用於修改基因轉錄的組合物和方法

2024-01-19 10:10:15 2

專利名稱：用於修改基因轉錄的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及從植物中分離的組合物以及它們在修改基因轉錄和/或表達中的用途。更具體地說，本發明涉及編碼作為細胞轉錄裝置的組件的轉錄因子的植物聚核苷酸序列以及所述聚核苷酸序列在修改基因表達中的用途。
背景技術：
真核基因表達在某種程度上由參與轉錄的細胞過程調節。在轉錄期間，通過RNA 聚合酶的作用形成與待轉錄DNA序列互補的單股RNA。真核細胞中轉錄的起始由位於待轉錄基因上遊的順式作用DNA基元與反式作用蛋白因子之間的複雜相互作用調節。順式作用調節區域中有稱為啟動子的DNA序列，所述啟動子位於接近轉錄起始位點處並且RNA聚合酶首先直接或間接地結合於所述啟動子。啟動子通常由近端(例如TATA盒)和較遠端元件(例如CCAAT盒)組成。增強子為順式作用DNA基元，其可位於距離起始位點較遠的上遊和/或下遊。
啟動子和增強子一般都包含若干個分離的、往往多餘的元件，這些元件各自可被一或多個稱為轉錄因子的反式作用調節蛋白識別。在所有處於發育中的生物體中，在空間和時間上觀測到的複雜基因表達模式的調節被認為是由與增強子和啟動子結合的、一般的並且具有組織特異性的轉錄因子與DNA的相互作用所致(伊澤T(Izawa T)、福斯特 R(Foster R)和蔡 NH(Chua NH)，分子生物學雜誌(J. Mol. Biol.) 230 :1131-1144,1993 ；Π 肯斯AE(Menkens AE)、辛德勒U (Schindler U)和卡什莫爾AR (Cashmore AR)，生物化學趨勢 (Trends in Biochem. Sci.) 13 :506-510,1995)。如黑腹果妮(Drosophila melanogaster)、 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)及福射松(Pinus radiata)的多種生物體中的發育決定都由轉錄因子調節。已顯示這些結合DNA的調節分子控制負責以下作用的基因的表達不同細胞類型的分化，例如擬南芥中的葉毛狀體和木質部組織的分化、爪蟾(Xenopus Iaevis)中由胚細胞形成內胚層；以及植物對環境和植物激素應力作出響應而起始基因表達(柳澤S(Yanagisawa S)和辛J(Sheen J)，植物細胞(The PlantCell)10 :75-89,1998)。
轉錄因子一般以序列特異性方式結合DNA並且活化或抑制轉錄起始。這些相互作用的特定機制仍有待充分闡釋。在轉錄因子內已鑑別至少3個獨立的結構域。一個對序列特異性DNA識別必不可少，一個對轉錄起始的活化/抑制必不可少，還有一個對蛋白質-蛋白質相互作用(諸如二聚)的形成必不可少。迄今已鑑別參與DNA順序識別和/或轉錄因子二聚的4個基元或結構域鋅指；螺旋-轉折-螺旋；亮氨酸拉鏈；和螺旋-環-螺旋。螺旋-環-螺旋和亮氨酸拉鏈蛋白基元都因其容易在活體內形成同型二聚體或異型二聚體的能力而牽涉到轉錄因子與DNA的結合中。「活化」」結構域富含脯氨酸、穀氨醯胺或酸性胺基酸。已提出，轉錄因子的這個淨負區域與結合TATA盒的轉錄因子TFIID、RNA聚合酶和/或與轉錄裝置相關的另一蛋白質相互作用。
研究表明，許多植物轉錄因子可基於其保守的DNA結合結構域而分成不同類別 (片桐F (Katagiri F)和蔡NH(Chua NH)，遺傳學趨勢(Trends Genet.) 8 :22-27,1992 ;門肯斯AE(Menkens AE)、辛德勒U (Schindler U)以及卡什莫爾AR (Cashmore AR)，生物化學趨勢 (Trends in Biochem. Sci.) 13 :506-510,1995 ;馬丁C(Martin C)和帕斯阿雷斯 J (Paz-Ares J)，遺傳學趨勢(Trends Genet.) 13 :67_73，1997)。這些家族的各成員與受不同調節信號控制的多個基因啟動子中通常發現的不同DNA序列基元相互作用並且結合。以下描述迄今已鑑別的若干類轉錄因子。
鹼性/亮氨酸拉鏈(bZIP)是由鹼性/亮氨酸拉鏈(bZIP)基元定義的保守的轉錄因子家族(蘭德斯舒爾茨(Landschultz)等人，科學(Science) 240 :1759-1764，1988 ;麥克奈特(McKnight)，科學美國人(Sci. Am.) 264 =54-64,1991 ;福斯特(Foster)等人，美國實驗生物學聯合會會刊(FASEB J.)8[2] :192-200,1994)。基因表達的轉錄調節是由bZIP和其他家族的轉錄因子通 過與相應基因的啟動子區域中存在的調節元件相互作用的序列特異性轉錄因子的協同作用所介導的。bZIP雙向DNA結合結構由與亮氨酸拉鏈相鄰的富含鹼性胺基酸的區域(鹼性區域)組成，所述區域的特徵在於若干個亮氨酸殘基以7個胺基酸的間隔有規律地隔開(文森(Vinson)等人，科學(Science) 246 =911-916,1989)。儘管鹼性區域直接接觸DNA，但亮氨酸拉鏈通過兩個α -螺旋的疏水性二聚界面的平行相互作用而介導蛋白質單體的同型二聚和異型二聚，從而產生捲曲的螺旋結構(奧歇(O' Shea)等人， 科學(Science) 243 :538-542,1989 ;科學(Science) 254 :539-544,1991 ;胡(Hu)等人，科學 (Science) 250 :1400-1403，1990 ;拉斯馬森(Rasmussen)等人，美國國家科學院院報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)88 :561-564,1991)。
Dof蛋白是相對較新的一類轉錄因子，並且被認為可介導對一些植物基因表達模式的調節，所述調節在某種程度上是通過bZIP蛋白與結合到緊密連接位點的其他類型的轉錄因子之間的組合相互作用來實現。已在bZIP與Dof轉錄因子之間觀察到這種組合相互作用的此種實例(辛格(Singh)，植物生理學(Plant Physiol.) 118 :1111-1120,1998)。 這些Dof蛋白具有在植物中高度保守的單鋅指DNA結合結構域(柳澤(Yanagisawa),植物科學趨勢(Trends Plant Sci.) I :213，1996)。已證明Dof蛋白與bZIP轉錄因子的特異性結合併且已提出，這種特異性相互作用刺激bZIP與植物啟動子中的DNA目標序列的結合 (陳(Chen)等人，植物雜誌(Plant J.) 10 =955-966,1996) 0在該文獻中已經報告過此種 Dof/bZIP相互作用的實例，包括例如已顯示含有若干個與ocs元件(已識別的bZIP結合位點)緊密連接的Dof結合位點的擬南芥穀胱甘肽S-轉移酶-6基因(GST6)啟動子(辛格 (Singh)，植物生理學(Plant Physiol.) 118 :1111-1120，1998)。
來自芥菜屬的bZIP家族的G盒結合因子(例如，包括GBF1、GBF2和GBF3)與回文 G盒基元(CCACGTGG)相互作用。然而，已證明這些轉錄因子(例如GBF1)的DNA結合特異性可能受側接於ACGT核心的核苷酸的性質影響(辛德勒(Schindler)等人,歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.), 11 :1274-1289,1992a)。活體內暫時性轉基因植物表達研究已顯示，這些ACGT元件是最大轉錄活化所必需的，並且已在受各種環境、生理和環境提示調節的許多植物基因中得到鑑別。基於這些轉錄因子結合到ACGT核心基元的能力對它們進行的分類產生一組相對多樣的蛋白質，包括例如CamV 35S啟動子as_l_結合蛋白，所述蛋白質展現和與G盒相互作用的那些蛋白質不同的DNA結合位點需求(塔巴塔(Tabata)等人，歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J. ) 10 =1459-1467,1991) ο因此，除了基於bZIP蛋白的DNA結合特異性來定義bZIP蛋白的個別類別以外，還可以根據它們的異型二聚特徵將所述蛋白質分類(曹(Cao)等人，基因與發育(Genes Dev.), 5 :1538-1552,1991 ;辛德勒(Schindler) 等人，歐洲分子生物學學會雜誌(EMBO J.) 11 :1261-1273，1992b)。
環境誘導型啟動子需要存在兩個對啟動子活性非常重要的順式作用元件，其中之一是中等保守的G盒(CCACGTGG)(德威頓(deVetten)等人，植物細胞(Plant Cell) 4 [10] 1295-1307，1992)。兩個元件之一的突變消除或嚴重降低了啟動子對環境變化作出響應的能力。位於G盒附近的第二順式作用元件的序列在不同環境誘導型啟動子之間不保守，但在由相同信號誘導的啟動子之間可能相似。G盒與第二順式作用元件之間的間距似乎非常重要，表明各別結合因子之間的直接相互作用(德威頓(deVetten)和福爾(Ferl)，國際生物化學期刊(Int. J. Biochem.) 26 [9] 1055-1068,1994 ;拉瑪錢德朗(Ramachandran)等人， 遺傳學與發育新見(Curr. Opin. Genet. Dev. )4[5] :642-646,1994)。
鹼性螺旋-環-螺旋拉鏈蛋白代表了文獻中所述的另外一類bZEP轉錄因子，並且包括例如Myc蛋白。這些蛋白質含有轉錄因子的兩個特徵區域由若干個磷酸化位點組成的N末端轉錄活化域，以及已知通過3個不同結構域(亮氨酸拉鏈、螺旋-環-螺旋和鹼性區域)介導二聚和序列特異性DNA結合的C末端鹼性螺旋-環-螺旋(bHLH)亮氨酸拉鏈基兀。
Myb家族的轉錄因子是在植物和動物中發現的一組功能多樣的轉錄活化子，其特徵為含有2個(在植物物種中)或3個(在動物物種中)具有約50個胺基酸的不完美串聯重複序列的保守氨基末端DNA結合結構域(羅辛斯基(Rosinski)和阿切利(Atchley), 分子進化雜誌(J. Mol. Evol.) 46 (I) :74-83,1998 ;斯託伯-格拉瑟(Stober-Grasser)等人，致癌基因(Oncogene) 7[3] :589_596，1992)。代表性植物和哺乳動物MYB蛋白的胺基酸序列之間的比較表明，與在來自相同蛋白質的R2和R3重複序列之間相比，在來自不同蛋白質的相同重複序列之間存在更大的保守程度(馬丁(Martin)和帕斯阿雷斯(Paz-Ares)，遺傳學趨勢(Trends Genet.) 13 [2] :67_73，1997)。已報告來自擬南芥的超過100種MYB基因(羅梅羅(Romero)等人，植物雜誌(Plant J. )14[3] :273_284，1998)，代表植物中目前已知的最大的調節基因家族。DNA結合研究已顯示，在植物MYB蛋白之間結合特異性存在差異以及頻繁的重疊，與開始針對這些蛋白質所識別的不同但通常相關的功能一致。涉及 MYBDNA結合結構域中的8個假定鹼基接觸殘基的研究已揭露，至少6個在迄今已鑑別的所有植物MYB蛋白中是完全保守的，而其餘2個在至少80%的這些蛋白質中是保守的(馬丁 (Martin)和帕斯阿雷斯(Paz-Ares),遺傳學趨勢(Trends Genet.) 13 [2] :67-73,1997)。涉及不接觸鹼基的殘基的突變分析已指出，MYB的序列特異性結合能力受到影響並且由此可解釋植物MYB蛋白質之間DNA結合特異性的一些差異(沙拉拿(Solano)等人，生物化學雜誌(J. Biol. Chem.) 272 [5] :2889_2895，1997)。這個大型基因家族可能促成作為植物所呈現的發育和代謝可塑性的基礎的調節靈活性。
同源轉錄因子在動物中已牽涉到許多發育過程中，包括例如控制昆蟲和脊椎動物胚胎中的模式形成以及規定許多組織中的細胞分化(英厄姆(Ingham)，自然(Nature) 335 25-34,1988 ;麥金尼斯(McGinnis)和克倫勞夫(Krumlauf)，細胞(Cell)68 :283-302, 1992)。同源結構域二級結構的特徵在於最初在細菌DNA結合結構域中鑑別的獨特的螺旋-轉折-螺旋基元。這種螺旋-轉折-螺旋序列/結構基元跨越約20個胺基酸,並且特徵為由急劇的90度彎曲或轉折分開的兩個短螺旋(哈裡森(Harrison)和艾嘉(Aggarwal), 生物化學年鑑(Ann. Rev. Biochem.) 59 =933-969,1990)。已證明這種螺旋結合在DNA螺旋的大溝中。
已在許多植物物種中鑑別了植物同源盒基因，包括擬南芥、玉米、香芹和大豆。對玉米同源盒基因家族成員的表達模式分析表明，這些轉錄因子可參與定義營養頂端分生組織中的特定區域，所述營養頂端分生組織可能參與葉結構的起始(傑克遜(Jackson)等人， 發育(Development) 120 :405_413，1994)。所述觀察暗示，與動物同源盒基因相同，植物同源盒基因可參與決定細胞命運。
同源結構域-拉鏈(HD-zip)代表了另外一個同源結構域蛋白家族。這些同源結構域-拉鏈蛋白(HD-zip)具有連接到另外的亮氨酸拉鏈二聚基元的特徵同源結構域。這個家族包括例如Athb-I和Athb-2(賽莎(Sessa)等人，歐洲分子生物學學會雜誌(ΕΜΒ0 J. ) 12 :3507-3517,1993)以及 Athb-4(卡拉貝利(Carabelli)等人，植物雜誌(Plant J. )4 =469-479,1993)。
LIM結構域是在多種蛋白質中發現的一個特殊化雙鋅指基元，與具有別異功能的結構域(如同源結構域)相關聯(參見向日葵花粉特異性SF3轉錄因子鮑爾茲(Baltz) 等人，植物雜誌(Plant J.) 2 :713-721,1992 ;或形成主要包含UM結構域的蛋白質戴維 (Dawid)等人，遺傳學趨勢(Trends Genet.) 14[4] : 156-162，1998)。LIM 結構域特異性地與其他UM結構域並且與許多不同的蛋白質結構域相互作用。LIM結構域被認為充當蛋白質相互作用模塊，介導功能性複合物成員之間的特異性接觸並且調整一些組成蛋白質的活性。LIM結構域的核酸結合雖然已由結構因素表明，但仍是一種未被證明的可能性。然而，存在以下可能=LIM結構域可與同源結構域一起結合到發育受控制的基因的調節區域， 如已針對配對盒提出，所述配對盒是最先在來自果蠅的配對(PRD)和醋慄(GSB)同源結構域蛋白中鑑別的保守序列基元(特裡斯曼(Triesman)等人,基因與發育(Genes Dev. )5 594-604,1991) o PRD盒還能夠在不存在同源結構域的情況下結合DNA。UM結構域蛋白可為核蛋白、細胞質蛋白或可在隔室之間芽梭。在動物系統中，已顯不若干種重要的LIM蛋白與細胞骨架相關聯，從而在粘著斑和肌動蛋白-微絲組構中具有一定作用。在核LIM蛋白之間，LIM同源結構域蛋白形成在動物發育期間的細胞譜系決定和模式形成中具有重要功能的一個主要的子家族。
AP2 (APETALA2)和EREBP (乙烯響應性元件結合蛋白)是植物特有的轉錄因子家族的原型成員，其獨特特徵在於其含有所謂的AP2DNA結合結構域。AP2/EREBP基因形成一個大的多基因家族，並且它們在整個植物生命周期中起著多種作用從作為若干個發育過程的關鍵調節子，如花的器官身份決定或葉表皮細胞身份控制，到形成植物用於對各種類型的生物和環境應力作出響應的機制的一部分。在擬南芥中，已顯示同源基因APETALA2 (AP2) 控制發育期間的3個突出過程(I)規定花器官身份和調節花的器官發生(徐福(Jofuku) 等人，植物細胞(Plant Cell)6 :1211-1225,1994) ； (2)確定花分生組織身份(艾裡什 (Irish)和蘇賽克斯(Sussex)，植物細胞(Plant Cell) 2 [8] :741-753,1990);以及(3)花同源基因活性的時間和空間調節(德魯斯(Drews)等人，細胞(Cell)65[6] =991-1002,1991)。DNA序列分析表明AP2編碼具有432個aa的理論多肽，其中獨特的68aa重複基元稱為AP2結構域。已顯示這個結構域對AP2功能必不可少，並且在68個aa內含有預計可形成兩性Ct-螺旋的18個胺基酸核心區(徐福(Jofuku)等人,植物細胞(Plant Cell) 6 1211-1225，1994)。通過鑑別乙烯響應性元件結合蛋白(EREBP)，在擬南芥(岡室(Okamuro) 等人，美國國家科學院院報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)94 :7076-7081,1997)和菸草中還鑑別出含有Ap2樣結構域的轉錄因子(高木野(Ohme-Takagi)和新稀(Shinshi),植物細胞(Plant Cell)7[2] : 173-182，1995)。在芥菜屬中，這些RAP2 (與AP2相關)基因編碼兩個獨特的含有AP2結構域的蛋白質的子家族，稱為AP2樣和EREBP樣(岡室(Okamuro)等人，美國國家科學院院報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 94 =7076-7081,1997)。迄今使用 RAP2 蛋白質尚未顯不體外DNA結合；然而，基於AP2結構域內存在兩個聞度保守的基兀YRG和 RAYD,已提出結合DNA結合以類似於AP2蛋白的方式發生。
Cys2His2型鋅指結構域似乎代表了真核轉錄因子中最豐富的DNA結合基元,迄今已鑑別出數千個(伯格(Be rg)和史(Shi)，科學(Science) 271 [5252] : 1081-1085，1996)。 最初在1983年針對轉錄因子IIIA(TFIIIA)提出鋅在轉錄因子中的結構作用(漢納斯 (Hanas)等人，生物化學雜誌(J Biol. Chem.) 258 [23] : 14120-14125，1983)。Cys2His2 鋅指結構域的特徵在於C-x (2,4) -C-X (3) -[LIVMFYWC] -χ⑶_Η_χ (3，5) -H的串聯序列陣列(其中X表示可變胺基酸)。在結構上，鋅指由兩個反向平行的β股和之後的α螺旋組成(李 (Lee)等人，科學(Science) 245 [4918] :635_637，1989)。這種結構配置允許半胱氨酸和組氨酸側鏈使鋅與3個其他保守殘基配位，從而形成與金屬配位單元相鄰的疏水性核心(伯格(Berg)和史(Shi)，科學(Science) 271 [5252] : 1081-1085，1996)。已顯示具有 Cys2His2 結構域的許多蛋白質以序列特異性方式與DNA相互作用。結合到特定DNA目標的小鼠轉錄因子Zif268的晶體結構分析表明蛋白質/DNA複合物中的鋅指存在於雙螺旋的大溝中，並且通過稱為接觸殘基的胺基酸側鏈與DNA鹼基相互作用(帕夫裡奇(Pavletich)和帕伯 (Pabo)，科學(Science) 252 [5007] :809-817,1991)。鋅指結構域相對於DNA的定向通常一致，其中各結構域接觸連續的三鹼基對亞位點，所述連續的三鹼基對亞位點中大部分是針對一個股。存在極少的結構域間相互作用，並且各鋅指的DNA識別似乎在很大程度上與其他結構域無關(伯格(Berg)和史(Shi)，科學(Science) 271 [5252] : 1081-1085，1996)。
已顯示傑利納斯(Gelinas)等人(自然(Nature)313 [6000] :323-325,1985)所鑑別的CCAAT盒元件出現在從轉錄起始位點開始的第80個鹼基對與第300個鹼基對之間， 並且可以任一定向操作，可能與多個盒(塔薩寧(Tasanen)等人，生物化學雜誌(J Biol. Chem.) 267 [16] :11513-11519,1992);或其他保守基元(穆羅(Muro)等人，生物化學雜誌 (J. Biol. Chem.) 267 [18] : 12767-12774，1992 ;裡耶平(Rieping)和斯科夫(Schoffl)，分子遺傳學與普通遣傳學(Mol. Gen. Genet.) 231 [2] =226-232,1992)發生協同相互作用。已在包括以下的多種生物體中的許多啟動子中鑑別出CCAAT盒相關基元酵母(哈林(Halin) 等人，科學(Science) 240[4850] :317_321，1988)、大鼠(麥蒂(Maity)等人，美國國家科學院院報(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 87 [14] :5378_5382，1990 ;沃裡奧(Vuorio)等人，生物化學雜誌(J. Biol. Chem.) 265 [36] =22480-22486,1990);以及植物(裡耶平(Rieping) 和斯科夫(Schoffl)，分子與普通遺傳學(Mol. Gen. Genet.) 231 [2] :226_232，1992 ;基歐 (Kehoe)等人，植物細胞(Plant Cell)6[8] :1123-1134,1994) 在酵母和脊椎動物中，已顯示蛋白質複合物結合CCAAT基元。在酵母中，所述複合物由被稱為HAP2、HAP3以及HAP5 的3種蛋白質組成(平卡姆(Pinkham)和瓜倫特(Guarente),分子細胞生物學(Mol. Cell. Biol.)5[12] :3410-3416,1985)。
MADS盒轉錄因子與被稱為MADS盒的DNA保守區域相互作用。所有MADS盒轉錄因子都含有被稱為MADS結構域的保守DNA結合/ 二聚區域，所述結構域已在不同的自然界中鑑別出(裡耶希曼(Riechmann)和邁耶羅維茨(Meyerowitz),生物化學(Biol. Chem. )378[10] :1079-1101,1997)。從植物中分離的許多MADS盒基因主要在花分生組織或花器官中表達，並且據信在規定花序和花分生組織身份或決定花器官身份方面起一定作用。負責花分生組織身份和分生組織發育模式的一類調節基因包括來自擬南芥的基因 APETALAI (API)、APETALA2 (AP2)、CAULIFLOWER (CAL)、LEAFY (LFY)以及 AGAM0US (AG)。已顯示LFY和API都編碼假定轉錄因子(威格爾(Weigel)等人，細胞(Cell) 69 :843-859,1992)，而API和AG各自編碼MADS盒結構域家族的假定轉錄因子(亞諾夫斯基(Yanofsky) 等人，自然(Nature) 346 :35_39，1990)。已顯示Lfy基因的突變引起花部分轉化成花序芽。 發明內容
簡而言之，本發明提供從植物中分離的編碼轉錄因子的聚核苷酸以及由所述聚核苷酸編碼的多肽。本發明的分離的聚核苷酸和多肽可有效地用於修改植物中的基因表達， 因為已顯示組織和時間特異性基因表達模式在植物的自然發育期間受轉錄因子支配。本發明的聚核苷酸和多肽因此可用於操縱植物表型。
在第一個方面，本發明提供從桉樹和松樹中分離的聚核苷酸，所述聚核苷酸編碼轉錄因子，包括來自以下調節蛋白家族的轉錄因子bZIP ;bZIP家族的G盒結合因子；鹼性螺旋-環-螺旋拉鏈(bHLH)；同源/同源結構域/同源盒/MADS ；同源結構域拉鏈(ZIP)； LIM結構域；AP2和EREB ；Cys2His2型鋅指結構域；CCAAT盒元件；以及MYB。在特定實施例中，本發明的分離的聚核苷酸包含選自由以下所組成的群組的DNA序列(a)SEQ ID NO 1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、 2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419 和 2421 中所述的序列；(b)鑑別為 SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419 和 2421 的序列的互補序列；(c)鑑別為 SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931_2106、2371、2374、 2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、 2413、2415、2417、2419和2421的序列的反向互補序列；(d)鑑別為SEQ ID NO 1-591, I183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419和 2421 的序列的反向序列；以及 (e)與(a)到(d)的序列具有60%、75%、80%、90%或95%—致性(如本文所定義)的序列。
在另一個方面，提供由本發明的聚核苷酸編碼的分離的多肽。在特定實施例中，所述多肽包含選自由以下所組成的群組的胺基酸序列(a) SEQ ID NO SEQ ID NO =592-1182, 1913-1930、2107-2278、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420和 2422 中所提供的序列；和(b) 與(a)的序列具有60%、75%、80%、90%或95%—致性(如本文所定義)的序列。
在另一個方面，本發明提供從桉樹和松樹中分離的多肽，所述多肽包含轉錄因子 DNA結合結構域。在特定實施例中，所述多肽包含選自由以下所組成的群組的胺基酸序列 (a) SEQ ID NO :2279-2293和2296-2368中所提供的序列；和(b)與(a)的序列具有60%、 75%、80%、90%或95%—致性(如本文所定義)的序列。
在另一個方面，本發明提供基因構建體，所述基因構建體包含單獨、與一或多種本文所公開的其 他聚核苷酸組合或與一或多種已知DNA序列組合的本發明聚核苷酸；以及包含所述構建體的經轉化細胞。
在特定實施例中，本發明基因構建體在5' -3'方向上包含基因啟動子序列；編碼由本發明聚核苷酸編碼的多肽的至少一個功能部分的開放閱讀框或其變異體；以及基因終止序列。開放閱讀框可定向成有義或反義方向。還提供包含以下的基因構建體編碼本發明轉錄因子多肽的聚核苷酸的未轉譯或非編碼區域，或與未轉譯區域互補的核苷酸序列， 以及基因啟動子序列和基因終止序列。優選地，基因啟動子和終止序列是宿主植物中的功能序列。最優選地，基因啟動子和終止序列是原始基因的序列，但本領域中一般使用的其他序列可有效地用於本發明，如花椰菜花葉病毒(Cauliflower Mosaic Virus, CMV)啟動子， 存在或不存在增強子(如科扎克序列(Kozak sequence)或Ω增強子(Omegaenhancer)), 以及根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂鹼合成酶終止子。可使用組織特異性啟動子以便將表達靶向一或多個所要組織。基因構建體可更包括用於鑑別經轉化細胞的標記物。
在又另一個方面，提供包含本發明的基因構建體的轉基因細胞和包含所述轉基因細胞的生物體，如植物。本發明還預期並且涵蓋所述轉基因植物的果實、種子、衍生物、子代、繁殖體和其他產品。如本文所用，術語「繁殖體」的意思是可用於再生或繁殖(有性或無性)的任何植物部分，包括插條。
在又另一個方面，提供用於修改目標生物體中的基因表達的方法，所述方法包括將本發明的基因構建體穩定地併入所述生物體的基因組中。在一個優選實施例中，目標生物體是植物，優選木本植物，更優選為選自由桉樹和松樹物種所組成的群組，並且最優選為選自由巨桉(Eucalyptus grandis)和福射松(Pinus radiata)組成的群組。在一個相關的方面，提供用於產生具有經修改的基因的目標生物體(如植物)的方法，所述方法包括用本發明的基因構建體轉化植物細胞以提供轉基因細胞並且在有助於再生和成熟植物生長的條件下培養轉基因細胞。
本發明更提供用於修改目標生物體(如植物)中轉錄因子的活性的方法，所述方法包括將本發明的基因構建體穩定地併入植物的基因組中。在一個優選實施例中，目標植物是木本植物，優選為選自由桉樹和松樹物種所組成的群組，並且最優選為來自由巨桉和輻射松組成的群組。
通過參考以下更具體的實施方式，本發明的上述和另外特徵以及獲得所述特徵的方式將顯而易見，並且將最透徹地理解本發明。本文所公開的所有參考文獻都以全文引用的方式併入本文中，就如同各參考文獻被個別地併入一般。


圖I描述所得質粒pWVK249的圖，所述質粒是用於轉化植物的二元載體並且對應於 SEQ ID 2373o
圖2描述來自對照和經過PWVK249轉化的三角葉楊的木材的基本比重的圖表。水平線指示各組的平均值。對照和PWVK249線之間的差異在5%水平下顯著。
具體實施方式
本發明提供編碼植物轉錄因子的分離的聚核苷酸以及由所述聚核苷酸編碼的分離的多肽。如上文所討論，轉錄因子是細胞「轉錄裝置」的組件並且參與基因表達的調節。 已知轉錄因子在植物生長發育和對外界刺激(如環境因素和疾病病原體)的細胞反應方面起重要作用。用編碼參與細胞轉錄過程的蛋白質的聚核苷酸轉化植物因此可用於修改多種性質，如木質素沉積、花發育以及雄性和雌性不育。
調節次生木質部或木材中的導管或纖維細胞形成的轉錄因子可用於改變木材的特徵。如果轉錄因子上調參與木質素生物合成的基因，那麼過度表達所述轉錄因子可以增加木材中木質素的量，而抑制或敲低所述轉錄因子可降低木材中木質素的量。某些轉錄因子抑制參與木質素形成的基因的表達，並且這些調節蛋白中的一者的過度表達將導致木質素減少。來自金魚草的AmMYB308的過度表達導致轉基因菸草中的木質素減少(塔瑪格儂 (Tamagnone)等人，植物細胞(Plant Cell) 10 :135_154，1998)。高木質素含量的木材潛在地適用作燃料以供燃燒或轉化成木炭，而低木質素含量的木材可用於製漿或轉化成乙醇。 上調參與細胞壁生物合成的整組基因的轉錄因子可用於改變細胞壁的厚度和木材的密度。 轉錄因子過度表達可使細胞壁生物合成基因的產量增多或產生時間延長，從而產生更厚的細胞壁和更緻密並且更強壯的木材。戈伊科切亞(Goicoechea)和合作者顯示，桉樹MYB基因在菸草中過度表達產生更厚的細胞壁以及改變的木質素組成(植物雜誌(Plant J.)43 553-567,2005)。
使用本發明的方法和材料，可以通過將編碼特定轉錄因子的聚核苷酸或所述聚核苷酸的片段的另外拷貝併入目標生物體(如植物)的基因組中來增加或減少所述轉錄因子的量。類似地，轉錄因子的量的增加或減少可通過用所述基因的反義拷貝來轉化目標植物而獲得。
在一個實施例中，本發明提供編碼或部分編碼參與基因表達調節的植物轉錄因子的分離的聚核苷酸。本發明的聚核苷酸是從林業植物來源，即從巨桉和輻射松中分離，但作為替代方案，其可使用常規合成技術合成。在特定實施例中，本發明的分離的聚核苷酸包含選自由以下所組成的群組的序列:鑑別為SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、 2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、 2409、2411、2413、2415、2417、2419 和 2421 的序列；鑑別為 SEQ ID NO :1-591、1183_1912、 1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419 和 2421 的序列的互補序列；鑑別為 SEQ ID NO :卜591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、 2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419 和 2421 的序列的反向互補序列；鑑別為 SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、 2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、 2417、2419和2421的序列的反向序列；至少包含任何上述聚核苷酸的規定數目的連續殘基 (χ聚體)的序列；對應於任何以上聚核苷酸的延伸序列；對應於任何以上聚核苷酸的反義序列；以及任何以上聚核苷酸的變異體，所述術語在本說明書中描述。
在另一個實施例中，本發明提供由SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、 2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、 2409、2411、2413、2415、2417、2419和2421的聚核苷酸所編碼的分離的多肽。在某些特定實施例中，所述分離的多肽包含選自由以下所組成的群組的序列SEQ ID NO =592-1182, 1913-1930、2107-2278、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、 2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420 和 2422。
本發明的聚核苷酸和多肽已證明與已知參與植物中轉錄和/或表達調節的轉化因子的相似性，如以下表I中所示。
表I
權利要求
1.一種分離的聚核苷酸，其包含選自由以下組成的群組的序列SEQ ID NO :1-591, I183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419 和 2421。
2.一種分離的聚核苷酸，其包含選自由以下組成的群組的序列(a)序列SEQ ID NO :1_591、1183-1912、1931_2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、 2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419 和 2421的互補序列；(b)序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、 2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419 和 2421的反向互補序列；以及(c)序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、2389、 2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、2419 和 2421的反向序列。
3.一種分離的聚核苷酸，其包含選自由以下組成的群組的序列(a)與序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、 2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、 2419和2421具有至少75%—致性的核苷酸序列；(b)與序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、 2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、 2419和2421具有至少90%—致性的核苷酸序列；(c)與序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、 2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、 2419和2421具有至少95%—致性的核苷酸序列；(d)在嚴格雜交條件下與序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、 2377、2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、 2413、2415、2417、2419和2421雜交的核苷酸序列；(e)是序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、 2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、 2419和2421的200聚體的核苷酸序列；(f)是序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、 2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、 2419和2421的100聚體的核苷酸序列；(g)是序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、 2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、 2419和2421的40聚體的核苷酸序列；以及(h)是序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、2385、2387、 2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、2415、2417、 2419和2421的20聚體的核苷酸序列；以及(i)通過簡併等於序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912、1931-2106、2371、2374、2377、.2385、2387、2389、2391、2393、2395、2397、2399、2401、2403、2405、2407、2409、2411、2413、 2415、2417、2419和2421的核苷酸序列，其中所述分離的聚核苷酸編碼轉錄因子。
4.一種寡核苷酸探針或引物，其包含至少10個與序列SEQ ID NO :1-591、1183-1912和 1931-2106的10個連續殘基互補的連續殘基。
5.一種分離的多肽，其由根據權利要求I到3中任一權利要求所述的聚核苷酸編碼。
6.一種分離的多肽，其包含選自由以下組成的群組的胺基酸序列SEQ ID NO 592, 594-850、852-930、932-951、953-1046、1048-1182、1913-1930、2107-2293、2296-2368、 2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420 和 2422。
7.一種分離的多肽，其包含選自由以下組成的群組的胺基酸序列(a)與序列SEQ ID NO :592、594-850、852-930、932-951、953-1046、1048-1182、 1913-1930、2107-2293、2296-2368、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、 2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420 和 2422 具有至少 75%—致性的序列；(b)與序列SEQ ID NO :592、594-850、852-930、932-951、953-1046、1048-1182、 1913-1930、2107-2293、2296-2368、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、 2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420 和 2422 具有至少 90%—致性的序列；以及(c)與序列SEQ ID NO :592、594-850、852-930、932-951、953-1046、1048-1182、 1913-1930、2107-2293、2296-2368、2372、2375、2378、2386、2388、2390、2392、2394、2396、 2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420 和 2422 具有至少 95% —致性的序列，其中所述分離的多肽充當轉錄因子。
8.一種分離的聚核苷酸，其編碼根據權利要求6和7中任一權利要求所述的多肽。
9.一種基因構建體，其包含根據權利要求I到3中任一權利要求所述的聚核苷酸。
10.一種轉基因細胞，其包含根據權利要求9所述的基因構建體。
11.一種基因構建體，其在5' -3'方向上包含(a)基因啟動子序列；(b)包含以下至少一者的聚核苷酸序列(1)編碼包含序列592、594-850、852-930、 932-951、953-1046、1048-1182、1913-1930、2107-2293、2296-2368、2372、2375、2378、2386、 2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、 2418,2420和2422的多肽的聚核苷酸；以及(2)包含根據權利要求I到3中任一權利要求所述的聚核苷酸或聚核苷酸非編碼區的聚核苷酸；以及(C)基因終止序列。
12.根據權利要求11所述的基因構建體，其中開放閱讀框是呈有義定向。
13.根據權利要求11所述的基因構建體，其中開放閱讀框是呈反義定向。
14.一種轉基因植物細胞，其包含根據權利要求9和11中任一權利要求所述的基因構建體。
15.一種植物，其包含根據權利要求14所述的轉基因植物細胞；或其果實或種子或繁殖體。
16.根據權利要求15所述的植物，其中所述植物是木本植物。
17.根據權利要求16所述的植物，其中所述植物是選自由桉樹、松樹、刺槐、白楊、楓香、柚木和桃花心木物種組成的群組。
18.一種用於修改植物中的基因表達的方法，其包括在所述植物的基因組中穩定地併入根據權利要求9和11中任一權利要求所述的基因構建體。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述植物是木本植物。
20.根據權利要求18所述的方法，其中所述植物是選自由桉樹、松樹、刺槐、白楊、楓香、柚木和桃花心木物種組成的群組。
21.一種用於產生具有經修改的基因表達的植物的方法，其包括(a)用根據權利要求9和11中任一權利要求所述的基因構建體轉化植物細胞，以獲得轉基因細胞；以及(b)在有助於再生和成熟植物生長的條件下培養所述轉基因細胞。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述植物是木本植物。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述植物是選自由桉樹、松樹、刺槐、白楊、楓香、柚木和桃花心木物種組成的群組。
24.一種用於修改植物中的多肽活性的方法，其包括在所述植物的基因組中穩定地併入根據權利要求9和11中任一權利要求所述的基因構建體。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述植物是木本植物。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述植物是選自由桉樹、松樹、刺槐、白楊、楓香、柚木和桃花心木物種組成的群組。
27.一種分離的多肽，其包含DNA結合結構域，其中所述DNA結合結構域包含選自由SEQ ID NO =2279-2293和2296-2368組成的群組的胺基酸序列。
全文摘要
提供了新穎的分離的聚核苷酸，其編碼植物轉錄因子；以及包含所述聚核苷酸的基因構建體。還公開了使用所述構建體調整內源性和/或異源性基因的表達的方法，以及包含所述構建體的轉基因植物。
文檔編號C07H21/02GK102985436SQ201180029914
公開日2013年3月20日 申請日期2011年4月19日 優先權日2010年4月19日
發明者瑪麗昂·伍德, 麥可·A·申克, 安妮特·麥格拉斯, 馬修·格倫, 威廉·H·羅特曼, 羅伯特·J·科德奇基 申請人:阿博根公司, 盧比肯森林控股有限公司