，否則含高濃度糖的發酵液容易焦化，影響酵母發酵效率。
所述第七步中的離心是指發酵結束後採用小型壓濾機將酵母細胞過濾或者 採用低速離心(4000rpm)將酵母細胞離心下來。在澄清的發酵液中加入粉末型 活性炭或者將發酵液通入脫色樹脂進行脫色。所用的脫色樹脂的型號為D301 (山 東東大化工股份有限公司生產)，脫色樹脂的參數為直徑為4cm，高度為60cm， 其中柱床高50cm，流速控制在每分鐘100毫升以內。採用活性炭脫色時，在澄 清發酵液中加入質量百分比為2-5%的粉末型活性炭，在90'C下以150轉速攪拌， 脫色60-120分鐘。再將脫色好的發酵液經過陽離子-陰離子-陽離子交換樹脂，直 到電導率低於20us/cm。再濃縮到折光率為60%以上。加入2-8倍的無水乙醇， 充分混勻，再加入質量百分比為5-10%的L-阿拉伯糖晶種，緩慢攪拌，在4-30 。C下結晶20-30小時。離心分離晶體，加入2倍質量的體積百分比為95%的乙醇 洗滌2-3次，乾燥晶體，得到純度大於98y。的L-阿拉伯糖白色粉末晶體。
本發明所述的一種消耗雜糖的酵母菌株CGMCC 2480的生物學特性如下
1、 形態特徵該菌株為細胞圓形或卵圓形，出芽生殖。
2、 培養特徵該菌株在YPD培養基上培養形成菌落，菌落圓形，邊緣光滑， 乳白色，表面微溼潤。
3、 菌株的生理生化特性能利用葡萄糖，半乳糖、木糖，木糖醇，山梨醇， 甘露醇，不利用L-阿拉伯糖以及L-阿拉伯糖醇。最適培養溫度為30-34°C，最 適生長pH值為5.0-7.5。
4、 菌株具有良好的穩定性將該菌株置於-201:含30%的甘油中保存，傳 代20次以上後仍然保持菌株的活性穩定。
本發明選用消耗雜糖的酵母菌株，通過發酵培養可以將木糖母液或者生物質 酸水解液中除L-阿拉伯糖以外的其它糖類代謝消耗，從而達到從木糖母液和生 物質酸水解液中高效提取L-阿拉伯糖的目的。本發明所利用的酵母菌能利用由 木糖轉變而成的木糖醇，能將98%以上的木糖醇代謝消耗。除了能高效的利用母 液或者水解液裡的木糖醇外，該酵母菌株還能高效利用半乳糖以及甘露糖。發酵 結束後其它雜糖的含量少於10%。同時，該酵母菌株雖然也能將部分L-阿拉伯 糖轉變為L-阿拉伯糖醇，但是轉變的量很少，小於5%，對後續分離純化影響很 小。而且該酵母的耐受性好，木糖母液不需要經過脫色以及脫毒前處理即能直接
用水稀釋一定倍數進行發酵，而不會影響其生長與發酵的效率。本發明所的提取 L-阿拉伯糖的方法不需要用到層析的步驟即能製備純度大於98%的L-阿拉伯糖， 大大減少了分離純化的成本與步驟。採用本發明提供的方法尤其是從木糖母液中 提取L-阿拉伯糖的方法，耗能少，汙染低，能夠變廢為寶，很好的解決了目前 困擾木糖生產廠家木糖母液處理的問題。
本發明所使用的菌株為
菌株分類命名德巴利酵母(Debaryomyces， spp)，
保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)， 保藏日期2008年5月4日， 保藏號CGMCC 2480。


圖l發酵前木糖母液的HPLC分析圖。
圖2從木糖母液發酵液中分離純化的L-阿拉伯糖晶體的HPLC分析圖。
圖3木糖母液發酵後的HPLC分析圖。
圖4生物質酸水解液發酵後的HPLC分析圖。
圖5從生物質酸水解液中分離純化的L-阿拉伯糖晶體的HPLC分析圖。
具體實施例方式
以下對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下 進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實 施例。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制 造廠商所建議的條件。
實施例1
量取1000ml木糖母液(來自山東福田藥業有限公司)，此母液為用玉米芯水 解液結晶木糖後殘留下的淡褐色粘稠液體，該母液含有木糖50-70%， L-阿拉伯 糖15-20%,葡萄糖10-15%，半乳糖3-8%以及7%以下的其它雜糖(均按乾物質 的質量百分比計)，該母液的HPLC分析如圖l所示木糖母液裡面的成分很復 雜，其中木糖佔50%以上，L-阿拉伯糖佔20%左右，葡萄糖佔15%左右，半乳 糖佔10%左右。加入質量百分比為1%的酵母粉(OXOID公司生產)、質量百分
比為0.01%的無水硫酸鎂和質量百分比為0.1%的磷酸二氫鉀，用去離子水稀釋 到2.7L (母液稀釋3倍)，充分溶解，轉入10L的發酵罐，離位滅菌，滅菌條件 為115°C下滅菌20分鐘。將保存在試管斜面上的德巴利酵母CGMCC2480接種 到含5ml發酵培養基的50ml的試管中，在26'C下進行培養，按照200rpm的攪 拌速度，培養24小時得到一級種子液；將一級種子液5ml全部加入到含50ml 發酵培養基的500ml搖瓶中，在32"C下進行培養，按照250rpm的攪拌速度，培 養12小時得到二級種子液；將二級種子液60ml全部加入到含300ml發酵培養 基的2000ml的搖瓶中，在3(TC下進行培養，按照250rpm的攪拌速度，培養24 小時得到三級種子液;再將此三級種子液按照10%的體積比全部接種到發酵罐中 進行發酵，在32。C， 300rpm條件下發酵120小時。離心分離酵母菌體，在澄清 發酵液中加入粉末活性炭30克，80。C脫色60分鐘，轉速為150轉/分，濾布過 濾除去活性炭，重複脫色3次。無色的發酵液再進行離子交換處理依次通過 D001型陽離子交換柱，D201型陰離子交換柱以及D001型陽離子交換柱，濾液 通過交換柱的流速為每分鐘100毫升。檢測流出液的電導率，當流出液的電導率 低於20iis/cm時停止離子交換。將脫鹽後的發酵液通過旋轉蒸發濃縮到原來體 積的三分之一，加入6倍體積的無水乙醇，緩慢加入L-阿拉伯糖含量的10%的 L-阿拉伯糖種晶(此處加入10克晶種)，然後，輕輕攪拌，20'C放置24小時充 分結晶，離心得到白色晶體，再用體積比為95%的乙醇洗滌二次，然後乾燥，稱 重得到78克乾燥的L-阿拉伯糖晶體。經HPLC分析，結果如圖2所示從木糖 母液發酵液中分離純化的L-阿拉伯糖晶體的HPLC的純度可以達到98%。 實施例2
量取1000ml木糖母液(來自山東福田藥業有限公司)，加入質量百分比為 0.1%的酵母粉(OXOID公司生產)、0.1%豆餅粉以及0.01%無水硫酸鎂與0.04% 磷酸二氫鉀，用去離子水稀釋到4500ml (母液稀釋5倍)，充分溶解，轉入10 升的發酵罐，離位滅菌，滅菌條件為115'C下滅菌30分鐘。將保存在試管斜面 的上的德巴利酵母CGMCC 2480接種到含5ml發酵培養基的50ml的試管中，在 36'C下進行培養，按照150rpm的攪拌速度，培養12小時得到一級種子液；將 一級種子液2.5ml全部加入到含50ml發酵培養基的500ml搖瓶中，在35'C下進
行培養，按照250rpm的攪拌速度，培養12小時得到二級種子液；將二級種子 液25ml全部加入到含500ml發酵培養基的2000ml的搖瓶中，在35'C下進行培 養，按照250rpm的攪拌速度，培養24小時得到三級種子液；再將此三級種子 液按照5%的體積比全部接種到發酵罐中進行發酵，在35°C, 600rpm條件下發 酵48小時，此時對發酵液進行HPLC分析檢測L-阿拉伯糖的純度，結果如圖3 所示木糖母液經過酵母Y161發酵36-120小時後，發酵液裡L-阿拉伯糖佔絕 大多數，純度可以達到總糖的95%以上，L-阿拉伯糖的保留時間為10.898min。。 離心分離酵母菌體，在澄清發酵液中加入粉末活性炭30克，80。C脫色60分鐘， 轉速為150轉/分，濾布過濾除去活性炭，重複脫色3次。無色的發酵液再進行 離子交換處理:依次通過D001型陽離子交換柱，D201型陰離子交換柱以及DOOl 型陽離子交換柱(山東大大化工股份有限公司生產)，濾液通過交換柱的流速為 每分鐘100毫升。檢測流出液的電導率，當流出液的電導率低於10lis/cm時停 止離子交換。將脫鹽後的發酵液通過旋轉蒸發濃縮到原來體積的五分之一，加入 2倍體積的無水乙醇，緩慢加入10克L-阿拉伯糖晶種，然後，輕輕攪拌，3(TC 放置24小時充分結晶，離心得到白色晶體，再用95%乙醇洗滌二次，然後乾燥， 得到88克乾燥的L-阿拉伯糖晶體。經HPLC分析，結果如圖2所示此晶體中 L-阿拉伯糖的純度在98%以上。 實施例3
量取700ml木糖母液(來自山東昌邑佳和糖業有限公司)，此母液為用玉米 芯水解液結晶木糖後殘留下的深褐色粘稠液體，該母液含有木糖45-70%, L-阿 拉伯糖10-20%，葡萄糖10-20%，半乳糖3-8%以及7%以下的其它雜糖(均按幹 物質質量百分比計)。加入質量百分比為3%的酵母粉(湖北安琪股份有限公司生 產)以及0.1%無水硫酸鎂與0.2%磷酸二氫鉀，用去離子水稀釋到6.3升(母液 稀釋10倍)，充分溶解，轉入10升的發酵罐，離位滅菌，滅菌條件為115'C下 滅菌20分鐘。將保存在試管斜面的上的德巴利酵母CGMCC 2480接種到含5ml 發酵培養基的50ml的試管中，在3(TC下進行培養，按照350rpm的攪拌速度， 培養36小時得到一級種子液；將一級種子液10ml全部加入到含50ml發酵培養 基的500ml搖瓶中，在28'C下進行培養，按照250rpm的攪拌速度，培養12小
時得到二級種子液；將二級種子液50ml全部加入到含350ml發酵培養基的 2000ml的搖瓶中，共兩瓶700ml種子液，在28'C下進行培養，按照250rpm的 攪拌速度，培養24小時得到三級種子液；再將此三級種子液按照20%的體積比 全部接種到發酵罐中進行發酵，在25'C， 100轉電機攪拌條件下發酵36小時。 離心分離酵母菌體，在澄清發酵液中加入粉末活性炭50克，8(TC脫色60分鐘， 轉速為150轉/分，濾布過濾除去活性炭，再將活性炭脫色液經過D301脫色樹脂 進一步脫色。無色的發酵液再進行離子交換處理依次通過001*7型陽離子交換 柱，201*7型陰離子交換柱以及001*7型陽離子交換柱(上海樹脂廠有限公司生 產)，濾液通過交換柱的流速為每分鐘IOO毫升。檢測流出液的電導率，當流出 液的電導率低於10iis/cm時停止離子交換。將脫鹽後的發酵液通過旋轉蒸發濃 縮到原來體積的十分之一，加入8倍體積的無水乙醇，緩慢加入15克晶種，然 後，輕輕攪拌，4。C放置24小時充分結晶，離心得到白色晶體，再用95%乙醇洗 漆二次，然後乾燥，得到57克乾燥的L-阿拉伯糖晶體。經HPLC分析，此晶體 中L-阿拉伯糖的純度在98%以上。 實施例4
量取500ml木糖母液(來自吉林江南糖醇有限公司)，此母液為用玉米芯水 解液結晶木糖後殘留下的深褐色粘稠液體，該母液含有木糖50-75%， L-阿拉伯 糖10-20%，葡萄糖10-20%，半乳糖3-8%以及7%以下的其它雜糖(均按乾物質 質量百分比計)。加入質量百分比為1.0%的酵母粉(湖北安琪股份有限公司生 產)、0.5%棉籽粉以及0.02%無水硫酸鎂與0.2%磷酸二氫鈉，用去離子水稀釋到 6.75升(母液稀釋15倍)，充分溶解，轉入10升的發酵罐，離位滅菌，滅菌條 件為115'C下滅菌30分鐘。將保存在試管斜面的上的德巴利酵母CGMCC 2480 接種到含5ml發酵培養基的50ml的試管中，在32'C下進行培養，按照200rpm 的攪拌速度，培養24小時得到一級種子液;將一級種子液5ml全部加入到含50ml 發酵培養基的500ml搖瓶中，在32"C下進行培養，按照250rpm的攪拌速度，培 養12小時得到二級種子液；將二級種子液50ml全部加入到含375ml發酵培養 基的2000ml.的搖瓶中，共兩瓶750ml種子液，在32。C下進行培養，按照250rpm 的攪拌速度，培養24小時得到三級種子液；再將此三級種子液按照10%的體積
比全部接種到發酵罐中進行發酵，在32。C， 400轉電機攪拌條件下發酵36小時。 下面的分離純化過程同實施例3,得到47克乾燥的L-阿拉伯糖晶體。經HPLC 分析，此晶體中L-阿拉伯糖的純度在98。/。以上。 實施例5
稱取200克千酒糟，用自來水洗淨灰塵與雜質，將水濾幹，加入1200ml 0.2% 濃度的硫酸在115'C預水解60分鐘(在高壓滅菌器中水解)，去除水解液，在預 水解過的酒糟中加入800ml的體積比為2%的硫酸，在120。C下水解120分鐘。 壓濾得到淡黃色的水解液1000ml。將水解液用CaO中和至pH4.5以上，過濾除 去沉澱得到澄清的水解液。將水解液通過Na型陽離子交換柱(D001)和鈉型離 子交換樹脂(FDL-18)(山東東大化工股份有限公司生產)除去絕大多數Ca^離 子，再通過C1型陰離子交換柱將S042—離子除去。所用的離子交換柱的參數為 直徑為4cm，高為60cm，流速每分鐘50毫升。濃縮過程中不斷取樣並且使用折 光儀(阿貝折光儀，上海光學儀器五廠生產)測量折光率，濃縮至折光率為20%。 得到200ml濃縮的水解液，折光率為21.45%。在此水解液中加入質量百分比為 1.5%的酵母粉(安琪酵母)、0.02%的硫酸鎂以及0.1%的磷酸二氫鉀，充分混勻 溶解，115。C下滅菌20分鐘。將保存在試管斜面上的德巴利酵母CGMCC2480 接種到含5ml發酵培養基的50ml的試管中，在28"C下進行培養，按照200rpm 的攪拌速度，培養24小時得到一級種子液;將一級種子液5ml全部加入到含50ml 發酵培養基的500ml搖瓶中，在28'C下進行培養，按照250rpm的攪拌速度，培 養12小時得到二級種子液；取50ml 二級種子液加入到上述滅菌的發酵培養基 中。此處發酵培養基的成分為折光率為20%的水解液100毫升，加入1克酵母 粉(安琪酵母)，0.01%硫酸鎂，0.2%磷酸二氫鉀，溶解，滅菌。在250rpm， 32 'C下發酵培養60小時，離心分離酵母菌得到澄清的發酵液。加入5克粉末活性 炭，在85'C下攪拌脫色(100rpm) 60分鐘，重複直到發酵液顏色基本無色或者 淡黃色。再經過DOOl、 D201以及D001離子交換樹脂去除鹽離子得到潔淨的發 酵液，濃縮到折光率70%，加入5倍體積的無水乙醇，混勻，然後加入l克L-阿拉伯糖晶種，混勻，在4。C下結晶。離心分離晶體，用體積百分比為95%的乙 醇洗滌一次，乾燥得到5.7克L-阿拉伯糖白色粉末結晶。
實施例6
稱取200克幹甘蔗渣，用自來水洗淨灰塵與雜質，將水濾幹，加入1200ml 體積百分比為0.5%的鹽酸溶液，在115t下預水解60分鐘(在高壓滅菌器中水 解)，去除水解液，加入800ml體積百分比為1.5%的鹽酸溶液，在12(TC下水解 120分鐘。壓濾得到淡黃色的水解液1000ml。將水解液用CaO中和至pH5.0以 上，過濾除去沉澱得到澄清的水解液。將水解液通過Na型陽離子交換柱(DOOl) 和鈉型離子交換樹脂(FDL-18)(山東東大化工股份有限公司生產)除去絕大多 數C^+離子，再通過C1型陰離子交換柱將S0^離子除去。所用的離子交換柱的 參數為直徑為4cm，高為60cm，流速每分鐘50毫升。濃縮過程中不斷取樣並 且使用折光儀(阿貝折光儀，上海光學儀器五廠生產)測量折光率，濃縮至折光 率為20%。得到200ml濃縮的水解液，折光率為21.45%。在此水解液中加入質 量百分比為0.1%的酵母粉(OXOID公司生產)、0.1%豆餅粉、0.01%無水硫酸鎂 與0.04%磷酸二氫鉀，充分混勻溶解，115'C下滅菌20分鐘。下面的步驟同實施 例5。乾燥得到11.6克L-阿拉伯糖白色粉末結晶。
實施例7
稱取200克幹玉米芯，用自來水洗淨灰塵與雜質，將水抽濾幹，加入1200ml 體積百分比為4M的硫酸溶液，在115"C下預水解60分鐘(在高壓滅菌器中水解)， 去除淡黃色水解液，再用清水洗滌一次，抽濾幹水分。在加入800ml體積百分比 為2%的鹽酸溶液，在120° C下水解120分鐘。壓濾得到淡黃色的水解液750ml。 將水解液用CaO中和至pH6.0以上，過濾除去沉澱得到澄清的水解液。將水解 液通過Na型陽離子交換柱(D001)和鈉型離子交換樹脂(FDL-18)(山東東大 化工股份有限公司生產)除去絕大多數(^2+離子，再通過Cl型陰離子交換柱將 SO^離子除去。所用的離子交換柱的參數為直徑為4cm，高為60cm，流速每 分鐘50毫升。濃縮過程中不斷取樣並且使用折光儀(阿貝折光儀，上海光學儀 器五廠生產)測量折光率，濃縮至折光率為20%。得到200ml濃縮的水解液， 折光率為21.45%。在此水解液中加入質量百分比為1.5%的酵母粉(安琪酵母)、 0.1%無水硫酸鎂與0.2%磷酸二氫鉀，充分混勻溶解，115'C下滅菌20分鐘。下 面的步驟同實施例5。水解液發酵結束後取樣HPLC分析其L-阿拉伯糖的純度，
結果如圖4所示玉米芯水解液經過酵母Y161發酵36-120小時後，發酵液裡 L-阿拉伯糖佔絕大多數，純度可以達到總糖的卯％以上。乾燥得到9.6克L-阿拉 伯糖白色粉末結晶，HPLC分析其純度，結果如圖5所示從玉米芯水解液中分 離純化的L-阿拉伯糖晶體的HPLC的純度可以達到99%。。 實施例8
稱取200克幹玉米皮，加入1500ml體積百分比為1%的鹽酸溶液，在120 "C下水解120分鐘。壓濾得到淡黃色的水解液1200ml。下面的中和、脫色、發 酵與純化步驟同實施例5。乾燥得到17.5克L-阿拉伯糖白色粉末結晶。
權利要求
1.一種從木糖母液以及生物質酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特徵在於，包括如下步驟第一步、木糖母液和生物質的預處理(1)木糖母液的預處理將木糖母液用蒸餾水稀釋3-10倍，加入氮源和無機鹽，氮源的添加質量為稀釋後木糖母液質量的0.2％到3％，無機鹽的添加質量為稀釋後木糖母液質量的0.05％到0.3％；(2)生物質的預處理將生物質用體積百分比為0.5％-4％的酸液進行水解，將水解液中和至pH4.5-6.0，收集上清液，將上清液通過離子交換樹脂以脫除水解液裡的陰陽離子，然後將脫除離子後的水解液濃縮至折光率大於15，加入氮源和無機鹽，氮源的添加質量為生物質酸水解液質量的0.2％到3％，無機鹽的添加質量為生物質酸水解液質量的0.05％到0.3％；第二步、將經過預處理的木糖母液和生物質酸水解液進行蒸汽溼熱滅菌製成無菌培養基；第三步、製備酵母一級種子液將保存在試管斜面上的德巴利酵母CGMCC2480細胞接種到液體發酵培養基的試管中，在26-36℃下進行培養，按照150-350rpm的攪拌速度，培養12-36小時；第四步、製備酵母二級種子液將一級種子液全部加入到含一定量液體發酵培養基的500ml搖瓶中，接種量按照5-20％的比率。培養條件同第三步；第五步、製備酵母三級種子液將二級種子液全部加入到含一定量的液體發酵培養基的2000ml的搖瓶中，接種量按照5-20％的比率，培養條件同第三步；第六步、將第五步中製備的酵母三級種子液接種到第二步中得到的無菌發酵培養基中發酵培養，酵母三級種子液的接種量按照體積比為5-20％，發酵溫度為25-35℃，發酵時間為36-120小時，發酵攪拌電機轉速在100轉/分-600轉/分，發酵過程中每間隔一定時間取樣並且檢測發酵液裡各種糖的含量與相對純度，當L-阿拉伯糖的相對純度大於80％時即可停止發酵；第七步、發酵結束後去除酵母菌，發酵上清液進行活性炭或者大孔樹脂進行脫色、離子交換樹脂進行脫鹽、濃縮處理，得到澄清無色的發酵液；第八步、在淨化後的發酵液中加入無水乙醇，加入無水乙醇的體積為淨化後發酵液體積的2-8倍，再加入L-阿拉伯糖晶種後在4℃-30℃下結晶，L-阿拉伯糖晶種的添加質量為淨化後發酵液的質量的10％；第九步、將含晶懸液離心，用體積百分比為95％的乙醇洗滌晶體，乾燥後得到L-阿拉伯糖晶體。
2、 根據權利要求1所述的從木糖母液以及生物質酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特徵是所述生物質包括玉米皮、麥麩、玉米芯、甘蔗渣、稻殼、棉籽殼、甜菜粕、酒糟等富含阿拉伯聚糖的植物纖維。
3、 根據權利要求1所述的從木糖母液以及生物質酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特徵是所述第一步中的氮源選自酵母膏、酵母粉、酵母抽提物、玉米槳、大豆餅粉、棉籽粉，硫酸銨、尿素中的至少一種。
4、 根據權利要求1所述的從木糖母液以及生物質酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特徵是所述第一步中的無機鹽選自無水硫酸鎂、七水硫酸鎂、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉中的至少一種。
5、 根據權利要求1或4所述的從木糖母液以及生物質酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特徵是所述第一步中的無機鹽為硫酸鎂和磷酸氫二鉀，其中硫酸鎂的添加質量為生物質酸水解液質量的0.01-0.04%，磷酸氫二鉀的添加 質量為生物質酸水解液質量的0. 05-0. 2%。
6、 根據權利要求1所述的從木糖母液以及生物質酸水解液中提取L-阿拉伯 糖的方法，其特徵是所述第二步中的滅菌方法為蒸汽溼熱滅菌，在10『C下滅 菌20分鐘。
7、 根據權利要求1所述的從木糖母液以及生物質酸水解液中提取L-阿拉伯 糖的方法，其特徵是所述第一步中的離子交換樹脂為鈉型離子交換樹脂。
8、 根據權利要求1所述的從木糖母液以及生物質酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，其特徵是所述第七步中採用脫色樹脂進行脫色，脫色樹脂的參數為 直徑為4cm，高度為60cm，其中柱床高50cm，流速控制在每分鐘100毫升以內。
9、 根據權利要求1所述的從木糖母液以及生物質酸水解液中提取L-阿拉伯 糖的方法，其特徵是所述第七步中採用活性炭脫色，在澄清發酵液中加入粉末 型活性炭，其質量為發酵液質量的2%-5%，在9(TC下以150轉速攪拌，脫色60-120分鐘。
全文摘要
本發明描述了一種從木糖母液以及生物質酸水解液中提取L-阿拉伯糖的方法，主要步驟如下第一步木糖母液和生物質預處理；第二步培養德巴利酵母菌Y161(Debaryomyces，spp)，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為2480；第三步將培養好的酵母菌接種到木糖母液或者水解液中進行培養；第四步發酵液脫色，並將脫色後的發酵液進行離子交換；第五步將發酵液濃縮到含糖量大於70％；第六步加入無水乙醇和L-阿拉伯糖晶種進行結晶；第七步用95％的乙醇洗滌晶體，乾燥得到L-阿拉伯糖純品。本發明的方法具有無汙染、成本低以及耗能少的優點，適合L-阿拉伯糖的大規模工業化生產。
文檔編號C12P19/00GK101372700SQ20081004090
公開日2009年2月25日 申請日期2008年7月24日 優先權日2008年7月24日
發明者程海榮, 鄧子新 申請人:上海交通大學;淄博科銳控制系統工程有限公司