參與昆蟲肽基-二肽酶a活性而調控害蟲的生理條件的試劑的製作方法

2024-01-30 07:50:15

專利名稱：：參與昆蟲肽基-二肽酶a活性而調控害蟲的生理條件的試劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種調節害蟲的生理條件的試劑，所述試劑參與昆蟲肽基-二肽酶A活性，等等。
背景技術：
：關於昆蟲肽基-二肽酶A，例如，已經報導在果蠅(Drosophila)肽基-二肽酶A中，存在下述兩種酶Ance:血管緊張素轉化酶和Acer:血管緊張素轉化酶相關的酶，並且在黑腹果蠅(D.melanogaster)幼蟲中，己經在中腸、大腦和血淋巴中檢測到高水平的肽基-二肽酶A活性(例如，Houard等，EurJBiochem.(歐洲生物化學雜誌);257(3):599掘，1998);在胚胎發生過程中和整個發育的胚胎後階段檢測到通過RNA檢測證實的^"ce禾卩爿cwmRNAs(例如，Tatei等，MechDev.(發育機制)，51(2-3):157-68，1995;Taylor等，Gene.(基因),181(1-2),191-7,1996);關於這兩種黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)肽基-二肽酶A基因(Ance和Acer)的缺失突變體在早期幼蟲階段表現出隱性致死性表型(例如，Tatei等，MechDev.(發育機制),51(2-3):157-68,1995等);Jnce在心臟、內臟或睪丸的收縮中起作用(例如，Tatei等，MechDev.(發育機制)，51(2-3):157-68，1995等)；在亞洲飛蝗(丄ocwto/m'y"to〃'a)中，暗示肽基-二肽酶A在locustamyotropins樣神經肽代謝中的可能的作用(例如，Isaac等，BiochemJ.(生物化學雜誌);330(Ptl):61-5，1998;Isaac等，AnnNYAcadSci(紐約科學院年刊),839:288-292,1998等);禾口肽基-二肽酶A已經在斯氏按蚊(^o/7/2e/^We;/^"wO雌蚊中證實，在雌蚊中該酶由血液進食誘導(例如，Ekbote等，FEBSLett(FEBS通信)；455(3):219-22，1999)，並且肽基-二肽酶A在發育的卵巢中積累，並且進入蚊子卵中，在卵中它在胚胎發生過程中在肽的代謝中起作用。農業化學藥品的發現傳統上是基於隨機篩選過程，通常直接檢測具體的化學品對整個生物體諸如昆蟲、真菌和/或植物的作用，並且確定生物活性。一旦發現具有適當生物活性的化合物，需要更深刻的研究來專門確定這些化合物在分子水平上的作用模式或作用位點，以預測這些化合物的安全性和環境負擔。
發明內容本發明描述一種更基於靶點的篩選農業化學品的方法，其中針對已經鑑定為與化學妨礙目標位點的目的生物學和/或生理學相關的特異的靶點篩選控制昆蟲或其它有害生物體的化合物。具體地，本發明描述調控害蟲的生理條件並且具有調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力的試劑用於控制害蟲。艮P，本發明提供1.一種調控害蟲的生理條件的試劑，其中所述試劑具有調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力；2.按照第1項的試劑，其中所述肽基-二肽酶A是棉蚜肽基-二肽酶A;3.按照第l項的試劑，其中所述試劑是殺蟲劑；4.按照第l項的試劑，其中所述調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力是抑制昆蟲肽基-二肽酶A與鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸反應的能力；5.—種殺蟲劑，其包括具有調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力的物質或者所述物質的農業可用的鹽作為活性成分；6.按照第5項的殺蟲劑，其中所述物質具有抑制昆蟲肽基-二肽酶A與鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸反應的能力；7.按照第6項的殺蟲劑，其中所述物質具有在不含細胞的系統中抑制昆蟲肽基-二肽酶A與鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸反應的能力，其中存在10^M或更多的所述物質時，所述肽基-二肽酶A的活性低於不存在所述物質時的活性；8.按照第6項的殺蟲劑，其中所述物質具有在不含細胞的系統中抑制昆蟲肽基-二肽酶A與鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸反應的能力，具有100!iM或更低的IC50;9.檢測測試物質的殺蟲活性的方法，其包括(1)第一步，檢測選自下組A的肽基-二肽酶A在所述肽基-二肽酶A與測試物質接觸的反應系統中的活性；禾口(2)第二步，基於通過比較在第一步中測定的活性與對照活性而獲得的差別評估所述測試物質的殺蟲活性；(a)包含胺基酸序列SEQIDNO:l的蛋白；(b)包含在胺基酸序列SEQIDNO:l中刪除、添加或取代一個或多個胺基酸的胺基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(c)包含與胺基酸序列SEQIDNO:1有65%或更高的序列相同性的胺基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(d)包含由核苷酸序列SEQIDNO:2編碼的胺基酸序列的蛋白，(e)包含由與核苷酸序列SEQIDNO:2有65X或更高的序列相同性的核苷酸序列編碼的胺基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(f)包含由多聚核苷酸編碼的胺基酸序列的蛋白，其中所述多聚核苷酸在嚴格條件下與包含同核苷酸序列SEQIDNO:2互補的核苷酸序列的多聚核苷酸雜交，並且其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(g)包含昆蟲肽基-二肽酶A的胺基酸序列的蛋白；禾口(h)包含棉蚜肽基-二肽酶A的胺基酸序列的蛋白；10.篩選殺蟲物質的方法，其包括選擇具有通過按照第9項的方法評估的殺蟲活性的物質；11.一種殺蟲劑，其包括通過按照第10項的方法選擇的物質或其農業可用的鹽作為活性成分；12.控制害蟲的方法，其包括將有效量的按照第5、6、7、8或11項的殺蟲劑應用到害蟲、害蟲棲息地或要防治害蟲的植物；13.—種控制害蟲的方法，其包括鑑定具有通過按照第9項的方法評估的殺蟲活性的物質，並且將害蟲與所鑑定的殺蟲物質接觸；14.一種昆蟲肽基-二肽酶A，其包含選自下組B的胺基酸序列(a)胺基酸序列SEQIDNO:1;(b)在胺基酸序列SEQIDNO:l中刪除、添加或取代一個或多個胺基酸的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；(c)與胺基酸序列SEQIDNO:1有65%或更高的序列相同性的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；(d)由核苷酸序列SEQIDNO:2編碼的胺基酸序列；(e)由與核苷酸序列SEQIDNO:2有65X或更高的序列相同性的核苷酸序列編碼的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；(f)由多聚核苷酸編碼的胺基酸序列，其中所述多聚核苷酸在嚴格條件下與包含同核苷酸序列SEQIDNO:2互補的核苷酸序列的多聚核苷酸雜交，並且其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；和(g)棉蚜肽基-二肽酶A的胺基酸序列；15.昆蟲肽基-二肽酶A作為提供評估殺蟲活性的指示劑的試劑的應用；16.按照第14項的昆蟲肽基-二肽酶A作為提供評估殺蟲活性的指示劑的試劑的應用；17.—種多聚核苷酸，其包含編碼按照第14項的肽基-二肽酶A的胺基酸序列的核苷酸序列；18.按照第17項的多聚核苷酸，其包括核苷酸序列SEQIDNO:2;19.一種多聚核苷酸，其包含與按照第17或18項的多聚核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列；20.—種多聚核苷酸，其包含按照第17或18項的多聚核苷酸的部分核苷酸序列；或與所述部分核苷酸序列互補的核苷酸序列；21.按照第20項的多聚核苷酸，其包含核苷酸序列SEQIDNO:3或4;22.獲得包含編碼肽基-二肽酶A的胺基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸的方法，其包括通過聚合酶鏈式反應擴增需要的多聚核苷酸的步驟，聚合酶鏈式反應使用按照第20或21項的多聚核苷酸作為引物；鑑定所擴增的需要的多聚核苷酸的步驟；和回收所鑑定的多聚核苷酸的步驟；23.獲得包含編碼肽基-二肽酶A的胺基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸的方法，其包括通過雜交檢測需要的多聚核苷酸的步驟，雜交使用按照第19、20或21項的多聚核苷酸作為探針；鑑定所檢測的需要的多聚核苷酸的步驟；和回收所鑑定的多聚核苷酸的步驟；24.—種包含按照第17或18項的多聚核苷酸的核苷酸序列的環形多聚核苷酸，其中所述核苷酸序列可操作地與杆狀病毒啟動子連接；25.按照第24項的環形多聚核苷酸，其中所述啟動子是多角體蛋白基因啟動子；26.按照第24或25項的環形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含用於在宿主細胞中自動複製的複製起點；27.按照第24、25或26項的環形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含杆狀病毒穿梭載體的核苷酸序列，並能夠作為病毒在昆蟲細胞中繁殖；28.製備環形多聚核苷酸的方法，其包括將按照第17或18項的多聚核苷酸連接到載體中；29.—種轉化體，其中引入按照第17或18項的多聚核苷酸；30.按照第29項的轉化體，其中所述轉化體是轉化的昆蟲細胞；31.製備轉化體的方法，其包括將按照第17或18項的多聚核苷酸引入到宿主細胞中；32.—種重組杆狀病毒，在其基因組中包含按照第17或18項的多聚核苷酸；33.生產肽基-二肽酶A的方法，其包括培養按照第29或30項的轉化體並且回收所生產的肽基-二肽酶A的步驟；34.按照第14項的肽基-二肽酶A或按照第17—21項中任一項的多聚核苷酸作為研究工具的應用；35.按照第34項的應用，其中所述研究工具是用於篩選殺蟲物質的實驗工具；和36.—種系統，其包括輸入、存儲和管理測試物質的能力的數據信息的裝置，其中所述能力是調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力；基於需要的標準查詢並且回傳(retrieve)數據信息的裝置；和顯示並且輸出查詢和回傳的結果的裝置。實行本發明的方式本發明將在下文中詳細地闡釋。在本發明中，"害蟲"是指通過直接傷害人和動物或者通過損害農作物而給人的生活帶來傷害或不適的小動物。它的實例包括節肢動物諸如昆蟲、蟎類、蜱類和線蟲類(Nematoda)，並且其典型的實例如下半翅目(Hemiptera):飛蝨禾鬥(Delphacidae)如灰飛蝨(Laodelphaxstriatellus)、褐飛蝨(Nilaparvatalugens)和白背稻飛蝨(Sogatellafurcifera)，角頂葉蟬科(Deltocephalidae)如黑尾口十蜂(Nephotettixcincticeps)禾口Empoascaonukii，蟲牙科(Aphididae)如棉頓(Aphisgossypii)和杉^頓(Myzuspersicae)，蝽科(Pentatomidae)，粉蝨科(Aleyrodidae)如溫室粉蝨(Trialeurodesvaporariorum)、甘薯粉蝨(Bemisiatabaci)禾口Bemisiaargentifolli，階禾鬥(Coccidae)，網蝽科(Tingidae)，木蝨科(Psyllidae)，等。鱗翅目(Lepidoptera):螟蛾科(Pyraiidae)如二化螟(Chilos卿固alis)、稻縱巻葉野螟(Cnaphalocrocismedinalis)、歐洲玉米螺(Ostrinianubilalis)禾口Parapediasiateterrella,夜蛾科(Noctuidae)如斜蛟貪夜蛾(Spodoptemlitura)、貪夜蛾(Spodoptemexigua)、禾佔蟲(Pseudaletiaseparata)、甘藍夜蛾(Mamestrabrassicae)、小地老虎(Agrotisipsilon)、粉夜蛾屬(Trichoplusiaspp.)、實夜蛾屬(Heliothisspp.)、Helicoverpa禾卩山巻蛾(Eariasspp.)，粉蝶科(Pieridae)如菜粉蝶曰本亞禾中(Pierisrapaecrucivora)，巻蟲我科(Tortricidae)如棉褐帶巻蛾(Adoxophyesoranafasciata)、梨小食心蟲(Grapholitamolesta)和蘋果皮小巻蛾(Cydiapomondla)，蛀果蛾科(Carposinidae)如桃蛀果蛾(Carposinaniponensis)，Bucculatricidae如桃潛夜蛾(Lyonetiaclerkella)，細蛾科(Gracillariidae)如金紋小潛細蛾(Phyllonorycterringoniella),夜潛蛾科(Phyllocnistidae)如柑橘夜潛蛾(Phyllocnistiscitrella)，巢蛾科(Yponomeutidae)如小菜蛾(Plutellaxylostella)，麥蛾科(Gelechiidae)如紅鈴麥蛾(Pectinophoragossypiella)，燈蛾科(Arctiidae),谷蛾科(Tineidae)，等。雙翅目(Diptera):庫蚊屬(Culex)如淡色庫蚊(Culexpipienspallens)、三帶喙庫蛟(Culestritaeniorhynchus)禾卩至文倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)，伊蚊屬(Aedes)如±矣及伊蚊(Aedesaegypti)和白紋伊蚊(Aedesalbopictus)，按蛟屬(Anopheles)如中華按蚊(Anophelinaesinensis),搖蚊禾鬥(Chironomidae)，蟲雖科(Muscidae)如家蟲雖(Muscadomestica)禾口履腐蟲龜(Muscinastabulans)，麗蟲黽禾鬥(Calliphoridae)，麻蟲竜禾鬥(Sarcophagidae)，夏廁蟲雖(Fanniacanicularis)，花蟲雖科(Anthomyiidae)如灰地禾中蟲雖(Deliaplatura)和蔥地種蠅(Deliaantigua)，實蠅科(Trypetidae),果蠅科(Drosophilidae),毛蠓科(Psychodidae),蚋科(Simuliidae),虻科(Tabanidae),螫蠅科(Stomoxyidae),潛蟲黽禾鬥(Agromyzidae)，等。翹翅目(Coleoptera):穀物食蟲(Diabrotica)如西方穀物食蟲(Diabroticavirgifera)和南方穀物食蟲(Diabroticaundecimpunctatahowardi)，金龜禾鬥(Scarabaeidae)如古銅異麗金龜(Anomalacuprea)禾卩多色異麗金龜(Anomalarufocuprea)，象蟲科(Curculionidae)如玉米象(Sitophiluszeamais)、稻7_K象(Lissorphoptmsoryzophilus)禾口綠豆象(Calosobruchyschinensis)，J以步甲科(Tenebrionidae)如黃粉甲(Tenebriomolitor)和赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)，卩十甲科(Chrysomelidae)如zK稻負泥蟲(Oulemaoryzae)、黃守瓜(Aulacophorafemoralis)、黃曲條菜跳甲(Phyllotretastriolata)和馬鈴薯葉甲(Leptinotarsadecemlineata)，竊蠹科(Anobiidae)，瓢蟲(Epilachnaspp.)如二十八斑票瓜蟲(Epilachnavigintioctopunctata)，教、蠹科(Lyctidae)，長蠹科(Bostrychidae),天牛禾鬥(Cerambycidae),毒隱翅蟲(Paederusfbiscipes)，等。纓翅目(Thysanoptera):薊馬科(Thripidae)，如包括palmi薊馬(Thripspalmi)的薊馬(Thripsspp.)，包括西方花薊馬(Flankliniellaoccidentalis)的花薊馬(Frankliniellaspp.)，包括Sciltothripsdorsalis的Sciltothrips，管薊馬禾鬥(Phlaeothripidae)，等。膜翅目(Hymenoptera):葉蜂科(Tenthredinidae)，蟻科(Formicidae),胡蜂科(Vespidae)，等。網翅目(Dictyoptera):蜚蠊科(Blattidae)，Blattellidae，等；直翅目(Orthoptera):劍角蝗科(Acrididae)，螻蛄科(Gryllotalpidae)，等。蚤目(Siphonaptera):人蚤(Pulexirritans)，等。蝨目(Anoplura):體蝨(Pediculushumanuscapitis)，等。等翅目(Isoptera):白蟻科(Termitidae)，等。蜱蟎目(Acarina):葉蟎科(Tetranychidae)如二斑葉蟎(Tetranychusurticae)、神澤氏葉蟎(Tetranychuskanzawai)、柑橘全爪蟎(Panonychuscitri)、蘋果全爪蟎(Panonychusulmi)禾口小爪蟎(Oligonychusspp.)，癭蟎科(Eriophyidae)如橘刺皮癭蟎(Aculopspdekassi)和斯氏針刺癭蟎(Aculusschlechtendali)，跗線蟎科(Tarsonemidae)如側多食跗線蟎(Polyphagotarsonemuslatus)，細須蟎科(Tenuipalpidae)，杜克蟎科(Tuckerellidae)，硬蜱科(Ixodidae)如長角血蜱(Haemaphysalislongicornis)、褐黃血蜱(Haemaphysalisflava)、臺灣革蜱((Acaridae)如腐食酪蟎(Tyrophagusputrescentiae)，皮刺蟎科(Dermanyssidae)，肉食蟎科(Cheyletidae)如粉塵蟎(Dermatophagoidesfarinae)和屋塵蟎(Dermatophagoidesptrenyssnus)，諸如普通肉食蟎(Cheyletuseruditus)、馬六甲肉食蟎(Cheyletusmalaccensis)禾口Cheyletusmoorei、皮朿U蟎(Dermanyssusspp.)，等。線蟲類(Nematodes):咖啡短體線蟲(Pratylenchuscoffeae),偽短體線蟲(Pratylenchusfallax),大豆異皮線蟲(Heteroderaglycines),馬鈴薯金線蟲(Globoderarostochiensis)，北方根結線蟲(Meloidogynehapla),南方根結線蟲(Meloidogyneincognita),等。在本發明中，"調控害蟲的生理條件"是指改變生命體內諸如各種現象的條件，所述條件是害蟲生存應該維持的，例如，功能如呼吸、消化、分泌、體液循環、新陳代謝、神經傳遞等，或其機制，改變成除正常條件以外的條件。實例包括通過停止呼吸以致不提供害蟲內部新陳代謝必需的氧氣而改變條件，和通過停止害蟲的神經傳遞功能以致終止害蟲的各種活動而改變條件。在本發明中，"調控害蟲的生理條件的試劑"是當對害蟲應用時可以調控害蟲的生理條件的試劑。在本發明中，"昆蟲肽基-二肽酶A"是指在昆蟲中存在的肽基-二肽酶A，是在各種生物體中存在的肽基-二肽酶A之一。在本文中，昆蟲是在動物界(Animalia)，節肢動物門(Arthropod),昆蟲綱(Insecta)下分類的動物，並且它的實例包括下列各目的節肢動物Protum，彈尾目(Collembola),雙尾目(Diplura)，纓尾目(Thysanura),蜉蝣目(Ephemeroptera)，蜻蜓目(Odonata),織翼夜蛾目(Plecoptera),跫蠊目(Grylloblattodea),直翅目(Orthoptera),Phasmatodea,革翅目(Dermaptera),螳蟲郎目(Mantodea),Blattaria,等翅目(Isoptera),紡足目(Embioptera),囓蟲目(Psocoptem),食毛目(Mall叩haga),蝨目(Anoplura),纓翅目(Thysanoptera),半翅目(Hemiptera),脈翅目(Neuroptera),長翅目(Mecoptera),毛翅目(Trichoptera),鱗翅目(Lepidoptera),鞘翅目(Coleoptera)，雙翅目(Diptera),膜翅目(Hymenoptera)，蚤目(Siphonaptera)，捻翅目(Strepsiptera)，等等。肽基-二肽酶A(EC3.4.15.1;血管緊張素I-轉化酶(ACE)，激酶II或二肽基羧肽酶I)是一種從短肽水解分裂羧基端二肽的金屬肽酶。肽基-二肽酶A具有從短肽激素的羧基端分裂二肽的活性。儘管還沒有鑑定昆蟲中肽基-二肽酶A的內源底物，但是可以使用合成底物，鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸(Abz-Gly-Phe(N02)-Pro)(由Bachem製備，目錄號M-H00)來檢測肽基-二肽酶A的活性。這種底物是一種表現出非常微弱的螢光的內在猝滅的肽。當肽鍵Gly-Phe(N02)分裂時這種猝滅消除，並且增加的螢光性與肽基-二肽酶A活性成比例。更具體地，肽基-二肽酶A的活性可以按照Carmel等(1979)ClinicaChimicaActa,93，215-220中所述的方法進行檢肽基-二肽酶A的活性可以使用天然或合成的酶底物應用體外檢測而測定。例如，肽基-二肽酶A活性可以使用放射性標記的血管緊張素I底物應用基於放射活性的檢測而進行檢測，如Huggins和Thampi,LifeSci.(生命科學)7(12),1968,633-639所述。使用血管緊張素I作為底物監測肽基-二肽酶A活性的另一個實例是基於所形成的產物的反相-HPLC分離，如Meng等，BiochemPharmacol(生物化學藥學)50，1995，1445-1450所述。類似地，存在許多可以使用合成的底物而不是天然底物如血管緊張素I和緩激肽用來確定肽基-二肽酶A活性的檢測。這些方法包括檢測放射性標記的底物的分裂產物，所分裂的底物的螢光或比色分析。所述檢測的類型由Holmquist等，AnalyticalBiochemistry(分析生物化學)95,540-548(1979);Carmel和Yaron,EurJBiochem(歐洲生物化學雜誌)87,265-273(1978);Araujo等，Biochemistry(生物化學)39(29),8519-8525(2000);Shepley等,JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis(製藥學和生物醫學分析雜誌),6(3),241-251(1988);Cushman和Cheung,BiochemPharmacol.(生物化學製藥學)20(7):1637-1648(1971);Groff等,ClinChem(臨床化學)39(3),400-404(1993);Dive等，PNAS96,4330-4335(1999);Cheviron等，AnalyticalBiochemistry(分析生物化學)280,58-64(2000);Meng和Oparil，JournalofChromatographyA(色譜A雜誌)743,105-122(1996)所述。在前文提及的檢測肽基-二肽酶A活性的各種方法中，使用鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸作為底物的反應優選用於許多樣品的肽基-二肽酶A活性的自動和有效的檢測。具體的實例包括在已報導的文獻(Carmel等(1979)ClinicaChimicaActa,93,215-220)中所述的方法。另外，檢測昆蟲肽基-二肽酶A活性的方法可以通過與上述方法相似的方法進行。在不同的昆蟲物種中已經鑑定了一些肽基-二肽酶A的胺基酸序列，例如，在黑腹果蠅ANCE中(登記號NP—477046),在西方角蠅(Haematobiairritans)中(登記號S65472)，在剛比亞按蚊(Anophelesgambiae)中(登記號XP—318838)，在家蠶蛾(Bombyxmori)中(登記號BAA97657)，在義大利蜜蜂(Apismellifera)中(登記號XP_393561)，在亞洲飛蝗中(登記號AAR85358)，等等，這些可以在公共資料庫中找到。此外，已經在不同的昆蟲物種中鑑定了一些肽基-二肽酶A基因的核苷酸序列，例如，在黑腹果蠅中(登記號NM—057698),在西方角蠅中(登記號L43965)，在剛比亞按蚊中(登記號AAAB01008980)，在家蠶蛾中(登記號AB026110)，在義大利蜜蜂中(登記號XM—393561)，在亞洲飛蝗中(登記號AY487174)，等等，這些可以在公共資料庫中找到。另外，按照下文所述的方法，可以從棉蚜鑑定肽基-二肽酶A的胺基酸序列和肽基-二肽酶A基因的核苷酸序列。所鑑定的棉蚜肽基-二肽酶A的胺基酸序列在SEQIDNO:1中顯示，並且棉蚜肽基-二肽酶A基因的核苷酸序列在SEQIDNO:2中顯示。在除昆蟲之外的動物中已經鑑定了一些肽基-二肽酶A的胺基酸序列，例如，在智人(Homosapiens)中(登記號NP—000780)，在牛(Bostaurus)中(登記號19192"A)，在秀麗隱杆線蟲(Ceanorhabditiselegans)中(登記號AAA98719)，等等，這些可以在公共資料庫中找到。此外，在除昆蟲之外的動物中已經鑑定了一些肽基-二肽酶A基因的核苷酸序列，例如，在智人中(登記號NM—000789)，在牛中(登記號AJ309016)，在秀麗隱杆線蟲中(登記號U56966)，等等，這些可以在公共資料庫中找到。表1顯示棉驟肽基-二肽酶A的胺基酸序列(SEQIDNO:l)和棉蚜肽基-二肽酶A基因的核苷酸序列(SEQIDNO:2)與在其它動物中發現的肽基-二肽酶A及其基因的序列的序列相同性。表1tableseeoriginaldocumentpage17調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力是指增加或者減少昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力，即，意指激活肽基-二肽酶A的能力，或者抑制肽基-二肽酶A活性的能力。並且，可以向檢測肽基-二肽酶A活性的反應系統中加入測試物質，以研究所述測試物質對肽基-二肽酶A活性的影響。例如，己知氯離子(CD為具有激活肽基-二肽酶A的能力的物質(LamangoNS等，BiochemJ.(生物化學雜誌)1996年3月1;314(Pt2):639-46.)，並且已知貝那普利、喹那普利、卡託普利、依那普利等為具有抑制肽基-二肽酶A活性的能力的物質。然而，從來不被發現或者從來不知道這樣的暗示，即，這些物質調控昆蟲的生理條件，特別地，可以作為殺蟲劑的活性成分。反應中測試物質的IC5Q值意指不含測試物質的反應的活性的50X被抑制的測試物質的濃度。測試物質的ICs。值可以通過這樣確定將不同濃度的測試物質添加到肽基-二肽酶A活性檢測反應系統中，檢測在添加的測試物質的每一濃度(劑量)的肽基-二肽酶A活性(反應)，產生劑量-反應曲線，並且計算肽基-二肽酶A活性被抑制50X時的所加入的測試物質的濃度。更具體地，劑量-反應曲線可以應用四參數邏輯模型或s形劑量-反應模型生成f(x)=(A+((B-A)/(l+((C/xrD)))爐+翁以計算ICso值。特別地，ICso值可以應用商購計算軟體XLfit(由IDBS製作)進行計算。具有調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力的試劑是一種含有具有調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力的物質作為活性成分的試劑。在本發明中，"調控害蟲的生理條件的試劑，其中所述試劑具有調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力"是一種具有通過前文提及的檢測方法指明的調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力的試劑，並且意指可以調控害蟲的生理條件的試劑。所述試劑的優選實例包括這樣的試劑，g卩，其中昆蟲肽基-二肽酶A是棉蚜肽基-二肽酶A。另夕卜，所述試劑的優選實例包括這樣的試劑，即，其中調控害蟲的生理條件的試劑是殺蟲劑。另外，所述試劑的優選實例包括這樣的試劑，即，其中調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力是抑制使用鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸作為底物的反應的能力。在本發明中，"殺蟲劑"是指具有控制害蟲的能力的試劑。除本發明中公開的方法之外，用於檢測控制害蟲的能力的方法的實例還包括，檢測關於害蟲的殺蟲活性的方法。具體地，例如，可以按照下述方法檢測殺蟲活性。按照昆蟲詞養手冊(HandbookofInsectRearing)第1巻(Elsevier科學出版(ElsevierSciencePublisers)1985)第35—36頁所述的方法，除了製備具有下述組合物(表2)的無菌人工飼料之外，並且將測試試劑在DMSO中的溶液以0.5體積。/。加入到人工詞料中，並且混合，飼養棉蚜，在6天後研究存活的棉蚜的數目，並且按照下述方程獲得控制值。表2tableseeoriginaldocumentpage19控制值(％)={l-(CbXTai)/(CaiXTb)}X100在所述方程中的字母代表下述意義:Cb:在未處理部分中在處理之前存活的蟲子數目Cai:在未處理部分中在觀察時存活的蟲子數目Tb:在未處理部分中在處理之前存活的蟲子數目Tai:在處理部分中在觀察時存活的蟲子數目可以這樣說，表現出顯著高的控制值的測試試劑具有殺蟲活性。更優選地，可以確定具有30%或更大的控制值的測試試劑具有實質殺蟲活性，並且可以確定具有小於30%的控制值的測試試劑沒有實質殺蟲活性。本發明的殺蟲劑包含具有調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力的化學物質或其農業可用的鹽作為活性成分。在本發明中，農業可用的鹽是指這樣形式的鹽，即，控制試劑的製備及所述製劑的應用不是變得不可能，並且可以是以任何形式的鹽。具體地，所述鹽的實例包括與無機酸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、和磷酸，有機酸如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、和乙磺酸，或酸性胺基酸如天冬氨酸和穀氨酸形成的酸式加成鹽；與無機鹼如鈉、鉀、鎂和鋁，有機鹼如甲胺、乙胺和乙醇胺，或鹼性胺基酸如賴氨酸和鳥氨酸形成的鹽；以及銨鹽。在本發明中，"包含具有調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力的物質或其農業可用的鹽作為活性成分的殺蟲劑"意指可以通過包含具有在檢測方法中鑑定的調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力的物質或其農業可用的鹽作為活性成分而控制害蟲的試劑。所述物質的優選實例包括具有抑制肽基-二肽酶A與鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸反應的能力的化合物。所述物質的更優選的實例包括具有在不含細胞的系統中抑制昆蟲肽基-二肽酶A與鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸反應的能力的物質，其中在存在10pM或更多的所述物質下，肽基-二肽酶A的活性低於在不存所述物質下的活性。另外，所述物質的其它優選的實例包括具有在不含細胞的系統中以100^M或更小的IC5。值而抑制昆蟲肽基-二肽酶A與鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸反應的能力的物質。在本發明中，"用於檢測測試物質的殺蟲活性的方法，其包括第一步，在肽基-二肽酶A與測試物質接觸的反應系統.中檢測選自組A的肽基-二肽酶A的活性，和第二步，基於通過比較在第一步中測定的活性與對照的活性而獲得的差別而評估測試物質的殺蟲活性"是指特徵在於在用於檢測測試物質的殺蟲能力的各種方法中包括第一步和第二步的方法。在本文中，組A是指(a)包含胺基酸序列SEQIDNO:l的蛋白；(b)包含在胺基酸序列SEQIDNO:l中刪除、添加或取代一個或多個胺基酸的胺基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(c)包含與胺基酸序列SEQIDNO:1有65%或更高的序列相同性的胺基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(d)包含由核苷酸序列SEQIDNO:2編碼的胺基酸序列的蛋白；(e)包含由與核苷酸序列SEQIDNO:2有65%或更高的序列相同性的核苷酸序列編碼的胺基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(f)包含由多聚核苷酸編碼的胺基酸序列的蛋白，其中所述多聚核苷酸在嚴格條件下與包含同核苷酸序列SEQIDNO:2互補的核苷酸序列的多聚核苷酸雜交，並且其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(g)包含昆蟲肽基-二肽酶A的胺基酸序列的蛋白；禾口(h)包含(f)棉蚜肽基-二肽酶A的胺基酸序列的蛋白(以下叫作組A)。第一步是在通過將測試物質加入到前文提及的各種肽基-二肽酶A活性檢測反應系統中而使得肽基-二肽酶A與測試物質接觸的狀態下檢測肽基-二肽酶A活性的步驟。另外，第二步是比較測試物質檢測的活性與對照物質的活性並且基於差異評估殺蟲能力的步驟。在本文中，對照意指，例如，在將溶解在溶劑中的測試物質添加到反應系統中的情形中，其中只加入與用來溶解所述測試物質相同的溶劑的檢測部分。在具有第一步和第二步用於檢測測試物質所擁有的殺蟲能力的方法中所用的肽基-二肽酶A是在組A中所示的蛋白。在組A的蛋白中，在由(a)代表的蛋白的胺基酸序列和由(b),(c)，(e),(f)，(g)和(h)代表的蛋白的胺基酸序列之間可以識別的差別是部分胺基酸的刪除、取代、加成等。這些包括，例如，由於具有由(a)代表的胺基酸序列的蛋白在細胞中受到的加工引起的刪除。另外，實例包括由下列各項所產生的胺基酸的刪除、取代、添加等由於剪接差異或蛋白來源的生物體的個體差異而引起的天然存在的基因突變，或通過基因定點誘變、隨機誘變、突變處理等而人工引入的基因突變。經受刪除、取代、添加等的胺基酸數目可以是在可以發現肽基-二肽酶A的肽酶活性的範圍內的數目。另外，胺基酸取代的實例包括用在疏水性、電荷、pH和空間結構上特徵相似的胺基酸進行取代。所述取代的具體實例包括在下列各組中的取代(1)甘氨酸，丙氨酸;(2)纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，穀氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，(4)絲氨酸，蘇氨酸;(5)賴氨酸，精氨酸;(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。人工引入胺基酸的刪除、添加或取代(下文，在一些情形中籠統叫作胺基酸的改變)的方法的實例包括將基因定點突變引入到編碼由(a)代表的胺基酸序列的DNA中，並且然後通過常規方法表達這一DNA的方法。在此處，基因定點誘變的實例包括應用amber突變的方法(缺口雙鏈方法(gappedduplexmethod),NucleicAcidsRes.(核酸研究),12,9441-9456(1984))、通過應用引入突變的引物的PCR的方法等。另外，人工改變胺基酸的方法的實例包括將突變隨機引入到編碼由(a)代表的胺基酸序列的DNA中並且然後通過常規方法表達這一DNA的方法。在此處，隨機引入突變的方法的實例包括使用編碼任一種前文提及的胺基酸序列的DNA作為模板並且使用可以擴增每種全長DNA的引物對在下列反應條件下進行PCR的方法即，在用作底物的每種dATP,dTTP,dGTP禾BdCTP的添加量從常規濃度改變的反應條件下，或在促進聚合酶反應的MgS+的濃度從常規濃度升高的反應條件下。PCR方法的實例包括，例如，在MethodinMolecularBiology(分子生物學方法),(31),1994,97-112中所述的方法。另一個實例包括在WO0009682中所述的方法。在本文中，"序列相同性"是指兩種核苷酸序列或兩種胺基酸之間的相同性。"序列相同性"通過比較在待比較的序列的所有區域的最佳狀態排列的兩個序列而確定的。在此處，在待比較的核苷酸序列或胺基酸序列的最佳比對中，可以允許添加或刪除(例如，缺口等)。可以通過使用如FASTA[Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(美國科學院學報)4,2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等，JournalofMolecularBiology(分子生物學雜誌)，215,403-410(1990)]、CLUSTALW[Thompson,Higgins和Gibson,NucleicAcidResearch(核酸研究)，22，4673-4680(1994a)]等的程序進行產生序列比對的同源性分析而計算序列相同性。所述程序一般在日本DNA資料庫日本信息生物學和DNA資料庫中心國家遺傳所(Genetics,CenterforInformationBiologyandDNADataBankofJapan)管理的國際DNA資料庫；CIB/DDBJ的網址(http:〃www.ddbj.nig.ac.jp)上可用。備選地，序列相同性還可以應用商購序列分析軟體而獲得。具體地，例如，可以應用GENETYX-WINVer.5(由軟體開發有限公司(SoftwareDevelopmentCo.Ltd.)審隨)通過Lipman-Pearson方法Lipman，D.J.禾口Pearson,W.R.，Science(科學),227,1435-1441,(1985)進行同源性分析並且生成序列比對而計算序列相同性。在(f)中所述的"嚴格條件"的實例包括這樣的條件，即，在所述條件下，在按照SambrookJ.,FrischE.F.,ManiatisT.,分子克隆第二版，冷泉港實驗室出版社(MolecularCloning2ndedition,ColdSpringHarborLaboratorypress)所述的常規方法進行的雜交中，例如，雜交體在45"C在含有6XSSC(含有1.5mNaCl和0.15m檸檬酸三鈉的溶液是10XSSC)的溶液中形成，並且然後，將這一雜交體在5(TC用2XSSC洗滌(MolecularBiology(分子生物學),JohnWiley和Sons,紐約(1989),6.3.1-6.3.6)。洗滌步驟的鹽濃度可以從2XSSC(低嚴格條件)至IJ0.2XSSC(高嚴格條件)的條件進行選擇。洗滌步驟的溫度，例如，可以在從室溫(低嚴格條件)到65"C(高嚴格條件)的條件進行選擇。備選地，鹽濃度和溫度都是可以變化的。在(h)中描述的蛋白是指在昆蟲肽基-二肽酶A中存在於棉蚜中的肽基-二肽酶A，並且包括含有(a)中所述的胺基酸序列的蛋白。另外，組A的蛋白包括含有在(g)中所述的昆蟲肽基-二肽酶A的胺基酸序列的蛋白，並且更優選地包括這樣的蛋白，即，其中當與胺基酸序列SEQIDNO:l比對時以致獲得最大的序列相同性，在與胺基酸序列SEQIDNO:l的(I)位置478,(II)位置498，(III)位置570,禾口(IV)位置567相對應的位置的胺基酸殘基分別為(I)半胱氨酸(在與478對應的位置)，(II)穀氨酸(在與498對應的位置)，(III)酪氨酸(在與507對應的位置)，(IV)甲硫氨酸(在與567對應的位置)。在此處，"與胺基酸序列SEQIDNO:l比對以致獲得最大的序列相同性"意指包括胺基酸序列SEQIDNO:1的多個待分析的胺基酸序列的序列相同性通過如上文所述的FASTA,BLAST,CLUSTALW程序進行分析，並且對它們進行序列比對。通過所述方法比對多個序列，而不管胺基酸序列的插入或刪除，可以確定每一胺基酸序列中的保守胺基酸殘基的位置。認為保守胺基酸殘基存在於目的蛋白的三維空間結構中的相同位置，並且推測關於目的蛋白的特異功能具有相似的作用。例如，當將包括在本發明中公開的肽基-二肽酶A序列的昆蟲肽基-二肽酶A與胺基酸序列SEQIDNO:1比對以致獲得胺基酸序列的最大的序列相同性時，顯示在與胺基酸序列SEQIDNO:l的(I)位置478,(II)位置498，(III)位置507，(IV)位置567相對應的位置的胺基酸殘基分別為(1)半胱氨酸(在與478對應的位置)，(II)穀氨酸(在與498對應的位置)，(III)酪氨酸(在與507對應的位置),(IV)甲硫氨酸(在與567對應的位置)。具有殺蟲能力的物質可以通過使用檢測對上文提及的害蟲的殺蟲能力或控制作用而測定殺蟲能力的方法進行篩選。備選地，具有殺蟲能力的物質還可以通過使用肽基-二肽酶A測定殺蟲能力的方法進行篩選。具體地，當應用使用肽基-二肽酶A測定殺蟲能力的方法鑑定測試物質的殺蟲能力是特定的值或更大，或者特定的值或更小時，可以通過選擇所述物質而篩選具有殺蟲能力的物質。由於通過所述篩選方法選擇的物質具有殺蟲能力，所以它可以用作包含所述物質或農業可用的鹽作為活性成分的殺蟲劑。害蟲的控制通常可以通過將有效量的殺蟲劑應用到被保護的農作物、害蟲或害蟲的棲息地而進行。當將殺蟲劑用於農業和林業時，其使用量通常關於每10001112的殺蟲劑的量為0.1到1000g。當將殺蟲劑配製成乳液、水可分散的粉劑、易流動的製劑、微膠囊製劑等時，所述試劑通常通過用水將活性成分稀釋至l到10,000ppm的濃度，並且用其噴霧而應用，並且當殺蟲劑配製成粒劑、粉劑等時，所述試劑通常如其那樣進行應用。殺蟲劑可以通過葉子-處理如農作物等需要防止害蟲的植物而使用，並且還可以通過在移植農作物的苗之前處理苗床，或者處理在種植時的種植洞或株基而使用。此外，為了控制害蟲在耕地的土壤中棲息的目的，可以通過處理所述土壤而應用所述試劑。備選地，所述試劑可以通過將已經加工成薄片或細線的樹脂製劑環繞在農作物上，將所述製劑在農作物附近延伸和/或散布在株基的土壤表面而使用。當將殺蟲劑用作害蟲控制劑用於防止時疫時，乳液、水可分散的粉劑、流動物等通常通過用水稀釋以致活性成分的濃度為0.01到10,000ppm而應用，並且油劑、氣溶膠、薰劑、毒館等按照原樣進行應用。殺蟲劑的一種用途的實例包括控制家畜如牛、綿羊、山羊和雞或小動物如狗、貓、大鼠和小鼠的外部寄生蟲，在這種情形中，所述試劑可以通過獸醫已知的方法施用給動物。作為一種具體的施用方法，當意欲全身控制時，例如，所述試劑通過片劑、混合在飼料中、栓劑、注射劑(肌內、皮下、靜脈內、腹膜內等)等而施用，當意欲非全身控制時，所述試劑通過噴霧油性試劑或水性液體試劑、在治療時進行傾倒或打點、用洗髮精製劑清洗動物或給動物附上已經加工成項圈或耳籤的樹脂製劑的方法而應用。當施用給動物體時殺蟲劑的量通常在0.1到l,000mg範圍，其表示為每lkg動物化合物A和化合物B的總量。它們的使用量和使用濃度都不同，這取決於這樣的情形諸如製劑種類、使用時間、使用位置、使用方法、害蟲種類、損害程度等，可以增加或減少，而不管前文提及的範圍，並且可以適當地選擇。前文提及的殺蟲劑可以用於上文所述的控制害蟲的方法中。另外，在另一方面，害蟲還可以通過使用前文提及的測定測試物質擁有的殺蟲能力的方法鑑定具有殺蟲能力的物質(所述鑑定方法具有第一步和第二步，使用選自組A的肽基-二肽酶A)，並且將所鑑定的具有殺蟲能力的物質與害蟲接觸而進行控制。在此處，作為將所鑑定的具有殺蟲能力的物質與害蟲接觸的方法，可以應用前文提及的製備方法、應用方法等。組B中所示的胺基酸序列是昆蟲肽基-二肽酶A的胺基酸序列，其包含下述(a)到(g)任一種胺基酸序列。(a)胺基酸序列SEQIDNO:1;(b)在胺基酸序列SEQIDNO:l中刪除、添加或取代一個或多個胺基酸的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；(c)與胺基酸序列SEQIDNO:1有65%或更高的序列相同性的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；(d)由核苷酸序列SEQIDNO:2編碼的胺基酸序列；(e)由與核苷酸序列SEQIDNO:2有65°/。或更高的序列相同性的核苷酸序列編碼的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；(f)由多聚核苷酸編碼的胺基酸序列，其中所述多聚核苷酸在嚴格條件下與包含同核苷酸序列SEQIDNO:2互補的核苷酸序列的多聚核苷酸雜交，並且其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；和(g)(f)棉蚜肽基-二肽酶A的胺基酸序列。在組B的胺基酸序列中，在由(a)代表的胺基酸序列和由(b),(c)，(e)，(f)和(g)代表的胺基酸序列之間可以識別的差別是部分胺基酸的刪除、取代、添加等。這些包括，例如，由於具有由(a)代表的胺基酸序列的蛋白在細胞中受到的加工引起的刪除。另外，實例包括由下列各項所產生的胺基酸的刪除、取代、添加等由於剪接差異或蛋白來源的生物體的個體差異而引起的天然存在的基因突變，或通過基因定點誘變、隨機誘變、突變處理等而人工引入的基因突變。經受刪除、取代、添加等的胺基酸數目可以是在可以發現肽基-二肽酶A的肽酶活性的範圍內的數目。另外，胺基酸取代的實例包括用在疏水性、電荷、pH和空間結構上特徵相似的胺基酸進行取代。所述取代的具體實例包括在下列各組中的取代(1)甘氨酸，丙氨酸；(2)纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，穀氨酸，天冬醯胺，穀氨醯胺，(4)絲氨酸，蘇氨酸;(5)賴氨酸，精氨酸;(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。人工引入胺基酸的刪除、添加或取代(下文，在一些情形中籠統叫作胺基酸的改變)的方法的實例包括將基因定點突變引入到編碼由(a)代表的胺基酸序列的DNA中，並且然後通過常規方法表達這一DNA的方法。在此處，基因定點誘變的實例包括應用amber突變的方法(缺口雙鏈方法，NucleicAcidsRes.(核酸研究)，12,9441-9456(1984))、通過應用引入突變的引物的PCR的方法等。另外，人工改變胺基酸的方法的實例包括將突變隨機引入到編碼由(a)代表的胺基酸序列的DNA中並且然後通過常規方法表達這一DNA的方法。在此處，隨機引入突變的方法的實例包括使用編碼任一種前文提及的胺基酸序列的DNA作為模板並且使用可以擴增每種全長DNA的引物對在下列反應條件下進行PCR的方法g卩，在用作底物的每種dATP,dTTP,dGTP和dCTP的添加量從常規濃度改變的反應條件下，或在促進聚合酶反應的M^+的濃度從常規濃度升高的反應條件下。PCR方法的實例包括，例如，在MethodinMolecularBiology(分子生物學方法)，(31),1994,97-112中所述的方法。另一個實例包括在WO0009682中所述的方法。在本文中，"序列相同性"是指兩種核苷酸或兩種胺基酸之間的相同性。"序列相同性"通過比較在待比較的序列的所有區域的最佳狀態排列的兩個序列而確定的。在此處，在待比較的核苷酸序列或胺基酸序列的最佳比對中，可以允許添加或刪除(例如，缺口等)。可以通過使用如FASTA[Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(美國科學院學報)4，2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等，JournalofMolecularBiology(分子生物學雜誌)，215,403-410(1990)]、CLUSTALW[Thompson，Higgins和Gibson,NucleicAcidResearch(核酸研究)，22,4673-4680(1994a)]等的程序進行產生序列比對的同源性分析而計算序列相同性。所述程序一般在日本DNA資料庫日本信息生物學和DNA資料庫中心國家遺傳所(Genetics,CenterforInformationBiologyandDNADataBankofJapan)管理的國際DNA資料庫；Cffi/DDBJ的網址(http:〃ddbj.nig.ac.jp)上可用。備選地，序列相同性還可以應用商購序列分析軟體而獲得。具體地，例如，可以應用GENETYX-WINVer.5(由軟體開發有限公司(SoftwareDevelopmentCo.Ltd.)製造)通過Lipman-Pearson方法Lipman，D.J.禾口Pearson,W.R.,Science(科學)，227，1435-1441,(1985)進行同源性分析並且生成序列比對而計算序列相同性。在(f)中所述的"嚴格條件"的實例包括這樣的條件，即，在所述條件下，在按照SambrookJ.,FrischE.F.，ManiatisT.,分子克隆第二版，冷泉港實驗出版社(MolecularCloning2ndedition,ColdSpringHarborLaboratorypress)所述的常規方法進行的雜交中，例如，雜交體在45。C在含有6XSSC(含有1.5mNaCl和0.15m檸檬酸三鈉的溶液是10XSSC)的溶液中形成，並且然後，將這一雜交體在50。C用2XSSC洗滌(MolecularBiology(分子生物學),JohnWiley和Sons,紐約(1989),6.3.1-6.3.6)。洗滌步驟的鹽濃度可以從2XSSC(低嚴格條件)到0.2XSSC(高嚴格條件)的條件進行選擇。洗滌步驟的溫度，例如，可以在從室溫(低嚴格條件)到65°C(高嚴格條件)的條件進行選擇。備選地，鹽濃度和溫度都是可以變化的。具有在(g)中所述的胺基酸序列的蛋白是指在昆蟲肽基-二肽酶A中存在於棉蚜中的肽基-二肽酶A，並且包括包含(a)中所述的胺基酸序列的蛋白。例如，具有在組B中所示的胺基酸序列的蛋白可以按照下文所述的方法使用編碼在組B中所示的胺基酸序列的多聚核苷酸進行製備。昆蟲肽基-二肽酶A可以用作提供評估殺蟲活性的指示的試劑。具體地，例如，昆蟲肽基-二肽酶A可以通過用作肽基-二肽酶A用於使用肽基-二肽酶A測定殺蟲能力的方法中而提供評估殺蟲活性的指示的試劑。另外，更特別的方法可以按照前文所述的檢測肽基-二肽酶A活性的方法而進行。另外，當昆蟲肽基-二肽酶A用作提供評估殺蟲活性的指示的試劑時，更優選地，理想的是昆蟲肽基-二肽酶A是具有在組B中所示的胺基酸序列的肽基-二肽酶A。具有編碼在組B中所示的胺基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸(以下，在一些情形中叫作多聚核苷酸組B)具有可以在生物體的細胞中或體外翻譯系統中產生具有組B中所示的胺基酸序列的蛋白的核苷酸序列。多聚核苷酸組B可以是從天然克隆的DNA、向從天然克隆的DNA中引入核苷酸的刪除、取代或添加的DNA，例如，通過基因定點誘變或隨機誘變，或人工合成的DNA。具體地，實例包括包含由SEQIDNO:2代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。例如，將在下文中顯示獲得包含多聚核苷酸組B中所包含的核苷酸序列SEQIDNO:2的多聚核苷酸的方法。作為一個步驟，總RNA從棉釾獲得，合成CDNA文庫，並且進行PCR擴增，由此可以獲得目的多聚核苷酸。將在盆栽黃瓜的葉片上培養的一群棉岈(^7/7&go^y;"')的成蟲和卵用小刷子從葉片表面刮下，並且將630mg得到的群體用研缽和研棒在液氮中壓成粉末。從得到的冷凍壓碎的粉末中使用RNA提取試劑ISOGEN(由Nippon基因製備)如下分離RNA。在將IOmlISOGEN加入到在研缽中冷凍壓碎的粉末中後，將所述壓碎的粉末碾磨10分鐘，同時保持在冰上。碾磨後，將流體樣品用移液管轉移到15ml試管中，並且向其中加入2ml氯仿(由Wako純化學工業有限公司(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)製備)。立即將混合物用力振蕩15秒，然後在室溫靜置3分鐘。然後，將得到的混合物在4'C以12,000xg離心15分鐘，並且將每5ml水相層轉移到兩個新管中。在將5mlISOGEN加入到每一管中後，將混合物立即用力振蕩15秒，並且然後在室溫靜置3分鐘。然後，將得到的混合物在4。C以12，000xg離心15分鐘，並且將每10ml水相層分別轉移到新的50ml管中。隨後，將10ml異丙醇(由Wako純化學工業有限公司製備)加入到每一管中，並且將混合物在冰上放置30分鐘。將得到的混合物在4"C以12,000xg離心10分鐘以沉澱RNA。去除上清後，向剩餘物中加入20ml70%乙醇。將得到的混合物在fC以10,000xg離心5分鐘。去除上清後，將總RNA的沉澱稍微乾燥，並且然後溶解在lml商購的不含RNA酶的水(NacalaiTesque有限公司)中。在260nm檢測製備的總RNA的吸收，以按照常規方法計算濃度。應用通過上述方法獲得的棉蚜總RNA作為模板，並且按照附在試劑上的手冊使用隨機引物(由Invitrogen製備)禾口superscriptIII(由Invitrogen製備)進行RT-PCR，以合成cDNA文庫。應用通過上述方法獲得的棉蚜cDNA文庫作為模板，並且按照附在試劑上的手冊使用包含核苷酸序列SEQIDNO:3的寡核苷酸引物和包含核苷酸序列SEQIDNO:4的寡核苷酸引物以及PfuUtra高保真聚合酶(由Stratagene製備)進行PCR。PCR的條件如下在94"C溫育10分鐘；然後是40個PCR循環，一個循環為94。C15秒，60°C15秒和72。C3分鐘；並且接著在72。C溫育7分鐘。如上文所述，可以獲得包含核苷酸序列SEQIDNO:2的多聚核苷酸。備選地，在多聚核苷酸組B中所示的多聚核苷酸還可以通過製備具有由下列方法引入其中的突變的多聚核苷酸而獲得應用為上文提及的基因定點誘變的amber突變的方法、通過使用引入突變等的引物使用包含核苷酸序列SEQIDNO:2的多聚核苷酸作為模板的PCR方法。備選地，在多聚核苷酸組B中所示的多聚核苷酸還可以通過使用包含核苷酸序列SEQIDNO:2的多聚核苷酸作為探針的雜交方法而獲得。更具體地，第三種獲得方法可以按照在前文提及的由冷泉港實驗出版社出版的SambrookJ.,FrischE.F.，ManiatisT.，分子克隆第二版中所述的常規雜交而進行。備選地，在多聚核苷酸組B中所示的多聚核苷酸還可以通過基於已知的昆蟲肽基-二肽酶A的胺基酸序列製備引物並且進行PCR而獲得。為了從其它昆蟲物種如德國蟑螂(德國小蠊(5/^￡//"^縮""/0^)分離肽基-二肽酶A的同系物，應用Codehop程序(在由FredHutchinson癌症研究中心管理的Blocks蛋白質分析伺服器(BlocksProteinAnalysisServer)的網址[1衝://1)10。]^.傷0^.0^/11(^]^/00€16110口.11加1公共可用)，並且基於前文提及的來源於棉蚜的肽基-二肽酶A基因序列和先前已知的蠶基因(NCBI登記號AB026110.1),剛比亞按蚊基因(AAABO1008980)，黑腹果蠅基因(NP—477046.1，AAN10856，AAF52693),和西方角蠅基因(Q10715)的核苷酸序列，設計簡併引物。在選擇的昆蟲物種中的肽基-二肽酶A基因同系物的部分序列通過一系列PCR擴增，所述PCR使用來源於昆蟲物種的第一鏈cDNA作為模板。在此處，所述作為模板的第一鏈cDNA通過前文提及的方法使用SuperscriptIII製備。PCR擴增使用作為正向引物和反向引物的一套簡併引物以及AmplitaqGold(由應用生物系統(AppliedBiosystems)製備)按照附在所述試劑上的生產商的方法而進行。PCR條件為在94。CIO分鐘；然後是40個PCR循環，一個循環為94"C30秒，45°Cl分鐘和72。C每lkb長度的預計擴增產物l分鐘；並且接著在72'C7分鐘。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO載體(由Invitrogen製備)中，並且測序。然後，設計對所得到的肽基-二肽酶A基因的昆蟲同系物的部分序列特異的引物，並且進行3，RACEPCR或5'RACEPCR，以獲得所述基因的全長序列。3'和5，RACEPCRs這樣進行，g卩，應用從昆蟲總RNA製備的第一鏈cDNA作為模板，並且使用SMARTPCRcDNA合成試劑盒(由Clontech製備)按照附在所述試劑盒上的生產商的用法指導而進行。在3，RACE和5，RACE反應中，在SMARTPCRcDNA合成試劑盒中包含的通用引物混合物(UPM)與對目的序列特異的正向引物或反向引物組合使用。PCR條件為在94"CIO分鐘I個循環；然後40個PCR循環，一個循環為94。C15秒，63°C15秒和72。C每lkb長度的預計擴增產物l分鐘；並且接著在72"C7分鐘1個循環。得到的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO載體(由Iiwitrogen製備)中，並且測序。當通過第一輪PCR沒有獲得明顯的擴增產物時，使用第一輪PCR產物作為模板進行嵌套式PCR。關於引物，在SMARTPCRcDNA合成試劑盒中包含的NUP引物與特異的正向引物或特異的反向引物組合使用，所述特異的正向引物或特異的反向引物設計成與第一輪目的PCR產物的內部序列結合。PCR條件為在94'CIO分鐘I個循環；然後40個PCR循環，一個循環為94"C15秒，63°C15秒和72"2分鐘；並且接著在72'C7分鐘1個循環。得到的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆至UpCR-XL-TOPO載體(由Invitrogen製備)中，並且測序。上述測序結果顯示5，-端序列和3'-端序列，每一個分別編碼昆蟲肽基-二肽酶A的N-端區域和C-端區域。因此，在多聚核苷酸組B中所示的多聚核苷酸可以通過基於已知的昆蟲肽基-二肽酶A的胺基酸序列製備引物通過PCR而獲得。具有與多聚核苷酸組B的多聚核苷酸序列互補的核苷酸序列的多聚核苷酸可以用來應用雜交方法獲得在多聚核苷酸組B中所示的多聚核苷酸。本發明中的獲得方法包括通過雜交檢測需要的多聚核苷酸的步驟，鑑定所檢測的需要的多聚核苷酸的步驟，和回收所鑑定的需要的多聚核苷酸的步驟。每一步驟將在下文中具體闡釋。通過雜交檢測需要的多聚核苷酸的步驟和鑑定所檢測的需要的多聚核苷酸的步驟可以這樣進行，即，通過使用具有與多聚核苷酸組B的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多聚核苷酸作為探針，按照例如"MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndedition(分子克隆實驗室手冊第二版)"(1989)，冷泉港實驗室出版社，"CurrentProtocolsInMolecularBiology(當代分子生物學方法)"(1987),JohnWiley和Sons有限公司ISBNO-471-50338-X等中所述的方法進行。具體地，例如，將具有與SEQIDNO:2代表的核苷酸序列互補的核苷酸序列的DNA通過已知的方法用放射性同位素或螢光標記進行標記，其使用隨機引發的DNA標記試劑盒(RandomPrimedDNALabellingKit,由Boehringer製備)、隨機引物DNA標記試劑盒Ver.2(由TAKARASHUZO有限公司製備)、ECL直接核酸標記和檢測系統(ECLDirectNucleicAcidLabellingandDitectionSystem，由(Amersham生物禾鬥學製備)，或MegaprimeDNA-標記系統(由Amersham生物科學製備)進行標記，並且這可以用作探針。用於雜交的條件的實例包括嚴格條件，並且具體地，實例包括這樣的條件，即，在所述條件下，在65"C在存在6XSSC(0.9MNaCl，0.09M檸檬酸鈉)、5XDenhart，s雜交溶液(0.1。/。(w/v)菲克400，0.1。/。(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.1%BSA)、0.5。/。(w/v)SDS和100嗎/ml變性的鮭魚精子DNA下，或者在含有100昭/ml變性的鮭魚精子DNA的DIG便易雜交溶液(DIGEASYHbysolution,BoehringerMamnnheim)中進行溫育，然後，在室溫在存在1XSSC(0.15mNaCl，0.015m檸檬酸鈉)禾口0.5%SDFS下進行溫育兩次持續15分鐘，並且此外，在68。C在存在0.1XSSC(0.015mNaCl，0.0015m擰檬酸鈉)和0.5%SDS下進行溫育持續30分鐘。更具體地，例如，可以通過應用具有與多聚核苷酸組B的核苷酸序列互補的核苷酸序列的多聚核苷酸作為模板，使用MegaprimeDNA-標記系統(由AmershamPharmacia生物技術製備)並且使用在試劑盒中指定的反應溶液，而製備用"P標記的探針。使用這一探針按照常規方法進行菌落雜交，在65°。在存在6XSSC(0.9MNaCl，0.09M擰檬酸鈉)、5XDenhart，s雜交溶液(0.1。/。(w/v)菲克400，0.1。/。(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.1%BSA)、0.5%(w/v)SDS和IOOlag/ml變性的鮭魚精子DNA下，或者在含有IOO嗎/ml變性的鮭魚精子DNA的DIG便易雜交溶液(DIGEASYHbysolution,BoehringerMamnnheim)中進行溫育，然後，在室溫在存在lXSSC(0.15mNaCl，0.015m檸檬酸鈉)和0.5%SDS下進行溫育兩次持續15分鐘，並且此外，在68。C在存在0.1XSSC(0.015mNaCI，0.0015m擰檬酸鈉)禾口0.5%SDS下進行溫育持續30分鐘，由此可以檢測(包含)雜交的多聚核苷酸(的菌落)。因此，可以通過雜交檢測需要的多聚核苷酸，並且可以鑑定所檢測的需要的多聚核苷酸。對於回收所鑑定的需要的多聚核苷酸，可以通過前文提及的方法，例如，按照如在"分子克隆實驗室手冊第二版"(1989)，冷泉港實驗室出版社中所述的鹼方法的方法，從含有所檢測並且鑑定的多聚核苷酸的菌落回收質粒DNA。所回收的需要的多聚核苷酸(質粒DNA)的核苷酸序列可以通過馬克薩姆吉爾伯特方法(MaxamGilbertmethod)(例如，在Maxam,A.M和W.Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院學報)，74,560,1977等中所述)或桑格方法(Sangermethod)(例如，在Sanger,F.禾BA.R.Coulson,J.Mol.Biol.(分子生物學雜誌)，94,441,1975，Sanger,F.和Nicklen和A.R.Coulson.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院學報)，74，5463,1977等中所述)進行驗證。因此，例如，可以使用商購的Termo測序酶II染色終止子循環測序試劑盒(由Amersham生物科學製備)、染色終止子循環測序FS快速反應試劑盒(由應用生物系統(AppliedBiosystems)製備)等。具有多聚核苷酸組B的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多聚核苷酸或具有與所述部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的多聚核苷酸可以用來使用PCR獲得在多聚核苷酸組B中所示的多聚核苷酸。更具體地，實例包括包含由SEQIDNO:3或4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。本發明中的獲得方法包括通過PCR擴增需要的多聚核苷酸的步驟，鑑定所擴增的需要的多聚核苷酸的步驟，和回收所鑑定的需要的多聚核苷酸的步驟。每一步驟將在下文中具體闡釋。在通過PCR擴增需要的多聚核苷酸的步驟中，具體地，基於約20bp一約40bp的核苷酸序列，例如，選自由SEQIDNO:2代表的核苷酸序列和與SEQIDNO:2代表的核苷酸序列有互補性的序列的核苷酸序列，從多聚核苷酸組B的核苷酸序列的部分核苷酸序列或與所述部分核苷酸序列有互補性的核苷酸序列設計並且合成的DNA可以用作引物對。引物對的實例包括一套包含SEQIDNO:3代表的核苷酸序列的多聚核苷酸和包含SEQIDNO:4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。例如，通過將商購的PCR試劑盒指定的反應溶液添加到通過前文提及的方法製備的cDNA文庫中而製備PCR反應溶液。反應條件可以變化，這取決於要用的引物對，並且例如，可以應用下列條件這樣的條件，即在所述條件下，在9fC溫育10秒鐘後，重複大約40個循環，1個循環為94"C15秒，60。C15秒，和72'C3分鐘，並且繼續在72"C進行溫育3分鐘；這樣的條件，即在所述條件下，在9fC進行溫育2分鐘，然後在約8'C進行溫育3分鐘，並且然後重複大約40個循環，1個循環為94。C30秒，55t:30秒，和72。C4分鐘；或者這樣的條件，即在所述條件下，進行5—10個循環，1個循環為94X:5秒，然後72。C4分鐘，並且繼續進行約20—40個循環，1個循環為在94。C溫育5秒，然後在7(TC4分鐘。在PCR中，例如，可以使用PfuUltra高保真度聚合酶(由Stratagene製備)，AmplitaqGold(由應用生物系統製備)，TakaraHemculase(商標名)(由TAKARASHUZO有限公司製備)，包含在便利cDNAPCR試劑盒(AdvantagecDNAPCRKit)中的DNA聚合酶(由Clonetech製備),TaKaRaExTaq(由TAKARASHUZO有限公司製備)，PLATINUMTMPCR超級混合物(由東方生命技術(LifetechOriental)製備)。通過PCR擴增的需要的多聚核苷酸的鑑定可以通過瓊脂糖凝膠電泳按照"分子克隆實驗室手冊第二版"(1989)，冷泉港實驗室出版社中所述的方法檢測分子量而進行。另外，關於所擴增的需要的多聚核苷酸，使用商購的DNA測序反應試劑盒，例如，染色終止子循環測序FS快速反應試劑盒(由應用生物系統製備)按照附在試劑盒上的手冊進行測序反應，並且使用DNA測序儀3100(由應用生物系統製備)分析核苷酸，由此，可以讀取擴增片段的核苷酸序列。回收所鑑定的需要的多聚核苷酸的方法的實例包括按照"分子克隆實驗室手冊第二版"(1989)，冷泉港實驗室出版社中所述的方法從瓊脂糖凝膠純化並且回收通過瓊脂糖凝膠電泳鑑定的前文提及的多聚核苷酸的方法。另外，這樣回收的多聚核苷酸或通過PCR擴增的需要的多聚核苷酸可以按照"分子克隆實驗室手冊第二版"(1989)，冷泉港實驗室出版社中所述的方法、和"當代分子生物學方法"(1987)，JohnWiley和Sons有限公司ISBN0-471-50338-X中所述的方法克隆到載體中。要用的載體實例包括pUCA119(由TAKARASHUZO有限公司製備)，pTVA118N(由TAKARASHUZO有限公司製備)，pBluescriptll(由Toyobo有限公司製備)，pCR2.1-TOPO(由Irwitrogen製備)等。另夕卜，克隆的多聚核苷酸的核苷酸序列可以通過馬克薩姆吉爾伯特方法(MaxamGilbertmethod)(例如，在Maxam，A.M和W.Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院學報)，74，560,1977中所述)或桑格方法(Sangermethod)(例如，在Sanger，F.禾QA.R.Coulson,J.Mol.Biol.(分子生物學雜誌)，94,441,1975，Sanger,F.和Nicklen和A.R.Coulson.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院學報)，74,5463,1977中所述)進行驗證。因此，例如，可以使用商購的Termo測序酶II染色終止子循環測序試劑盒(由Amersham生物科學製備)、染色終止子循環測序FS快速反應試劑盒(由應用生物系統(AppliedBiosystems)製備)等。另外，具有多聚核苷酸組B的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多聚核苷酸或具有與所述部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的多聚核苷酸可以用來獲得多聚核苷酸組B中所示的多聚核苷酸，其不但使用PCR方法還使用前文提及的雜交方法。更具體地，實例包括包含由SEQIDNO:3或4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。製備具有在組B中所示的胺基酸序列的蛋白的方法的實例包括培養其中引入選自多聚核苷酸組B的多聚核苷酸的轉化體並且回收所生產的蛋白的方法。另外，為了製備本文所用的轉化體，其為這樣的工作，諸如製備包含這樣的多聚核苷酸的環形多聚核苷酸，即，在所述多聚核苷酸中，選自多聚核苷酸組B的多聚核苷酸可操作性地與來源於杆狀病毒的啟動子連接。所述方法將在下文詳細闡述。另外，通過類似的方法，使用具有編碼所用的肽基-二肽酶A的核苷酸序列的多聚核苷酸，可以製備並且獲得在組A中所示的肽基-二肽酶A，所述肽基-二肽酶A用於使用肽基-二肽酶A來測定殺蟲能力的方法中。杆狀病毒是屬於各種組的感染許多不同物種的昆蟲作為它們的天然宿主的大雙鏈DNA病毒中的病毒。杆狀病毒基因組在感染的宿主細胞的細胞核中複製並且轉錄，在所述宿主細胞的細胞核中大的環形杆狀病毒DNA(80-200kb)包裝成杆狀核殼體。用於外源基因表達的分離體的實例為苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(Autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus(AcMNPV))和家蠶蛾(Bombyxmori)(蠶)核型多角體病毒(BmNPV)。杆狀病毒來源的啟動子意指包含在杆狀病毒基因組中的基因的啟動子。在它們當中，用於表達外源基因的杆狀病毒啟動子的實例包括多角體蛋白基因的啟動子，和plO基因的啟動子(Harris和Polayes(1997).Focus(焦點)19,6-8)。多角體蛋白(多角體)基因的啟動子是編碼多角體蛋白的基因的啟動子，所述多角體蛋白是當杆狀病毒感染昆蟲細胞時所產生的細胞核內內含體的主要成分。多角體蛋白不是複製病毒必需的蛋白，並且通過用目的蛋白的基因取代它的基因，可以表達數量達到細胞蛋白50%的目的蛋白。在本發明中，"可操作性地連接"意指將包含目的基因的多聚核苷酸連接到包含啟動子序列的多聚核苷酸的下遊，以便目的基因可以在所用的轉錄系統中進行轉錄。具體地，例如，當使用後來描述的多角體蛋白基因的啟動子時，包含目的基因的多聚核苷酸可以連接到多角體蛋白基因啟動子的下遊。另外，例如，當使用除多角體蛋白基因啟動子之外的啟動子時，還可以將包含目的基因的多聚核苷酸連接到包含除多角體蛋白基因啟動子以外的啟動子序列的多聚核苷酸的下遊。更具體地，例如，當使用利用多角體蛋白基因啟動子的質粒pFastbacHT(由Invitrogen製備)載體時，可以通過將目的基因連接到位於多角體蛋白基因啟動子下遊的限制酶位點如BamHI,EcoRI,Sail,Spel,NotI,Xbal,PstI,Xhol,Sphl，KpnI和HindIII而可操作性地連接多聚核苷酸。在本發明中，"環形多聚核苷酸"是通過將多聚核苷酸鏈的末端結合而製成環形的多聚核苷酸，並且實例包括除了質粒DNA、杆狀病毒穿梭載體DNA等以外的許多細菌的染色體DNA。質粒DNA是相對低分子量的環形多聚核苷酸，並且實例包括pET(由TakaraMirus生物有限公司製備)和pBluescriptII(由Stratagene製備)，其用於在大腸桿菌(E.coli)中克隆和表達。其它實例包括pFastBacl，pFastBacHTA，pFastBacHTB,pFastBacHTC,pFastBacDual,pBlueBacII(由Invitrogen製備),pAcSG2(由Pharmingen製備)等，其包含杆狀病毒表達盒。杆狀病毒穿梭載體是由BAC(細菌人工染色體)組成的高分子量DNA，所述BAC包含完整的杆狀病毒基因組，例如在DH10BacTM大腸桿菌細胞(invitrogen)中存在的bMON14272(136kb)。杆狀病毒穿梭載體DNA在大腸桿菌細胞中作為大質粒增殖，並且可以包含用於在杆狀病毒啟動子控制下表達外源基因的表達盒。在其中將包含編碼在組B中所示的胺基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸可操作性地連接到杆狀病毒來源的啟動子上的環形多聚核苷酸特異地為，例如，包含含有與杆狀病毒的多角體蛋白啟動子可操作性地連接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA的環形多聚核苷酸，並且例如，可以按照下述方法製備並且獲得。將包含按照前文提及的方法克隆的棉蚜肽基-二肽酶A基因的質粒DNA用EcoRI和XhoI消化，並且將得到的包含棉蚜肽基-二肽酶A基因的約1.9kbpDNA片段與預先用EcoRI和XhoI消化的質粒載體pFastBacHTB(由Invitrogen製備)連接。所獲得的質粒是包含含有與杆狀病毒多角體蛋白啟動子可操作性連接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA的環形多聚核苷酸的一個實例。另外，按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統(由Invitrogen製備)上的手冊，這一質粒可以引入到大腸桿菌(Escherichiacoli)DH10Bac中，並且包含多角體蛋白基因啟動子和棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA可以通過在細胞中重組而插入到杆狀病毒穿梭載體DNA中。例如，通過前文提及的方法，可以製備並且獲得包含含有與杆狀病毒的多角體蛋白啟動子可操作性地連接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA的環形多聚核苷酸。類似地，環形多聚核苷酸可以通過將編碼在組B中所示的胺基酸序列的核苷酸連接到載體上而製備。在本發明中，"複製起點"是對於自身在宿主細胞中複製所必需的特異的DNA序列。複製起點的實例包括用於細菌質粒的colEl和fl。另外，同源重複(hrs)區域和非-hr區域存在於杆狀病毒穿梭載體DNA中(Pijlman等.(2003)JournalofGeneralVirology(普通病毒學雜誌)84,2669-2678)。所述環形多聚核苷酸的一個實例是杆狀病毒穿梭載體。在此處，杆狀病毒穿梭載體意指杆狀病毒穿梭載體(bacmid)DNA。杆狀病毒穿梭載體DNA可以增殖並且遺傳加工到大腸桿菌中。當從大腸桿菌分離並且引入到昆蟲宿主細胞中時，杆狀病毒穿梭載體可以作為病毒增殖。例如，在bMON14272(invitrogen)情形中，可以在大腸桿菌中產生重組杆狀病毒穿梭載體，其通過將包含來自pFastBacTM供體質粒的杆狀病毒表達盒的mini-Tn7元件轉座到杆狀病毒穿梭載體上的mini-attTn7附著位點上而產生。用作杆狀病毒增殖的宿主並且用於通過重組杆狀病毒的方式而表達外源蛋白的宿主的昆蟲細胞包括來源於^^fo內era戶Mg^eWa或來源於7Wc/2o;/^flw'的細胞系。所述細胞系的實例為Sf21細胞，Sf9細胞，Tn-368或HighFive細胞或MimicSf9昆蟲細胞(Invitrogen)。轉化體是通過向細胞中引入外源多聚核苷酸而遺傳改變的真核細胞或原核細胞。轉化體的實例包括通過引入包含杆狀病毒表達盒的質粒如質粒載體pFastBac(由Irwitrogen製備)等而轉化的大腸桿菌細胞等。另外，將DNA引入宿主細胞的技術的實例包括轉化、轉染、原生質體融合、脂轉染、電穿孔等。其中引入編碼組B所示的胺基酸序列的多聚核苷酸的轉化體的實例包括轉化的大腸桿菌，在其中引入包含與杆狀病毒多角體蛋白啟動子可操作性地連接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA。具體地，所述轉化體可以按照下述方法進行製備。轉化體可以這樣製備，即通過按照在"分子克隆實驗室手冊第二版"(1989)，冷泉港實驗室出版社中所述的方法，將在EcoRI位點和XhoI位點之間插入包含棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA的質粒載體pFastBacHTB(由Invitrogen製備)引入到大腸桿菌細胞中而製備。另夕卜，轉化體還可以通過按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統(由Invitrogen製備)上的手所述的方法將相同的質粒載體引入到大腸桿菌r)H10Bac中而製備。備選地，轉化體還可以通過按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統(由Irwitrogen製備)上的手冊所述的方法將其中插入包含多角體蛋白基因啟動子和棉蚜肽基-二肽酶A基因的片段的杆狀病毒穿梭載體DNA轉染到昆蟲細胞中而獲得。重組杆狀病毒是在其中通過遺傳-加工技術而改變杆狀病毒基因組序列的杆狀病毒。重組杆狀病毒的具體的實例包括，包含含有與杆狀病毒的多角體蛋白啟動子可操作性地連接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA片段的重組杆狀病毒。重組杆狀病毒可以這樣製備，例如，通過杆狀病毒DNA和轉移載體DNA在昆蟲細胞中的同源重組(Kitts(1996)Cytotechnology(細胞技術學)20,111-123)而製備。備選地，重組杆狀病毒還可以這樣製備，例如，通過將按照前文提及的方法製備的包含含有與杆狀病毒的多角體蛋白啟動子可操作性地連接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA片段的重組杆狀病毒穿梭載體DNA引入到昆蟲細胞中而製備。具體地，重組杆狀病毒可以通過按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒表達系統(由Invitrogen製備)上的手冊所述的方法，將包含含有與前文提及的杆狀病毒的多角體蛋白啟動子可操作性地連接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA片段的重組杆狀病毒穿梭載體DNA轉染到昆蟲細胞中而製備。更具體地，按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒(商標名)表達系統(由Irwitmgen製備)上的手冊，將所述重組杆狀病毒穿梭載體DNA轉染到Sf9細胞(ATCC:CRL-1711)中，以獲得重組的杆狀病毒。對於轉染，使用cellfectin(由Irwitrogen製備)，補充L-胺基酸的格雷絲昆蟲細胞培養基(Grace'sInsectCellCultureMedium)(由Invitrogen,Gibco製備)，10。/。胎牛血清(由Clontech製備)，和青黴素/鏈黴素(由生命技術製備)。另外，對於轉染，使用2昭杆狀病毒穿梭載體DNA和7^cellfectin。按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒(商標名)表達系統(由Invitrogen製備)上的手冊，在8天後復甦P1重組杆狀病毒儲液。例如，0.5ml的這一桿狀病毒儲液可以進一步增殖，其通過接種在lxlS個細胞/ml的300mlSf9細胞培養物上而進行。按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒(商標名)表達系統(由Invitrogen製備)上的手冊，在4天後收集擴增的杆狀病毒儲液。將Sf9細胞在Erlenmeyer燒瓶中在27'C和135rpm懸浮培養。用於這種培養的培養基的成分包括補充L-胺基酸的格雷絲昆蟲細胞培養基(由Invitrogen，Gibco製備)，10。/。胎牛血清(由Clontech製備)，青黴素/鏈黴素(由生命技術製備)，和終濃度0.1^的普盧蘭尼克F-68(PluronicF-68，由Sigma-aldrich製備)。肽基-二肽酶A可以通過培養由前文提及的方法製備的轉化體並且回收所生產的來源於昆蟲的肽基-二肽酶A而製備。例如，肽基-二肽酶A蛋白可以通過重組杆狀病毒/Sf9細胞表達系統生產。這一系統是一種最有力和通用的可用真核表達系統，並且可以用來表達來自許多不同來源包括真菌、植物、細菌和病毒的異源基因。備選地，肽基-二肽酶A蛋白可以通過重組大腸桿菌表達系統生產。這一系統是用於異源蛋白高水平生產的最常用的原核表達系統。大腸桿菌是己知的遺傳和生理上最有特徵的生物體，容易操作，許多工具可用，它能夠非常快速地生長，它在廉價的複合物或很好確定的基本培養基上生長，並且它具有極高的合成異源蛋白的能力。另外，將通過培養轉化體而生產的昆蟲來源的肽基-二肽酶A通過諸如超聲、弗氏壓碎器和Dyno碾碎機的方法進行裂解，並且以包含在細胞粗提物中的形式回收，並且通過使用通常在酶純化中所用的方法諸如離子交換柱層析、反相柱層析、凝膠過濾柱層析等而獲得純化的蛋白。備選地，當設計來源於昆蟲的肽基-二肽酶A以具有His-標記的形式生產時，可以通過特異性識別並且結合His-標記的親和柱層析快速從細胞粗提物中獲得純化的蛋白。通過所述方法，可以製備來源於昆蟲的肽基-二肽酶A。例如，來源於昆蟲的肽基-二肽酶A可以這樣製備，即通過培養用含有與杆狀病毒的多角體蛋白啟動子可操作性地連接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA片段轉化的昆蟲細胞，並且用弗氏壓碎器將細胞碾碎，然後用柱層析純化而製備。更具體地，例如，將4xlS個Sf9細胞懸浮在30ml包含重組杆狀病毒穿梭載體DNA的重組杆狀病毒儲液中，所述重組杆狀病毒穿梭載體DNA含有包含與杆狀病毒多角體蛋白啟動子可操作性地連接的棉蚜肽基-二肽酶A基因的DNA片段，將混懸液在125mlErlenmeyer中在135rpm在27"C旋轉培養l小時。然後，將每l/3的細胞混懸液置於3個25ml的Erlenmeyer燒瓶中，向每個燒瓶中加入培養基，以便培養溶液的體積達到100ml，加入lml的10%普盧蘭尼克溶液，並且將這繼續培養。48小時後，通過以290Xg離心5分鐘而收集感染杆狀病毒的Sf9細胞。將緩衝液A(50mMHepes-HaOHpH7.5,0.5mNaCl，10mM咪唑)加入到所收集的Sf9細胞中，以將它們懸浮，並且使用弗氏壓碎器(由ThermoSpectronic製備)按照在附加的手冊中所述的方法在l,500psi的壓力下將細胞裂解。將這一弗氏-加壓的溶液在4。C以13,000xg離心20分鐘，並且將得到的上層清液通過0.45mm過濾器過濾。然後，將這注射到用緩衝液A(50mMH印es-HaOHpH7.5,0.5mNaCl，10mM咪唑)平衡的串聯連接的兩個HiTrap/HisTrap親和柱(柱體積5ml，由Amersham生物科學製備)上，並且用100ml緩衝液A洗滌柱。然後，用150ml通過混合93X的緩衝液A和7X的緩衝液B(50mMH印es-HaOHpH7.5，0.5mNaCl，500mM咪唑)而獲得的緩衝液洗滌柱。最後，將60ml通過混合50^的緩衝液A和50。/^的緩衝液B而獲得的緩衝液注射到柱上。分離每lml的洗脫級分，並且保存，並且用SDS-PAGE分析等分物，以鑑定含有75Kda肽基-二肽酶A的級分。這些級分是以最大量含有肽基-二肽酶A的溶液。此外，將每1.5ml的含有肽基-二肽酶A的溶液注射到用緩衝液C(50mMHepes-HaOH，pH7.5，0.5mNaCl)平衡的HiTrap脫鹽柱(柱體積5ml，由Amersham生物科學製備)上，然後注射4.5ml的緩衝液C，回收洗脫的級分。這一級分包含溶解在緩衝液C中的目的肽基-二肽酶A。通過用SDS-PAGE分析這一級分的等分物，可以證實包含75Kda的肽基-二肽酶A。包含組B中所示的胺基酸序列的昆蟲肽基-二肽酶A可以用作研究工具。例如，它可以用作進行諸如檢測殺蟲能力、篩選具有殺蟲能力的化學物質等的研究的研究工具。另外，例如，在分析作用為肽基-二肽酶A的試劑的作用和機制的研究中，肽基-二肽酶A也可以用作研究工具。另外，編碼在組B中所示的胺基酸序列的多聚核苷酸和具有與它們有互補性的核苷酸序列的多聚核苷酸，以及編碼在組B中所示的胺基酸序列的多聚核苷酸的部分核苷酸序列，或具有與所述部分核苷酸序列有互補性的核苷酸序列的多聚核苷酸，和包含由SEQIDNO:3或4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸，可以用作研究工具。例如，它們中的一部分作用為用於上文所述的製備肽基-二肽酶A的方法的多聚核苷酸。另外，部分可以用作重要的研究工具，用於進行使用PCR獲得在多聚核苷酸組B中所示的多聚核苷酸，或者使用雜交獲得在多聚核苷酸組B中所示的多聚核苷酸，如上文所述。特別地，當進行殺蟲劑的篩選時，它們可以用作對於篩選所進行的實驗的實驗工具。具體地，它們可以用作在進行檢測殺蟲能力、篩選具有殺蟲能力的化學物質等時進行的實驗的實驗工具。此外，本發明還包括這樣的系統，所述系統包括輸入、存儲和管理測試物質的能力的數據信息的裝置，其中所述能力是調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力(以下，在一些情形中，叫作裝置a)，基於需要的標準查詢並且回傳數據信息的裝置(以下，在一些情形中，叫作裝置b)，和顯示並且輸出查詢和回傳的結果的裝置(以下，在一些情形中，叫作裝置c)(以下，在一些情形中叫作本系統)。首先，將闡釋裝置a。裝置a意指，當輸入關於測試物質具有的調控來源於昆蟲的肽基-二肽酶A活性的能力的數據信息之後，存儲並且管理所輸入的信息，如上文所述。信息通過輸入裝置l輸入，並且通常以記憶裝置2記憶。輸入裝置的實例包括可以輸入信息的裝置諸如鍵盤和滑鼠。當完成信息輸入和存儲、管理時，程序進展到下一種裝置b。對於存儲、管理所述信息，可以通過使用硬體如計算機和軟體如OS和資料庫管理而輸入具有數據結構的信息，並且將所述信息存儲到適當的記憶裝置中，例如計算機可讀的記錄介質如軟盤、光磁碟、CD—ROM、DVD—ROM和硬碟，而有效地存儲和管理大量的信息。將闡釋裝置b。裝置b是一種通過基於獲得需要的結果的標準的a的方式査詢並且回傳所存儲和管理的數據信息的裝置，如上文所述。對於所述信息，當將關於查詢和回傳的標準通過輸入裝置l輸入，並且在通常記憶在記憶裝置2中的信息中選擇符合所述標準的信息時，程序進展到下一裝置c。選擇的結果通常記憶在記憶裝置2中，並且可以進一步通過顯示輸出裝置3顯示。將闡釋裝置C。裝置C是顯示並且輸出查詢和回傳的結果的裝置，如上文所述。顯示輸出裝置3的實例包括顯示器、印表機等，並且所述結果可以在計算機的顯示裝置上顯示，或者可以通過列印在紙上輸出。實施例下面將通過實施例的方式更詳細地闡釋本發明，但是本發明不限於這些具體的實例。實施例l(從棉蚜和德國蟑螂提取總RNA)(1)從棉蚜提取總RNA將在盆栽黃瓜的葉片上培養的一群棉蚜(^/^gw^^7)的成蟲和卵用小刷子從葉片表面刮下，並且將630mg得到的群體用研缽和研棒在液氮中壓成粉末。從得到的冷凍壓碎的粉末中使用RNA提取試劑ISOGEN(由Nippon基因製備)如下分離RNA。在將IOmlISOGEN加入到在研缽中冷凍壓碎的粉末中後，將所述壓碎的粉末碾磨10分鐘，同時保持在冰上。碾磨後，將流體樣品用移液管轉移到15ml試管中，並且向其中加入2ml氯仿(由Wako純化學工業有限公司(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)製備)。立即將混合物用力振蕩15秒，然後在室溫靜置3分鐘，然後，將得到的混合物在4"C以12,000xg離心15分鐘，並且將每5ml水相層轉移到兩個新管中。在將5mlIS0GEN加入到每一管中後，將混合物立即用力振蕩15秒，並且然後在室溫靜置3分鐘。然後，將得到的混合物在4"C以12,000xg離心15分鐘，並且將每10ml水相層分別轉移到新的50ml管中。隨後，將10ml異丙醇(由Wako純化學工業有限公司製備)加入到每一管中，並且將混合物在冰上放置30分鐘。將得到的混合物在4。C以12,000xg離心10分鐘以沉澱RNA。去除上清後，向剩餘物中加入20ml70。/。乙醇。將得到的混合物在4。C以10,000xg離心5分鐘。去除上清後，將總RNA的沉澱稍微乾燥，並且然後溶解在lml商購的不含RNA酶的水(NacalaiTesque有限公司)中。製備的總RNA的濃度(從在260nm的吸收計算)為6.9mg/ml。(2)從德國蟑螂提取總RNA提供人工培養的德國蟑螂(德國小蠊^/加￡//"^，朋&^)的成蟲、幼蟲和卵囊作為樣品。10隻雄性成蟲和10隻雌性成蟲(來自每一隻己經去除卵囊的個體)用作l.lg的成蟲樣品，將10隻雄性幼蟲和10隻雌性幼蟲用作1.0g的幼蟲樣品，並且將26隻卵囊用作1.0g的卵囊樣品。將這三種樣品使用獨立的研缽和研棒獨立地在液氮中壓成粉末。從每一份得到的冷凍壓碎的粉末中使用RNA提取試劑ISOGEN(由Nippon基因製備)如下分離RNA。在將IOmlISOGEN加入到在研缽中冷凍壓碎的粉末中後，將所述壓碎的粉末碾磨10分鐘，同時保持在冰上。碾磨後，將流體樣品用移液管轉移到15ml試管中，並且向其中加入2ml氯仿(由Wako純化學工業有限公司(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)製備)。立即將混合物用力振蕩15秒，然後在室溫靜置3分鐘，然後，將得到的混合物在4t:以12，000xg離心15分鐘，並且將每5ml水相層轉移到兩個新管中。在將5mlIS0GEN加入到每一管中後，將混合物立即用力振蕩15秒，並且然後在室溫靜置3分鐘。然後，將得到的混合物在4t:以12,000xg離心15分鐘，並且將每10ml水相層分別轉移到新的50ml管中。隨後，將10ml異丙醇(由Wako純化學工業有限公司製備)加入到每一管中，並且將混合物在冰上放置30分鐘。將得到的混合物在4。C以12,000xg離心10分鐘以沉澱RNA。去除上清後，向剩餘物中加入20ml70%乙醇。將得到的混合物在4。C以10,000xg離心5分鐘。去除上清後，將總RNA的沉澱稍微乾燥，並且然後溶解在lml商購的不含RNA酶的水(NacalaiTesque有限公司)中。製備的總RNA的濃度(從在260nm的吸收計算)在來源於成蟲的總RNA的情形中為1.1mg/ml，在來源於幼蟲的總RNA的情形中為2.5mg/ml，並且在來源於卵囊的總RNA的情形中為1.4mg/ml。實施例2(分離棉頓肽基-二肽酶A基因)使用來自棉蚜的總RNA，用於RT—PCR的隨機引物(Invitrogen)和SuperscriptIII(Invitrogen)按照SuperscriptIII的生產商的方法而製備第一鏈cDNA。通過使用包含核苷酸序列SEQIDNO:3的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQIDNO:4的寡核苷酸，其為對所述基因特異的引物，禾BPfUUltm高保真度聚合酶(由Stratagene製備)按照生產商的方法進行PCR而擴增棉蚜肽基-二肽酶A的全長cDNA。將如上述製備的第一鏈cDNA用作模板。應用的PCR條件如下起始變性在94。C10分鐘；然後40個PCR循環，一個循環為94。C15秒，6(TC15秒和72"3分鐘；接著在72。C7分鐘。得到的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以將包含核苷酸SEQIDNO:2的1921bp的目的DNA克隆至UpCR-blunt載體(Invitrogen)中。從所述核苷酸序列推定的胺基酸序列為胺基酸序列SEQIDNO:1。得到的質粒命名為在pGATl。實施例3(分離德國蟑螂肽基-二肽酶A基因)為了從其它昆蟲物種如德國蟑螂(德國小蠊)分離肽基-二肽酶A基因的同系物，應用Codehop程序(在由FredHutchinson癌症研究中心管理的Blocks蛋白質分析伺服器(BlocksProteinAnalysisServer)的網址http:〃blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.h加公共可用)，並且基於前文提及的來源於棉蚜的肽基-二肽酶A基因序列和先前已知的蠶基因(NCBI登記號AB026110.1),剛比亞按蚊基因(AAAB01008980)，黑腹果蠅基因(NP—477046.1,AAN10856,AAF52693)，和西方角蠅基因(Q10715)的核苷酸序列，設計簡併引物。在選擇的昆蟲物種中的肽基-二肽酶A基因同系物的部分序列通過一系列PCR擴增，所述PCR使用來源於昆蟲物種的第一鏈cDNA作為模板。在此處，所述作為模板的第一鏈cDNA通過前文提及的方法使用SuperscriptIII製備。PCR擴增使用作為正向引物和反向引物的一套簡併引物以及AmplitaqGold(由應用生物系統(AppliedBiosystems)製備)按照附在所述試劑上的生產商的方法而進行。PCR條件為在94。C10分鐘；然後是40個PCR循環，一個循環為94"30秒，45。Cl分鐘和72。C每lkb長度的預計擴增產物l分鐘；並且接著在72t:7分鐘。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO載體(由Invitrogen製備)中，並且測序。因此，獲得分別包含核苷酸序列SEQIDNO:12，14，16，18或20的德國小蠊肽基-二肽酶A基因的部分序列。從這些所述部分序列的每一個推定的胺基酸序列分別為胺基酸序列SEQIDNO:13，15，17，19或21。然後，設計對所得到的肽基-二肽酶A基因的昆蟲同系物的部分序列特異的引物，並且進行3'RACEPCR或5，RACEPCR，以獲得所述基因的全長序列。3'和5，RACEPCRs這樣進行，即，應用從昆蟲總RNA製備的第一鏈cDNA作為模板，並且使用SMARTPCRcDNA合成試劑盒(由Clontech製備)按照附在所述試劑盒上的生產商的用法指導而進行。在3'RACE和5'RACE反應中，在SMARTPCRcDNA合成試劑盒中包含的通用引物混合物(UPM)與對目的序列特異的正向引物或反向引物組合使用。PCR條件為在94"C10分鐘1個循環；然後40個PCR循環，一個循環為94。C15秒，63°C15秒和72。C每lkb長度的預計擴增產物l分鐘；並且接著在72'C7分鐘1個循環。得到的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO載體(由Invitrogen製備)中，並且測序。當通過第一輪PCR沒有獲得明顯的擴增產物時，使用第一輪PCR產物作為模板進行嵌套式PCR。關於引物，在SMARTPCRcDNA合成試劑盒中包含的NUP引物與特異的正向引物或特異的反向引物組合使用，所述特異的正向引物或特異的反向引物設計成與第一輪目的PCR產物的內部序列結合。PCR條件為在94"CIO分鐘I個循環；然後40個PCR循環，一個循環為94t:15秒，63°C15秒和72。C2分鐘；並且接著在72。C7分鐘1個循環。得到的PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化，以獲得目的DNA。此外，將獲得的DNA克隆至lJpCR-XL-TOPO載體(由Invitrogen製備)中，並且測序。上述測序結果顯示5'-端序列和3，-端序列，每一個分別編碼昆蟲肽基-二肽酶A的N-端區域和C-端區域。實施例4(構建重組杆狀病毒穿梭載體)(1)將肽基-二肽酶AcDNA克隆到基因表達載體pFastBac(註冊商標名)HTb中將通過用EcoRI和Xhol消化在實施例2中獲得的pGAT1而得到的1916bpDNA片段分離並且純化，並且連接到基因表達載體pFastBac(註冊商標名)HTb的EcoRI/XhoI克隆位點。以下，得到的載體命名為pGAT3。然後，將編碼His-標記的核苷酸序列引入到棉蚜肽基-二肽酶cDNA的3'末端。艮卩，分離並且純化克隆AC301的207bp的SM/XhoIDNA片段，並且連接到pGAT3的6519bp的SM/Xho1DNA片段中。得到的載體命名為pGAT6。克隆AC301通過PCR產生，如下所述。通過使用棉蚜總RNA作為模板，並且使用PfoUltm高保真度聚合酶(由Strategene製備)，合成第一鏈cDNA。PCR按照附在所述試劑上的手冊進行，並且包含核苷酸序列SEQIDNO:5的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQIDNO:6的寡核苷酸用作引物。PCR條件如下在94'C2分鐘1個循環；然後35個PCR循環，一個循環為94。C15秒,60。C15秒和72。C25秒;接著在72t:7分鐘1個循環。然後，通過對得到的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行分析和純化而得到目的DNA片段。此外，將獲得的DNA片段克隆至IJpCR-blunt載體(由Invitrogen製備)中，並且確定克隆的DNA片段的核苷酸序列。這樣得到的質粒命名為AC301。pGAT6的N端His-標記通過用Rsrl/EcoRI消化而去除，並且用接頭代替，其中所述接頭通過將包含核苷酸序列SEQIDNO:7的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQIDNO:8的寡核苷酸退火而產生。得到的載體為這樣的載體，即，其中具有C端His-標記的編碼全長棉蚜肽基-二肽酶A的核苷酸序列插入到pFastBac(註冊商標)HTb中，並且在下文命名為pGAT14。(2)產生重組的杆狀病毒穿梭載體DNA使用獲得的pGAT14，轉化大腸桿菌DH10Bac的感受態細胞。從轉化的大腸桿菌DH10Bac分離關於棉蚜肽基-二肽酶A的重組杆狀病毒穿梭載體DNA。所有的步驟按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒(商標名)表達系統(由Invitrogen製備)上的手冊。通過PCR分析驗證目的基因在重組杆狀病毒穿梭載體中的存在或不存在。由於所述杆狀病毒穿梭載體包含M13正向(-40)和M13反向引發位點，所以使用M13正向(-40)和M13反向引物。此外，還使用M13正向(-40)或M13反向引物與對目標特異的引物的組合。每一操作按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒(商標名)表達系統(由Invitrogen製備)上的手冊而進行。每一PCR條件如下(a)在包含核苷酸序列SEQIDNO:9的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQIDNO:IO的寡核苷酸的情形中(i)94"C5分鐘；接著(ii)20個循環94°C15秒，60。C15秒，和72""C4分鐘30秒；接著(iii)25個循環94°C15秒，和63。C15秒，和72。C4分鐘30秒(每+l個循環增加5秒)；並且接著(iv)72'C7分鐘。(b)在包含核苷酸序列SEQIDNO:IO的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQIDNO:ll的寡核苷酸的情形中(i)94"C5分鐘；接著(ii)20個循環94°C15秒，60°C15秒，和72。C4分鐘30秒；接著(iii)25個循環94°C15秒，和63。C15秒，和72。C4分鐘30秒(每+l個循環增加5秒)；並且接著(iv)72。C7分鐘。基於擴增的DNA片段的大小，選擇兩種重組杆狀病毒穿梭載體pGAT15和pGAT16。從兩種杆狀病毒穿梭載體擴增的DNA片段具有正確的大小。因此，表明pFastBac(註冊商標名)表達構建體到杆狀病毒穿梭載體DNA的轉座已經發生。實施例5(製備重組杆狀病毒穿梭載體儲液)(1)重組的杆狀病毒穿梭載體的轉染按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒(商標名)表達系統(由Invitrogen製備)上的手冊，將重組的杆狀病毒穿梭載體pGAT15轉染到Sf9細胞(ATCC:CRL-1711)中，以產生重組的杆狀病毒。對於轉染，使用下述材料cellfectin(由Invitrogen製備)，補充L-胺基酸的格雷絲昆蟲細胞培養基(由Invitrogen,Gibco製備)，10%胎牛血清(由Clontech製備)，和青黴素/鏈黴素(由生命技術製備)。使用2嗎杆狀病毒穿梭載體DNA和7^cdlfectin。按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒(商標名)表達系統(由Invitrogen製備)上的手冊，在8天後收集P1重組杆狀病毒儲液。通過將0.5ml的Pl病毒儲液或後來產生的病毒儲液接種在1"06個細胞/ml的300mlSf9細胞培養物上，而擴增棉蚜肽基-二肽酶A杆狀病毒儲液。按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒(商標名)表達系統(由Invitrogen製備)上的手冊，在培養4天後收集擴增的杆狀病毒儲液。將Sf9細胞培養物在Erlenmeyer(Elscolab)中在135rpm和27。C懸浮培養。培養基成分如下補充L-胺基酸的格雷絲昆蟲細胞培養基(由Invitrogen,Gibco製備),10%胎牛血清(由Clontech製備)，青黴素/鏈黴素(由生命技術製備)，和終濃度0.1X的普盧蘭尼克F-68(PluronicF-68，由Sigma-aldrich製備)。杆狀病毒儲液的滴度通過蝕斑檢測按照附在Bac-to-Bac杆狀病毒(商標名)表達系統(由Invitrogen製備)上的手冊確定，但是對於蝕斑檢測的培養基，使用2%瓊脂糖代替4%瓊脂糖。實施例6(肽基-二肽酶A在昆蟲細胞中的表達)將4xlS個Sf9細胞懸浮在30ml引入棉蚜肽基-二肽酶A基因的重組杆狀病毒儲液中，並且在125mlErlenmeyer(由Elscolab製造)中在27°C,135rpm旋轉培養1小時。然後，將細胞混懸液等分到3個250ml的Erlenmeyer(由Elscolab製造)中，並且加入實施例5中所述的細胞培養基，直到在每個Erlenmeyer中培養溶液的體積達到100ml。將Sf9細胞在135rpm在27'C在製備的培養溶液中旋轉培養48小時。將培養的溶液以1200rpm離心以收集感染杆狀病毒的Sf9細胞。將收集的Sf9細胞在液氮中快速冷凍，並且保存在-8(TC以備將來應用。實施例7(肽基-二肽酶A的純化)(1)製備粗提物將冷凍的轉染杆狀病毒的S細胞重懸在30ml緩衝液A(50mMHepespH7.5,0.5mNaCl，10mM咪唑)中，並且隨後通過弗氏壓碎器(由ThermoSpectronic製備)的方式在緩衝液A中裂解。在破碎細胞步驟過程中，壓力保持在1300-1500psi。將弗氏加壓的溶液在2t:以13,000xg離心20分鐘以獲得上清液。得到的上層清液通過0.45pm過濾器過濾並且保存在冰上。(2)純化將蚜蟲肽基-二肽酶A以在6XHis標記閱讀框內克隆到pFastBacHTb中。重組蛋白使用金屬親和層析純化，其使用HiTrap鰲合HP(Amersham生物科學)或HisTrapHP(Amersham生物科學)柱，按照生產商(Amersham生物科學)的用法說明進行。純化步驟在AKTA-FPLC(Amersham生物科學)上進行。按照生產商的方法(Amersham生物科學)製備HiTrap/HisTrap親和柱。緩衝液A，其為結合緩衝液，由50mMHepespH7.5，0.5MNaCl，10mM咪唑製成；和緩衝液B，其為洗脫緩衝液，由50mMHepespH7.5，0.5MNaCl,500mM咪唑製成。純化蚜蟲肽基-二肽酶A的純化流程包括下述步驟(i)樣品注射，(ii)用13個柱體積(CV)的緩衝液A洗掉未結合的蛋白，(iii)用15個的CV7X緩衝液B(35mM咪唑)洗滌，以平衡柱，(iv)用6個CV50X緩衝液B(250mM咪唑)洗脫純化的蛋白，和(v)用5個CV100X緩衝液B(500mM咪唑)洗滌柱。分析獲得的洗脫級分，以通過SDS-PAGE和蛋白質印跡的標準技術的方式檢驗重組棉蚜肽基-二肽酶A的存在。由於肽基-二肽酶A蛋白的分子量為75kDa，所以使用8%聚丙烯醯胺凝膠用於肽基-二肽酶A蛋白的最佳凝膠電泳分析(resolution)。對於蛋白質印跡分析，將l:500稀釋的抗-His(H15)sc-803兔多克隆IgG抗體(由tebubio製備)用作一級抗體。二級抗體是1:10000稀釋的山羊抗-兔-HRP(由Pierce製備)。在通過SDS-PAGE和蛋白質印跡對凝膠分析之後，將目的級分收集在一起，並且加入甘油至終濃度10%。蛋白濃度通過使用預先稀釋的蛋白測定標準物牛血清白蛋白級分V系列，按照生產商(Bio-Rad)的方法用Bradford分光光度法確定。然後將收集的級分分成幾等份，並且立即在液氮中快速冷凍，並且保存在-8(TC。(3)脫鹽在純化的棉蚜肽基-二肽酶A級分中的咪唑通過使用5mlHiTrap脫鹽柱(由Amersham生物科學製備)通過緩衝液交換而去除。緩衝液交換步驟在AKTA-FPLC(Amersham生物科學)上如下進行。緩衝液C，其為平衡和洗脫緩衝液，由50mMHepespH7.5和0.5MNaCl製成。從棉蚜肽基-二肽酶A級分去除咪唑的流程包括下述步驟(i)注射1.5ml樣品；(ii)用4.5ml緩衝液C平衡柱；(iii)用9ml緩衝液C洗脫純化的蛋白，和(iv)用20ml緩衝液C洗滌柱。分析得到的洗脫級分，以通過如上述的SDS-PAGE和蛋白質印跡的標準技術的方式檢驗重組棉蚜肽基-二肽酶A的存在。蛋白濃度通過使用預先稀釋的蛋白測定標準物牛血清白蛋白級分V系列，按照生產商(Bio-Rad)的方法用Bradford分光光度法確定。洗脫的級分補充甘油(10%終濃度)，在液氮中快速冷凍，並且保存在-8(TC。實施例8(選擇抑制肽基-二肽酶A活性的化合物)調控肽基-二肽酶A活性的化合物的選擇在這樣的系統中進行，艮P，在所述系統中，檢測並且評估肽基-二肽酶A的活性，其通過將測試化合物添加到使用在實施例7中製備的蚜蟲肽基-二肽酶A的體外反應系統中而受到調控。'岈蟲肽基-二肽酶A活性的檢測這樣進行，其按照在先前報導的文獻(Carmel等，(1979)ClinicaChimicaActa,93，215-220)中所述的方法，應用Abz-Gly-對-硝基-Phe-Pro-OH(由Bachem製備，M-1100)作為底物。對於活性檢測，當包含溶解在DMSO中的測試化合物至終濃度10時，檢測蚜蟲肽基-二肽酶A的活性。另夕卜，當包含DMSO代替測試化合物時，檢測蚜蟲肽基-二肽酶A的活性。然後，計算包含溶解在DMSO中的測試化合物時釾蟲肽基-二肽酶A活性的測定值相對於在包含DMSO代替測試化合物時頓蟲肽基-二肽酶A活性的測定值的比例(％)，並且將通過從100%減去所計算的值而得到的值作為抑制程度(％)。在每一測試化合物中的結果與實施例9的結果一起顯示在實施例9中的表4中。當包含溶解在DMSO中的測試化合物至每一濃度100|aM,30|aM，10HM，3pM，1^M,0.30.1|iM或0.03)iiM的終濃度時，檢測岈蟲肽基-二肽酶A的活性。使用濃度-依賴性檢測分析軟體XLfit(由idbs製備)從每一測試化合物每一濃度的結果計算IC5Q(pM)。結果與實施例9的結果一起顯示在實施例10的表5中，實施例9(殺蟲活性檢測)製備具有下述組成(表3)的無菌人工飼料，然後，按照與在昆蟲飼養手冊(HandbookofInsectRearing)第1巻(Elsevier科學出版社1985)第35-36頁中所述的方法相同的方法，除了將溶解在DMSO中至終濃度640)iM的測試化合物以0.5%體積加入到所述人工飼料中以夕卜，並且混和成分，培養棉蚜。培養後6天，研究存活的棉蚜數目，並且通過用下述方程獲得控制值而確定表現出顯著控制值(例如，30%或更大的控制值)的實體具有殺蟲活性控制值(％)={l-(CbXTai)/(CaiXTb)}X100在所述方程中的字母代表下述意義。Cb:在未處理部分中在處理之前存活的蟲子數目Cai:在未處理部分中在觀察時存活的蟲子數目Tb:在處理部分中在處理之前存活的蟲子數目Tai:在處理部分中在觀察時存活的蟲子數目結果與實施例8的結果一起顯示在實施例9中的表4中。表3tableseeoriginaldocumentpage53表4tableseeoriginaldocumentpage54除了加入溶解在DMSO中至終濃度50ppm的測試化合物之外，按照與實施例9的方法相同的方法，進行殺蟲活性檢測，並且結果與實施例8的結果一起顯示在實施例10中的表5中。表5formulaseeoriginaldocumentpage56工業適用性按照本發明，可以提供篩選農業化學品的更基於靶點的途徑，其中針對已經鑑定為與化學幹擾目標位點以控制昆蟲或其它害蟲生物體的目的生物學和/或生理學相關的特異的靶點篩選化合物。設計的PCR寡核苷酸引物SEQIDNO:6設計的PCR寡核苷酸引物SEQIDNO:7設計的用於連接的寡核苷酸接頭SEQIDNO:8設計的用於連接的寡核苷酸接頭SEQIDNO:9設計的PCR寡核苷酸引物SEQIDNO:10設計的PCR寡核苷酸引物SEQIDNO:11設計的PCR寡核苷酸引物權利要求1.一種調控害蟲生理條件的試劑，其中所述試劑具有調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力。2.按照權利要求l的試劑，其中所述肽基-二肽酶A是棉蚜肽基-二肽酶A。3.按照權利要求1的試劑，其中所述試劑是殺蟲劑。4.按照權利要求l的試劑，其中所述調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力是抑制昆蟲肽基-二肽酶A與鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸反應的能力。5.—種殺蟲劑，其包括具有調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力的物質或所述物質的農業可用的鹽作為活性成分。6.按照權利要求5的殺蟲劑，其中所述物質具有抑制昆蟲肽基-二肽酶A與鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸反應的能力。7.按照權利要求6的殺蟲劑，其中所述物質具有在不含細胞的系統中抑制昆蟲肽基-二肽酶A與鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸反應的能力，其中在存在lO)aM或更多的所述物質時所述肽基-二肽酶A的活性低於不存在所述物質時的活性。8.按照權利要求6的殺蟲劑，其中所述物質具有在不含細胞的系統中抑制昆蟲肽基-二肽酶A與鄰-氨基苯甲醯甘氨醯-對-硝基-L-苯丙氨醯-L-脯氨酸反應的能力，具有100pM或更低的IC50。9.檢測測試物質的殺蟲活性的方法，其包括(1)第一步，檢測選自下組A的肽基-二肽酶A在所述肽基-二肽酶A與測試物質接觸的反應系統中的活性；和(2)第二步，基於通過比較在第一步中測定的活性與對照活性而獲得的差別評估所述測試物質的殺蟲活性；〈組A〉(a)包含胺基酸序列SEQIDNO:l的蛋白；(b)包含在胺基酸序列SEQIDNO:l中刪除、添加或取代一個或多個胺基酸的胺基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(c)包含與胺基酸序列SEQIDNO:1有65%或更高的序列相同性的胺基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(d)包含由核苷酸序列SEQIDNO:2編碼的胺基酸序列的蛋白；(e)包含由與核苷酸序列SEQIDNO:2有65%或更高的序列相同性的核苷酸序列編碼的胺基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(f)包含由多聚核苷酸編碼的胺基酸序列的蛋白，其中所述多聚核苷酸在嚴格條件下與包含同核苷酸序列SEQIDNO:2互補的核苷酸序列的多聚核苷酸雜交，並且其中所述蛋白具有肽基-二肽酶A活性；(g)包含昆蟲肽基-二肽酶A的胺基酸序列的蛋白；和(h)包含棉蚜肽基-二肽酶A的胺基酸序列的蛋白。10.篩選殺蟲物質的方法，其包括選擇具有通過按照權利要求9的方法評估的殺蟲活性的物質。11.一種殺蟲劑，其包括通過按照權利要求10的方法選擇的物質或其農業可用的鹽作為活性成分。12.控制害蟲的方法，其包括將有效量的按照權利要求5、6、7、8或ll的殺蟲劑應用到害蟲、害蟲棲息地或要防治害蟲的植物。13.—種控制害蟲的方法，其包括鑑定具有通過按照權利要求9的方法評估的殺蟲活性的物質，並且將害蟲與所鑑定的殺蟲物質接觸。14.一種昆蟲肽基-二肽酶A，其包含選自下組B的胺基酸序列(a)胺基酸序列SEQIDNO:1;(b)在胺基酸序列SEQIDNO:l中刪除、添加或取代一個或多個胺基酸的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；(c)與胺基酸序列SEQIDNO:1有65%或更高的序列相同性的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；(d)由核苷酸序列SEQIDNO:2編碼的胺基酸序列；(e)由與核苷酸序列SEQIDNO:2有65%或更高的序列相同性的核苷酸序列編碼的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；(f)由多聚核苷酸編碼的胺基酸序列，其中所述多聚核苷酸在嚴格條件下與包含同核苷酸序列SEQIDNO:2互補的核苷酸序列的多聚核苷酸雜交，並且其中所述胺基酸序列具有肽基-二肽酶A活性；和(g)棉蚜肽基-二肽酶A的胺基酸序列。15.昆蟲肽基-二肽酶A作為提供評估殺蟲活性的指示劑的試劑的應用。16.按照權利要求14的昆蟲肽基-二肽酶A作為提供評估殺蟲活性的指示劑的試劑的應用。17.—種多聚核苷酸，其包含編碼按照權利要求14的肽基-二肽酶A的胺基酸序列的核苷酸序列。18.按照權利要求17的多聚核苷酸，其包括核苷酸序列SEQIDNO:2。19.一種多聚核苷酸，其包含與按照權利要求17或18的多聚核苷酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列。20.—種多聚核苷酸，其包含按照權利要求17或18的多聚核苷酸的部分核苷酸序列；或與所述部分核苷酸序列互補的核苷酸序列。21.按照權利要求20的多聚核苷酸，其包含核苷酸序列SEQIDNO:3或4。22.獲得包含編碼肽基-二肽酶A的胺基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸的方法，其包括通過聚合酶鏈式反應擴增需要的多聚核苷酸的步驟，聚合酶鏈式反應使用按照權利要求20或21的多聚核苷酸作為引物；鑑定所擴增的需要的多聚核苷酸的步驟；和回收所鑑定的多聚核苷酸的步驟。23.獲得包含編碼肽基-二肽酶A的胺基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸的方法，其包括通過雜交檢測需要的多聚核苷酸的步驟，雜交使用按照權利要求19、20或21的多聚核苷酸作為探針；鑑定所檢測的需要的多聚核苷酸的步驟；和回收所鑑定的多聚核苷酸的步驟。24.—種包含按照權利要求17或18的多聚核苷酸的核苷酸序列的環形多聚核苷酸，其中所述核苷酸序列可操作地與杆狀病毒啟動子連接。25.按照權利要求24的環形多聚核苷酸，其中所述啟動子是多角體蛋白基因啟動子。26.按照權利要求24或25的環形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含用於在宿主細胞中自動複製的複製起點。27.按照權利要求24、25或26的環形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含杆狀病毒穿梭載體的核苷酸序列，並且能夠作為病毒在昆蟲細胞中繁殖。28.製備環形多聚核苷酸的方法，其包括將按照權利要求17或18的多聚核苷酸連接到載體中。29.—種轉化體，其中引入按照權利要求17或18的多聚核苷酸。30.按照權利要求29的轉化體，其中所述轉化體是轉化的昆蟲細胞；31.製備轉化體的方法，其包括將按照權利要求17或18的多聚核苷酸引入到宿主細胞中。32.—種重組杆狀病毒，在其基因組中包含按照權利要求17或18的多聚核苷酸。33.生產肽基-二肽酶A的方法，其包括培養按照權利要求29或30的轉化體並且回收所生產的肽基-二肽酶A的步驟。34.按照權利要求14的肽基-二肽酶A或按照權利要求17—21中任一項的多聚核苷酸作為研究工具的應用。35.按照權利要求34的應用，其中所述研究工具是用於篩選殺蟲物質的實驗工具。36.—種系統，其包括輸入、存儲和管理測試物質的能力的數據信息的裝置，其中所述能力是調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力；基於需要的標準查詢並且回傳數據信息的裝置；和顯示並且輸出査詢和回傳的結果的裝置。全文摘要本發明提供調控害蟲的生理條件的試劑，其中所述試劑具有調控昆蟲肽基-二肽酶A活性的能力；用於檢測測試物質的殺蟲活性的方法，其包括在肽基-二肽酶A與測試物質接觸的反應系統中檢測肽基-二肽酶A活性的步驟，等等。文檔編號C12N9/64GK101243183SQ20068002974公開日2008年8月13日申請日期2006年6月23日優先權日2005年6月23日發明者下川床康孝,于爾根·德巴維伊,揚·納烏德特,桑德拉·圖爾科尼,蓋伊·尼斯,艾琳·努爾恩,馬克·范德·克雷恩申請人:住友化學株式會社