與乳腺癌相關的基因和多肽的製作方法

2024-01-19 13:49:15

專利名稱：與乳腺癌相關的基因和多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物科學領域，具體而言本發明涉及癌症研究領域。特別 是本發明涉及與乳腺癌增殖機制有關的癌症相關基因」7322、 和 屍57&TO屍K,以及由所述基因編碼的多肽。本發明的基因和多肽可以例如用 於乳腺癌的預後和診斷中，以及作為抗乳腺癌藥物開發的靶分子。
背景技術：
乳腺癌是一種遺傳上異質的疾病(genetically heterogeneous disease), 它 是在女性中最為常見的惡性腫瘤。全世界每年報導的推測的新發病例約為 800,000例(Parkin DM,等人，(1999). CA Cancer J Clin 49: 33-64)。對於該疾病 的醫學治療，乳房切除術仍是目前首選的治療方案。然而，即便手術切除 了原發性腫瘤，由於診斷時存在不能檢出的微小轉移(SaphnerT,等人，1996， J Clin Oncol, 14,2738-46)，在局部或遠端部位仍可能出現復發。為了殺死那 些殘留細胞或癌前細胞，通常在手術後施用細胞毒劑作為輔助療法。使用 傳統的化學治療劑治療常常依賴於經驗，其主要是基於組織學的腫瘤參數。 在缺乏對具體機制的認識的條件下，靶向性藥物正逐漸成為針對乳腺癌的 基本治療。他莫昔芬(tamoxifen)和芳香酶抑制劑是此類藥物的2個代表，將 其作為輔劑或化學預防劑施用於患有轉移性乳腺癌的患者，獲得了良好的 反應(Fisher B，等人,(1998). J Natl Cancer Inst， 90， 1371-88; Cuzick J (2002). Lancet 360， 817-824)。然而，其缺點是只有表達雌激素受體的患者才對這 些藥物敏感。此外，最近人們對其副作用的關注程度有所提高，例如在絕 經後女性中因長期使用他莫昔芬治療引起的子宮內膜癌和因接受芳香酶治療引起的的骨折(ColemanRE(2004). Oncology. 18(5 Suppl 3),16-20)。
儘管近來已在診斷和治療策略方面取得進步，但晚期癌患者的預後仍 然很差。雖然分子研究已揭示在癌發生中涉及腫瘤抑制基因和/或癌基因的 改變，但精確的機制仍有待闡明。
cDNA微陣列技術使得人們得以構建正常細胞和惡性細胞中基因表達 的全面分布圖，並比較惡性細胞和相應正常細胞中的基因表達(Okabe等人, Cancer Res 61:2129-37 (2001); Kitahara等人，Cancer Res 61: 3544-9 (2001); Lin等人，Oncogene 21:4120-8 (2002); Hasegawa等人，Cancer Res 62:7012-7 (2002))。這種方法有助於對癌細胞複雜性質的理解，並幫助人們闡明癌發 生的機理。鑑定出肺瘤中下調的基因能夠更準確和精確地診斷個別癌症， 並可開發新的治療靶(BienzandClevers, Cell 103:311-20 (2000))。為了,人全基 因組的角度揭示肺瘤的機制，並且找到用於診斷和用於開發新型治療藥的 靶分子，本發明人使用23,040個基因的cDNA微陣列分析了腫瘤細胞的基 因表達模式(Okabe等人，Cancer Res 61:2129-37 (2001); Kitahara等人，Cancer Res 61:3544-9 (2001); Lin等人，Oncogene 21:4120-8 (2002); Hasegawa等人， Cancer Res 62:7012-7 (2002))。
旨在揭示癌發生機理的研究已經促進了抗腫瘤劑分子靶標的鑑定。例 如，法尼基轉移酶抑制劑(FTI)—其最初被研發的目的是為了抑制活化依賴 於翻譯後法尼基化的Ras相關的生長信號傳導途徑一已被證明可有在動物 模型中效治療Ras依賴性腫瘤(Sun J,等人，Oncogene. 1998;16:1467-73),。 以拮抗原癌基因受體HER2/neu為目的使用抗癌藥物和抗-HER2單克隆抗體 曲妥珠單抗(trastuzumab)的組合對人體進行的臨床試驗，已使乳腺癌患者獲 得改善的臨床反應和總存活率(Molina MA,等人，Cancer Res. 2001;61:4744-9)。已經開發出能選擇性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶 抑制劑STI-571,以治療慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemias)， 在所述慢性髓性白血病中，bcr-abl酪氨酸激酶的組成性激活在白細胞轉化 中起著至關重要的作用。這些種類的藥物被設計用於抑制特定基因產物的 致癌活性(O'Dwyer ME & Dmker BJ, Curr Opin Oncol. 2000;12:594-7)。因此， 在癌細胞中通常上調的基因產物可以作為開發新型抗癌藥的潛在靶標。
例如，在臨床試驗中嘗試了使用基因特異性siRNA的癌症治療新方法 (B腿crot D等人，Nat Chem Biol 2006 Dec, 2(12): 711-9)。 RNAi似乎已在主
27要技術平臺之中擁有一席之地(Putral LN等人，Drug News Perspect 2006 Jul-Aug， 19(6): 317-24; Frantz S， Nat Rev Drug Discov 2006 Jul, 5(7): 528-9; Dykxhoorn DM等人，Gene Ther 2006 Mar, 13(6): 541-52)。然而，在RNAi可 用於臨床之前需要面對幾個挑戰。這些挑戰包括RNA在體內穩定性差(Hall AH等人，Nucleic Acids Res 2004 Nov 15， 32(20): 5991-6000, Print 2004; Amarzguioui M等人，Nucleic Acids Res 2003 Jan 15, 31(2): 589-95)、作為藥物 的毒性(Frantz S, Nat Rev Drug Discov 2006 Jul, 5(7): 528-9)、遞送模式、使 用的siRNA或shRNA的準確序列，以及細胞類型特異性。存在與部分同源 基因沉默或通過激活幹擾素反應誘導一般基因抑制有關的可能毒性，這是 眾所周知的事實(Judge AD等人，Nat Biotechnol 2005 Apr, 23(4): 457-62, Epub 2005 Mar 20; Jackson AL & Linsley PS, Trends Genet 2004 Nov, 20(11): 521-4)。因此，需要沒有不良副作用的靶向癌特異性基因的雙鏈分子，用於 開發抗癌藥。
另外，已證實CD8+細胞毒T淋巴細胞(CTL)識別源自MHC I類分子上 呈遞的腫瘤相關抗原(TAA)的表位肽，並裂解肺瘤細胞。自發現首例TAA 即MAGE家族以來，採用免疫學手段已經發現了很多其他的TAA (Boon, Int J Cancer 54: 177-80 (1993); Boon and van der Bmggen, J Exp Med 183: 725-9 (1996); van der Bmggen等人，Science 254: 1643-7 (1991); Brichard等人，J Exp Med 178: 489-95 (1993); Kawakami等人，J Exp Med 180: 347-52 (1994》。目 前， 一些新發現的TAA正作為免疫療法的靶標處於臨床開發階段。迄今為 止所發現的TAA包括MAGE(van der Bmggen等人，Science 254: 1643-7 (1991))、 gplOO (Kawakami等人，J Exp Med 180: 347-52 (1994))、 SART (Shichijo等人，J Exp Med 187: 277-88 (1998))，以及NY-ESO-1 (Chen等人, ProcNatl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997))。另一方面，經證實在肺瘤細胞中 特異性過表達的基因產物已顯示可以作為誘導細胞免疫應答的靶標被識 別。這樣的基因產物包括p53 (Umano等人，Brit J Cancer 84: 1052-7 (2001))、 HER2/neu (Tanaka等人，Brit J Cancer 84: 94-9 (2001))、 CEA (Nukaya等人，Int J Cancer 80: 92-7 (1999))等。
儘管已在與TAA有關的基礎和臨床研究中取得了顯著的進步 (Rosenberg等人，Nature Med 4: 321-7 (1998); Mukherji等人，Proc Natl Acad Sci USA 92: 8078-82 (1995); Hu等人，Cancer Res 56: 2479-83 (1996))，但目前可以使用的能治療腺癌(包括乳腺癌)的候選TAA的數目仍然很有限。在癌 細胞中大量表達且同時其表達局限於癌細胞中的TAA被認為是理想的候選 免疫治療靶標。此外，能誘導有效且特異的抗胂瘤免疫應答的新型TAA的 鑑定有望鼓勵人們在臨床上針對多種類型的癌症使用肽接種策略(Boon和 van der Bruggen, J Exp Med 183: 725-9 (1996》van der Bruggen等人,Science 254: 1643-7 (1991); Brichard等人，J Exp Med 178: 489-95 (1993); Kawakami 等人，J Exp Med 180: 347-52 (1994); Shichijo等人，J Exp Med 187: 277-88
(1998) ; Chen等人，Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997); Harris, J Natl Cancer Inst 88: 1442-55 (1996); Butterfield等人，Cancer Res 59: 3134-42
(1999) ; Vissers等人，Cancer Res 59: 5554-9 (1999); van der Burg等人，J Immunol 156: 3308-14 (1996); Tanaka等人，Cancer Res 57: 4465-8 (1997); Fujie等人，Int J Cancer 80: 169-72 (1999); Kikuchi等人，Int J Cancer 81: 459-66 (1999); Oiso等人，Int J Cancer 81: 387-94 (1999》。
據多篇文獻報導，得自於某些健康供體的經肽刺激的外周血單核細胞 (PBMC)可應答於該肽而產生顯著水平的IFN-y，但在"Cr-釋放試驗中很少 以HLA-A24或A0201限制性方式對腫瘤細胞發揮細胞毒性(Kawano等人, Cancer Res 60: 3550-8 (2000); Nishizaka等人，Cancer Res 60: 4830-7 (2000); Tamura等人，Jpn J Cancer Res 92: 762-7 (2001))。然而，與在白種人人群中 一樣，在日本人中HLA-A24和HLA-A0201兩者均是常見的HLA等位基因 (Date等人，Tissue Antigens 47: 93-101 (1996); Kondo等人，J Immunol 155: 4307-12 (1995); Kubo等人，J Immunol 152: 3913-24 (1994); Imanishi等人， Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992》 Williams等人, Tissue Antigen 49: 129 (1997))。因此，由這些HLA呈遞的癌症抗原肽對於 治療日本人和白種人群的癌症可能特別有用。另外，已知使用高濃度的肽
通常可在體外誘導低親和力的CTL，而在抗原呈遞細胞(APC)上產生高水平 的特異性肽/MHC複合物，這些複合物將有效激活這些CTL (Alexander-Miller等人，Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7 (1996》。
為了確定乳腺癌發生的機制，並鑑定這些胂瘤的新的診斷標誌和/或治 療用藥物靶標，本發明人使用含有27,648個基因的全基因組cDNA微陣列 分析了乳腺癌發生中的基因的表達模式。從藥理學的角度看，抑制致癌信號在實踐中比激活腫瘤抑制效應更加容易。因此，本發明人搜尋了在乳腺 癌發生過程中上調的基因。
由於細胞毒類藥物經常引起嚴重的不良反應，根據比較明確的作用機 理來認真選擇新型靶分子將會促進開發副作用風險極小的有效抗癌藥。為
了實現該目標，本發明人以前對81例乳腺癌(Nishidate T等人，Int J Oncol 2004, 25: 797-819)和29例正常人類組織(Saito-Hisaminato A等人，DNA Res 2002, 9: 35-45; WO05/028676)進行了表達模式分析，發現了數十個在乳腺癌 細胞中高度且普遍上調的基因。
/^《(PDz-結合激酶y ro屍^:(源自t-lak細胞的蛋白激酶)基因是這些 基因中的一種，發現其在所考察的大多數乳腺癌病例中是顯著過表達的
(WO05/028676中稱屍5i:/7U/^:基因為"A7870，，)。另夕卜，本發明人證明，被 設計成降低i^尺/rO/^:基因表達的小幹擾RNA(siRNA)對表達該基因的乳 腺癌細胞有生長抑制作用。
PBK/TOPK是絲氨S臾/蘇氨酸激酶家族的一員，最初通過酵母雙雜交篩 選(yeast two-hybrid screening)被鑑定為Dlgl-相互作用蛋白，並表徵為C末 端帶有PDZ-結合基序的有絲分裂激酶(Gaudet S等人，Proc Natl Acad Sci USA 2000， 97: 5167-72)。另一個研究組也提出PBK/TOPK是可磷酸化p38 蛋白的MAPKK (促分裂原活化蛋白激酶激酶)樣蛋白激酶(Abe Y等人，J Biol Chem 2000, 275: 21525-31)。另外，通過酵母雙雜交篩選分析展現了 Raf 和PBK/TOPK之間可能的相互作用(Yuryev A等人，Genomics 2003, 81: 112-25)。這兩個發現暗示了 PBK/TOPK可能參與MAPK途徑。
以前描述了組蛋白H3的N末端部分的翻譯後修飾，包括乙醯化、曱基 化和磷酸化(Martin C & Zhang Y, Nat Rev Mol Cell Biol 2005， 6: 838-49; Nowak SJ等人，Trends Genet 2004, 214-20; Prigent C & Dimitrov S, J Cell Sci 2003,116:3677-85)。其中，已知組蛋白H3 Ser10處的磷酸化與哺乳動物的 染色體濃縮(細胞有絲分裂中的一個重要事件)的引發有關(Prigent C & Dimitrov S, J Cell Sci 2003, 116: 3677-85; Van Hooser A等人，J Cell Sci 1998, 111: 3497-506)。按照"預備產生標記(ready production label)"模型,組蛋白 H3 Ser10處的磷酸化在中期達最高水平，作為染色體準備分離的指標，然 後Ser10脫去磷酸，同時伴隨著中期/後期過渡(Hans F和Dimitrov S， Oncogene 2001, 20: 3021-7)。有趣的是，以前的報導指出，岡田酸(okadaic acid)
30("OA，，)通過抑制蛋白磷酸酶(PPs)從而誘導組蛋白H3的SerlO磷酸化(Murnion ME等人，J Biol Chem 2001， 276: 26656-65; Eyers PA等人，Curr Biol2003,13:691-7)。例如，已知Aurora-A被蛋白磷酸酶2A (PP2A)去活化，但其通過與能阻礙PP2A活性的TPX2 (爪蟾(Xenopus)驅動蛋白樣蛋白2的靶蛋白)蛋白結合，發生自磷酸化作用從而重新活化(Eyers PA等人，Curr Biol2003, 13: 691-7)。
激活靶向許多底物的CDK1-細胞周期蛋白B1激酶觸發哺乳動物細胞中有絲分裂的進入，以誘發隨後的有絲分裂過程(Nigg EA.， Nat Rev Mol CellBiol 2: 21-32 (2001))。那些底物也藉由CDK1-細胞周期蛋白Bl複合物的磷酸化而參與細胞有絲分裂晚期階段的，分別是APC(後期促進複合物)遍在蛋白質連接酶(其被激活從而引發有絲分裂的退出)(Kraft C等人，EMBO J 22:6598-609 (2003))以及獲得PLK1停泊位點的構象蛋白，中期-後期過渡和胞質分裂所需的INCENP (內部著絲粒蛋白，Goto H等人，Nat Cell Biol 8: 180-7(2006))和PRC1 (胞質分裂蛋白質調節劑1， Neef R等人，Nat Cell Biol 9:436-44(2007))。此外，因為最近的著作報導了蛋白質磷酸酶1的活性(PPla有被CDKl-細胞周期蛋白Bl激酶靶向的無活性磷酸化位點(Thr320)(KwonYG等人，ProcNatlAcadSciUSA94: 2168-73 (1997)),這暗示了蛋白質激酶和磷酸酶之間緊密協作促進細胞有絲分裂的作用。雖然已經報導，CDKl-細胞周期蛋白Bl可在Thr9處磷酸化PBK7TOPK，但PBK/TOPK是怎樣被CDKl-細胞周期蛋白Bl複合物有絲分裂細胞激活以及其在細胞增殖和癌演進中的功能仍然知之甚少。

發明內容
因此，本發明旨在提供乳腺癌細胞增殖機制中涉及的新型蛋白和編碼所述蛋白的基因，以及其生產和在乳腺癌診斷和治療中和應用的方法。
在通常在乳腺癌中上調的轉錄物中，分別鑑定了人基因屍5A/rop/:、
爿7322和F337《此外，通過轉染屍BA/T(9屍i:、 ^73"和7^574的特異性小幹擾RNA降低它們的表達，抑制了乳腺癌細胞的生長。許多抗癌藥，例如DNA和/或RNA合成的抑制劑、代謝抑制劑以及DNA嵌入劑，不僅對癌細胞有毒性，還對正常生長的細胞有毒性。但抑制PBK/TOPK、A7322或F3374表達的作用劑不會對其他器官產生不良影響，因為這些基因在正常器官中的表達是受限的，例如A7322限於腦，而F3374限於睪丸和胸腺、胎盤和骨髓。
因此，本發明提供分離的核酸分子，包括PBK/TOPK、 F3374和^7322 (SEQIDNO: 79)基因。這些核酸分子是候選的癌症預後和診斷標記，也是 用於開發新診斷策略和有效的治療抗癌藥的有希望的潛在靶標。另外，本 發明提供了由這些基因編碼的多肽，以及其生產和應用。
本發明還提供生產蛋白質的方法，該方法用編碼PBK/TOPK、 F3374或 A7322蛋白中至少一者的多核苷酸序列轉染或轉化宿主細胞，並表達所述 多核苷酸序列。另外，本發明提供包含編碼PBK/TOPK、 F3374或A7322 蛋白中至少一者的核苷酸序列的載體，以及攜帶編碼A7322蛋白的多核苷 酸的宿主細胞。這樣的載體和宿主細胞可用於生產PBK/TOPK、 F3374和 A7322蛋白。
本申請還提供識別PBK/TOPK、 F3374或A7322蛋白的抗體或非抗體
結合蛋白。部分地，還提供屍5^yro/^:、」ww或^7^2基因的抑制性多核
苦酸，例如反義DNA、核酶和siRNA(小幹擾RNA)。
本發明進一步提供乳腺癌的診斷方法，該方法包括下述步驟測定標 本的生物樣品中^7322或F3374W基因的表達水平，並將」7322或FW74K7 基因的表達水平與正常樣品中的表達水平進行比較；其中樣品中J73"或 i^574F7基因的高表達水平表示乳腺癌。
本發明進一步提供篩選在乳腺癌治療中有用的化合物的方法。該方法 包括使受試化合物與A7322或F3374V1多肽接觸，並選擇與A7322或 F3374V1多肽結合的受試化合物。
本發明進一步提供篩選在乳腺癌治療中有用的化合物的方法，其中方 法包括下述步驟使受試化合物與A7322或F3374V1多肽接觸；以及選擇 抑制A7322或F3374V1多肽生物活性的受試化合物。
本申請還提供在乳腺癌治療中有用的藥物組合物。藥物組合物可以例 如是抗癌劑。藥物組合物包含分別顯示及記載於SEQIDNO:34、 35、 37、 38、 67或68的爿7W2、 FW74P7或」t/i i^多核苷酸序列的反義S-寡核苷 酸或siRNA的至少 一部分。
本發明進一步提供使用由本發明提供的藥物組合物治療乳腺癌的方法。另外，本發明提供一種治療或預防乳腺癌的方法，其包括施用A7322 或F3374V1多肽的步驟。通過施用所述A7322或F3374V1多肽-誇導抗腫瘤 免疫。因此，本發明還提供一種誘導抗腫瘤免疫的方法，包括施用A7322 或F3374V1多肽的步驟，還提供含有A7322或F3374V1多肽的用於治療或 預防乳腺癌的藥物組合物。
本發明的這些及其他目標和特徵在閱讀下文的詳細描述連同附圖和實 施例之後將更加明顯。但是，應理解上文的發明概述和下文的詳細描述都 是優選的實施方案，而不是對本發明或本發明的其他替代實施方案的限制。
本發明還基於，至少部分基於，PBK/TOPK在體外和體內在Serl0處磷 酸化組蛋白H3的新機制這一發現。由於PBK/TOPK是癌症/睪丸抗原，其 激酶功能可能與其致癌活性相關，所以該蛋白還是用於乳腺癌治療的一種 有希望的分子靶標。
具體地，本發明提供一種篩選在乳腺癌細胞中誘導有絲分裂的作用劑 的方法。還可以通過下述步驟進行篩選使PBK/TOPK多肽與被PBK/TOPK 多肽磷酸化的底物和作用劑在處於容許該底物的磷酸化的條件下接觸；檢 測該底物的磷酸化水平；將該底物的磷酸化水平與在沒有所述作用劑存在 下檢測的該底物的磷酸化水平進行比較；以及選擇降低多肽磷酸化水平的 作用劑。根據該方法，組蛋白或組蛋白的包含至少其磷酸化位點(例如組蛋 白H3的SerlO)的片段可以用作底物。
通過上述方法篩選的經鑑定的作用劑在乳腺癌細胞中誘導有絲分裂。 因此，篩選的作用劑是治療或預防乳腺癌的候選物。因而，本發明還提供 了通過阻止或抑制PBK/TOPK對H3的Ser10的磷酸化來篩選用於治療或預 防乳腺癌的作用劑的方法。
本發明進一步提供篩選在乳腺癌治療中有用的化合物的方法，其中方 法包括下述步驟使CDK1、細胞周期蛋白Bl和受試化合物與PBK/TOPK 接觸；以及選擇抑制PBK/TOPK多肽磷酸化水平的化合物。
本發明還涉及用於治療和/或預防乳腺癌的方法，其包括下述步驟施 用含有MEGISNFKTPSKLSEKKK (SEQ ID NO: 98)的抑制性多肽；或編碼它 的多核香酸。此外，本發明涉及本發明的多肽或者編碼它的核苷酸在生產 用於治療和/或預防乳腺癌的藥物製劑中的應用。
本發明進一步提供篩選在乳腺癌的治療中有用的化合物的方法，其中
33方法包括下述步驟使受試化合物與表達蛋白磷酸酶la(PPla)和PBK/TOP 多肽的細胞接觸；以及選擇抑制PBK/TOPK多肽磷酸化水平的受試化合物。 本發明進一步提供篩選在乳腺癌的治療中有用的化合物的方法，其中 方法包括下述步驟使PBK/TOPK多肽與p47多肽、p97多肽和受試化合 物接觸；以及選擇抑制PBK/TOPK和p47之間結合或p97多肽磷酸化水平 的受試化合物。
本發明進一步提供篩選在乳腺癌治療中有用的化合物的方法，其中方 法包括下述步驟使受試化合物與表達PBK/TOP多肽的細胞接觸；以及選 擇使細胞間連接變成長的細胞間橋(intercellular bridge)和/或增加細胞的 G2/M群體的受試化合物。


圖1. A7322和F3374在乳腺癌及正常組織中的表達
(A) A7322在來自12例乳腺癌患者的腫瘤細胞(3T、 31T、 149T、 175T、 431T、 453T、 491T、 554T、 571T、 709T、 772T和781T)中的表達,F3374 在來自乳腺癌病例的肺瘤細胞(16、 102、 247、 252、 302、 473、 478、 502、 552、 646、 769和779)中的表達，以及PBK/TOPK在來自乳腺癌病例的腫 瘤細胞(糾、5、 13、 86、 110、 214、 327、 411、 623、 624、 631和869)中的 表達，通過半定量RT-PCR得到。
(B) F3374在9個乳腺癌細胞系(HBC4、 HBC5、 HBUOO、 HCC1937、 MCF7、 MDA-MB-231、 SKBR3、 T47D、 YMB1)和正常人類組織(乳腺、肺、 心臟、肝臟、腎臟和腦)中的表達，通過半定量RT-PCR得到。
(C) 多種人類組織A7322、 F3374和PBK/TOPK的Northern印跡分析。 MTN膜包含下述人類正常組織1:心臟，2:腦，3:胎盤，4:肺，5: 肝臟，6:骨骼肌，7:腎臟，8:胰臟，9:脾臟，10:胸腺，11:前列腺， 12:睪丸，13:卯巢，14:小腸，15:結腸，16:外周血白細胞，17:胃， 18:曱狀腺，19:脊髓，20:淋巴結，21:氣管，22:腎上腺，及23:骨 髓。
(D) Northern印跡分析，對於A7322用22個乳腺癌細胞系(HBC4 、 HBC5 、 HBL100、 HCC1937、 MCF7、 MDA-MB-231 、 MDA-MB-435S、 SKBR3、 T47D、 YMB1、 BSY-1、 BT-549、 HCC1935、 MDA-MB-157、 BT畫20、 MDA-MB-453、ZR75-1、 BT474、 HCC1143、 HCC1500、 HCC1599、 OCUB-F)和正常人類組 織(乳腺、肺、心臟、肝臟、腎臟和腦)；對於F3374用乳腺癌細胞系和正常 人類組織，包括胸腺、肺、心臟、肝臟、腎臟和骨髓；對於PBK/TOPK用 乳腺癌細胞系(HBC4 、 HBC5 、 HBL100 、 HCC1937 、 NCF-7 、 MDA-MB-231MDA-MB-435S、 SKBR3、 T47D及YBB-l)和正常人類組織(乳 腺、肺、心臟、肝臟、腎臟和骨髓)。
(E) F3374V1的基因組結構。
(F) F3374V1在乳腺癌細胞系和正常組織中的表達圖式，通過半定量 RT-PCR得到。
(G) 外源性A7322蛋白在BT-549細胞中的表達，通過Western印跡分
析得到。
圖2. A7322在乳腺癌細胞系和組織切片中的內源性表達
(A) 內源性A7322蛋白在SK-BR-3乳腺癌細胞中的表達，使用抗A7322 多克隆抗體通過Western印跡分析得到。
(B) 內源性A7322蛋白在SK-BR-3乳腺癌細胞中的亞細胞定位。使用親 和純化的抗A7322多克隆抗體(綠色)和DAPI(藍色)進行了免疫細胞化學染 色以區分細胞核。內源性A7322顯示出定位在細胞質。
(C) -(E) -使用親和純化的抗A7322多克隆抗體進行了免疫組織化學染 色分析。在(C)乳頭管狀癌(樣品號240和241)中癌細胞的細胞質被強染色，
(D) 實性管狀癌(樣品號238、 242和290)，
(E) 及在正常乳腺組織中(樣品號4B)。
(F) A7322在正常人類組織(心臟、肺和肝臟)中的免疫組織化學染色。 在心臟、肺和肝臟中幾乎;f企測不到A7322蛋白的表達。
圖3.免疫細胞化學和免疫組織化學分析
(A) 內源性F3374蛋白在乳腺癌細胞系和HMEC中的表達，使用抗 F3374抗體通過western印跡分析得到。
(B) X磷酸酶實驗，外源性表達時用全長F3374蛋白進行。
(C) 用於確定磷酸化區域的F3374缺失構建體的典型圖式。
(D) X磷酸酶實驗，外源性表達時用各種F3374缺失構建體(A-1、 △-2 和A-3)進行。
(E) 細胞周期中內源性PRC1蛋白在乳腺癌細胞中的亞細胞定位。使用親和純化的抗F3374多克隆抗體(紅色)和DAPI(藍色)對HBC5細胞進行免 疫細胞化學染色以區分細胞核(參見"材料和方法")。白色箭頭表示F3374 定位在末期細胞的中間體。
(F)乳腺癌和正常乳腺組織切片的免疫組織化學染色結果。使用抗F3374 抗體染色內源性F3374蛋白。從正常乳腺組織(10441N)幾乎檢測不到表達， 但在所有研究的癌組織中癌細胞都被強染色，包括乳頭管狀癌(10005T和 00317T)、硬癌(10069T和10571T)及實性管狀癌(10164T和10185T)。典型 圖來自於顯微鏡觀察，原始放大倍數x200。在正常人類組織切片(心臟、肺、 腎臟、肝臟和睪丸)中F3374的免疫組織化學染色的典型影像。內源性F3374 蛋白用抗F3374抗體染色。原始放大倍數x50。
圖4. PBK/TOPK蛋白在乳腺癌細胞系和組織切片中的表達
(A) 內源性PBK/TOPK蛋白在乳腺癌細胞系和HMEC中的表達，使用 抗PBK/TOPK單克隆抗體通過western印跡分析得到。
(B) 內源性PBK/TOPK蛋白在乳腺癌細胞系TT7D、 BTJO和HBC5中 的亞細胞定位，所述細胞系用抗PBK/TOPK單克隆抗體(紅色)和DAPI(藍色) 進行免疫細胞化學染色以區分細胞核。內源性PBK/TOPK蛋白在細胞質中 被染色。
(C) 乳腺癌(l-3)和正常乳腺(4)組織切片的免疫組織化學染色。用抗 PBK/TOPK單克隆抗體染色內源性PBK/TOPK蛋白。在正常乳腺組織(4)中 幾乎不能檢測到蛋白的表達，但在所有研究的癌組織中癌細胞的細胞質都 被強染色，包括導管內癌(l)、乳頭管狀癌(2)及硬癌(3)。圖面描繪了典型的 顯微照片，原始放大倍數，左圖面x100，右圖面x200。
(D) PBK/TOPK蛋白在正常人類組織中的表達圖式。使用抗PBK/TOPK 單克隆抗體考察了心臟(l)、肺(2)、肝臟(3)、腎臟(4)及睪丸(5)的組織。結果， 在4個重要器官(l-4)中幾乎檢測不到表達的PBK/TOPK蛋白，但在睪丸中 被強染色，染色僅在生精小管的外層(5)。這些免疫組織化學染色結果與 MTN的結果很相關(圖1C)。圖面描繪了典型的顯微照片，原始放大倍數， 左圖面x 100，右圖面'x200。
圖5.被設計成降低A7322在乳腺癌細胞中表達的小幹擾RNA(siRNAs) 的生長抑制作用
(A)半定量RT-PCR，顯示抑制」73"在乳腺癌細胞系(BT-549細胞)中
36的內源性表達。用作為內部對照。
(B) MTT測定，表明在BT-549細胞中敲低A7322減少了集落數量。
(C) 集落形成試驗，表明在BT-549細胞中敲低A7322減少了集落數量。
(D) 半定量RT-PCR，顯示抑制A7322在BT-549細胞中的內源性表達。 被設計成不降低A7322表達的siRNAs-錯配的敲低效應。
(E) MTT測定，表明在BT-549細胞中敲低A7322減少了集落數量。
(F) 集落形成試驗，表明在BT-549細胞中敲低A7322減少了集落數量。
(G) 被設計成不降低A7322在乳腺癌細胞系(BT-474細胞)中表達的 siRNA錯配的敲低效應，通過半定量RT-PCR測得。
(H) MTT測定，表明在BT-474細胞中通過/47322-錯配的siRNA (mis-#3; 最初自si-#3設計)減少了集落數量。
(I) FACS分析，顯示通過抑制A7322在BT-474乳腺癌細胞中的內源性 表達增加了凋亡細胞群體(用sub-Gl百分數表示)。新黴素選擇後第二天， 對來自才莫擬和si-#3轉染的BT-474細胞的總共10,000個細胞同樣地計數。
圖6.被設計成降低F3374在乳腺癌細胞中表達的小幹擾RNA(siRNAs) 的生長抑制作用
(A) 半定量RT-PCR，顯示抑制F3374在乳腺癌細胞系(T47D細胞)中的 內源性表達。用作為內部對照。
(B) 集落形成試驗，表明在BT-549細胞中敲低F3374減少了集落數量。
(C) MTT測定，表明在T47D細胞中敲低F3374減少了集落數量。
(D) 半定量RT-PCR,顯示通過FW74特異性siRNA (si#l和s說4)抑制 在乳腺癌細胞系(HBC4)中的內源性表達。作為上樣對照。
(E) 集落形成試驗，表明在HBC4細胞中敲低F3374減少了集落數量。
(F) MTT測定，表明在HBC4細胞中敲低F3374減少了集落數量(s說l 和si弁4:分別為/ <0.001;非配對/檢驗)。
(G) 通過western印跡分析確認了 siRNA使內源性F3374表達沉默。(3-肌動蛋白作為上樣對照。
(H) 顯孩i鏡所見的用siF3374轉染的HBC4細胞的形態變化。siEGFP 用作對照siRNA。箭頭表示兩個分離的細胞(右圖面)。
圖7. PBK/TOPK-siRNA對乳腺癌細胞系的生長抑制作用 (A)-(B)半定量RT-PCR的結果顯示了新黴素選擇後11天的PBK/TOPK沉默。GAPDH作為內部對照。在第11天進行了 MTT測定以評價細胞生存 力，將經過標準化的結果作圖，其中取模擬的結果作為1.0。選擇後3周， 進行集落形成試驗(參見"材料和方法")。兩個siRNA構建體(si42和#3)顯示 了針對內部PBK/TOPK表達的敲低效應，並且抑制了兩種細胞系T47D (A) 和BT-20 (B)的細胞生長。^t擬用作陰性對照。
(C)-(D)新黴素選擇後2周，通過顯微鏡觀察研究了模擬對照(C)和si-#3 誘導的T47D細胞(I))之間的表型差異。觀察到了 PBK/TOPK缺失細胞不規 則的形狀延長的中間體、消失和不受控制的胞質分裂(D)。
(E) 顯示了 Western印跡的結果，確認內部PBK/TOPK表達的沉默。
(F) 描繪FACS的結果，顯示在si43-誘導的T47D細胞中而不是在模擬 對照轉染的細胞中有更大群體的凋亡細胞(用sub-Gl百分數表示)。從模擬 和si-#3轉染的T47D細胞同樣地計數總共10,000個細胞。
圖8. 將PHB2/REA鑑定為A7322的相互作用蛋白
(A) 含有免疫沉澱蛋白的SDS-PAGE凝膠的銀染色。用模擬(模擬泳道) 或FLAG標籤(FLAG-tagged)的A7322 (A7322-FLAG泳道)轉染了 BT-549細 胞。出現在A7322泳道的差異條帶經過質譜分析，將33kDa附近出現的一 個條帶鑑定為PHB2/REA。右圖面顯示了免疫沉澱樣品的Western印跡分析。 使用抗FLAG M2單克隆抗體檢測到了 FLAG標籤的A7322的表達。
(B) PHB2/REA和A7322轉錄物在乳腺癌臨床樣品(4T、 13T、 86T、 138T、 327T、 341T、 411T、 631T、 818T和846T)和乳腺中的半定量RT-PCR結果。 (32-MG作為內部對照。PHB2/REA和A7322轉錄物在乳腺癌細胞系(HBC4、 HBC5、 HBL100、 HCC1937、 MCF-7、 MDA-MB-231、 MDA-MB-435S、 SK-BR-3、 T-47D、 YMB-1、 BSY-1、 BT-549、 HCC1935、 MDA-MB-157、 BT-20、 MDA-MB-453、 ZR-75畫1、 BT474、 HCC1143、 HCC1500、 HCC1599、 OCUB-F)、 HMEC和乳腺中的半定量RT-PCR結果。P2-MG作為內部對照。
(C) A7322和PHB2/REA蛋白的相互作用。用FLAG標籤模擬物、FLAG 標籤A7322、 HA標籤模擬物和HA標籤PHB2/REA的組合轉染COS-7細 胞，用抗FLAG M2瓊脂糖免疫沉澱所述細胞，用抗HA高親和性(3F10)大 鼠單克隆抗體進行免疫印跡。用FLAG標籤A7322和HA標籤PHB2/REA 轉染的第四泳道顯示了這兩種蛋白的直接結合。右圖面顯示通過用抗HA 瓊脂糖偶聯物免疫沉澱和用抗FLAG M2單克隆抗體免疫印跡對A7322和PHB2/REA蛋白相互作用的確認。用FLAG標籤A7322和HA標籤 PHB2/REA轉染的第四泳道顯示了這兩種蛋白的直接結合。
(D) PHB2/REA在乳腺癌細胞中的內源性表達。使用抗PHB2/REA多克 隆抗體(綠色)和DAPI (藍色)在SK-BR-3乳腺癌細胞中進行了免疫細胞化學 染色，以區分細胞核。內源性PHB2/REA顯示主要定位在細胞質，但有些 細胞也顯示定位在細胞核(箭頭)。
圖9. A7322顯示不與ERot蛋白直接結合
(A) A7322和ERa蛋白不相互作用的確認。用HA標籤模擬物(模擬 -HA)、 HA標籤A7322 (A7322-HA)、 FLAG標籤模擬物(模擬-FLAG)和FLAG 標籤ERa (ERa-FLAG)的組合轉染COS-7細胞，用抗FLAG M2瓊脂糖免疫 沉澱所述細胞，用抗HA高親和性(3F10)大鼠單克隆抗體免疫印跡。用 A7322-HA和ERa-FLAG轉染的第四泳道顯示了這兩種蛋白沒有直接結合。 右圖面通過用抗HA瓊脂糖偶聯物免疫沉澱和用抗FLAG M2單克隆抗體免 疫印跡顯示了對A7322和ERa蛋白相互作用的確認。用A7322-HA和 ERa-FLAG轉染的第四泳道顯示了這兩種蛋白沒有直接結合。
(B) A"M和ERa在雌二醇處理下的亞細胞定位。用A"2厶HA(綠色) 和ERa-FLAG (紅色)轉染MCF-7 (ER+)細胞24小時，再用DMSO (-E2;左 圖面)或1jiME2(+E2;右圖面)處理24小時。在E2下A7322保留在細胞質 中。使用SK-BR-3 (ER-)細胞進行相同的實驗。(C)顯示了在E2下A7322不 移動。
圖10. A7322抑制PHB2/REA的核轉運
(A) 在A"22存在下PHBWREA的亞細胞定位。用HA標籤PHB2/REA (綠色)、FLAG標籤ERa (紅色)，及FLAG標籤模擬物(-A7322;左圖面)或 FLAG標籤A7322 (紅色)(+A7322;右圖面)轉染MCF-7 (ER+)細胞24小時， 用l|aM E2再處理24小時。左圖面中箭頭顯示了在沒有A7322存在下 PHB2/REA的核轉運，而右圖面中顯示了 A7322存在下PHB2/REA保留在 細胞質中。
(B) 使用SK-BR-3 (ER-)細胞進行了相同的實驗，顯示了 A7322的存在 對PHB2/REA的核轉運的抑制。
(C) 使用siRNA寡核苷酸在蛋白質水平上敲低了 A722、 ERa和PHB2 的表達。si-EGFP用作對照siRNA。 ACTB作為western印跡分析的上樣對照。
或si-EGFP作為對照處理MCF-7 (ER+)細胞。siRNA處理後24小時，用E2 處理細胞48小時，然後通過免疫細胞化學染色分析。
圖11. 通過抑制內源性PHB2/REA的核轉運增強ER轉錄活性
(A) 外源性A7322和內源性PHB2/REA蛋白在MCF-7和SK-BR-3細胞
中的表達。
(B) SEAP測定確定ERa的轉錄活性。將MCF-7 (ER+)或SK-BR-3 (ER-) 細胞分別共轉染FLAG標籤A7322 (FLAG-A7322)構建體和雌激素應答報導 基因(pERE-TA-SEAP)構建體或者模擬對照和pERE-TA-SEAP報導基因構建體。
(C) 顯示了 A7322抑制PHB2/REA核轉運的概要。在沒有A7322存在下 (-A7322), PHB2/REA與ERa轉移至細胞核，抑制與雌二醇配合的ERa的 轉錄活性(左圖面)。另一方面，在A7322存在下(十A7322)， PHB2/REA在 細胞質中與A7322結合，抑制PHB2/REA的核轉運，促進增強ERa的轉錄 活性(右圖面)。
圖12. F3374的細胞周期依賴性表達
(A) FACS分析顯示了同步化後，從0-12小時每3小時收集的T47D細 胞的群體。
(B) 在T47D細胞中有絲分裂期間F3374的Western印跡分析。值得 注意的是,F3374的表達在從細胞周期停滯解脫後的0-3小時(G1/S期)最高， 其磷酸化在從細胞周期停滯解脫後的9-12小時之間(G2/M期)變得明顯。
圖13. F3374蛋白表達受AURKB的調節
(A) 推斷的F3374蛋白C末端的胺基酸序歹J(胺基酸591-730)。下劃線表 示Aurora激酶的3個假定的共有磷酸化位點([R/K]^[T/S]和 [R/K風T/S][I/L/V]。
(B) 在11個乳腺癌細胞系(BT-20、 BT549、 HBC4、 HBC5、 HCC1937、 MCF-7、 MDA-MB-231、 SK-BR-3、 T47D and YMB-1)、人乳腺上皮細胞系 (HMEC)和正常乳腺中，和/4WWB轉錄物的半定量RT-PCR實驗。
用作定量對照。
(C) F3374和AURKB蛋白的共免疫沉澱。將來自用HA標籤F3374和
40Flag標籤AURKB蛋白轉染的HEK293T細胞的細胞裂解物與小鼠抗Flag 或正常大鼠IgG免疫沉澱。使用小鼠抗HA抗體對免疫沉澱物進行免疫印 跡。W.C丄代表全細胞裂解物。
(D) 用純化的F3374 C末端重組蛋白(36 kDa，包括組氨酸標籤)進行體外 激酶測定。將F3374重組蛋白加至含ARUKB的反應混合物(見正文)。箭頭 表示磷酸化的F3374。
(E) 用AURKB特異性siRNA處理消除AURKB內源性表達導致F3374 蛋白的總量和磷酸化降低。(3-肌動蛋白作為蛋白質的定量對照。
(F) 使用親和純化的抗F3374和AURKB多克隆抗體(綠色)及DAPI (藍 色)對T47D細胞進行免疫細胞化學染色以區分細胞核(參見"材料和方法，，)。 箭頭分別表示T47D細胞胞質分裂中的AURKB和F3374蛋白。
圖14.有絲分裂期間PBK/TOPK蛋白的磷酸化
(A) 描繪了 FACS分析的結果，顯示同步化後從0-15小時每3小時收集 的細胞群體。
(B) 描繪了考察PBK/TOPK表達的Western印跡的結果。值得注意的是， 細胞周期解脫之後6-12小時(其代表如(A)所示的G2/M期)PBK/TOPK被磷
酸化並上調。
(C) 顯示了細胞周期解脫後12小時典型的免疫細胞化學染色。在前期或 中期凝聚染色體附近衝企測到內源性PBK/TOPK的強染色(用箭頭表示)。
(D) 描繪了有絲分裂期間PBK/TOPK磷酸化的結果。用0.3 ug/mL諾考 達唑(nocodazole)處理6小時、12小時和18小時，顯示了磷酸化PBK/TOPK 時間依賴性增加的強度(左圖面)。進一步將細胞裂解物與/不與IUX磷酸酶 於30。C溫育2小時，顯示了用箭頭表示的緩慢遷移的條帶為磷酸化的 PBK/TOPK蛋白(右圖面)。
(E) 描繪了 FACS分析的結果，顯示在用諾考達唑處理後6-18小時處於 G2/M期的細胞(箭頭)比例提高。
圖15. PBK/TOPK蛋白在體外和體內砩酸化SerlO-組蛋白H3 (A)描繪了用純化的PBK/TOPK重組蛋白(40kDa,包括組氨酸標籤)進行 的體外激酶測定的結果。除PBK/TOPK之外，還加入組蛋白混合物或組蛋 白H3作為底物。分別用箭頭和星號(*)表示磷酸化的組蛋白H3和 PBK/TOPK的自磷酸化。(B) 用野生型和激酶失活(kinase-dead)突變體(K64-65A)轉染T47D細胞， 接著用1 OOnM岡田酸(OA)處理6小時。OA處理引起兩種PBK/TOPK蛋白(箭 頭)磷酸化，但只有野生型蛋白誘發了通過SerlO-特異性抗體的磷酸化檢測
到H3磷酸化。
(C) 顯示了轉染和新黴素選擇2周後，siRNA (si43)使T47D細胞中 PBK/TOPK的內部表達沉默。結果，PBK/TOPK的消除伴隨著組蛋白H3在 SerlO處的磷酸化的降低。還考察了 P-肌動蛋白和總H3作為上樣對照。
(D) 描繪了 PBK/TOPK和組蛋白H3的免疫細胞化學染色分析結果。結 果顯示了在乳腺癌細胞系T47D和HBC5中有絲分裂細胞(前期)的凝聚染色 體(藍色)上，PBK/TOPK(紅色)與在Serl0處磷酸化的組蛋白H3(綠色)匯合。
(E) 顯示了在T47D細胞的中期，PBK/TOPK和絲氨酸10處磷酸化的組 蛋白H3的亞細胞定位。
(F) 顯示了 PBK/TOPK表達和組蛋白H3磷酸化在後期細胞中降低(空心 箭頭)。實心箭頭表示處於間期的細胞。
圖16.在有絲分裂細胞中CDKl-細胞周期蛋白Bl磷酸化PBK/TOPK
蛋白
(A) 在乳腺癌細胞系(T47D細胞)的有絲分裂細胞中內源性PBK/TOPK、 CDK1和細胞周期蛋白Bl的核轉運。箭頭表示有絲分裂細胞中 PBK/TOPK(上圖面)、CDK1 (中圖面)和細胞周期蛋白Bl(下圖面)的核轉運。
(B) PBK/TOPK在體外被CDKl-細胞周期蛋白Bl直接磷酸化。野生型 -PBK/TOPK (WT)重組蛋白被CDKl-細胞周期蛋白Bl重組蛋白磷酸化，但 在Thr9-PBK/TOPK處丙氨酸取代的突變體(T9A)不被CDKl-細胞周期蛋白 Bl重組蛋白磷酸化。
(C) 用ppl-18肽抑制PBK/TOPK在Thr 9處被CDKl-細胞周期蛋白Bl 磷酸化。通過體外激酶測定考察了該肽阻斷CDKl-細胞周期蛋白Bl誘導的 TOPK磷酸化的效力。將TOPK和CDKl-細胞周期蛋白Bl的重組蛋白分別 與以0、 5pM、 IOiiM和20jiM濃度添加的可通透的肽一起溫育。SDS-PAGE 和放射自顯影后觀察到了磷酸化的蛋白。
(D) ppl-18肽處理明顯劑量依賴性地抑制了表達PBK/TOPK的T47D的 細胞生長(P=0.0096 ， Student's t檢驗)。另 一 方面，ppl-18肽不影響 PBK/TOPK-陰性HMEC細胞的生長。活細胞數目用MTT試驗測定。(E) ppl-18肽處理對T47D細胞的細胞周期的影響。用諾考達唑(0.3 嗎/mL)處理T47D細胞，接著加入ppl-18肽(IO pM)再過18小時或24小時 後收集，然後使用抗PBK/TOPK抗體進行western印跡分析及FACS分析。
(F) 通過顯微鏡所見的用50pM ppl-18肽處理的T47D細胞的形態變 化。箭頭表示ppl-18肽處理細胞在胞質分裂期間的長細胞間橋。
圖17.有絲分裂細胞中PBK/TOPK蛋白的自磷酸化或PPla調節的 PBK/TOPK磷酸化，以及CDK1使PBK/TOPK活化或PPla失活
(A) PBK/TOPK在有絲分裂細胞中被磷酸化。用諾考達唑處理T47D細 胞18小時，然後進行FACS分析和人磷酸酶測定。
(B) 有絲分裂細胞中PBK/TOPK的自磷酸化。分別用野生型TOPK (WT)、 Thr9處丙氨酸取代的突變體(T9A)、激酶失活(KD)和雙突變體 (T9A/KD)轉染T47D細胞，使用抗HA單克隆抗體進行western印跡分析。 WT和T9A被磷酸化，但KD和T9A/KD未被磷酸化。
(C) 用岡田酸(OA)處理誘導了 PBK/TOPK的磷酸化。用100 nM岡田酸 (OA)處理T47D細胞，在處理後1小時、3小時和9小時收集細胞。用OA 處理9小時後出現了磷酸化的條帶，通過XPPase測定證實。
(D) PBK/TOPK和PPla的相互作用。用GST-融合的PPla(GST-PPla) 和HA標籤的PBK/TOPK (HA-PBK/TOPK)共轉染COS-7細胞，用經平4軒的 Glutathione Sepharose 4B i朱子拉下(pull-down)或用抗HA單克隆抗體免疫沉 澱所述細胞，接著使用抗GST或HA單克隆抗體進行western印跡分析。
(E) 在有絲分裂細胞中用PPla處理以及XPPase處理使TOPK脫去磷酸。
(F) 用諾考達唑處理T47D細胞16小時，接下來，與25 nM CDK1抑 製劑一起溫育0-4小時之後收集，進行FACS分析。
(G) CDK1抑制劑處理後各時間點(O小時、0.5小時、l小時、2小時和 4小時)對各細胞周期的群體(％)作圖。
(H) 分別用抗TOPK單克隆抗體、抗-磷酸-PPlgi (Thr320)多克隆抗體、 抗-總-PPla多克隆抗體、抗-磷酸-Rb(Ser807/811)多克隆抗體和抗-總-Rb單 克隆抗體對等量總蛋白進行免疫印跡。
圖18. siRNA所致的PBK/TOPK消除導致有絲分裂障礙和Gl停滯 (A) si-TOPK-#3在蛋白質水平上敲低PBK/TOPK表達的Western印跡分 析。與在s正GFP處理的細胞中相比，在si-TOPK-#3處理的T47D細胞中
43PBK/TOPK表達被明顯抑制。p-肌動蛋白作為western印跡分析的對照。
(B)用si-TOPK-#3或s正GFP轉染後2天用相差顯微鏡觀察了細胞形態 (上圖面)。用si-TOPK-#3或siEGFP轉染後2天還通過免疫細胞化學染色研 究了細胞形態(下圖面)。為闡明細胞的形態，用Alexa Fluor 594鬼筆環肽 (phalloidin)將肌動蛋白結構染色，用DAPI復染細胞核。
(C)用si-TOPK-#3或siEGFP轉染T47D細胞。轉染後2天，用0.3嗎/mL 諾考達唑處理細胞，再溫育24小時。分別通過相差顯微鏡檢查和FACS分 析研究了細胞形態和細胞周期。
(D) 用si-EGFP作為對照轉染T47D細胞，用時差顯微術(Time-lapse microscopy)測定了細胞有絲分裂的持續時間。
(E) 用TOPK-#3轉染T47D細胞，用時差顯《效術測定了細胞有絲分裂 的持續時間。
(F) 用野生型(WT)或激酶失活HA標籤的TOPK表達載體轉染T47D細 胞，接著分別用si-EGFP或si-TOPK-#3轉染。在每種siRNA轉染後48小 時，我們進行了免疫細胞化學染色。用抗HA單克隆抗體對外源表達的TOPK 蛋白進行免疫焚光染色。用稀釋的Alexa Fluor 594鬼筆環肽(phalloidin)將肌 動蛋白結構染色，用DAPI復染細胞核。
圖19. PBK/TOPK在體外和體內磷酸化p97/VCP蛋白
(A) PBK/TOPK與p47蛋白的相互作用。用HA標籤的PBK/TOPK (HA-PBK/TOPK)構建體轉染COS-7細胞，然後用裂解緩沖液裂解所述細 胞。接下來，將細胞裂解物與GST標記的p47 (GST-p47)重組蛋白混合在 一起，然後用GST-珠子拉下。使用抗HA抗體對沉澱物進行的免疫印跡表 明了 GST-p47與HA-PBK/TOPK共沉澱。
(B) 外源表達的P47和內源性PBK-TOPK在T47D細胞中用或不用諾考 達唑處理時的共定位(colocalization)。
(C) p97和PBK/TOPK蛋白在乳腺癌細胞系中的表達圖式。從乳腺癌細 胞系(BT-549、 HBC5、 HCC1937、 MCF-7、 MDA-MB-231、 MDA-MB陽435S、 T47D和ZR75-1)和HBL100，以及人類哺乳動物上皮細月包系(HMEC)制 備了等量的總蛋白。SDS-PAGE並轉膜後，用抗TOPK單克隆抗體或抗p97 多克隆抗體對蛋白質進行免疫印跡。P-肌動蛋白作為western印跡分析的對 照。(D) co-IP實驗所示的PBK/TOPK和p97蛋白的相互作用。我們將 HA-PBK/TOPK和myc標記的97 (myc-p97)構建體共轉染至COS7細胞， 然後用HA標籤抗體共免疫沉澱。HA-PBK/TOPK不直接與myc-p97相互作用。
(E) PBK/TOPK通過p47蛋白作為銜接子與p47/p97複合物結合。用GST 融合的p47、 myc標記的p97或HA標籤的TOPK構建體三重轉染 (tri-transfect) COS-7細胞。使用抗GST抗體或抗myc單克隆抗體對那些蛋 白質中的複合物進行免疫沉澱，然後分別用抗HA或抗myc單克隆抗體進 行western印跡。用裂解緩沖液清洗5次並進行SDS-PAGE後，如上所述研 究了蛋白質之間的那些相互作用。
(F) p97的體外激酶測定。將經免疫沉澱的p97蛋白與重組TOPK蛋白 於3(TC—起溫育30分鐘。
(G) 用si-EGFP和si-p97的siRNA雙鏈體各100 pmol轉染T47D細胞。
(H) 用siRNA轉染兩天後，用相差顯微鏡觀察了細胞形態。
發明的具體實施方案 凝迷 為了理解與癌症相關的致癌機制並鑑定用於開發新型抗癌藥的潛在靶 標，使用代表27，648個基因的cDNA微陣列對純化的乳腺癌細胞群體中的 基因表達圖式進行了大規模分析。更特別地，為了分離用於乳腺癌治療的 新分子靶標，聯合使用cDNA微陣列與雷射束顯微解剖，考察了 81例乳腺 腫瘤的精確的全基因組表達模式。
在上調基因中，本發明人著眼於在多數乳腺癌標本中表達為上調的 A7322。隨後的半定量RT-PCR和Northern印跡證實，A7322在臨床乳腺癌 標本和乳腺癌細胞系中是上調的，但是在正常器官(除了腦之夕卜)中不表達。 由於NCBI資料庫中組裝的A7322 cDNA序列短於來自northern印跡分析的 約15kb轉錄物，所以本發明人進行了外顯子連接和5，RACE實驗，以獲得 全長A7322 mRNA。最後獲得了 14,763個核苷酸的cDNA序列(Genbank登 錄號AB252196)，含有6534個核苷酸的開放閱讀框(SEQ ID NO: 79的 172-6702)，其編碼2,177個胺基酸的蛋白質。簡單模塊構架搜索工具(simple modular architecture research tool, SMART)程序顯示，預測的A7322蛋白在密碼子586和798之間包含Sec7區域，該區域對於蛋白質正確地通過轉運 高爾基體轉運可能是必需的。
此外，本發明人將PHB2/REA (GenBank登錄號NM—007273)鑑定為 A7322-相互作用蛋白。A7322和PHB2/REA共定位在乳腺癌細胞的細胞質。 A7322在乳腺癌發生中通過抑制PHB2/REA蛋白的核轉運使ERa再活化從 而發揮作用。
在上調基因中，本發明人還著眼於鑑定包括4,221個核香酸的F3374V1 的全長cDNA序列(GenBank登錄號NM—016448)，其含有2,193個核苷酸 的開放閱讀框，編碼730個胺基酸的多肽。F3374V1基因有15個外顯子。 RT-PCR顯示，與正常人類組織相比，F3374V1 (1，296bp)在乳腺癌細胞中顯 著地過表達。隨後的半定量RT-PCR和Northern印跡分析證實，與正常人 類組織(除了睪丸、胸腺、胎盤和骨髓以外)相比，F3374在12例乳腺癌標 本的IO例中及所有受試的乳腺癌細胞系中都是過表達的。使用檢測內源性 F3374的抗F3374多克隆抗體進行的免疫組織化學染色分析顯示了在乳腺 癌細胞中的細胞周期依賴性定位。
用小幹擾RNA (siRNAs)處理乳腺癌細胞有效地抑制了 ^73"和 的表達，且抑制了乳腺癌細胞系BT-549和BT-474的細胞/肺瘤生長(對於 A7322),或抑制了細胞系T47D和HBC4的細胞/月中瘤生長(對於F3374),顯 示了這些基因在細胞生長增殖中發揮關鍵作用。這些發現與^73"和FW74 過表達同乳腺腫瘤發生有關這個結論一致，為乳腺癌患者特異性治療提供 了有希望的策略。
此外，本發明人發現了 F3374蛋白與有絲分裂激酶Aurora-B(AURKB)
的相互作用並被其磷酸化。證明了用siRNA消除乳腺癌細胞中所致的有絲 分裂激酶JL見《S的表達減少了 F3374蛋白的磷酸化，並降低了 F3374蛋白 的穩定性。
因此，分離了在乳腺癌細胞中顯著過表達的^73"和^537^基因。通 過半定量RT-PCR和Northern印跡分析確認了 ^73"和在乳腺癌細 胞中的表達圖式是特異性過表達。以前報導了 ^7^2和的ESTs在膀 胱癌和非小細胞肺癌中都是上調的。但以前這些基因與乳腺癌的關聯是未 知的。此外，本發明首次提供了這些基因的全長核芬酸序列。
在使用cDNA微陣列技術檢測為在乳腺癌中過表達但在正常人類組織(除睪丸和胸腺外)中不表達的基因中，本發明人著眼於屍BAyr(9/^:基因。免
疫組織化學分析也支持高水平內源性屍^^70屍尺表達，與Northern印跡分
析的結果一致。另外，通過siRNA技術敲低內源性屍A^/ro/^:表達導致了
乳腺癌細胞系的生長抑制(圖5A和圖5B)，證明了屍^OT(9/^:基因在乳腺 癌細胞中的致癌作用。
除了迄今為止報導的PBK/TOPK在睪丸中的重要作用外，本發明人發 現了其在M期間的亞細胞轉運，表明了其在癌細胞有絲分裂中的關鍵作用。 此外，證明了用特異性siRNA敲低PBK/TOPK表達引起胞質分裂障礙，隨 後導致癌細胞凋亡(圖5C-F)。這些結果與PBK/TOPK在細胞分裂和胞質分 裂中起重要作用的結論一致。值得注意的是，顯微鏡和FACS觀察siRNA 對PBK/TOPK的作用與siRNA對胞質分裂完成所需的膜聯蛋白(Annexin) 11 的作用十分相似膜聯蛋白11敲低產生窄的細胞質橋，增加處於sub-Gl 的細胞群體(Tomas A等人，J Cell Biol 2004， 165: 813-22)。
由於PBK/TOPK含有激酶域，所以本發明人用幾種刺激物處理細胞以
分別研究其與雌激素受體和細胞有絲分裂信號的關聯(數據未顯示)，所述刺 激物包括OA (岡田酸)、PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate,佛波醇(12-) 十四酸酯(-13-)乙酸酯)、p-雌二醇和諾考達唑。在這些刺激物中，發現OA 引起PBK/TOPK的磷酸化，OA是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶的特異性抑制 劑，引起間期細胞中有絲分裂樣過程、染色體濃縮和以不依賴於Cdc2的方 式進入有絲分裂(AjiroK等人，JBiol Chem 1996, 271: 13197-201; Gowdy PM 等人，JCell Sci 1998， 111:3401-10)。
與PBK/TOPK是p38 (Abe Y等人，J Biol Chem 2000, 275: 21525-31)和 p42/ERK2 (其通常在乳腺癌細胞系中是上調的)的上遊激酶這一預測相反的 是，體外激酶測定未顯示這些蛋白的磷酸化(數據未顯示)。而如本發明中首 次報導的，PBK/TOPK觀察到了高度選擇性的組蛋白H3磷酸化。有趣的是， 在組蛋白H3的N末端(SerlO)磷酸化表明，該磷酸化步驟是一個早期的有絲 分裂事件，伴隨著OA處理後的染色體濃縮(Ajiro K等人，J Biol Chem 1996, 271:13197-201)。
另外，由於使用乳腺癌細胞的免疫染色實驗顯示了 PBK/TOPK在有絲 分裂(特別在前期和中期)時亞細胞定位在細胞中的染色體周圍(圖8C)，所以 考察了 PBK/TOPK以確定其在體內是否在絲氨酸10處磷酸化組蛋白H3。
47比較了在有或無OA刺激下的野生型和激酶失活(K64-65A突變體SEQ ID NO: 92中賴氨酸64和65變成丙氨酸突變體)的PBK/TOPK蛋白，證明了 PBK/TOPK磷酸化組蛋白H3的絲氨酸IO(圖9B)，在有絲分裂細胞中內源 性PBK/TOPK蛋白與磷酸化的組蛋白H3很好地匯合(圖9D)。
組蛋白H3的細胞周期依賴性SerlO磷酸化與PBK/TOPK表達水平及定 位相關，特別是在有絲分裂的早期(圖9D和圖9E)。因此，PBK/TOPK-組蛋 白H3途徑促進有絲分裂事件，因而增強癌細胞增殖，類似於已被人指出在 乳腺癌細胞中具有重要作用的Pakl (Li F等人，EMBO Rep 2002， 3: 767-73)。 但PBK/TOPK被siRNA敲低的細胞的形態變化暗示了其他參與胞質分裂的 物質的存在(圖5)。
本發明部分基於這樣一個發現，即PBK/TOPK在乳腺癌中是過表達的， 且其激酶活性在乳腺癌發生(包括乳腺癌細胞生長)中發揮重要作用。此外， PBK/TOPK作為癌症/睪丸抗原的表達圖式這一事實證明，PBK/TOPK很有 希望作為分子靶標，用於通過癌症疫苗介導的免疫療法和/或抑制 PBK/TOPK-特異性激酶功能來治療乳腺癌。因此，用PBK/TOPK激酶活性 作為 一種指標提供了開發抗癌藥的策略。
定乂
除非另有說明，本說明書中使用的詞語"一個"或"一種"或"該" 是指"至少一個"或"至少一種"。
本說明書中在乳腺癌("BC")中差異表達的基因統稱為"BC基因"、"BC 核酸"或"BC多核苷酸"，相應的編碼的多肽稱為"BC多肽"或"BC蛋白"。 BC基因選自下組J7W2、 F1574K/、屍/^2/7 fi4和屍SA/r(9屍尺基因。
明所屬技術領域的普通技術人員一般理解的含義相同。如有衝突，以本說 明書(包括定義)為準。
核茅^、,農、戎沐及涼i勿應
本發明包括人基因^7322,其含有如SEQIDNO: 79中所述的多核苷酸 序列，以及其簡併體和突變體(以它們編碼A7322蛋白為限)，包括SEQ ID NO: 80中列出的胺基酸序列或其功能等價物。與A7322功能上等價的多肽的例子 包括例如相應於人A7322蛋白的、其他生物體的同源蛋白，以及人A7322 蛋白的突變體。本發明還包括新的人基因其含有SEQIDNO: 81中所述的多 核苷酸序列，以及其簡併體和突變體(以它們編碼F3374V1蛋白為限)，包括 SEQIDNO: 82中列出的胺基酸序列或其功能等價物。與F3374V1功能上等 價的多肽的例子包括例如相應於人F3374V1蛋白的、其他生物體的同源蛋 白，以及人F3374V1蛋白的突變體。但上述突變體保留磷酸化區域，例如但 不限於F3374V1的胺基酸591-730。
人屍/^2/i^4基因的核香酸序列示於SEQ ID NO: 89，還可以得自 GenBank登錄號NM—007273.3。編碼人PHB2/REA基因的胺基酸序列示於 SEQ ID NO: 90，還可以得自GenBank登錄號NP—009204。在本發明中， PHB2/REA基因編碼的多肽稱為"PHB2/REA"，有時稱為"PHB2/REA多 肽"或"PHB2/REA蛋白"。
人爿[/i KB基因的核苷酸序列示於SEQIDNO: 87,還可以得自GenBank 登錄號NM一004217。編碼人AURKB基因的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 88。 在本發明中，AURKB基因編碼的多肽稱為"AURKB"，有時稱為"AURKB 多肽"或"AURKB蛋白"。
人屍^S7rO屍K基因的核普酸序列示於SEQ ID NO: 91，還可以得自 GenBank登錄號AF237709。在本說明書中，短語"PSX/rO屍K基因，，包括 人以及其他動物的屍SX/r(9屍《基因，所述其他動物包括但不限於非人靈長
類、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛，還包括相應於/^x/ro/^基因的等位
基因突變體及在其他動物中發現的基因。編碼人PBK/TOPK基因的胺基酸 序列示於SEQ ID NO: 92，也可獲自GenBank Accession No. AAF7152U。 在本發明中，PBK/TOPK基因所編碼的多肽被稱為"PBK/TOPK",有時稱 為"PBK/TOPK多肽"或"PBK/TOPK蛋白"。
人CDK1基因的核苷酸序列示於SEQ ID NO: 94,還可以得自GenBank 登錄號NM—001786。在本說明書中，短語"CDK1基因"包括人以及其他 動物的CDK1基因，所述其他動物包括但不限於非人靈長類、小鼠、大鼠、 狗、貓、馬和牛，還包括相應於CDK1基因的等位基因突變體及在其他動 物中發現的基因。編碼人CDK1基因的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 95, CDK1基因編碼的多肽稱為"CDK1",有時稱為"CDK1多肽，，或"CDK1 蛋白"。
人細胞周期蛋白Bl (qyc/Z"^0基因的核苷酸序列示於SEQ ID NO: 96,還可以得自GenBank登錄號NM—031966。在本說明書中，短語"細胞周期 蛋白B基因，，包括人以及其他動物的細胞周期蛋白Bl基因，所述其他動物 包括但不限於非人靈長類、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛，還包括相應於 細胞周期蛋白Bl基因的等位基因突變體及在其他動物中發現的基因。編碼 人細胞周期蛋白Bl基因的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 97。在本發明中， 細胞周期蛋白Bl基因編碼的多肽稱為"細胞周期蛋白B1"，有時稱為"細 胞周期蛋白B1多肽"或"細胞周期蛋白B1蛋白"。
人蛋白磷酸酶l-a(PPlq基因的核苷酸序列示於SEQ ID NO: 115，還可 以得自GenBank登錄號NM—002708。在本說明書中，短語"PPla基因" 包括人以及其他動物的PPla基因，所述其他動物包括但不限於非人靈長類、 小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛，還包括相應於PPla基因的等位基因突變體 及在其他動物中發現的基因。編碼人PPla基因的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 116。在本發明中，PPla基因編碼的多肽稱為"PPla",有時稱為"PPla 多肽"或"PPla蛋白"。
人p47基因的核苦酸序列示於SEQ ID NO: 117，還可以得自GenBank 登錄號NM—016143。在本說明書中，短語"p^7基因"包括人以及其他動 物的/^7基因，所述其他動物包括但不限於非人靈長類、小鼠、大鼠、狗、 貓、馬和牛，還包括相應於； 47基因的等位基因突變體及在其他動物中發 現的基因。編碼人/^/7基因的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 118。在本發明 中，p47基因編碼的多肽稱為"p47"，有時稱為"p47多肽"或"p47蛋 白，，。
人p97基因的核苦酸序列示於SEQ ID NO: 119，還可以得自GenBank 登錄號NM一007126。在本說明書中，短語"； 97基因"包括人以及其他動 物的p97基因，所述其他動物包括但不限於非人靈長類、小鼠、大鼠、狗、 貓、馬和牛，還包括相應於p97基因的等位基因突變體及在其他動物中發 現的基因。編碼人; 97基因的胺基酸序列示於SEQ ID NO: 120。在本發明 中，p"基因編碼的多肽稱為"p97",有時稱為"p97多肽"或"p97蛋白"。
與給定蛋白質功能上等價的多肽的製備方法是本領域技術人員公知 的，包括向蛋白質導入突變的公知方法。例如，本領域技術人員可以通過 定點誘變向人BC蛋白或AURKB中任一種的胺基酸序列中導入適當的突 變，從而製備出與這些蛋白功能上等價的多肽(Hashimoto-Gotoh等人，Gene
50152:271-5 (1995); Zoller and Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 (1983); Kramer等人，Nucleic Acids Res. 12:9441-9456 (1984); Kramer和Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67 (1987); Kunkel， Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92 (1985); Kunkel, Methods Enzymol 204: 125-139 (1991》。胺基酸變異也 可自然發生。本發明的多肽還包括具有一個或多個胺基酸殘基發生了突變 的人BC蛋白或AURKB的胺基酸序列的蛋白質，只要是結果獲得的突變多 肽與人BC蛋白或AURKB功能上等價。在所述突變體中發生突變的胺基酸 數目通常為10個胺基酸或以下，優選為6個胺基酸或以下，更優選為3個 胺基酸或以下。
術語"多肽"、"肽"和"蛋白(質)"在本說明書中可互換使用，是指 胺基酸殘基的多聚體。這些術語適用於這樣的胺基酸多聚體，其中一個或 多個胺基酸殘基是相應的天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，還適用於 天然存在的胺基酸多聚體、含有修飾殘基的胺基酸多聚體，以及非天然存 在的胺基酸多聚體。
術語"胺基酸，，指的是天然存在及合成的胺基酸，以及功能類似於天 然存在的胺基酸的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由 遺傳密碼編碼的那些，以及後來被修飾的胺基酸，例如羥脯氨酸 (hydroxyproline) 、 y羧基穀氨酸Cy-carboxyglutamate)和 O畫石粦酸絲氨酸 (O-phosphoserine)。胺基酸類似物指的是具有與天然存在的胺基酸相同的基 本化學結構(例如與氫、羧基、氨基和R基結合的a碳)的化合物，例如高絲 氨酸(homoserine)、 正亮氨酸(norleucine)、 曱石克氨酸亞諷(methionine sulfoxide)、曱碌^氨酸曱基4危(methionine methyl sulfonium)。所述類似物可以 具有修飾的R基(例如正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但仍保留與天然存在的氨 基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物指的是具有與胺基酸的 一般化學 結構不同的結構、但功能類似於天然存在的胺基酸的化合物。
在本說明書中胺基酸可用其通常公知的3個字母符號表示，或用 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (國際理論和應用化學聯 合會-國際生物化學聯合會生物化學命名委員會)推薦的單字母符號表示。同 樣，核苷酸也可以用其通常公認的單字母代碼表示。
除非另有具體說明，術語"基因"、"多核苷酸"、"寡核苷酸"、 "核苷酸，，和"核酸，，在本說明書中可互換使用，類似於用其通常公認的單字母代碼表示胺基酸。所述術語適用於這樣的核酸(核苷酸)多聚物，其中一個或多個核酸通過酯鍵連接。多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸或核酸可以
由DNA、 RNA或其組合物組成。
本說明書中使用的術語"雙鏈分子，，指的是抑制靶基因表達的核酸分子，包括例如短幹擾RNA (siRNA:例如雙鏈核糖核酸(dsRNA)或小髮夾狀RNA(small hairpin RNA, shRNA))和短幹擾DNA/RNA (siD/R-NA:例如DNA和RNA的雙鏈嵌合體(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小髮夾狀嵌合體(shD/R-NA》。
在本發明中，術語"功能上等價"是指對象多肽具有類似於BC蛋白的促進細胞增殖活性及賦予癌細胞致癌活性的活性。用於測定所述活性的試驗是本領域公知的。例如，將編碼對象多肽的DNA導入表達對象多肽的細胞，然後檢測細胞增殖的促進作用或集落形成活性的提高，可以判斷該多肽是否具有細胞增殖活性。這樣的細胞包括例如COS7和NIH3T3細胞。
在本發明的某些實施方案中，A7332的功能等價物中的Sec7區域是保守的，以維持A7332多肽的生物活性。A7332多肽的Sec7區域對應於SEQID NO: 80的胺基酸序列的位點139 (Ala)至209 (Val),由SEQ ID NO: 79的核苷酸序列的密碼子586和798編碼。在本發明中，A7332或F3374V1多肽的生物活性包括細胞增殖活性。因此，本發明的功能等價物具有細胞增殖活性。
在本發明的某些實施方案中，A7322多肽中還包括功能等價物。此處，蛋白質的"功能等價物"是具有生物活性，特別是具有與PHB2/REA的結合活性及具有PHB2/REA蛋白的核轉運活性的多肽。即，任何保留A7322蛋白的PHB2/REA結合域的多肽都可以用作本發明中的所述功能等價物。所述功能等價物包括那些其中在A7322蛋白天然存在的胺基酸序列中取代、缺失、添加或插入一個或幾個胺基酸的。
另外，PHB2/REA多肽中也包括功能等價物。此處，蛋白質的"功能等價物"是具有與所述蛋白質等價的生物活性，特別是A7322結合活性的多肽。即，任何保留PHB2/REA蛋白的A7322結合域的多肽都可以用作本發明中的所述功能等價物。所述功能等價物包括那些其中在PHB2/REA蛋白天然存在的胺基酸序列中取代、缺失、添加或插入一個或幾個胺基酸的。
在本發明優選的實施方案中，F3374V1多肽中也包括功能等價物。此處，蛋白質的"功能等價物"是具有生物活性，特別是與AURKB的結合活性，並被AURKB磷酸化的多肽。即，任何保留F3374V1蛋白的結合域和磷酸化位點的多肽都可以用作本發明中的所述功能等價物。所述功能等價物包括那些其中在F3374V1蛋白天然存在的胺基酸序列中取代、缺失、添加或插入一個或幾個胺基酸的。
另外，AURKB多肽中也包括功能等價物。此處，蛋白質的"功能等價物"是具有與蛋白質等價的生物活性，特別是針對F3374V1的結合和磷酸化活性的多肽。即，任何保留AURKB蛋白的針對F3374V1的結合和磷酸化活性的多肽都可以用作本發明中的所述功能等價物。所述功能等fN勿包括那些其中在AURKB蛋白天然存在的胺基酸序列中取代、缺失、添加或插入一個或多個胺基酸的。
在本發明優選的實施方案中，PBK/TOPK多肽也包括功能等價物。此處，蛋白質的"功能等價物，，是具有與蛋白質等價的生物活性，特別是磷酸化活性的多肽。即，任何保留PBK/TOPK蛋白的磷酸化活性的多肽都可以用作本發明中的所述功能等價物。所述功能等價物包括那些其中在PBK/TOPK蛋白天然存在的胺基酸序列中取代、缺失、添加或插入一個或多個胺基酸的。
已知經突變的蛋白或修飾的蛋白保留原來的生物活性，其中所述蛋白具有通過在特定胺基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一個或多個胺基酸殘基而被修飾的胺基酸序列(Mark等人，Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6 (1984); Zoller和Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982);Dalbadie-McFarland等人，Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982))。
優選將待突變的胺基酸殘基突變為保留胺基酸側鏈性質的其他胺基酸(該過程即公知的保守胺基酸取代)。胺基酸側鏈性質的例子包括疏水胺基酸(A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水胺基酸(R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、H、 K、 S、 T)以及具有以下共有官能團或特性的側鏈脂肪族側《連(G、 A、V、 L、 I、 P);含羥基側鏈(S、 T、 Y);含好u原子側鏈(C、 M);含羧酸和醯胺側鏈(D、 N、 E、 Q);含鹼(base)側鏈(R、 K、 H)和含芳香族側鏈(H、 F、 Y、W)。需說明的是括號中的字母表示胺基酸的單字母符號。
給出功能上類似的胺基酸的保守取代表是本領域公知的。除了這種保守性修飾的變異體之外，還包括且不排除本發明的多態變異體、種間同系
53物和等位體(allele)。例如，以下8組分別包含彼此構成保守取代的胺基酸
1) 丙氨酸(A)、甘氨酸(G);
2) 天冬氨酸(D)、穀氨酸(E);
3) 天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q);
4) 精氨酸(R)、賴氨酸(K);
5) 異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);
6) 苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
7) 絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);及
8) 半胱氨酸(C)、曱硫氨酸(M)(參見例如Creighton, Proteins (1984))。 在本發明的BC蛋白和AURKB蛋白中包括這樣的保守修飾的多肽。但
本發明並不限於此，BC蛋白和AURKB蛋白還包括非保守性修飾，只要它 們保留BC蛋白和AURKB的磷酸化活性。在所述經修飾的蛋白中待突變的 胺基酸數目通常為IO個胺基酸或以下，優選為6個胺基酸或以下，更優選 為3個胺基酸或以下。
在人BC蛋白或AURKB蛋白的胺基酸序列中添加一個或多個胺基酸殘 基而成的多肽的例子是含有人BC蛋白或AURKB蛋白的融合蛋白。本發明 包括人BC蛋白或AURKB蛋白與其他肽或蛋白質的融合物即融合蛋白。通 過本領域技術人員公知的技術即可製備融合蛋白，例如通過將編碼本發明 的人BC蛋白或AURKB蛋白的DNA與編碼其他肽或蛋白的DNA連接， 使得讀碼框一致，然後將融合DNA插入表達載體並在宿主中表達所述融合 DNA。對於與本發明的蛋白融合的肽或蛋白沒有限制。
可以用作與本發明蛋白融合的肽的已知肽包括例如FLAG (Hopp等人, Biotechnology 6: 1204-10 (1988))、含有6個His (組氨酸)殘基的6xHis、 10xHis、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、pl8HIV 片段、T7-標籤、HSV-標籤、E-標籤、SV40T抗原片段、lck標籤、(3-微管 蛋白片段、B-標籤、蛋白C片段等。可以與本發明的蛋白融合的蛋白的例 子包括GST (穀胱甘肽-S-轉移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恆定 區、p-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖-結合蛋白)等。
通過將編碼上述融合肽或蛋白的可商購的DNA與編碼本發明的多肽的 DNA融合，並表達所製備的融合DNA，即可製備出融合蛋白。
本領域公知的分離功能上等價的多肽的可選方法為例如使用雜交技術的方法(Sambrook等人，Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58， Cold Spring Harbor Lab. Press (1989))。本領域技術人員能夠容易地分離出與編碼人BC 蛋白或AURKB蛋白的DNA序列(即SEQIDNO: 80、 82、 90、 92或88)的 全部或部分具有高度同源性的DNA，並且由該分離的DNA分離與人BC蛋 白或AURKB蛋白功能上等價的多肽。本發明的多肽包括由與編碼人BC蛋 白或AURKB蛋白的DNA序列的全部或部分雜交的DNA編碼的、功能上 等價於人BC蛋白或AURKB蛋白的多肽。這些多肽包括對應於人源蛋白的 哺乳動物同系物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因編碼的多肽)。例如，在從動 物中分離與編碼人A7322蛋白的DNA高度同源的cDNA時，特別優選使用 來自睪丸或乳腺癌細胞系的組織。或者，在從動物中分離與編碼人F3374V1 蛋白的DNA高度同源的cDNA時，特別優選使用來自乳腺癌細胞系的組織。
本領域技術人員可以按常規選擇用於分離編碼與人BC蛋白或AURKB 蛋白功能上等價的蛋白的DNA的雜交條件。短語"嚴緊(雜交)條件"指的 是在此條件下核酸分子會與其靶標序列雜交，通常在核酸的複雜混合物中， 但檢測不到與其他序列雜交。嚴緊條件是依賴序列的，在不同環境下會不 同。比較長的序列在較高的溫度特異性雜交。對核酸雜交的全面指導可在 Tijssen, rec/z"^^es5/oc/7em/W/17 aw^n.<i/za"o" vVwc/e/c /V06ey， "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacidassays"(1993)中找到。通常，對於確定的離子強度pH下的特異 性序列嚴緊條件選擇為比熱解鏈溫度(Tm)低約5-10。C。 Tm是50。/。同靶點互 補的探針與處於平衡狀態(由於靶標序列過量存在，在Tm， 50%的探針被佔 據)的靶標序列雜交的溫度(在確定的離子強度、pH和核酸濃度下)。還可以 通過加入去穩定劑(例如曱醯胺)達到嚴緊條件。對於選擇性或特異性雜交， 陽性信號為背景的至少兩倍，優選為背景雜交的10倍。
例如雜交可通過如下方式進行使用"Rapid-hyb緩衝液"(Amersham LIFE SCIENCE)於68。C進行預雜交30分鐘或更長時間，加入標記的探針， 並在68。C保溫1小時或更長時間。其後的洗滌步驟，例如可以在低度嚴緊 條件下進行。低度嚴緊條件為例如42。C、 2xSSC、 0.1°/。SDS,或優選50°C 、 2xSSC、 0.1%SDS。更優選使用高嚴緊條件。高嚴緊條件的例子包括，室溫 下用2xSSC、 0.01%SDS洗滌3次，每次20分鐘，然後於37。C用lxSSC、 0.1。/。SDS洗滌3次，每次20分鐘，再於50。C用lxSSC、 0.1。/。SDS洗滌2次，每次20分鐘。然而，幾種因素，如溫度和鹽濃度會影響雜交的嚴緊度， 本領域技術人員可適當選擇這些因素以獲得所需的嚴緊度。
可以採用基因擴增法，例如聚合酶鏈反應(PCR)法代替雜交來分離編碼 與人BC蛋白或AURKB蛋白功能上等價的多肽的DNA,所述基因擴增法 使用基於編碼所述蛋白的DNA的序列信息(SEQIDNO:79、 81、 89、 91或 87)合成的引物。
由通過上述雜交技術或基因擴增技術分離的DNA編碼的、與人BC蛋 白或AURKB蛋白功能上等價的多肽一般與所述人BC蛋白或AURKB蛋白 的胺基酸序列具有高度同源性。"高度同源性"或"高度序列同一性"可互換 使用，是指同源性(序列同一性)為40%或更高，優選為60%或更高，更優選 為80%或更高，更優選為95%或更高。多肽的同源性可例如通過"Wilburand Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)"中的算法測定。本說明書 中描述了適用於測定序列同 一性百分比的算法的其它實例。
本發明的多肽可能在胺基酸序列、分子量、等電點、存在或不存在糖 鏈或形式等方面有差異，這取決於用於產生所述多肽的細胞或宿主或者採 用的純化方法。無論如何，只要該多肽具有等價於本發明的人BC蛋白或 AURKB蛋白的功能，就落入本發明的範圍。
本發明還包括應用BC蛋白或AURKB蛋白的部分肽。部分肽具有BC 或AURKB的蛋白特有的胺基酸序列，並由少於約400個、通常少於約200 個、經常少於約100個，且至少約7個，優選約8個或更多，更優選約9 個或更多胺基酸組成。通過基因工程、已知的肽合成法、或用適當的肽酶 消化本發明的多肽，均可以產生本發明的部分肽。例如肽合成可以採用固 相合成或液相合成。
本發明的一種用於篩選的部分肽適當地包含至少PHB2/REA結合位點 或A7322蛋白核轉運活性的活性中心。短語A7322蛋白的"功能等價物" 也包括所述部分肽。
本發明的一種用於篩選的部分肽適當地包含至少PHB2/REA蛋白的 A7322結合位點。短語PHB2/REA蛋白的"功能等價物，，也包括這樣的部 分肽。
本發明的一種用於篩選的部分肽適當地包含至少F3374V1蛋白的 AURKB結合位點或F3374V1蛋白被AURKB蛋白磷酸化的位點(SEQ IDNO: 88的胺基酸591-730)。短語F3374V1蛋白的"功能等價物，，也包括這 樣的部分肽。
本發明的一種用於篩選的部分肽適當地包含至少AURKB蛋白的 F3374V1蛋白結合位點或AURKB蛋白的催化域。短語PBK/TOPK蛋白的 "功能等價物"也包括這樣的部分肽。
用於本發明的使用PBK/TOPK的激酶活性水平作為指標的篩選的部分 肽適當地包含至少激酶域(SEQ ID NO: 92的胺基酸32-318)，特別是保留 PBK/TOPK蛋白的催化位點(SEQ ID NO: 92的Lys64和Lys65)。短語 PBK/TOPK蛋白的"功能等價物"也包括這樣的部分肽。此外，用於本發 明的使用PBK/TOPK的磷酸化水平作為指標的篩選的部分肽適當地包含至 少PBK/TOPK蛋白的磷酸化位點(SEQ ID NO: 92的Thr9)。短語PBK/TOPK 蛋白的"功能等價物"也包括這樣的部分肽。
通過基因工程、已知的肽合成法或用適當的肽酶消化天然的BC蛋白， 均可以產生所述部分肽。例如，肽合成可以採取固相合成或液相合成。可 用於合成的常規肽合成法包括
1) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
2) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
3) Peptide Synthesis (日語)，Mamzen Co., 1975;
4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日語),Maruzen Co,， 1985;
5) Development of Pharmaceuticals (第二巻)(曰語)，Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;
6) W099/67288;和
7) Barany G. & Merrifield R.B.， Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。
可進一步將多肽或其片段與其他物質連接，只要多肽和片段保留其最 初對生物活性的能力，例如磷酸化某種物質或被激酶磷酸化。可用的物質 包括肽、脂質、糖和糖鏈、乙醯基、天然和合成的多聚物等。可以進行 這些種類的修飾以賦予額外的功能或穩定多肽和片段。
可用本領域技術人員公知的方法，以重組蛋白或天然蛋白的形式製備 本發明的多肽。當提到例如細胞、核酸、蛋白或載體時，使用術語"重組" 表示所述細胞、核酸、蛋白或載體已經通過導入異源核酸或蛋白、或者改造天然核酸或蛋白而被修飾，或者表示所述細胞源自如此修飾的細胞。因 此，例如重組細胞表達在該細胞的天然(非重組)形式中沒有發現的基因，或 表達原本異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。
本說明書中的術語"重組核酸"指的是， 一般通過對核酸加以操作(例 如使用聚合酶和內切核酸酶)、以非在自然界正常發現的形式在體外最初形 成的核酸。用這種方式，可實現將不同序列可操作連接。因此，以線性形
式分離的核酸，或通過在體外將正常情況下不連接的DNA分子加以連接而 形成的表達載體，都被認為是本發明的重組體。應理解， 一旦製得重組核 酸並將其再插入宿主細胞或生物體，其將非重組地進行複製，即，用宿主 細胞的體內細胞機制而非通過體外操作進行複製；但所述核酸一旦重組產 生，即使隨後進行非重組複製，就本發明的目的而言也仍認為其是重組的。
同樣地，"重組蛋白"是使用重組技術製得的蛋白，即通過表達如上 所述的重組核酸而製得的蛋白。因此，可通過下述方法製備重組蛋白將 編碼本發明多肽的DNA (例如含有SEQ ID NO: 79、 81 、 89、 91或87的核 苷酸序列的DNA)插入適當的表達載體，將載體導入適當的宿主細胞，獲得 提取物，然後對提取物進行層析以純化多肽，所述層析例如離子交換層析、 反相層析、凝膠過濾或利用固定了針對本發明蛋白的抗體的層析柱的親和 層析，或上述多於一種柱子的組合。
此外，當在宿主細胞(例如動物細胞和大腸桿菌)中將本發明的多肽表達 成與穀胱甘肽S-轉移酶蛋白的融合蛋白或添加多個組氨酸的重組蛋白時， 可以使用穀胱甘肽柱或鎳柱來純化所表達的重組蛋白。或者，當將本發明 的多肽表達成用c-myc、多個組氨酸或FLAG標籤的蛋白時，可分別使用針 對c-myc、 His或FLAG的抗體進行檢測和純化。
純化融合蛋白之後，根據需要也可能通過用凝血酶(thrombin)或因子X a 切割融合蛋白來除去目的多肽之外的區域。
可以採用本領域技術人員公知的方法分離出天然蛋白，例如使結合有 可與下述的BC蛋白結合的抗體的親和柱與表達本發明多肽的組織或細胞 的提取物接觸。所述抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
此外，本發明提供編碼本發明的多肽的多核苷酸。本發明的多核苷酸 可以用於體內或體外產生上述本發明的多肽。可以使用本發明多核苷酸的 任何形式，包括mRNA、 RNA、 cDNA、基因組DNA、化學合成的多核苷酸，只要其編碼本發明的多肽。本發明的多核苷酸包括含有給定核苷酸序
列及其簡併序列的DNA,只要所得的DNA編碼本發明的多肽。
可以採用本領域技術人員公知的方法製備本發明的多核苷酸。例如， 本發明的多核苷酸可來自表達本發明多肽的細胞的cDNA文庫，通過用本 發明的DNA(例如SEQIDNO:79、 81、 89、 91或87)的部分序列作為探針 進行雜交。cDNA文庫可以採用例如Sambrook等人，Molecular Cloning, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)中所述的方法製備；或者 可以使用可商購的cDNA文庫。還可以採用下述方法製備cDNA文庫從 表達本發明多肽的細胞中提取RNA,基於本發明DNA的序歹'J(例如SEQID NO: 79、 81、 89、 91或87)合成寡聚DNA,以寡聚DNA為引物進行PCR， 擴增編碼本發明的蛋白的cDNA。
另夕卜，通過對所得cDNA的核苷酸進行測序，可以常規地確定由cDNA 編碼的翻譯區，這樣就可以容易地獲得本發明多肽的胺基酸序列。而且， 通過以所得cDNA或其部分作為探針篩選基因組DNA文庫，可以分離出基 因組DNA。
更具體地，可以首先從表達本發明的對象多肽的細胞、組織、器官(例 如用於473"的腦或乳腺癌細胞系；用於F3374W的睪丸或乳腺癌細胞系； 用於PHB2/REA的乳腺癌細胞系；以及用於i^^T(9i^:的睪丸或乳腺癌細 胞系)中製備mRNA。可以採用公知的方法分離mRNA;例如，總RNA的 製備可以採用胍超離心法(Chirgwin等人，Biochemistry 18:5294-9 (1979))或 AGPC法(Chomczynski和Sacchi， Anal Biochem 162:156-9 (1987))。另外，可 以使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等由總RNA純化mRNA，或者，可以 使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接純化mRNA。
使用逆轉錄酶用獲得的mRNA來合成cDNA。可以-使用可商購的試劑 盒，如AMV逆轉錄酶cDNA第一鏈合成試劑盒(Seikagaku Kogyo)合成 cDNA。或者，可以使用本說明書所述引物等、5，-Ampli FINDER RACE試 劑盒(Clontech)和聚合酶鏈式反應(PCR),採用5，-RACE法(Frohman等人， Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002 (1988); Belyavsky等人，Nucleic Acids Res 17: 2919-32 (1989))合成和擴增cDNA。
由PCR產物製備所需DNA片段，並與載體DNA連接。使用重組載體 轉化大腸桿菌等，由選出的菌落製備所需的重組載體。可採用常規方法，
59如雙脫氧核苷酸鏈終止法驗證所需DNA的核苷酸序列。
考慮待用表達宿主中密碼子使用的頻率，可以將本發明多核苷酸的核
苷酸序列設計成能夠更有效地表達的形式(Grantham等人，Nucleic Acids Res 9:43-74(1981))。另外，可以使用可商購的試劑盒或常規方法改變本發明的 多核苦酸的序列。例如，可以通過用限制性酶消化、插入合成的寡核苷酸 或適當的多核普酸片段、添加接頭或插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼 子(TAA 、 TGA或TAG)的方式改變序列。
在一個特別優選的實施方案中，本發明的多核苷酸包括含有SEQ ID NO: 79、 81、 89、 91或87所示核苷酸序列的DNA。
此外，本發明提供在嚴緊條件下與具有SEQ ID NO: 79、 81、 89、 91 或87所示核苷酸序列的多核苷酸雜交、並且編碼與上述的本發明BC蛋白 或AURKB蛋白功能上等價的多肽的多核苷酸。如上所述，本領域技術人 員可以適當地選擇嚴緊條件。例如，可以採用低嚴緊條件。優選採用高嚴 緊條件。這些條件如上所述。上述的雜交DNA優選為cDNA或染色體DNA。
本發明還提供了載體，其中插入了本發明的多核苷酸。本發明的載體 可以用於在宿主細胞中維持本發明的多核苷酸，尤其是DNA,以表達本發
明的多肽。
當宿主細胞選為大腸桿菌，並且在大腸桿菌(如JM109、 DH5a、 HB101 或XLlBlue)中大量擴增和製備載體時，載體應具有用於在大腸桿菌中擴增 的"ori"和用於選擇轉化大腸桿菌的標記基因(例如通過藥物，如氨苄西林、 四環素、卡那黴素、氯黴素等選擇的藥物抗性基因)。例如，可以使用M13 系列載體、pUC系列載體、pBR322、 pBluescript、 pCR-Script等。另外，與 上述載體相同，pGEM-T、pDIRECT和pT7也可以用於亞克隆和提取cDNA。 當使用載體製備本發明的蛋白時，表達載體是特別有用的。
例如，在大腸桿菌中表達的表達載體須具備上述特徵，以便在大腸杆 菌中擴增。當將大腸桿菌，如JM109、 DH5a、 HB101或XLlBlue用作宿主 細胞時，載體應具有能夠在大腸桿菌中有效表達所需基因的啟動子，例如 lacZ啟動子(Ward等人，Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992))、 araB啟動子(Better等人，Science 240: 1041-3 (1988))、或T7啟動子等。在這 方面，可以使用例如pGEX-5X畫1 (Pharmacia) 、 "QIAexpress系統，，(Qiagen)、 pEGFP和pET (此時，宿主優選為表達T7 RNA聚合酶的BL21)來替代上述載體。另外，載體也可以含有用於多肽分泌的信號序列。指導多肽分泌至
大腸桿菌周質的例示性信號序列為pe舊信號序列(Lei等人，J Bacteriol 169: 4379-83 (1987))。將載體導入靶宿主細胞的方法包括例如氯化鈣法和電穿孔法。
除大腸桿菌外，可以使用下述載體製備本發明多肽例如源自哺乳動 物細胞的表達載體(例如pcDNA3 (Invitrogen)和pEGF-BOS (Mizushima S., Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990))、 pEF、 pCDM8)，源自昆蟲細月包的表 達載體(例如"Bac-to-BAC杆狀病毒表達系統，，(GIBCO BRL)、 pBacPAK8), 源自植物的表達載體(例如pMHl 、 pMH2)，源自動物病毒的表達載體(例如 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)，源自逆轉錄病毒的表達載體(例如pZIpneo)，源 自酵母的表達載體(例如"畢赤酵母(Pichia)表達試劑盒"(Invitrogen)、 pNVl 1 、 SP-Q01)以及源自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的表達載體(例如pPL608、 pKTH50)。
為了在動物細胞，如CHO、 COS或NIH3T3細胞中表達載體，載體應 具有在所述細胞中進行表達所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulligan 等人，Nature 277: 108-14 (1979))、 MMLV-LTR啟動子、EFlot啟動子 (Mizushima等人，Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990))、 CMV啟動子等，並優 選具有用於選擇轉化子的標記基因(例如通過藥物(例如新黴素、G418)進行 選"^的藥物抗性基因)。具有這些特徵的已知載體的例子包括例如pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK-CMV、 pOPRSV和pOP13。
另外，可以採用這樣的方法，在穩定地表達基因的同時，擴增細胞中 該基因的拷貝數。例如，可以將含有互補性(complementary) DHFR基因的載 體(例如pCHOI)導入核酸合成途徑缺失的CHO細胞，然後利用曱氨蝶呤 (MTX)擴增該載體。此外，當瞬時表達基因時，可以採用如下方法用含有 SV40複製起點的載體(pcD等)轉化染色體上含有SV40 T抗原表達基因的 COS細胞。
按上述方法獲得的本發明多肽可自宿主細胞的內部或外部(如培養基) 分離，並純化成基本上純的均質多肽。術語"基本上純的"在本說明書中 用來指給定多肽時，是指該多肽基本上不含有其他生物大分子。基本上純
的多肽以乾重表示為至少75%(例如至少80%、 85%、 95%或99%)純。可採 用任何適當的標準方法來測定純度，所述方法例如柱層析、聚丙烯醯胺凝膠電泳或HPLC分析。多肽的分離和純化方法並不局限於任何特定的方法，
實際上可以釆用任何標準方法。
例如，可以適當選擇和組合柱層析、過濾、超濾、鹽析、溶劑沉澱、
溶劑提取、蒸餾、免疫沉澱、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳、透 析和重結晶等方法，進行多肽的分離與純化。
層析的例子包括例如親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、 反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))。這些層析可通過液相色譜，例如HPLC和FPLC 來進行。因此，本發明提供通過上述方法製備的高純度多肽。
在本發明上下文中，"序列同一性百分比"是在對比窗口 (comparison window)中比較兩個最佳比對的序列而確定的，其中多核苷酸序列在對比窗 口中的部分與不含有添加或缺失的參照序列(例如本發明的多肽)相比，可以 含有添加或缺失(即缺口)，以便對兩種序列進行最佳比對。百分比通過如下 方法計算測定在兩個序列中出現的相同核酸鹼基或胺基酸殘基的位置的 數目，得到匹配的位置數，用匹配的位置數除以對比窗口中總位置數，將 結果乘以100，就得到了序列同一性百分比。
術語"相同，，或百分比"同一性，，，在兩個或多個核酸序列或多肽序 列的語境下，指的是兩個或多個相同的序列或子序列。兩個序列如滿足下 列條件則為"實質相同"使用以下任一種序列比較算法或通過手工比對 和目測觀察確定，在對比窗口或在指定區域內比較和比對兩個序列以得到 最大的對應關係時，兩個序列具有指定百分比的相同胺基酸殘基或核苷酸 (即，在指定區域內，或當未指定的情況下，在整個序列範圍內，有60%同 一性，任選為65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%同一性)。任選地， 所述同一性存在於長度至少約50個核苷酸的區域內，或更優選長度100-500 或1000或更多個核苷酸的區域內，或全長胺基酸或核酸序列內。
對於序列比較，通常將一個序列作為參照序列，用測試序列與其比較。 使用序列比較算法時，將測試序列和參照序列輸入計算機，需要時設定子 序列坐標，並設定序列算法程序參數。可以使用默認的程序參數，或者可 另外設定參數。然後序列比較算法根據程序參數計算測試序列相對於參照 序列的序列同一性百分比。
62本說明書中使用的"對比窗口 (comparison window)"可以指這樣的區段， 其具有選自下組中任一數目的連續位置20-600、通常約50-200，更通常約 100-150，將一個序列與具有相同數目連續位置的參照序列形成最佳比對後， 可以在該區段中將這兩個序列進行比較。用於比較的序列比對方法是本領 域公知的。用於比較的序列最佳比對可以用以下方法進行，例如Smith和 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-9的局部同源性算法、Needleman和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-53的同源性比對算法、Pearson和Lipman (1988) Proc. Nat，l. Acad. Sci. USA 85:2444-8的相似性檢索法、這些算法的計 算機實現(GAP， BESTFIT, FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package中,Genetics Computer Group, 575 Science Dr.， Madison, WI)、或手工比對和目測觀察(參見例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement))。
兩例適用於測定百分比序列同一性和序列相似性的算法是BLAST和 BLAST 2.0算法，它們分別記載於Altschul等人(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-402和Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10。進行BLAST分 析的軟體可通過National Center for Biotechnology Information公開得到。該 算法包括，首先通過在查詢序列(query s叫uence)中識別長度為W的短字從 而確定高分值序列對(HSP)，當其與資料庫序列中相同字長的字進行比對 時，或者匹配或者符合某正值閾值T。 T被稱為是相鄰字分數闞值(Altschul 等人，同上)。用這些最初的相鄰命中字(wordhits)作為種子開始檢索，以尋 找包含它們的更長的HSP。命中字在每一個序列中沿兩個方向延伸，只要 累積的比對分值可以增加。累積分值的計算對於核苷酸序列而言使用參數 M (匹配殘基的獎分值;總是> 0)和N (錯配殘基的罰分值；總是< 0)。對於氨 基酸序列，使用分值矩陣來計算累積分值。命中字在每一個方向的延伸在 以下情況下停止累積比對分值從其已獲得的最大值下降達到量X;由於 一個或多個負分殘基比對的累積，使得累積分值為0或更低；或達到任一 個序列的末端。BLAST算法參數W、 T和X決定了比對的敏感度和速度。 BLASTN程序(用於核苷酸序列)設置為默認值字長(W)-ll、期望值 (expectation, E)=10、 M=5、 N=4，並且比較兩條鏈。對於胺基酸序列，BLASTP 程序設置為默認值字長=3、期望值(E"IO、 BLOSUM62分值矩陣(參見 Henikoff和Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)比對(B)二50、期望值(E)-IO、 M=5、 N=-4,並且比較兩條鏈。
Karlin和Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7)。 BLAST算法 提供的一種相似性量度是最小合計概率(smallest sum probability, (P(N))),它 提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如，在 比較測試核酸與參照核酸時，如果最小合計概率是小於約0.2、更優選小於 約O.Ol、最優選小於約0.001，則認為所述核酸與參照序列相似。
可任選地通過在純化前或純化後用適當的蛋白修飾酶處理本發明多肽 來對其進行修飾或部分缺失。有用的蛋白修飾酶包括但不限於胰蛋白酶 (trypsin)、月夷〗疑乳蛋白酶(chymotrypsin)、賴氨醯內肽酶(lysylendopeptidase)、 蛋白激酶(protein kinase)、 葡糖香酶(glucosidase)等。 抗體和非抗體結合蛋白
本發明還提供與本發明多肽特異性結合的抗體和非抗體結合蛋白。本 發明的抗體和非抗體結合蛋白可以作為任意形式，包括單克隆或多克隆抗 體使用，並包括用本發明的多肽免疫動物如兔獲得的抗血清、所有種類的 多克隆抗體和單克隆抗體，人抗體和通過基因重組製備的人源化抗體。
在抗體或非抗體結合蛋白的上下文中出現的"與……特異性結合"或 "特異性結合於……，，或"附接了(attached)"或"附接有(attaching)"這些 術語是指作用劑或配體在整體或部分上與目標表位(例如A7322、 F3374 或PBK/TOPK)的優先結合，所述作用劑或配體結合細胞或組織之中或之上 表達的A7322、 F3374或PBK/TOPK，或者與另 一種作用劑或配體竟爭結合 細胞或組織之中或之上表達的A7322、 F3374或PBK/TOPK。當然，公認在 抗體和非目標表位之間可能發生某種程度的非特異性相互作用。儘管如此， 特異性結合仍然可以與之區別，因其是通過對目標表位的特異性識別來介 導的。特異性結合通常導致被遞送的分子和帶有目標表位的實體(例如，測 試孔或細胞)之間的結合大大強於已結合的抗體和缺乏所述目標表位的實體 (例如，測試孔或細胞)之間的結合。特異性結合通常導致與缺乏目標表位的 細胞或組織相比，與含有目標表位(即REG4)的細胞和組織結合的作用物或 配體的量(每單位時間)超過本底增加至少約2倍，優選大於約10倍，並且 最優選大於約100倍的增加。兩個實體之間的特異性結合通常意味著至少 1(^M"的親和力。大於1SM"或更高的親和力是優選的。可以測定核酸以及蛋白質作用劑以及配體的特異性結合。對於核酸作用劑可以使用本領域
已知的任何測定法來測定特異性結合，包括但不限於Northern印跡、凝膠 移位測定法和原位雜交。對於蛋白質作用劑和配體可以使用本領域已知的 任何結合測定法來測定特異性結合，包括但不限於凝膠電泳、Western印跡、 ELISA、流式細胞術和免疫組織化學。 抗體
本說明書中使用的術語"抗體"包括天然抗體和非天然抗體，包括例 如單鏈抗體、嵌合抗體、雙功能抗體和人源化抗體以及它們的抗原結合片 段(例如Fab'， F(ab')2， Fab， Fv和rlgG)。也可以參考Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co" Rockford, IL)。還可以參考例如 Kuby， J" Immunology, 3rd Ed" W.H. Freeman & Co" New York (1998)。這樣的 非天然抗體可以通過固相肽合成來構建，也可以通過重組產生，或者還可 以如Huse等人，Science 246:1275-81 (1989)(通過提述併入本說明書)所描述 的那樣，通過對由可變輕鏈和可變重鏈組成的組合文庫進行篩選來獲得。 例如，製備嵌合抗體、人源化抗體、CDR移植抗體、單鏈抗體和雙功能抗 體的上述方法和其它方法是本領域技術人員公知的(參見分別通過提述併入 本說明書的Winter和Harris, Immunol. Today 14:243-6 (1993); Ward等人, Nature 341:544-6 (1989); Harlow和Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988; Hilyard等人，Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrebaeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995》。
術語"抗體，，包括多克隆抗體和單克隆抗體這兩者。該術語還包括遺 傳工程化的形式，如嵌合抗體(例如人源化小鼠抗體)和異源綴合 (heteroconjugate)抗體(例如雙功能抗體)等。該術語還指重組單鏈Fv片段 (scFv)。術語"抗體，，還包括二價或雙特異性分子、雙抗體、三抗體(triabodies) 和四抗體(tetrabodies)。 二價和雙特異性分子在例如以下文獻中有所描述 Kostelny等人(1992) J Immunol 148:1547-53; Pack和Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579-84; Holliger等人(1993) Proc Natl Acad Sci USA. 90:6444-8; Gruber等人(1994) J Immunol :5368-74; Zhu等人(1997) Protein Sci 6:781-8; Hu等人(1997) Cancer Res, 56:3055-61; Adams等人(1993) Cancer Res. 53:4026;以及McCartney,等人(1995) Protein Eng. 8:301-14。
65典型地，抗體具有重鏈和輕鏈。重鏈和輕鏈分別包含恆定區和可變區(這
些"區"也稱為"域")。重鏈和輕鏈可變區包含4個"框架區"，它們被3 個超可變區(又稱為"互補決定區"或"CDR")所隔開。框架區和CDR的 範圍已被確定。不同輕鏈或重鏈的框架區的序列在一個物種內是相對保守 的。抗體的框架區，即組成抗體的輕鏈和重鏈的框架區的組合，幫助CDR 在三維空間中的定位和排列。
CDR主要起結合到抗原表位的作用。各鏈的CDR —般從N末端起按 順序編號依次稱為CDR1、 CDR2和CDR3，而且一般通過特定CDR所在的 鏈來識別。因此，VHCDR3位於其存在的抗體的重鏈的可變域，而VLCDR1 是其所在的抗體的輕鏈的可變區的CDR1。
作為抗原使用以獲得抗體的本發明多肽，可源自任何動物物種，但優 選源自哺乳動物，如人、小鼠或大鼠，更優選源自人。人源多肽可以由本 發明公開的核普酸或胺基酸序列獲取。
根據本發明，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白，或者是蛋白的 部分肽。部分肽可以包含例如本發明多肽的氨基(N)末端片段或羧基(C) 末端片段。
可將編碼本發明多肽或其片段的基因插入已知的表達載體，然後用該 載體轉化如本說明書所述的宿主細胞。可通過任意標準方法從宿主細胞內 或細胞外回收所需多肽或其片段，然後可將其用作抗原。此外，表達多肽 的全細胞或其裂解物，或者化學合成的多肽均可用作抗原。
可以用抗原免疫任意哺乳動物，但優選考慮與用於細胞融合的親本細 胞的相容性。通常使用齧齒目(Rodentia),兔形目(Lagomorpha)或靈長類 (Primates)動物。齧齒目動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠(hamster)。兔形目動 物包括例如家兔。靈長目動物包括例如狹鼻猿(Catarrhini)(東半球猴(old world monkey))^口食蟹浙美(Macaca fascicularis)、恆河豸吳(rhesus monkey) 、 3弗3弗 (sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。
用抗原免疫動物的方法是本領域中已知的。例如腹腔注射或皮下注射 抗原是免疫哺乳動物的標準方法。更具體地，可以在適量的磷酸鹽緩衝鹽 水(PBS)、生理鹽水等中稀釋和懸浮抗原。如果需要，將抗原懸液與適量的 標準佐劑如弗氏(Freund，s)完全佐劑混合，製成乳液，然後施用於哺乳動物。 優選其後每4至21天施用數次與適量弗氏不完全佐劑混合的抗原。也可使
66用合適的載體進行免疫。如上述進行免疫後，用標準方法檢驗血清中所需 的抗體量的增加。
可以按如下方法製備針對本發明多肽的多克隆抗體從經檢測其血清 中所需的抗體的增加的免疫哺乳動物收集血液，並通過任意常規的方法從 所述血液中分離血清。多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，以及可以 從所述血清中分離含有該多克隆抗體的級分。可如下述地從僅識別本發明 多肽的級分中製備免疫球蛋白G或M:使用例如與本發明多肽偶聯的親和 柱，並進一步用蛋白A或蛋白G柱純化該級分。
為了製備單克隆抗體，從用抗原免疫的哺乳動物收集免疫細胞，如上 所述檢查血清中所需抗體水平升高，並用於細胞融合。用於細胞融合的免 疫細胞優選獲自脾。其它優選用來與上述免疫細胞融合的親本細胞包括例 如哺乳動物骨髓瘤細胞，更優選獲得了用於藥物選擇融合細胞的性質的骨 髓瘤細月包。
才艮據已知的方法，如Milstein等(Galfre和Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46(1981))的方法可將上述免疫細胞和骨髓瘤細胞進行融合。
在標準選擇培養基如HAT培養基(含次黃噪呤，氨基蝶呤和胸苷的培養 基)中進行培養，可以選出由細胞融合所得的雜交瘤。通常，細胞培養是在 HAT培養基中連續進行數天至數周，這段時間足以使除了所需的雜交瘤細 胞之外的所有其它細胞(非融合的細胞)死亡。然後，進行標準有限稀釋 (standard limiting dilution)篩選並克隆生產所需抗體的雜交瘤細胞。
除了上述以抗原免疫非人動物製備雜交瘤的方法外，還可以在體外用 多肽、表達多肽的細胞或其裂解物來免疫人淋巴細胞，如EB病毒感染的淋 巴細胞。然後，使免疫後的淋巴細胞與能夠無限分裂的源自人的骨髓瘤細 胞，如U266融合，可以獲得產生能與所述多肽結合的期望人抗體的雜交瘤 細胞(特開昭63-17688)。
然後將獲得的雜交瘤細胞移植入小鼠腹腔，並抽取腹水。獲得的單克 隆抗體可以通過例如石克酸銨沉澱、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層 析或偶聯了本發明多肽的親和柱進行純化。本發明的抗體不僅可以用於純 化和4企測本發明多肽，還可以作為本發明多肽的激動劑和拮抗劑的候選物。 此外，該抗體可以用於與本發明多肽相關的疾病的抗體治療。當將獲得的 抗體施用於人體時(抗體治療)，優選使用人抗體或人源化抗體以降低免疫原性。
例如，可以使用選自多肽、表達多肽的細胞或其裂解物的抗原來免疫
具有人抗體基因庫(repertory)的轉基因動物。然後，從該動物收集產生抗體 的細胞，將其與骨髓瘤細胞融合以獲得雜交瘤，從該雜交瘤可製備針對所 述多肽的人抗體(參見WO92-03918， WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735 和W096畫34096)。
或者，可以通過癌基因使產生抗體的免疫細胞，如經免疫的淋巴細胞 永生化(immortalize)，並用於製備單克隆抗體。
如此獲得的單克隆抗體也可以利用基因工程技術重組製備(參見例如 Borrebaeck and Larrick， (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers LTD於英國出版)。例如，可以從免疫細胞，如產生抗體的雜交瘤 或經免疫的淋巴細胞克隆編碼抗體的DNA，將該DNA插入合適的載體並 引入宿主細胞，來製備重組抗體。本發明還提供如上所述製備的重組抗體。
此外，本發明的抗體可以是抗體片段或修飾的抗體，只要其結合一種 或多種本發明的多肽。例如，所述抗體片段可以是Fab、 F(ab，)2、 Fv或將來 自H鏈和L鏈的Fv片段通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv (scFv) (Huston 等人，(1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83)。更具體地，可以用酶如木 瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體以產生抗體片段。或者，還可以構建編碼該 抗體片段的基因，將其插入合適的表達載體，並在適合的宿主細胞中表達(參 見例如Co等人，(1994) J Immunol 152: 2968-76; Better and Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Enzymol 178: 497-515; Lamoyi, (1986) Methods Enzymol 121: 652-63; Rousseaux等人, (1986) Methods Enzymol 121: 663-9; Bird and Walker, (1991) Trends Biotechnol 9: 132-7)。
述及"VH"是指抗體的免疫球蛋白重鏈的可變區，包括Fv、 scFv或 Fab的重鏈。述及"VL"是指免疫球蛋白輕鏈的可變區，包括Fv、 scFv、 dsFv或Fab的輕《連。
"單鏈Fv"或"scFv"是指常規的雙鏈抗體的重鏈的可變域和輕鏈的 可變域連接起來形成一條鏈而得到的抗體。 一般地，將接頭肽插入到兩條 鏈之間，使得正確的摺疊和活性結合位點的形成成為可能。
"嵌合抗體，，是(a)恆定區或其一部分發生改變、取代或交換而得到的免疫球蛋白分子，所述改變、取代或交換使得抗原結合位點(可變區)結合於
類另U(class)、效應物作用和/或物種不同或改變的恆定區，或者結合於賦予嵌 合抗體新特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等)； 或(b)可變區或其一部分發生改變、取代或交換成為具有不同的或改變的抗 原特異性的可變區而得到的免疫球蛋白分子。
"人源化抗體"是包含最少的源自非人免疫球蛋白的序列的免疫球蛋白 分子。人源化抗體包含這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體 的互補決定區(CDR)的殘基被來自具有所需特異性、親和力和能力(capacity) 的非人物種(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的殘基(供體抗體)所取代。在 有些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應的非人殘基所取代。人源 化抗體可含有既不是在受體抗體中也不是在引入的CDR或框架序列中發現 的殘基。 一般而言，人源化抗體包含至少一個，通常是兩個可變域的基本 上全部，其中所有或基本上所有CDR區與非人免疫球蛋白的CDR區對應， 而所有或基本上所有框架區具有人免疫球蛋白共有序列。人源化抗體還優 選包括免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少 一部分，通常是人免疫球蛋白的恆定區 的至少一部分(參見Jones等人，(1986) Nature.;321:522-5; Riechmann等人, (1988) Nature.;332:323-7; Presta， (1992) Curr Opin Struct Biol. 2:593隱6)。
人源化可以基本上通過下述方法實現按照Winter與其共同研究者的 方法(Jones等人，Nature 321:522-5 (1986); Riechmann等人，Nature 332:323-7 (1988); Verhoeyen等人，Science 239:1534-6 (1988))用嚙齒類的CDR或CDR 序列取代人抗體的對應序列。因此，這樣的人源化抗體是嵌合抗體，其中
利第4，816，567號)。
術語"表位，，和"抗原決定簇"是指抗原上被抗體所結合的位點。表 位可以由相鄰的胺基酸形成，也可以由通過蛋白質的三維摺疊而並列的非 相鄰胺基酸來形成。 一般而言，由相鄰胺基酸形成的表位即使經變性溶劑 處理仍能夠保持，而通過三維摺疊而形成的表位會因溶劑處理而消失。表 位通常處於獨特空間構象的至少3個、更一般為至少5個或至少8~10個氨 基酸。確定表位的空間構象的方法包括例如X射線晶體分析和二維核磁共 #■。參見i"列^口 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)。
69抗體可以通過與各種分子如聚乙二醇(PEG)綴合來進行修飾。本發明提 供這樣的修飾抗體。可通過將抗體進行化學修飾來獲得修飾抗體。這些修 飾方法是本領域常規的。
或者，可以以嵌合抗體或人源化抗體的形式獲得本發明的抗體，所述 嵌合抗體為源自非人抗體的可變區與源自人抗體的恆定區之間的嵌合抗
抗體的框架區(FR)和恆定區的人源化抗體。所述抗體可利用已知技術製備。 除人框架區和恆定區外還包含人可變區的完整人抗體也是可以利用 的。這樣的抗體可利用本領域已知的各種技術製備。例如，體外方法包括 使用在噬菌體上展示的人抗體片段的重組文庫(例如，Hoogenboom & Winter: (1992) J. Mol. Biol. 227:381-8)。類似地，可通過將人免疫J求蛋白基因座引入 轉基因動物，例如內源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠，來製備 人抗體。該方法描述於例如美國專利Nos. 6,150,584; 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016。 非抗體結合蛋白
本發明還包括特異性結合本發明的多肽的抗原結合蛋白或非抗體結合 蛋白(non-antibody binding protein)(例如，配體)。非抗體配體包括4吏用非免 疫球蛋白蛋白支架的抗體模擬物，包括Adnectins、 Avimers、單鏈多肽結合 分子和抗體樣結合肽模擬物，更詳細的討論如下。
已經開發了以類似於抗體的方式靶向並結合靶物的其它物質。某些這 樣的"抗體模擬物"使用非免疫球蛋白性蛋白支架作為替代性蛋白構架用
於抗體可變區。
例如，Ladner等(美國專利No.5，260，203)描述了單多肽鏈結合分子，其 結合特異性類似於聚集的、但在分子水平上分離的抗體輕鏈和重鏈可變區 的結合特異性。單鏈結合分子含有通過肽接頭連接的抗體重鏈和輕鏈可變 區的抗原結合位點，並且將摺疊成與雙肽抗體類似的結構。單鏈結合分子 相對於常規抗體表現出幾種優勢，包括更小的尺寸、更好的穩定性並且更 容易進行修飾。
Ku等(屍rac. iVW/.爿cad U.S.A. 92(14):6552-6556 (1995》公開了基於 細胞色素b562的抗體替代物。Ku等(1995)製成了一個文庫，其中將細胞色素b562的兩個環隨機化並選擇其對牛血清白蛋白的結合。發現突變體個體 象抗BSA抗體那樣地選擇性結合BSA。
Lipovsek等(美國專利Nos. 6,818,418和7,U5，396)公開了 一種抗體模擬 物，其特徵為纖連蛋白或纖連蛋白樣蛋白支架和至少一個可變環。這些被 稱為Adnectins的基於纖連蛋白的抗體模擬物展現出許多與天然或工程抗體 相同的特徵，包括對任何靶配體的高親和力和特異性。任何用於發展新的 或改進的結合蛋白的技術可以用於這些抗體模擬物。
這些基於纖連蛋白的抗體模擬物的結構類似於IgG重鏈可變區的結構。
力。另外，這些基於纖連蛋白的抗體模擬物相對於抗體和抗體片段表現出 某些益處。例如，這些抗體模擬物的天然摺疊穩定性不依賴於二硫鍵，並 且因此這些抗體模擬物在通常會破壞抗體的條件下是穩定的。此外，因為 這些基於纖連蛋白的抗體模擬物的結構類似於IgG重鏈，可以在體外採用 用於環隨機化和改組的方法，其類似於體內抗體親和力成熟的過程。
Beste等(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96(5): 1898-1903 (1999》公開了 一種 基於脂籠蛋白支架的抗體模擬物(Anticalin⑧)。脂籠蛋白由P-桶組成，其在 所述蛋白的末端具有四個超變環。Beste (1999)對所述環進行了隨機誘變， 並選擇了其與例如螢光素的結合。三個變體表現出與螢光素的特異性結合， 其中一個變體顯示與抗螢光素抗體類似的結合。進一步的分析揭示全部隨 機化位置是可變的，說明Anticalin⑧將會適合作為抗體的替代物使用。
Anticalins⑧是小單鏈肽，通常為160-180個殘基，其相對於抗體提供了 幾個優勢，包括生產成本的降低、儲藏穩定性的增加和免疫反應的減少。
Hamilton等(美國專利No. 5,770,380)公開了 一種合成抗體模擬物，其中 使用剛性的非肽有機支架——杯芳烴(calixarene),其附接了多個用作結合位 點的可變肽環。所述肽環相對於^L此全部^v杯芳烴的同一側幾Y可伸出。由 於這種幾何構象，所有環均可用於結合，增加了對配體的結合親和力。然 而，與其它抗體模擬物比較，基於杯芳烴的抗體模擬物不是全部由肽組成， 因此它較不容易受到蛋白酶的攻擊。所述支架也不是純粹由肽、DNA或 RNA組成，意味著這種抗體模擬物在極端環境條件下相對穩定並且壽命較 長。另外，由於基於杯芳烴的抗體模擬物相對較小，其產生免疫應答的可 能性較低。Murali等(CW/. Mo/.所o/. 49(2):!209-216 P00")討論了用於將抗體減小 成更小的肽模擬物的方法學，他們將其稱為"抗體樣結合肽模擬物"(ABiP), 也可作為抗體替代物使用。
Silverman等(Ato.所o&c/z"o/. (2005)， 23: 1556陽1561)公開了融合蛋白，其 是包含多個稱為"avimers"的結構域的單鏈多肽。通過體外外顯子改組和 噬菌體展示從人胞外受體結構域發展出的avimers是一類結合蛋白，在它們 對多種靶分子的親和力和特異性方面在某種程度上類似於抗體。與單表位 結合蛋白相比，所得多結構域蛋白可以包含多個獨立結合結構域，它們顯 示改進的親和力(在一些情況下為亞毫微摩爾)和特異性。關於構建的方法和
的用途的其它細節公開在例如美國專利申請7>開20040175756、 20050048512、 20050053973、 20050089932和20050221384中。
除了非免疫球蛋白蛋白構架，抗體性質還在包含RNA分子和非天然寡 聚體的化合物(例如，蛋白酶抑制劑、苯二氮雜卓、噤呤衍生物和p-轉角模 擬物)中得到了模仿，它們全部適用於本發明。
可以將如上獲得的抗體純化至均質。例如，可根據用於普通蛋白的分 離和純化方法進行抗體的分離和純化。例如，可以通過適當選^^和組合4吏 用柱層析如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電 ;永、等電聚焦,來分離4元體(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory),但並不局限於此。蛋白A 柱和蛋白G柱可以用作親和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如Hyper D, POROS和Sepharose F.F, (Pharmacia)。
例示性的層析，除親和層析之外，包括離子交換層析、疏水層析、凝 月交過濾、反相層片斤、吸附層對斤等(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak等人， (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press)。可以通過液相層析，如HPLC 和FPLC進行層析程序。
例如，可以採用吸光度測定、酶聯免疫吸附測定(elisa)、酶免疫測定
合活性。在e!isa中，將本發:月"抗體或非抗體結合蛋白固定在平板j^,
將本發明多肽施加到平板上，再施加含有所需抗體的樣品，如產生抗體的 細胞的培養上清液或純化的抗體。然後施加用酶(如鹼性磷酸酶)標記的、識
72別第一抗體的第二抗體，並溫育平板。接下來在洗滌後，在平板中加入酶底物如磷酸對硝基苯酯，測定吸光度以評價樣品的抗原結合活性。多肽的片段，如C-末端或N-末端片段可以用作抗原來評價抗體的結合活性。可以
4吏用BIAcore (Pharmacia)評Y介本發明抗體的活性。
上述方法允許通過將本發明的抗體或非抗體結合蛋白暴露於假定含有本發明多肽的樣品，再檢測或測定由抗體和多肽形成的免疫複合物，來檢測或測定本發明的多肽。
肽，所以該方法可應用於使用多肽的各種實驗。反義寡核苷酸
如上述，本發明還提供與編碼人A7322或F3374V1蛋白的多核苷酸(SEQIDNO:79或81)或其互補鏈雜交，並含有至少15個核苷酸的多核苷酸。優選例如下述反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸與選自SEQ IDNO:79(A7322)的第1 384位中的連續核苷酸序列互補。 一般而言，包含起始密碼子的核苷酸序列對於設計有效的反義寡核苷酸而言是優選的。A7322的起始密碼子(172 174)位於SEQ ID NO: 79(A7322)的第1 384位之內。本發明的多核苷酸優選與編碼本發明的多肽的DNA特異性雜交的多核苷酸。
本說明書中使用的術語"特異性雜交"指在通常的雜交條件下、優選在嚴緊的雜交條件下不與編碼其它蛋白的DNA發生明顯的交叉雜交(cross-hybridization)。這樣的多核苷酸包括與編碼本發明多肽的DNA或其互補鏈特異性雜交的探針、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如，反義寡核苷酸和核酶)。此外，這樣的多核苷酸可以用於製備DNA晶片。
如本說明書中使用的術語"反義核酸"，不但指其中與組成DNA或mRNA —定區域的那些核苷酸對應的核苷酸為完全互補的反義核酸，還指具有一個或多個核苷酸錯配的核酸，只要DNA或mRNA及反義寡核苷酸能與SEQIDNO:79或81所示核苷酸序列特異性雜交。
包括這樣的多核苷酸，它們在"至少15個連續核苷酸序列區域"內，具有至少約70%或更高、優選至少約80%或更高、更優選約至少90%或更高、更優選至少約95%或更高的同源性。所述同源性可使用本說明書記載的算法確定。這樣的多核苷酸可以如下文所述的一個實施例中那樣用作分離或檢測編碼本發明多肽的DNA的探針，或者作為用於擴增的引物。反義寡核芬酸的衍生物或修飾產物可以用作本發明的反義寡核香酸。
這樣的修飾產物的例子包括低級烷基膦酸酯(lower alkyl phosphonate)修飾，如曱基-膦酸酯型或乙基-膦酸酯型，硫代磷酸酯修飾和氨基磷酸酯修飾。
本發明的反義寡核苷酸衍生物通過如下方式作用於產生本發明多肽的細胞與編碼本發明多肽的DNA或mRNA結合，抑制其轉錄或翻譯，促進mRNA降解並抑制本發明多肽的表達，由此抑制該多肽的功能。
通過將本發明的反義寡核苷酸衍生物與對該衍生物無活性的基質混合，可以將其製成外用製劑，如搽劑或罨劑。
此外，根據需要，通過添加賦形劑、等滲劑(isotonic agents)、增溶劑、穩定劑、防腐劑、鎮痛劑等，可以將這樣的衍生物配製成例如片劑、粉末、顆粒、膠嚢、脂質體膠嚢、注射劑、溶液、滴鼻劑和冷凍乾燥劑。這些劑型可以按常規方法製備。
通過直接將反義寡核苷酸衍生物施於患處(ailing site),或通過將其輸入血管以使其到達患處而給予患者。也可使用反義封固介質(antisense-mounting medium)來提高持久性和膜通透性。封固介質的例子包括脂質體、聚-L-賴氨酸、脂質、膽固醇、脂質轉染試劑(lipofectamine)或它們的衍生物。
本發明的反義寡核苷酸衍生物的劑量可以根據患者的狀況(condition)適當調整，並按所需的量使用。例如，可以施用的劑量範圍為0.1-100mg/kg,優選0.1-50mg/kg。siRNA
術語"siRNA"的意思是阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。使用將siRNA導入細胞的標準技術，包括其中用DNA為模板轉錄RNA的那些方法。本發明的siRNA包含編碼人A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB蛋白的多核苷酸(SEQIDNO:79、 81、 92或88)的有義核酸序列和反義核酸序列。siRNA可以這樣構建，使單一轉錄物(雙鏈RNA)同時具有來自靶基因的有義序列和互補的反義序列，例如髮夾。siRNA可以是dsRNA或sh類A。
如用於本文，術語"dsRNA"指兩個RNA分子的構建體，這兩個RNA分子包含彼此互補的序列，並且藉由所述互補序列退火在一起形成雙鏈RNA分子。兩條鏈的核苷酸序列不僅可以包含選自靶基因序列的蛋白編碼
74序列的"有義"或"反義"RNA，還可以包含具有選自靶基因非編碼區的 核苷酸序列的RNA分子。
術語"shRNA"如用於本文指具有莖環結構的siRNA，其包含彼此互 補的第一區和第二區，即有義鏈和反義鏈。兩個區的互補程度和方向足以 使兩個區之間發生鹼基配對，所述第一區和第二區通過環區連接在一起， 所述環是因為在環區內的核苷酸(或核香酸類似物)之間缺乏鹼基配對而產 生的。shRNA的環區是介於有義鏈和反義鏈之間的單鏈區，也可以稱作"間 插單鏈(intervening single-strand)"。
如用於本文，術語"siD/R-NA"指由RNA和DNA 二者組成的雙鏈多 核苷酸分子，包括RNA和DNA的雜合體和嵌合體，其阻止靶mRNA的翻 譯。在本文中，雜合體表示這樣的分子，其中由DNA組成的多核苷酸和由 RNA組成的多核普酸相互雜交形成雙鏈分子；而嵌合體表示組成所述雙鏈 分子的鏈中的一條或兩條可以含有RNA和DNA。使用將siD/R-NA導入細 胞的標準技術。siD/R-NA包括CX有義核酸序歹'K也稱為"有義鏈")和/或 CX反義核酸序列(也稱作"反義鏈，，)。siD/R-NA可以這樣構建，使單個轉 錄物同時具有來自靶基因的有義核酸序列和互補反義核酸序列，例如髮夾。 siD/R-NA可以是dsD/R-NA或shD/R-NA。
如用於本文，術語"dsD/R-NA"指兩個分子的構建體，所述兩個分子
苷酸分子。兩條鏈的核苦酸序列可以不僅僅包含選自靶基因序列的蛋白編 碼序列的"有義，，或"反義，，多核苷酸序列，還可以包含具有選自靶基因 非編碼區的核香酸序列的多核苷酸。組成dsD/R-NA的兩個分子中的一個或 兩個由RNA和DNA二者組成(嵌合分子)，或者一個分子由RNA組成而另 一個由DNA組成(雜合雙鏈 )。
術語"shD/R-NA"如用於本文指具有莖環結構的siD/R-NA,其包含彼 此互補的第一區和第二區，即有義鏈和反義鏈。所述區的互補程度和方向 足以使它們之間發生鹼基配對，第一區和第二區通過環區連接，所述環是 因為在環區內的核芬酸(或核香酸類似物)之間缺乏鹼基配對而產生的。 shD/R-NA的環區是介於有義鏈和反義鏈之間的單鏈區，也可以稱作"間插 單鏈"。
A7322、 F3374V1 、 PBK/TOPK或AURKB的siRNA分別針對A7322、F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB基因序列的單個靶標。或者，siRNA針對 A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB序列的多個靶標。例如，所述組 合物分別包含針對A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB的兩個、三個、 四個或五個或更多個靶標序列的A7322、 F3374V1 、 PBK/TOPK或AURKB 的siRNA。 "A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB的靶標序列"的意 思是與A7322、 F3374V1 、 PBK/TOPK或AURKB基因的一部分相同的核苷 酸序列。
靶標序列可以包括人A7322、 F3374V1 、 PBK/TOPK或AURKB基因的 5'非翻譯(UT)區、可讀框(ORF)或3'非翻譯區。與靶mRNA雜交的A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB的siRNA與正常條件下為單鏈的mRNA 轉錄物結合，從而幹擾翻譯並由此阻抑蛋白質的表達，由此減少或抑制由 A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB基因編碼的A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB多肽產物的產生。因此，本發明的siRNA分子可以 通過它們與來自A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB基因的mRNA 或cDNA在嚴緊條件下特異性雜交的能力來定義。
siRNA與靶細胞中的對應於A7322、 F3374V1 、 PBK/TOPK或AURKB 的轉錄物相結合引起細胞所產生的該蛋白的減少。寡核苷酸的長度為至少 10個核香酸，可以與天然存在的轉錄物等長。優選寡核苷酸的長度小於100、 75、 50、 25個核苷酸。更優選寡核苷酸的長度為19 25個核苷酸。抑制癌 細胞生長的A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB的siRNA寡核苷酸 的例子包括包含SEQ IDNO:34或35的靶標序列(對A7322而言)、包含SEQ ID NO:37、 38或67的靶標序列(對F3374V1而言)、包含SEQ ID NO:39或 40的靶標序列(對PBK/TOPK而言)、或者包含SEQ IDNO:68的靶標序列(對 AURKB而言)。
此外，為了增強siRNA的抑制活性，可以將核香酸"u"添加至靶標序 列反義鏈的3，端。所添加"u"的數目是至少大約2個，通常是大約2個至 大約10個，優選大約2個至大約5個。添加的"u"在siRNA反義鏈的3，
端形成單鏈。
可以將A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB的siRNA以能夠與 mRNA轉錄物結合的形式直接導入細胞中。在這些實施方案中，本發明的 siRNA分子一般如上述對於反義分子的描述那樣進行修飾。其它的修飾也是可以的，例如與膽固醇綴合的siRNA顯示出改進的藥理學特性(Song等人 NatureMed. 9:347-51 (2003))。或者，編碼A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或 AURKB的siRNA的DNA可以包含在載體中。
載體的產生例如通過將A7322、 F3374V1 、 PBK/TOPK或AURKB靶標 序列克隆入表達載體，與A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB序列側 翼的調節序列以允許兩條鍊表達的方式(通過DNA分子的轉錄)可操作地連 接(Lee，N.S.等，Nature Biotechnology 20 : 500-5.)。相對於A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB的mRNA的反義RNA分子通過第一啟動子(例如， 位於被克隆的DNA的3'的啟動子序列)轉錄，而相對於A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB的mRNA的有義RNA分子通過第二啟動子轉錄(例 如，位於被克隆的DNA的5，的啟動子序列)。所述有義鏈和反義鏈在體內 雜交生成siRNA構建體用於沉默A7322、 F3374V1 、 PBK/TOPK或AURKB 基因。或者，可應用兩個構建體來產生siRNA構建體的有義鏈和反義鏈。 克隆的A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB可以編碼具有二級結構例 如髮夾的構建體，其中單一轉錄物同時具有來自靶基因的有義序列和互補 的反義序列。
此外，為了形成髮夾環結構，可在有義序列和反義序列之間^L置由任 意核苷酸序列組成的環序列(loop s叫uence)。因此，本發明還提供具有通式 5'-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA,其中，[A]為核糖核苷酸序列，其對應於SEQID NO:34、 35、 37、 38、 39、 40、 67或68的核苷酸的序列，[B]為由3-23個 核苦酸組成的核糖核香酸序列，並且[A，]是由[A]的互補序列組成的核糖核 苷酸序列。所述環序列可以由長度優選為3-23個核苷酸的任意序列組成。 所述環序列例如可以選自由如下序列組成的組(http:〃www.ambion.com/ techlib/tb/tb—506.html)。在本發明的siRNA中，為了增強siRNA的抑制活性， 可以將核苷酸"u"添加到[A，]的3，端。添加的"u"的數目為至少2，通常為 2-10,優選為2-5。此外，由23個核苷酸組成的環序列也提供活性siRNA (Jacque， J,M.,等人，(2002) Nature 418: 435-8.):
CCC， CCACC或CCACACC: Jacque, J.-M.,等人，Nature 418: 435-8 (2002);
UUCG: Lee， N.S.,等人，(2002) Nature Biotechnology 20: 500-5. Fruscoloni P.,ef Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4): 1639-44 (2003);和UUCAAGAGA: Dykxhoorn, D. M"等人，Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-67 (2003)。
例如，具有本發明的髮夾結構的優選siRNA如下所示。在下面的結構 中，環序歹'J可以選自下組CCC， UUCG, CCACC， CCACACC和 UUCAAGAGA 。 一個優選的環結構是UUCAAGAGA (DNA中為 "ttcaagaga，，)。
aagaaagcaucgcagucucag-[B]-cugagacugcgaugcuuucuu (4十隻於輩巴才示序歹l] SEQ ID NO: 34)
aagaugcguucucugccacac-[B]-guguggcagagaacgcaucuu (4f只於輩巴才示序歹寸SEQ ID NO: 35)
gaucaugucuccgagaaaa-[B]-uuuucucggagacaugauc (4十隻十輩巴標序歹'J SEQ ID NO: 37)
ggaagccauagaauugcuc畫[B]隱gagcaauucuauggcuucc (4十隻於革巴標序歹寸SEQ ID NO: 38)
cuggaugaaucauaccaga畫[B]隱ucugguaugauucauccag (4十3於革巴標序歹寸SEQ ID NO: 39)
guguggcuugcguaaauaa-[B]-uuauuuacgcaagccacac (4十^j"輩巴標序歹l) SEQ ID NO:92)
acuccuacguucucuauua-[B]-uaauagagaacguaggagu (4十隻於革巴才示序歹寸SEQ ID NO: 67)
aaggugauggagaauagcagu-[B]-acugcuauucuccaucaccuu (4十隻十革巴才示序歹'J SEQ ID NO: 68)
A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB序列側翼的調節序列是相同 的或者不同的，這樣它們的表達能夠獨立地，或者以時間性或空間性方式 被調控。通過將A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB基因模板克隆到 載體上來在細胞內轉錄siRNA,其中所述載體含有例如來自小核RNA (snRNA) U6或人HI RNA啟動子的RNA聚合酶III轉錄單元。為了將載體 導入細胞，可以4吏用轉染增強劑(transfection-enhancing agent)。 FuGENE (Roche diagnostices) ， Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ， Oligofectamine (Invitrogen)和Nucleofector (Wako pure Chemical)可以用作轉染增強劑。
siRNA的核香酸序列可使用能夠從全球資訊網上Ambion網站(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder.html)^方問的siRNA ^殳i十 電腦程式來設計。所述電腦程式基於如下規程選擇siRNA的核苷酸序 列
選擇siRNA靶位點
1. 從目標轉錄物的AUG起始密碼子開始向下遊掃描，尋找AA二核苷 酸序列。記錄每個AA的出現及其3'側鄰近的19個核苷酸作為潛在的siRNA 把位點。Tuschl等在Genes Dev 13(24): 3191-7 (1999)中，不推薦針對5'和3' 非翻譯區(UTRs)和鄰近起始密碼子的區域(75個石威基之內)設計siRNA,因為 上述區域可能更為富含調控蛋白結合位點。UTR結合蛋白和/或翻譯起始復 合物可幹擾siRNA內切核酸酶複合物的結合。
2. 將所迷潛在靶位點與人基因組資料庫進行比較，將任何與其它編碼 序列顯著同源的靶標序列排除在考慮之外。可採用BLAST (Altschul SF， et. al., Nucleic Acids Res. 1997; 25(17):3389-402.; J Mol Biol. 1990; 215(3):403-10)進行同源性搜索，其可見於全球資訊網上的NCBI伺服器 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。
3. 選擇合格的靶標序列用於合成。在Ambion,優選沿待評價的基因的 長度選擇幾個把標序列。
採用標準方法，針對與A7322、 F3374V1 、 PBK/TOPK或AURKB mRNA 的不同部分互補的寡核苷酸和寡核苷酸，在體外檢測它們降低腫瘤細胞中 A7322 、 F3374V1 、 PBK/TOPK或AURKB的產生的能力(例如使用乳腺癌細 胞系，如A7322使用BT-549、 BT-474,對於F3374使用D47T和HBC4， 對於PBK/TOPK使用T47D和BT-20)。可以使用A7322、 F3374V1 、 PBK/TOPK或AURKB特異性抗體或採用其它檢測策略檢測與不存在候選 siRNA組合物的情況下培養的細胞相比，與所述候選siRNA組合物接觸的 細胞中A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB基因產物的減少。對於在 體外細胞測定或無細胞測定中減少A7322、F3374Vl、PBK/TOPK或AURKB 產生的序列，可以進一步測定它們對細胞生長的抑制作用。對於在體外細 胞測定中抑制細胞生長的序列，在大鼠或小鼠中進行體內測定，以確認在 帶有惡性新生物的動物中A7322、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB產生的 減少和腫瘤細胞生長的降低。
本發明還包括含有靶標序列的核酸序列的雙鏈分子，所述靶標序列例如SEQIDNQ:34、 35、 37、 38、 38、 39、 67或68的核芬酸。在本發明中， 雙鏈分子包括有義鏈和反義鏈，其中所述有義鏈包含對應於SEQ ID NO: 34、 35、 37、 38、 38、 39、 67或68的核糖核苷酸序列，而所述反義《連包含 與所述有義鏈互補的核糖核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈相互 雜交形成所述雙鏈分子，且其中所述雙鏈分子，當#1導入表達A7322、 F3374V1、或AURKB基因的細胞時，抑制所述基因的表達。
在本發明中，當分離的核酸為RNA或其衍生物時，應在核苷酸序列中 將鹼基"t"替換為"u，，。本說明書中使用的術語"互補的"指核酸分子的核 苷酸單位之間形成Watson-Crick或Hoogsteen鹼基配對。而術語"結合，，指兩 個多肽或化合物、或者相關的(associated)多肽或化合物、或者其組合之間的 物理或化學相互作用。當多核苷酸包含修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯連接 時，這些核酸也可以相同的方式彼此結合。
互補的核酸序列在適宜條件下雜交，形成幾乎不含或不含錯配的穩定 雙鏈體。此外，本發明的分離核苷酸的有義鏈和反義鏈可以通過雜交形成 雙鏈核苷酸或髮夾環結構。在優選的實施方案中，這樣的雙鏈體的平均每 10個匹配中含有的錯配不超過1個。在特別優選的實施方案中，雙鏈體的 鏈完全互補，這樣的雙鏈不含錯配。
例如，核酸分子的長度短於500、 200、 75個核苷酸。本發明還包括包 含一個或多個本說明書中描述的核酸的載體，以及包含所述載體的細胞。 對於針對A7322或F3374V1的siRNA或者編碼這些siRNA的DNA而言， 本發明的分離核酸是有用的。將這些核酸用於siRNA或其編碼DNA時，有 義鏈優選為長於19個核普酸，更優選長於21個核苷酸。
本發明的雙鏈分子可以包含一個或多個修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯 鍵。本領域熟知的化學修飾能夠增加所述雙鏈分子的穩定性、可用性和/或 細胞對該雙鏈分子的攝取。本領域技術人員將意識到可以引入本分子的其 它類型化學修飾(WO03/070744; WO2005/045037)。在一個實施方案中，修 飾可以用於提供更好的降解抗性或更好的攝取。這些修飾的實例包括硫代 磷酸酯連接、2'-0-曱基核糖核苷酸(特別是在雙鏈分子的有義鏈上)、2，-脫 氧-氟代核糖核苷酸、2，-脫氧-核糖核苷酸、"通用鹼基"核苷酸、5'-C-曱基 核苦酸和反向脫氧脫石威基殘基的引入(inverted deoxyabasic residue incorporation) (US20060122137)。
80在另一個實施方案中，修飾可以用於增強雙鏈分子的穩定性或增加尋 耙效率。修飾包括雙鏈分子兩條互補鏈之間的化學交聯、雙鏈分子一條鏈
的3，或5'末端的化學修飾、糖修飾、核鹼基修飾和/或主鏈修飾、2-氟代修 飾的核糖核苷酸和2'-脫氧核糖核苷酸(W02004/029212)。在另一個實施方 案中，修飾可以用於增加或減少針對耙mRNA中和/或互補雙鏈分子的鏈中 互補核香酸的親和力(W02005/044976)。例如，未》務飾的嘧咬核香酸可以用 2-硫代、5-炔基(5-alkynyl)、 5-曱基或5-丙炔(5-propynyl)嘧啶取代。另外， 未修飾的噪呤可以用7-脫氮(7-deza)、 7-烷基或7-烯基。票呤取代。在另一個 實施方案中，當雙鏈分子是具有3'突出端的雙鏈分子時，3，-末端核苷酸的 突出核苷酸可以由脫氧核糖核苷酸替代(Elbashir SM等，Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200)。 關於進 一 步的細節，可以利用公開文獻如 US20060234970。本發明不限於這些實例，可以將任何已知化學修飾應用於 本發明的雙鏈分子，只要所得分子保留了抑制靶基因表達的能力。
此外，本發明的雙鏈分子可以包含DNA和RNA 二者，例如dsD/R-NA 或shD/R-NA。具體而言， 一條DNA鏈和一條RNA鏈形成的雜合多核苷酸 或DNA-RNA嵌合多核苷酸表現出提高的穩定性。可以形成DNA和RNA 的混合，即，由一條DNA鏈(多核苷酸)和一條RNA鏈(多核苷酸)組成的雜 合型雙鏈分子，或在任一單鏈(多核香酸)或兩條單鏈(多核苷酸)上同時包含 DNA和RNA的嵌合型雙鏈分子等，來增強所述雙鏈分子的穩定性。DNA 鏈和RNA鏈的雜合體可以是這樣的雜合體，其中有義鏈是DNA而反義鏈 是RNA，或者相反，只要在導入表達靶基因的細胞中時，該雜合體具有抑 制所述基因表達的活性。優選地，有義鏈多核苷酸是DNA而反義鏈多核苷 酸是RNA。同樣，嵌合型雙鏈分子可以是其中的有義鏈和反義鏈均由DNA 和RNA組成，或者有義鏈或反義鏈中的任一條由DNA和RNA組成，只要 在導入表達靶基因的細胞中時，所述雙鏈分子具有抑制該基因表達的活性。
為了增強雙鏈分子的穩定性，所述分子優選包含儘可能多的DNA，而 為了誘導對靶基因表達的抑制，所述分子在某個範圍內必須是RNA以誘導 對表達的充分抑制。嵌合型雙鏈分子的優選實例是雙鏈分子的上遊部分區 (即，有義鏈或反義鏈內靶標序列或其互補序列的側翼區)是RNA。優選地， 所述上遊部分區表示有義鏈的5'側(5，端)和反義鏈的3，側(3，端)。也就是說， 在優選的實施方案中，反義鏈3'側的側翼區由RNA組成，或者有義鏈5，側的側翼區和反義鏈3，側的側翼區均由RNA組成。例如，本發明的嵌合型 或雜合型雙鏈分子包含以下組合。
有義鏈 5'-[DNA]-3，
3，-(RNA)-[DNA]-5，反義鏈，
有義鏈 5'-(RNA)-[DNA]-3，
3'-(RNA)-[DNA]-5，反義鏈，和
有義鏈 5'-(RNA)-[DNA]-3，
3'-(RNA)-5，反義鏈。
上遊部分區優選是由9-13個核苷酸組成的結構域，從雙鏈分子的有義 鏈或反義鏈內的靶標序列或其互補序列的末端算起。此外，這種嵌合型雙 鏈分子的優選實例包括鏈長為19-21個核苷酸的那些，其中多核苷酸的至少 上遊的半區(對於有義鏈為5'側區域而對於反義鏈為3'側區域)是RNA，而 另一半是DNA。在這樣的嵌合型雙鏈分子中，抑制靶基因表達的效果比反 義4連整體為RNA時強得多(US20050004064)。
在本發明中，雙鏈分子可以形成髮夾，例如短髮夾RNA (shRNA)和由 DNA及RNA組成的短髮夾(shD/R-NA)。 shRNA或shD/R-NA是RNA序列 或RNA和DNA的混合物，其形成緊密的髮夾轉彎，可以用來通過RNA幹 擾來沉默基因表達。shRNA或shD/R-NA在單一鏈上包含有義靶標序列和 反義輩巴標序列，其中所述序列通過環序列隔開。通常，髮夾結構被細胞機 制切割成dsRNA或dsD/R-NA，其後所述dsRNA或dsD/R-NA與RNA誘導 的沉默複合物(RNA-induced silencing complex, RISC)結合。這種複合物結合 並切割與所述dsRNA或dsD/R-NA的把標序列匹配的mRNA。 乳腺癌的診斷
本發明的抑制性多核苷酸(例如反義寡核苷酸或siRNA)抑制本發明的 多肽的表達，因此對於抑制本發明的多肽的生物活性是有用的。此外，含 有本發明的反義寡核苷酸或siRNA的表達抑制劑對於抑制本發明的多肽的 生物活性是有用的。因此，包含一種或多種本發明的抑制性多核苷酸(例如 反義寡核苷酸或siRNA)的組合物對於乳腺癌的治療是有用的。而且，本發 明還提供利用本發明多肽的表達水平作為預後預測用和/或診斷用標誌的用 於進行乳腺癌的預後預測、診斷、檢測或檢查的方法。
本發明的診斷方法包括以下步驟(a) 檢測本發明的」73"或i^374F7基因的表達水平；和
(b) 將A7322和/或F3374V1的表達(例如轉錄和/或翻譯)水平的上升與 乳腺癌的診斷或預後相關聯。
具體樣本中」7J"基因或FJ374P7基因的表達水平可以通過定量與 爿7322基因或74 W基因對應的mRNA或由^ 7322或W W基因編碼 的蛋白來加以評估。mRNA的定量方法是本領域技術人員公知的。例如， 可以通過Northern印跡分析或RT-PCR (例如使用定量PCR或實時PCR)來 評估對應於」7322 -戈屍W74F7基因的mRNA的水平。爿73"或FB74F7基 因的全長核苷酸序列在SEQ ID NO:79或81中示出，因此任何本領域技術 人員均能夠設計出用於定量」73"或FW74F7基因的探針或引物的核苷酸 序列。
此外，基於由爿73"或F3374W基因編碼的蛋白的活性或量(quantity)， 也可以分析該基因的表達水平。下面示出了一種測定A7322或F3374V1蛋 白量的方法。例如，免疫測定法對於測定生物材料中的蛋白是十分有效的。 可以將任何生物材料用作測定蛋白或其活性的生物樣品。例如，對血液樣 品進行分析可以用於對血清標誌物所編碼的蛋白進行評估。另一方面，可 根據待分析的蛋白的活性選擇適當的方法來測定由」73"或FB74F/基因 編碼的蛋白的活性。
作為另 一種基於」73"或F3374W基因的翻譯產物來檢測其表達水平 的方法，可以藉由使用針對A7322蛋白或F3374V1蛋白的抗體的免疫組織 化學分析來觀察染色的強度。即，如果觀察到強染色，則顯示A7322蛋白 或F3374V1蛋白的存在量增加，並且顯示^73"或F3374W基因的高表達 水平。優選用乳腺癌組織作為免疫組織化學分析的受試材料。
根據本發明的方法，對樣本(受試樣品)中的^7322成F3WW基因的表 達水平進行評估，並與正常樣品中的表達水平相比較。當這樣的比較顯示 靶基因的表達水平比正常樣品中的表達水平高，則判定該受試者患有(be affected with)乳腺癌。可以同時測定來自正常樣品和受試者的樣本中」73" 一戎FW74W基因的表達水平。或者，可以採用統計學方法，基於分析從對 照組預先採集的樣本中基因表達水平獲得的結果，確定出表達水平的正常 範圍。將由受試者樣品獲得的結果與正常範圍進行比較；當該結果未落入 正常範圍時，即判定受試者患有乳腺癌。也可以將樣本(受試樣品)中的^73"成/^374W基因的表達水平與一種或多種乳腺癌樣品中的表達水平相比 較。乳腺癌樣品可以代表乳腺癌的各個疾病階段。當這樣的比較顯示靶基 因的表達水平與乳腺癌樣品中的表達水平基本上相等，則判定該受試者患 有乳腺癌。此外，通過與處於各種疾病階段的乳腺癌樣品相比較，使得生 物樣品中的疾病進展程度相關的預後預測和/或診斷成為可能。
根據本發明，能夠獲得用於檢查受試者狀況的中間結果。將這樣的中 間結果與附加信息組合，能夠為醫師、護師或其它技術人員診斷受試者患 有本疾病提供輔助。或者，還可以將本發明用於檢測受試者來源的組織中 的癌性細胞，以及為醫師提供診斷受試者患有本疾病的有用信息。
在本發明中，還提供診斷乳腺癌的診斷試劑。本發明的診斷試劑包含 與本發明的多核苷酸或多肽結合的化合物。優選地，與本發明的多核苷酸 雜交的寡核苷酸，或者與本發明多肽結合的抗體或非抗體結合蛋白可用作 這樣的化合物。
例如，包含選自J73" -戈FW74P7基因的核苷酸序列中的15個連續核 香酸鹼基或其互補物的寡核苷酸，可以作為本發明的優選診斷試劑使用。 這樣的寡核苷酸作為用於分離或檢測473"威F3374P7基因的探針是有用 的。或者，特異性識別J73"鹹F3374W基因所編碼的多肽的抗體或非抗 體結合蛋白，作為本發明的診斷試劑也是有用的。 乳腺癌治療的監測
」73"減i^WW基因的表達水平還使得監測乳腺癌治療的過程成為 可能。在本方法中，從正在接受乳腺癌治療的受試者提供受試細胞群體。 必要時，在治療前、治療中和/或治療後的不同時間點由受試者獲取受試細 胞群體。然後確定受試細胞群體中」7^2或K5374W基因中的一個或多個 的表達，並與參照細胞群體相比較，所述參照細胞群體包含乳腺癌狀態已 知的細胞。在本發明的上下文中，參照細胞應未接受相關治療。
當參照細胞群體不包含乳腺癌細胞時，受試細胞群體和參照細胞群體 中爿7322或FB74F7基因中的一個或多個的表達相似，顯示所考察的受試 者的治療是有效的。而在受試群體和正常對照參照細胞群體中，這些基因 的表達不同，則說明臨床後果或預後不甚良好。相似地，當參照細胞群體 包含乳腺癌細胞時，受試細胞群體和參照細胞群體中^ 73"或74 W基 因中的一個或多個的表達不同，顯示所考察的受試者的治療是有效的。而在受試群體和參照細胞群體中，上述基因表達相似，則說明臨床後果或預 後不甚良好。
而且，還可以將在治療後獲得的受試者來源的生物樣品中確定的本發 明的基因的表達水平(即治療後水平)、與在治療開始前獲得的受試者來源的
生物樣品中確定的」7322或i^374F7基因中的一個或多個的表達水平(即治 療前水平)相比較。治療後樣品中表達水平降低，表明所考察的受試者的治 療是有效的；而治療後樣品中表達水平上升或維持不變，表明臨床後果或 預後不甚良好。
當在本說明書中使用時，術語"有效的"表示治療引起受試者體內病 理性上調的基因的表達下降，病理性下調的基因的表達上升，或乳腺癌(例 如乳腺導管癌)的大小、患病率(prevalence)或轉移潛力降低。當預防性施用 所述的治療時，術語"有效的"表明該治療延遲或防止乳房肺瘤的形成， 或者延遲、防止或減輕臨床乳腺癌的症狀。乳房腫瘤的評價可以使用標準 的臨床規程進行。
此外，與任何已知的診斷或治療乳腺癌的方法相結合來確定治療的有 效性。例如，可以通過確定症候性異常(例如體重減輕、腹痛、背部痛、食 欲不振、噁心、嘔吐以及全身疲倦感、虛弱無力和黃疰)來診斷乳腺癌。 篩選方法
(l)用於篩選的受試化合物
在本發明的上下文中，通過本篩選方法鑑定的作用劑可以是任意化合 物或包含多種化合物的組合物。而且，根據本發明的篩選方法暴露於細胞 或蛋白的受試作用劑可以是單 一化合物或者化合物的組合。當在所述方法 中使用化合物的組合時，可以順次或同時使化合物進行接觸。
在本發明的篩選方法中可以使用任何受試作用劑，例如細胞提取物、 細胞培養物上清、發酵微生物的產物、海洋生物提取物、植物提取物、純 化或粗製蛋白、肽、非肽化合物、合成的小分子化合物(包括核酸構建物、 如反義RNA、 siRNA、核酶等)以及天然化合物。本發明的受試作用劑可以 使用本領域已知的多種組合文庫方法中的任一種獲得，所述方法包括
(1) 生物學文庫，
(2) 空間可尋址平4亍固相或溶液相文庫(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries),(3) 需要去巻積(deconvolution)的合成文庫法，
(4) "一5朱一化合物(one bead one compound)"文庫法，和
(5) 使用親和層析選擇的合成文庫法。
使用親和層析選擇的生物學文庫法僅限於肽文庫，而其它四種方法適 用於肽，非肽寡聚體或化合物小分子文庫(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145)。合成分子文庫的方法的舉例見於本技術領域(DeWitt等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb等人(1994) Pro" Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann等人(1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho等 人(1993) Science 261: 1303-5; Carell等人(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell等人(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop等 人(1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51)。化合物文庫可存在於溶液中(參見 Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21)或珠子(Lam (1991) Nature 354: 82-4)、晶片(Fodor (1993) Nature 364: 555-6)、細菌(美國專利5,223,409)，孢 子(美國專利5,571,698; 5,403,484和5，223,409)、質粒(Cull等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9)或噬菌體(Scott and Smith (1990) Science 249: 386-卯；Delvin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10;美國專利申請 2002103360)上。
的任何篩選方法篩選的化合物中的部分結構進行添加、缺失和/或取代而轉 變而成的化合物。
而且，當篩選的受試作用劑是蛋白時，為了獲得編碼該蛋白的DNA, 可以測定該蛋白的全胺基酸序列來推定編碼該蛋白的核酸序列。或者可以 分析所得蛋白的部分胺基酸序列、基於該序列製備寡聚DNA作為探針，使 用該探針對cDNA文庫進行篩選，從而得到編碼該蛋白的DNA。所得DNA 可用於製備治療或預防癌症的候選受試作用劑。
在本說明書中記載的篩選中有用的受試作用劑還可以是與BC蛋白或 部分BC肽特異性結合的抗體或非抗體結合蛋白，所述BC蛋白或部分BC 肽缺失對配偶體的結合活性、或者缺失在體內磷酸化底物進行或被激酶磷 酸化的活性。這樣的部分蛋白或抗體可以按照本說明書所描述的方法製備 (參照"核苦酸、多肽、載體和宿主細胞，，或"抗體"項)，可以針對它們阻斷BC蛋白磷酸化、或者蛋白(例如A7322、 F3374V1或PBK/TOPK)與其結
合配偶體的結合活性的能力進行測試。
(2)—般篩選方法
為了篩選與BC蛋白結合的化合物，在免疫沉澱法中，向用合適的去汙 劑製備的細胞裂解物中添加這些抗體或非抗體結合蛋白，形成免疫複合物。 所述免疫複合物由多肽、具有與該多肽結合的能力的多肽和抗體或非抗體 結合蛋白組成。除使用抗上述表位的抗體之外，還可以使用抗多肽的抗體 進行免疫沉澱，所述抗體可以如上所述製備(參照"抗體"項)。
當所述抗體是小鼠IgG抗體時，可以通過例如蛋白A Sepharose或蛋白 G Sepharose沉澱免疫複合物。如果將本發明的多肽製備成帶有表位，如GST 的融合蛋白，可使用與這些表位特異性結合的物質，例如穀胱甘肽-Sepharose 4B,按照與使用抗多肽的抗體相同的方式形成免疫複合物。
免疫沉澱可以才艮據或遵照，例如文獻(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988))中的方 法進行。
通常使用SDS-PAGE對免疫沉澱的蛋白進行分析，可以使用合適濃度 的凝膠通過蛋白的分子量來分析結合的蛋白。由於採用常規染色法例如考 馬斯(Coomassie)染色或銀染色難以檢測與多肽結合的蛋白，可以通過下述 方法改進所述蛋白的檢測靈敏度在含有放射性同位素35S -曱硫氨酸或35S -半胱氨酸的培養基中培養細胞，在細胞中標記蛋白，和檢測蛋白。在已知 蛋白的分子量時，可以從SDS -聚丙烯醯胺凝膠直接純化目標蛋白並測定其 序列。
作為使用多肽來篩選與BC多肽結合的蛋白質的方法，可以採用例如 West-Western印跡分析(Skolnik" a/, Cell 65: 83國卯(1991))。具體地說，可 以通過下述方法獲得能夠結合BC多肽的蛋白質使用噬菌體載體(例如 ZAP)，由期望表達與BC多肽結合的蛋白質的細胞、組織、器官(參照"核 苷酸、多肽、載體和宿主細胞"或"抗體"項)或者培養的細胞製備cDNA 文庫；使該蛋白在LB-瓊脂糖(LB-agarose)上表達，將表達的蛋白固定在濾 膜(filter)上，再使經純化和標記的BC多肽與上述濾膜反應，然後根據標記 來檢測表達與BC多肽結合的蛋白質的噬菌斑。利用生物素與抗生物素蛋白 之間的結合，或者利用與BC多肽或融合於BC多肽的肽或多肽(例如GST)特異性結合的抗體，均可以對BC多肽進行標記。也可以採用使用放射性同位素或螢光等的方法。在本說明書中，術語"標記"和"可檢出標記"用於指能夠利用分光學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法檢出的任意組合物。這樣的標記中包括用於使用標記鏈和素綴合物的
染色的生物素、磁珠(例如DYNABEADStm)、螢光染料(例如螢光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色螢光蛋白等)、放射性標記(例如311、 125I、 35S、 14C或3￥)、酶(例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶以及一般用於ELISA的其它酶)、以及比色定量用標記如膠體金或者有色玻璃或塑料(例如苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)制的珠子等。教導這樣的標記的使用的專利包括美國專利3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,275,149;和4,366,241。檢測這樣的標記的方法是本領域技術人員公知的。因而，例如，放射性標記可以使用照相底片或閃爍檢測器來檢測；螢光標記可以使用用於檢測發射光的光4企測器來4企測。酶標記通常這樣檢測對酶給與底物，；險測酶作用於底物而生成的反應產物；比色定量標記可以通過對生色的標記進行簡單可一見化來鬥全測。
或者，在本發明的篩選方法的另一實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜交系統(two-hybrid system) ("MATCHMAKER雙雜交系統"、"哺乳動物MATCHMAKER雙雜交測定試劑盒"、"MATCHMAKER單雜交系統，，(Clontech); "HybriZAP雙雜交載體系統，，(Stratagene);參照"Dalton andTreisman， Cell 68: 597-612(1992)，，， "Fields and Sternglanz， Trends Genet 10:286-92 (1994)，，)。
在雙雜交系統中，將本發明的多肽與SRF-結合區或GAL4-結合區融合，並在酵母細胞中表達。由預期表達與本發明的多肽結合的蛋白質的細胞製備cDNA文庫，並使該文庫在表達時與VP16或GAL4轉錄活化區域(transcriptional activation region)禹蟲合。然後l誇cDNA文庫導入上述酵母細月包，從檢測為陽性的克隆分離出源自所述文庫的cDNA (當酵母細胞中表達出可與本發明的多肽結合的蛋白質時，兩者的結合激活報導基因，使得陽性克隆能夠被檢出)。通過將上述分離的cDNA導入大腸桿菌並表達蛋白質，可以製備由該cDNA編碼的蛋白質。
就報導基因而言，除HIS3基因夕卜，還可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。採用親和層析法同樣可以篩選可與BC多肽結合的化合物。例如，可以將BC多肽固定於親和層析柱的載體上，並將包含能與BC多肽結合的蛋白質的受試化合物加於該層析柱。本說明書中的受試化合物可以是例如細胞提取物、細胞裂解物等。在將所述受試化合物上樣後，對層析柱進行洗滌，並可製備出已與BC多肽結合的化合物。
當受試化合物是蛋白時，分析獲得的蛋白的胺基酸序列，基於該序列合成寡聚DNA，以該寡聚DNA為探針篩選cDNA文庫，從而獲得編碼所述蛋白的DNA。
在本發明中，可以將利用表面等離子體共振現象(surface plasmonphenomenon)的生物傳感器(biosensor)用作對結合的化合物進行才全測或定量的手段。當使用這類生物傳感器時，而且只使用極少量的多肽且不需標記，可實時觀察表現為表面等離子體共振信號的BC多肽和受試化合物之間的相互作用(例如BIAcore, Pharmacia)。因此，可以使用生物傳感器諸如BIAcore來評價BC多肽和受試化合物之間的結合。
作為用於篩選抑制BC蛋白(例如A7322、 F3374V1或PBK/TOPK)與其結合配偶體之間的結合的化合物的方法，可以採用本領域技術人員公知的多種方法。例如，篩選可以採用體外測定系統如細胞系統等形式進行。更具體地，首先使BC蛋白或其結合配偶體之一結合在支持物上，然後將另一種蛋白同受試化合物一起添加至其中。然後，對該混合物進行溫育並清洗，再對結合在支持物上的另 一種蛋白進行檢測或測定。
在本發明的上下文中，2個蛋白之間的"結合的抑制"是指至少使蛋白之間的結合減少。因此，在一些情況下，與適當的(例如，未經用受試化合物處理的、或者來自非癌樣品，或來自癌樣品的)對照相比較，樣品中存在受試作用劑時的結合對的百分數有所減少。結合的蛋白的量的減少可以是相對於對照樣品中的結合對為例如小於卯％、小於80%、小於70%、小於60%、小於50%、小於40%、小於25%、小於腦、小於5%、小於1%或更少(例如0%)。
可用於結合蛋白的支持物(support)的實例包括例如不溶性多糖，如瓊脂糖、纖維素和葡聚糖；及合成樹脂，如聚丙烯醯胺、聚苯乙烯和矽；可優選使用由上述材料製備的商業上可得到的珠子和板(例如多孔板，生物傳感器晶片等)。使用珠子時，可以將它們填入柱子。或者，磁珠的使用也是本技術領域公知的，該方法可以藉助磁力容易地將結合在珠子上的蛋白分離出來。
蛋白質與支持物的結合可根據常規方法進行，這些方法例如化學結合 或物理吸附。可選地，蛋白質可通過特異性識別它的抗體而與支持物結合。 此外，還可以利用抗生物素蛋白和生物素來進行多肽與支持物的結合。
篩選當固定化的多肽暴露於合成化合物、天然物質庫或隨機噬菌體肽 展示文庫時與之結合的分子的方法，以及基於組合化學技術使用高通量
(Wrighton等,Science 273: 458-64 (1996); Verdine, Nature 384: 11-13 (1996); Hogan, Nature 384: H-9 (19M))來分離蛋白質和與蛋白質結合的化合物(包 括激動劑和拮抗劑)的篩選方法，是本領域技術人員公知的。
而且，多肽或其功能等價物的磷酸化水平可以根據本領域已知的任意 方法進行檢測。例如，使受試化合物與表達多肽的細胞接觸，對該細胞進 行充分時間的溫育以容許多肽的磷酸化，然後，可檢測磷酸化的多肽的量。 或者，在體外使受試化物與多肽相接觸，將多肽在容許該多肽磷酸化的條 件下進行溫育，然後檢測被磷酸化的多肽的量(參見"(17)體內和體外的激 酶測定"項)。
在本發明中，適於磷酸化的條件可以通過在磷酸供體例如ATP的存在 下對底物和酶蛋白進行溫育來提供。適於磷酸化的條件還包括表達多肽的 細胞的培養中的條件。例如，細胞是帶有包含編碼BC多肽的多核苷酸的表 達載體的轉化細胞(參見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞"項)。溫育後， 可以例如使用識別磷酸化底物的抗體，或者通過4企測ATP磷酸供體所轉移 的帶標記的Y磷酸，來檢測底物的磷酸化水平。在檢測磷酸化底物前，可以 將底物從其它組分或者轉化細胞的細胞溶解物中分離出來。例如，凝膠電 泳可以用於底物的分離。或者，可以通過接觸帶有針對底物的抗體的載體 來捕4足底物。
SDS-PAGE或免疫沉澱可以用於磷酸化蛋白的檢測。而且，識別磷酸 化殘基或轉移的標記磷酸的抗體可以用於檢測磷酸化蛋白水平。使用識別 磷酸化多肽的抗體的任意免疫學方法均可以用於檢測。使用識別磷酸化多 肽的抗體的ELISA或免疫印跡可以用於本發明。當使用標記的磷酸供體時， 利用跟蹤標記，可以4企測底物的磷酸化水平。例如，可以使用放射性標記 的ATP(例如"P-ATP)作為磷酸供體，此時，分離的底物的放射性與底物的磷酸化水平相關。或者，從未磷酸化的底物中特異性識別磷酸化底物的抗 體可以用於磷酸化底物的檢測。
與受試化合物接觸的磷酸化BC多肽的檢出量，如果與未接觸受試化合
物時才企出的量相比減少，則判斷為受試化合物抑制BC蛋白的多肽磷酸化， 因此判斷其具有乳腺癌抑制能力。在本說明書中，與在未接觸受試作用劑 的細胞中檢出的磷酸化水平相比，如果磷酸化水平減少例如10%、 25%或 50%,或者減少至少0.1倍、至少0.2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍、 至少10倍或更多，可以判斷為"減少"。可將Student's t-檢驗，Mann-Whitney U-檢驗或ANOVA用於統計學分析。
而且，可以按照本技術領域公知的任意方法來檢測多肽或其功能等價 物的表達水平。例如，可以採用報導分子測定。適合的報導基因和宿主細 胞是本技術領域中公知的。篩選所必需的報導分子構建物可以通過使用BC 基因或其下遊基因的轉錄調控區來製備。當基因的轉錄調控區為本領域技 術人員公知時，報導分子構建物可以通過使用已有的序列信息來製備。當 轉錄調控區尚未鑑定時，可以基於基因的核苦酸序列信息從基因組文庫中 分離出包含轉錄調控區的核苷酸區段。在本說明書中，基因的轉錄調控區 是指從起始密碼子到至少500bp上遊、優選1000bp、更優選5000或10000bp 上遊的區域。包含轉錄調控區的核苷酸區段可以從基因組文庫中分離出來， 或者使用PCR進行擴增。用於鑑定轉錄調控區的方法和測定規程是公知的 (Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。
各種低通量和高通量的酶測定方式是本技術領域公知的，並且可以容 易地適用於BC多肽的磷酸化水平的檢測或測定。為了進行高通量篩選，可 以將底物適宜地固定化在固體支持物上。反應後，可以通過上述方法檢測 固體支持物上的磷酸化底物。或者，可以在溶液中進行接觸步驟，然後可 以將底物固定化在固體支持物上並檢測磷酸化底物。為了容易地進行這樣 的測定，可以用鏈黴親和素包被固體支持物而用生物素標記底物，或者用 針對底物的抗體包被固體支持物。本領域技術人員可以根據篩選所希望的 通量能力確定適當的測定方式。
本發明的測定還適合於便於進行高通量篩選的自動化程序。已經開發 了用於溶液相化學的多種公知的機器人系統。這些系統包括自動工作站，如Takeda Chemical Industries 乂>司(Osaka, Japan)開發的自動合成裝置，以及 許多利用機器手的機器人系統(ZymateII、 Zymark公司、Hopkinton, Mass.; Orca， Hewlett Packard, PaloAlto， Calif.),它們模擬化學技術人員的手工合 成操作。上面的任何一種設備均適合用於本發明。為使其能夠如本文所述 地工作而對這些設備所作的修改(如果有的話)的性質和實施，對於相關領域 的技術人員而言是顯而易見的。此外，很多組合文庫本身是可以商業獲得 的(見例長口 ComGenex， Princeton、 N丄，Asinex， Moscow, Ru, Tripos， Inc., St. Louis, MO、 ChemStar， Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD等)。 (3)採用針對A3722或F3374的結合活性作為指標的篩選
本發明還提供使用本發明的多肽篩選在乳腺癌的治療中有用的化合物 的方法。本發明還提供對本發明的蛋白具有結合能力的化合物的篩選方法。 這樣的篩選方法的一種實施方案包括下述步驟
(a) 使受試化合物與選自下組的多肽接觸
(1) 包含SEQIDNO:80或82所示胺基酸序列的多肽，
(2) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 80或82所示氨基 酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽
(3) 與包含SEQIDNO:80或82的胺基酸序列的多肽具有至少約90%、 93%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%序列同一性的多肽，並且該多肽具有 與SEQ ID NO: 80或82的胺基酸序列的多肽等價的生物活性，和
(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 79或81所示核苷酸序列組成的 多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；
(b) ;險測受試化合物與多肽之間的結合活性；和
(c) 選擇與多肽結合的受試化合物。
用於篩選的多肽可以是重組多肽或衍生自天然來源的蛋白、或者它們 的部分肽。前述任意受試化合物均可以用於篩選。
例如，作為使用A3722多肽或F3374V1多肽(或者它們的功能等價物， 參見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞"項)篩選與多肽結合的蛋白的方法， 可以採用本領域技術人員公知的多種方法。這種篩選可以使用免疫沉澱、
92West-Western印跡分析(Skolnik"a/， Cell 65: 83-90(1991))、利用細胞的雙 雜交系統("MATCHMAKER雙雜交系統"、"哺乳動物MATCHMAKER雙雜 交測定試劑盒"、"MATCHMAKER單雜交系統"(Clontech); "HybriZAP雙雜 交載體系統，，(Stratagene);參照"Dalton and Treisman， Cell 68: 597-612 (1992)，，， "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)，，)、親和層 析色語以及利用表面等離子共振現象的生物傳感器來進行(參見"(2)—般篩 選方法"項)。
可以使用前述的任意受試化合物(參見(l)"用於篩選的受試化合物"項)。 (4)採用A3722或F3374的表達水平作為指標的篩選 此外，本發明的篩選方法可以包括以下步驟
(a) 使導入了載體的細胞與候選化合物接觸，其中所述載體含有^7322 基因或F3374F7基因的轉錄調控區和在該轉錄調控區的調控下表達的報導 基因；
(b) 測定所述報導基因的表達或活性水平；和
(c) 選擇這樣的化合物與不存在該受試化合物時檢出的所述報導基因 的表達或活性水平相比，該化合物降低所述報導基因的表達或活性水平。
合適的報導基因和宿主細胞是本技術領域公知的。篩選所必需的報導 基因構建體可以按照前述方法製備(參見"(2)—般篩選方法，，項)。
通過該篩選而分離出的化合物是抑制A7322多肽或F3374V1多肽的活 性的作用劑的候選物，其對於乳腺癌的治療和預防是有用的。通過本發明 的篩選方法獲得的化合物中還包括通過本篩選方法得到的具有與A7322多 肽或F3374V1多肽結合的活性的化合物的部分結構發生增加、缺失和/或取 代的變化而得到的化合物。
在 一 個更進一 步的實施方案中，本發明提供作為乳腺癌治療中的靶標 的候選化合物的篩選方法。如以上詳細討論的那樣，通過調控A7322蛋白 或F3374V1蛋白的表達水平，可以控制乳腺癌的發生和進展。因此，利用 A7322或F3374V1的表達水平和活性為指標進行篩選，能夠鑑定乳腺癌治 療靶標的候選'化合物。在本發明的上下文中，這樣的篩選可以包括例如以 下步驟
(a) 使候選化合物與表達A7322蛋白或F3374V1蛋白的細胞接觸；和
(b) 選擇這樣的化合物與在不存在受試化合物的條件下檢出的表達水平相比，所述化合物降j氐A7322或F3374V1的表達水平。
表達A7322蛋白或F3374V1蛋白中的至少一種的細胞包括例如從乳腺 癌建立的細胞系，這樣的細胞可以用於本發明的上述篩選。表達水平可以 採用本領域技術人員公知的方法來評價。在篩選方法中，可以選擇降低 A7322或F3374V1中至少一種的表達水平的化合物作為j美選化合物。
在本發明的篩選在乳腺癌的治療中有用的化合物的方法的另 一種實施 方案中，該方法採用本發明的多肽的生物活性作為指標。A7322蛋白或 F3374V1蛋白具有促進細胞增殖的活性，因而可以利用該活性作為指標來 篩選可抑制本發明的這些蛋白中之一 的活性的化合物。
任何多肽均可以用於篩選，只要它們包含A7322蛋白或F3374V1蛋白 的生物活性(例如分別與PHB2/REA或AURKB結合促進細胞增殖)。這樣的 生物活性包含人A7322蛋白或F3374V1蛋白的細胞增殖活性。例如，可以 使用人A7322蛋白或F3374V1蛋白，也可以使用與這些蛋白在功能上等價 的多肽。這樣的多肽可以是細胞內源性表達的或外源性表達的。 (5)採用A7322和PHB2/REA的結合作為指標的篩選
在本發明中，確認了 A7322蛋白與PHB2/REA蛋白相互作用，抑制 PHB2/REA蛋白的核轉移(圖IOA)。而且，還確認了 A7322蛋白存在下的 ERa的再活化的抑制(圖11A和B)。PHB2/REA是已知的雌激素受體a(ERa) 的選擇性共調控因子，其抑制以雌二醇為配體的Era的轉錄活性。由此， 本發明人等揭示，A7322通過抑制ERa與PHB2/REA的相互作用來活化ERa 的轉錄活性(圖IIC)。因此，抑制A7322蛋白與PHB2/REA之間的結合的 化合物可以通過採用這樣的A7322蛋白與PHB2/REA間的結合、PHB2/REA 蛋白的細胞定位或者ERa的轉錄活性作為指標來篩選。因而，本發明還提 供用於抑制A7322蛋白與PHB2/REA之間的結合的化合物的篩選方法，該 方法能夠採用這樣的A7322蛋白與PHB2/REA間的結合、PHB2/REA蛋白 的細胞定位或者ERa的轉錄活性作為指標來進行篩選。而且，本發明還提 供用於篩選治療或預防乳腺癌的化合物的方法。本方法特別適合於可能用 於乳腺癌的治療或預防的作用劑的篩選。更具體地，本方法包括下述步驟
(a) 在存在受試化合物的條件下，使A7322多肽或其功能等價物與 PHB2/REA多肽或其功能等價物相接觸；
(b) 檢測步驟(a)的多肽之間的結合；和(c)選擇抑制A7322多肽與PHB2/REA多肽之間的結合的受試化合物。
在本發明的上下文中，A7322多肽或PHB2/REA多肽的功能等^f介物分 別指具有與A7322多肽(SEQ ID NO:79)或PHB2/REA多肽(SEQ ID NO:90) 等價的生物活性的多肽(參見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞"項)。
作為篩選抑制A7322與PHB2/REA間的結合的化合物的方法，可以採 用本領域技術人員公知的多種方法。
用於篩選的多肽可以是重組多肽或衍生自天然來源的蛋白、或者它們 的部分肽。前述任意受試化合物均可以用於篩選。
作為使用A3722多肽或PHB2/REA多肽(或者它們的功能等價物，參見 "核苷酸、多肽、載體和宿主細胞，，項)篩選例如與多肽結合的蛋白的方法， 可以採用本領域技術人員公知的多種方法。這種篩選可以使用例如免疫沉 澱、West-Western印跡分析(SkolnikW"/, Cell 65: 83-90(1991))、利用細胞 的雙雜交系統("MATCHMAKER雙雜交系統"、"哺乳動物MATCHMAKER 雙雜交測定試劑盒"、"MATCHMAKER單雜交系統"(Clontech); "HybriZAP 雙雜交載體系統，，(Stratagene);參照"Dalton and Treisman， Cell 68: 597-612 (1992)，,， "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)，，)、親和層 析色譜以及利用表面等離子共振現象的生物傳感器來進行(參見"(2)—般篩 選方法"項)。
可以使用前述的任意受試化合物(參見(l)"用於篩選的受試化合物"項)。 而且，本發明提供採用PHB2/REA的細胞定位作為指標的、抑制A7322
與PHB2/REA間的相互作用的化合物的方法。更具體地，本方法包括以下
步驟
(a) 使候選化合物與表達A7322蛋白以及PHB2/REA蛋白的細胞相接
觸；
(b) 4企測PHB2/REA蛋白的亞細胞定位；和
(c) 選擇這樣的化合物與不存在受試化合物時檢出的所述蛋白的水平 相比，所述化合物降低核內的PHB2/REA蛋白的水平。
在某些實施方案中，該方法進一步包括檢測候選化合物與A7322或 PHB2/REA的結合的步驟，或者檢測A7322與PHB2/REA間結合的水平的 步驟。表達A7322蛋白和PHB2/REA蛋白的細胞包含例如從乳腺癌建立的 細胞系，這樣的細胞只要其表達這2種基因，就可以用於本發明的上述篩選。或者，對於細胞，可以轉染A7322和/或PHB2/REA的表達載體，以表 達這2種基因。PHB2/REA蛋白的亞細胞定位可以通過使用抗PHB2/REA 抗體的免疫細胞化學染色(參照"(8)免疫細胞化學染色"項)、分級法與 Western印跡法或者與利用同位素或螢光標記的PHB2/REA蛋白的組合來進 行檢測(參見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞"項)。
在另一個實施方案中，本發明提供採用ERa的轉錄活性作為指標的、 抑制A7322與PHB2/REA間的相互作用的化合物的方法。更具體地，本方 法包括以下步驟
(a) 在E2處理下，使候選化合物與表達A7322蛋白、PHB2/REA蛋白以 及ERa蛋白且導入有下述載體的細胞相接觸，所述載體包含雌激素應答性 轉錄調控區以及在該轉錄調控區的調控下表達的報導基因；
(b) 測定該報導基因的表達或活性水平；和
(c) 選擇這樣的化合物與不存在受試化合物時檢出的該報導基因的表 達或活性水平相比，所述化合物降低該報導基因的表達或活性水平。
表達A7322蛋白、PHB2/REA蛋白和ERa蛋白的細胞包含例如從乳腺 癌建立的細胞系，這樣的細胞只要其表達這3種基因，就可以用於本發明 的上述篩選。或者，對於細胞，可以轉染A7322、 PHB2/REA和ERa的表 達載體中每一種或任一種(each or either),以使得這3種基因表達。合適的 報導基因和宿主細胞是本技術領域公知的。篩選所需的報導分子構建體可 以按照上文或下文記載的方法來製備(參見"(2)—般篩選方法"和"(19)雌 激素應答元件(ERE)報導基因測定"項)。 (6)採用F3374V1的磷酸化水平作為指標的篩選
而且，在本發明中確認了 F3374V1蛋白因在C末端區域(第591~730位 胺基酸)處的磷酸化而被修飾。因而，可以採用這樣的修飾作為指標來篩選 抑制F3374V1蛋白的磷酸化的化合物。因此，本發明還提供用於抑制 F3374V1蛋白的磷酸化的化合物的篩選方法。而且，本發明還提供篩選用 於治療或預防乳腺癌的化合物的方法。本方法特別適合於可能用於乳腺癌 的治療或預防的作用劑的篩選。更具體地，本方法包括下述步驟
(a)使受試化合物與表達選自下組的多肽的細胞接觸
(1) 包含SEQIDNO:82所示胺基酸序列的多肽，
(2) 包含取代、缺失、插入和/或添加了 一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列組成的 蛋白等價的生物活性的多肽，
(3) 與包含SEQ ID NO: 82的胺基酸序列的多肽具有至少90%、 93%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%序列同一性的多肽，並且該多肽具有與SEQ ID NO: 82的胺基酸序列的多肽等價的生物活性，和
(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:81所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:82所示 胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；
(b) 檢測該多肽的磷酸化水平；
(c) 比較該多肽的磷酸化水平與不存在該受試化合物時檢出的該多肽 的磷酸化水平；
(d) 選擇降低該多肽的磷酸化水平的化合物作為該多肽磷酸化水平的 抑制劑或者用於治療或預防乳腺癌的化合物。
在本說明書中，可以使用任意細胞，只要其表達F3374V1多肽或其功 能等價物即可(參見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞"項)。在本篩選中使 用的細胞可以是天然表達F3374V1多肽的細胞，這其中包括例如衍生自乳 腺癌和睪丸的細胞、以及由它們建立的細胞系。可以使用HBC4, HBC5, HBLIOO， HCC1937， MCF-7， MDA-MB-231, MDA畫MB-435S， SKBR3, T47D, 和YMB1這些乳腺癌的細胞系。
或者，篩選中使用的細胞也可以是並非天然表達F3374V1多肽、而是 被用表達F3374V1多肽或F3374V1的功能等價物的載體轉染的細胞。這樣 的重組細胞可以按照諸如上述的公知基因工程方法(例如Morrison DA.， J Bacteriology 1977， 132: 349-51; Clark畫Curtiss & Curtiss， Methods in Enzymology (Wu等人編)1983， 101: 347-62)來獲得(參見"核苷酸、多肽、載 體和宿主細胞"項)。
前述的任意受試化合物可以用於本發明的篩選。但是，優選選擇可滲 透至細胞內的化合物。或者，當受試化合物是多肽時，可以通過將包含編 碼受試作用劑的核苷酸序列的載體轉染到細胞中，在細胞中表達受試作用 劑，從而使本篩選中的細胞與受試作用劑接觸。
在另一個實施方案中，可以在體外提供適於F3374V1多肽或F3374V1 的功能等價物磷酸化的條件。該篩選方法包括下述步驟
97(a) 使受試化合物與本發明的多肽或其片段(例如C末端區域(第591 730 位胺基酸))接觸；
(b) 檢測步驟(a)的多肽的磷酸化；
(c) 選擇這樣的化合物與不存在受試化合物的條件下檢出的生物活性 相比，所述化合物抑制所述多肽的磷酸化。
在本發明中，如上述，F3374V1蛋白的生物活性優選為磷酸化活性。 本領域技術人員可以如上述地評價磷酸化水平(參見"(2)—般篩選方法，，項)。
因此，在這些實施方案中，本發明提供篩選用於抑制F3374V1的磷酸 化或者用於預防或治療乳腺癌的作用劑的方法，本方法包括下述步驟
(a) 在容許該多肽的磷酸化的條件下，使受試化合物與選自下組的多肽 或其包含磷酸化位點的片段接觸
(1) 包含SEQIDNO:82所示胺基酸序列的多肽，
(2) 包含取代、缺失、插入和/或添加了 一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列組成的 蛋白等價的生物活性的多肽，
(3) 與包含SEQIDNO: 82的胺基酸序列的多肽具有至少約90%、93%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%序列同一性的多肽，其中該多肽具有與SEQ ID NO: 82的胺基酸序列的多肽等價的生物活性，和
(4) 由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:81所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽或其包含磷酸化位點的片段，其中該多肽 具有與由SEQ ID NO:82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；
(b) 檢測該多肽或其片段的磷酸化水平；
(c) 比較底物的磷酸化水平與不存在該受試化合物時檢出的該多肽的 磷酸化水平；
(d) 選擇降低該多肽的磷酸化水平的化合物作為用於抑制該多肽的磷 酸化或者預防或治療乳腺癌的化合物。
在這些實施方案中，容許F3374V1多肽的磷酸化的條件可以通過將該 多肽與適用於F3374V1多肽的磷酸化的激酶以及ATP—起溫育來提供。在 一些實施方案中，還使F3374V1多肽與AURKB多肽相接觸。而且，在優 選的實施方案中，可以將增強F3374V1多肽的磷酸化的物質添加到篩選的 反應混合物中。如果多肽的磷酸化因該物質的添加而增強，則可以以更高的靈敏度來確定磷酸化水平。
F3374V1多肽或其功能等價物的磷酸化水平可以採用本技術領域公知 的任意方法來檢測(參見"(2)—般篩選方法"項)。
而且，本發明人等揭示了在乳腺癌細胞中F3374V1與AURKB相互作 用(圖13)。因此，可以認為兩種多肽的相互作用在癌症發生或細胞增殖，特 別是乳腺癌細胞增殖中起決定性作用。基於此，希望篩選抑制F3374V1多 肽與AURKB多肽相互作用或其反相互作用(vice versa interaction)的、在乳 腺癌的治療或預防中有用的化合物。因此，本發明提供用於篩選抑制 F3374V1多肽與AURKB多肽相互作用的化合物的方法。而且，本發明還 提供篩選用於治療或預防乳腺癌的化合物的方法。本方法包括下述步驟
(a) 在受試化合物的存在下，使AURKB多肽或其功能等價物與F3374V1 多肽或其功能等價物相接觸；
(b) 檢測步驟(a)的多肽間的結合；
(c) 選擇抑制AURKB多肽與F3374V1多肽間的結合的受試化合物。 在本發明的語境下，F3374V1多肽或AURKB多肽的功能等價物分別是
指具有與F3374V1多肽(SEQ ID NO:82)或AURKB多肽(SEQ ID NO:88)等價 的生物活性的多肽(參見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞"項)。
作為抑制AURKB引起的F3374V1石舞酸化的化合物的篩選方法，可以 採用本領域技術人員公知的多種方法。例如，篩選可以以細胞系統等體外
測定系統的形式進行。
本發明還基於這樣的認識AURKB具有針對F3374V1的激酶活性。例 如，AURKB引起的F3374V1磷酸化的位點位於F3374蛋白的C末端部分(第 591 730位胺基酸)(SEQ ID NO:122)。這些認識暗示AURKB對F3374V1 的磷酸化在腫瘤細胞增殖中起著重要作用、以及AURKB對F3374V1的磷 酸化的抑制可以成為抗癌藥物開發的有希望的目標。出於該目的，本發明 的一個方面涉及調節AURKB介導的F3374V1的磷酸化的受試化合物的鑑 定。因此，本發明提供篩選用於抑制AURKB介導的F3374V1的磷酸化的 化合物的方法。而且，本發明還提供一種篩選用於治療或預防乳腺癌的化 合物的方法。本方法包括下述步驟
(a)在受試化合物的存在下，在適於AURKB對F3374V1的磷酸化的條 件下，將F3374V1和AURKB—起溫育，其中，所述F3374V1是選自下組的多肽
(1)包含SEQIDNO:82所示胺基酸序列(F3374Vl)的多肽；
(2 )包含取代、缺失或插入了 一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 82所
示胺基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸
序列組成的蛋白等價的生物活性；
(3)與包含SEQ ID NO: 82的胺基酸序列的多肽具有至少約90°/。、 93%、
95%、 96%、 97%、 98%或99%序列同一性的多肽，其中該多肽具有與SEQ
ID NO: 82的胺基酸序列的多肽等價的生物活性，和
(4)由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 81所示核苷酸序列組成的多核
苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 82
所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；
(b) 檢測FBMV1的磷酸化水平；
(c) 將F3374Vl的磷酸化水平與對照水平相比較；和
(d) 選擇這樣的化合物與不存在受試化合物時檢出的對照水平相比， 所述化合物降低F3374V1的磷酸化水平。
這裡，篩選抑制AURKB介導的F3374V1的磷酸化的化合物或者治療 或預防乳腺癌的化合物的方法包括在C末端F3374蛋白(第591 730位氨基 酸)(SEQ IDNO:122)或該多肽的同源位置處的F3374V1磷酸化水平的檯r測。
在本發明的另一個方面中，還提供用於篩選抑制AURKB介導的 F3374V1的磷酸化或用於治療或預防乳腺癌的化合物的試劑盒。本試劑盒 包含以下組成組分
(a)選自下組的多肽 (1 )包含SEQIDNO:82所示胺基酸序列(F3374V1)的多肽， (2 )包含取代、缺失或插入了 一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 82所 示胺基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸 序列組成的蛋白等價的生物活性，
(3)與包含SEQIDNO: 82的胺基酸序列的多肽具有至少約90%、 93%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%序列同一性的多肽，其中該多肽具有與SEQ ID NO: 82的胺基酸序列的多肽等價的生物活性，和
(4)由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 81所示核苷酸序列組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；
(b) 選自下組的多肽
(1 )包含SEQ IDNO:88所示胺基酸序歹廿(AURKB)的多肽，
(2 )包含取代、缺失或插入了 一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 88所
示胺基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 88所示胺基酸
序列組成的蛋白等價的生物活性，
(3)與包含SEQ ID NO: 88的胺基酸序列的多肽具有至少約90%、 93%、
95%、 96%、 97%、 98%或99%序列同一性的多肽，其中該多肽具有與SEQ
ID NO: 88的胺基酸序列的多肽等價的生物活性，和
(4 )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 87所示核苷酸序列組成的多核
苷酸雜交的多核普酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 88
所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；以及
(c) 用於檢測F3374V1的磷酸化水平的試劑。
而且，本發明還提供用於篩選治療或預防乳腺癌的化合物的試劑盒。 本試劑盒包含以下組成組分
(a) 表達選自下組的多肽的細胞
(1 )包含SEQ ID NO:82(F3374Vl)所示胺基酸序列的多肽，
(2 )包含取代、缺失或插入了 一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 82所
示胺基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸
序列組成的蛋白等價的生物活性，
(3)與包含SEQ ID NO: 82的胺基酸序列的多肽具有至少約90%、 93%、
95%、 96%、 97%、 98%或99%序列同一性的多肽，其中該多肽具有與SEQ
ID NO: 82的胺基酸序列的多肽等價的生物活性，和
(4)由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 81所示核苷酸序列組成的多核
苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 82
所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；以及
(b) 用於檢測F337々V1的磷酸化水平的試劑。
而且，用於篩選抑制AURKB介導的F3374V1的磷酸化的化合物或治 療或預防乳腺癌的化合物的試劑盒包含還表達選自下組的多肽的細胞 (a)包含SEQ ID NO:88 (AURKB)所示胺基酸序列的多肽， (b )包含取代、缺失或插入了 一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 88所示胺基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 88所示胺基酸 序列組成的蛋白等價的生物活性，
(c)與包含SEQIDNO: 88的胺基酸序列的多肽具有至少約90°/。、 93%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%序列同一性的多肽，其中該多肽具有與SEQ ID NO: 88的胺基酸序列的多肽等價的生物活性，和
(d)由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 81所示核苦酸序列組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 88 所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性。
在另 一個方面中，試劑盒中使用的細胞是乳腺癌細胞。
在本發明中，試劑盒中還可以包含磷酸供體。本發明的試劑盒還可以 包含識別磷酸化的C末端F3374蛋白(第591 730位胺基酸)(SEQIDNO:122) 的抗體作為檢測磷酸化F3374V1的試劑。因此，本發明還提供用於篩選治 療或預防乳腺癌的化合物的試劑盒，在該試劑盒中，用於檢測F3374V1的 磷酸化水平的試劑是識別發生在C末端F3374蛋白(第591 730位氨基 酸)(SEQIDNO:122)的磷酸化的抗體。根據本發明能夠確定對象蛋白是否是 磷酸化的靶標。例如，針對F3374V1的激酶活性可以這樣來確定將多肽 在適於F3374V1的磷酸化的條件下溫育，檢測磷酸化F3374V1水平。例如， AURKB對F3374V1的磷酸化的位點為C末端F3374蛋白(第591-730位氨 基酸)(SEQ ID NO:122)。
在本發明中，適於AURKB對F3374V1的磷酸化的條件可以通過在磷 酸供體例如ATP的存在下對F3374V1和AURKB進行溫育來提供。適於 AURKB對F3374V1的磷酸化的條件還包括在表達該多肽的細胞的培養中 的條件(參見"(2)—般篩選方法"項)。
用於製備與指定蛋白功能等價的多肽的方法是本領域技術人員公知 的，這其中包括用於向如上述的蛋白中導入變異的公知方法(參見"核苷酸、 多肽、載體和宿主細胞"項)。
在一些優選實施方案中，F3374V1的功能等價物中可以包括對應於 AURKB結合域的氨基S吏序列，例如SEQ ID NO:122的胺基酸序列。相似地， AURKB的功能等價物中可以包括對應於F3374V1結合域的胺基酸序列。
如上述，F3374V1與AURKB之間結合被抑制導致細胞增殖受到抑制。 而且，AURKB對F3374V1的磷酸化被抑制也導致細胞增殖受到抑制。因此，抑制這種結合或磷酸化的化合物可能充當治療或預防乳腺癌的藥物。
用於本發明的篩選方法的F3374V1多肽和AURKB多肽可以是重組多肽， 也可以是來源於自然界的蛋白，還可以是它們的部分肽，只要它保持著全 長蛋白的結合活性或磷酸化活性即可。這樣的保持著結合能力或磷酸化活 性的部分肽在本說明書中稱做"功能等價物"。篩選方法中要使用的F3374V1 多肽和AURKB多肽可以是例如純化多肽、可溶性蛋白、結合於載體的形 式、或者與其它多肽融合的融合蛋白。
作為用於篩選抑制F3374V1與AURKB間結合的化合物的方法，可以 釆用本領域技術人員公知的多種方法。蛋白間的結合優選在緩沖液中進行， 緩沖液的例子包括但不限於磷酸緩衝液和Tris緩衝液。但是，所選擇的緩 衝液不得抑制蛋白間的結合。前述的任意檢測方法可以用於本篩選(參見"(2) 一般篩選方法"項)。而且，前述任意受試化合物可以用於本篩選(參照"(1) 用於篩選的受試化合物"項)。
根據本發明的篩選方法分離出的化合物是抑制F3374V1或AURKB的 活性的藥物的候選，用於治療或預防歸於例如細胞增殖性疾病的疾病，如 乳腺癌。對根據本發明的篩選方法得到的化合物的部分結構通過增加、缺 失和/或取代而轉變從而得到的化合物也包括在根據本發明的篩選方法得到 的化合物中。對抑制過表達基因即F3374V1基因和AURKB基因的表達有 效的化合物在臨床上可以認為是有價值的，可以在動物模型或受試者中對 其降低或防止癌細胞增殖的能力進行進一 步的測試。
本發明還可包括與F3374V1多肽或AURKB多肽結合從而抑制它們的 相互作用的蛋白的篩選。為此目的，可以採用本領域技術人員公知的多種 方法。這樣的篩選例如可以通過採用本4支術領域公知方法的免疫沉澱測定 來進行。本發明的蛋白可以採用上述標準規程通過重組來產生(參見"(2)— 般篩選方法"項)。與F3374V1多肽或AURKB多肽結合的化合物也可以採 用上述的親和色鐠來篩選(參照"(l)用於篩選的受試化合物"項)。
(7)採用PBK/TOPK的磷酸化水平作為指標的篩選
本發明提供誘導乳腺癌細胞中的凋亡或細胞周期停滯的作用劑的篩選 方法。我們認為誘導表達TOPK的細胞例如乳腺癌細胞的凋亡或細胞周期 停滯的作用劑對於乳腺癌的治療或預防是有用的。因此，本發明還提供用 於篩選治療或預防乳腺癌的作用劑的方法。本方法特別適用於能夠用於浸潤性乳腺導管癌(IDC)的治療或預防的作用劑的篩選。 更具體地，本方法包含下述步驟
(a) 使表達PBK/TOPK多肽或其功能等價物的細胞與作用劑接觸；
(b) 檢測PBK/TOPK多肽的磷酸化水平；
(c) 將該多肽的磷酸化水平與在不存在作用劑的條件下4企出的該多肽 的磷酸化水平相比較；和
(d) 選擇降低該多肽的磷酸化水平的作用劑作為誘導表達TOPK的細 胞、例如乳腺癌細胞的凋亡或細胞周期停滯的作用劑，或者作為用於治療 或預防乳腺癌的作用劑。
在另一實施方案中，本方法包括下述步驟
(a) 使表達PP1 a多肽和PBK/TOPK多肽或它們的功能等價物的細胞與 作用劑接觸；
(b) 檢測PBK/TOPK多肽的磷酸化水平；
(c) 將多肽的磷酸化水平與在不存在作用劑的條件下檢出的多肽的磷 酸化水平相比較；和
(d) 選擇降低多肽的磷酸化水平的作用劑作為誘導乳腺癌細胞的凋亡 或細胞周期停滯的作用劑，或者作為用於治療或預防表達TOPK的細胞， 例如乳腺癌的作用劑。
這裡，可以使用任意細胞，只要其表達PBK/TOPK多肽或其功能等價 物即可。在本篩選中使用的細胞可以是天然表達PBK/TOPK多肽的細胞， 這其中包括例如來自乳腺癌(例如IDC)、胸腺和睪丸的細胞、以及由它們建 立的細胞系。可以使用HBC4， HBC5， HBL100, HCC1937, MCF-7, MDA-MB-231， MDA-MB-435S, SKBR3, T47D和YMB1這些乳腺癌細胞系。
或者，篩選中使用的細胞也可以是並非天然表達PBK/TOPK多肽和 PPla,而是被用表達PBK/TOPK多肽或PBK/TOPK的功能等價物的載體、 或者表達PPla的載體轉染的細胞。這樣的重組細胞可以按照諸如上述的公 知基因工程方法(例如Morrison DA., J Bacteriology 1977， 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss， Methods in Enzymology (eds. Wu等人)1983， 101: 347-62)來獲得(參見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞"項)。
前述的任意受試作用劑均可以用於本篩選(參見"(l)用於篩選的受試化 合物"項)。但是，優選選擇可滲透至細胞內的作用劑。或者，當受試作用劑是多肽時，可以通過將包含編碼受試作用劑的核苷酸序列的載體轉染到 細胞中，在細胞內表達受試作用劑，從而使本篩選中的細胞與受試作用劑接觸。
在本發明中，可以將增強PBK/TOPK多肽的磷酸化的物質添加到篩選 的反應混合物中。如果多肽的磷酸化因該物質的添加而增強，則可以以更 高的靈敏度來確定磷酸化水平。
PBK/TOPK多肽或其功能等價物的磷酸化水平可以採用本技術領域公 知的任意方法來檢測(參見"(2)—般篩選方法"項)。
或者，PBK/TOPK多肽或其功能等價物的磷酸化水平還可以通過檢測 細胞的細胞周期來檢測。具體地，細胞的細胞周期可以採用本技術領域公 知的常規方法包括FACS等來確定。當為了確定多肽的磷酸化水平而檢測 細胞的細胞周期時，優選在細胞與受試作用劑接觸後對細胞溫育充分的時 間、例如12小時或以上，直至正常細胞經過G2/M期。根據該規程，當檢 測到細胞周期停止在G2/M期時，可以判定受試物質具有誘導乳腺癌細胞的 凋亡的能力。
在另一實施方案中，本方法包括下述步驟
(a) 在允許底物的磷酸化的條件下，使CDK1、細胞周期蛋白Bl和 PBK/TOPK多肽或其功能等價物與能夠被該多肽磷酸化的底物和作用劑相 接觸；
(b) 檢測PBK/TOPK多肽的磷酸化水平；
(c) 將PBK/TOPK多肽的磷酸化水平與不存在作用劑時檢出的磷酸化水 平相比4交；和
(d) 選擇降低PBK/TOPK多肽的磷酸化水平的作用劑作為用於誘導乳腺 癌細胞的凋亡的作用劑，或者作為用於抑制PBK/TOPK多肽的磷酸化或者 用於治療或預防乳腺癌的作用劑。
這裡，篩選中使用的CDK1、細胞周期蛋白Bl以及PBK/TOPK多肽或 其功能等價物，可以採用本領域技術人員公知的方法以重組蛋白或天然蛋 白的形式來製備。多肽可以按照諸如上述的產生多肽的任意公知基因工程 方法(例如Morrison, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu等人)1983， 101: 347-62)來獲得(參見"核苷 酸、多肽、載體和宿主細胞"項)。
105而且，在本發明中還可以使用CDK1和細胞周期蛋白Bl的蛋白複合體， 只要其保持針對PBK/TOPK蛋白的激酶活性。這樣的部分肽可以通過基因 工程、肽合成的公知方法或者用適當的肽酶消化天然CDK1和細胞周期蛋 白B1蛋白來產生(參見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞"項)。
與CDK1和細胞周期蛋白Bl的蛋白複合體相接觸的PBK/TOPK多肽 或其功能等價物可以是例如純化多肽、可溶性蛋白、或者與其它多肽相融 合而成的融合蛋白。
在這些實施方案中，容許具有CDK1和細胞周期蛋白Bl多肽的激酶活 性的條件可以通過將CDK1和細胞周期蛋白Bl多肽與用於磷酸化 PBK/TOPK多肽的PBK/TOPK多肽以及ATP —起溫育來實現。而且，在本 發明中，可以將增強PBK/TOPK多肽的磷酸化的物質添加到篩選的反應混 合物中。如果PBK/TOPK多肽的磷酸化因該物質的添加而增強，則可以以 更高的靈敏度來確定PBK/TOPK多肽的磷酸化水平。
CDK1、細胞周期蛋白Bl以及PBK/TOPK多肽或其功能等價物與受試 作用劑的接觸可以在體內或體外進行。體外篩選可以在緩衝液中進行，緩 沖液的例子包括但不限於磷酸緩沖液和Tris緩衝液，只要緩衝液不抑制 PBK/TOPK多肽或其功能等價物的磷酸化即可。
根據本發明的一個方面，可以本篩選方法所必需的組分作為試劑盒來 提供，用於篩選誘導乳腺癌細胞的凋亡或細胞周期停滯的作用劑或者治療 或預防乳腺癌的作用劑。本發明的試劑盒可以包含，例如，表達PBK/TOPK 多肽或其功能等價物、或者PBK/TOPK多肽和/或PPla或其功能等價物、 或者PBK/TOPK、 CDK1和細胞周期蛋白Bl的多肽或它們的功能等價物的 細胞。而且，本試劑盒還可以包含對照試劑(陽性和/或陰性)、可檢測標記、 細胞培養基或緩衝液、篩選所必需的容器、用於實施本方法的說明書(例如 書面文件、磁帶、VCR、 CD-ROM、其它)等等。組分和試劑可以分別包裝 在不同的容器中。
(8)採用PBK/TOPK對底物的激酶活性作為指標的篩選
根據本發明的另一個方面，可以採用PBK/TOPK底物的磷酸化水平作 為指標來篩選誘導乳腺癌細胞的凋亡或者能夠用於治療或預防乳腺癌(如 IDC)的作用劑。具體地，本方法包括下述步驟
(a)在容許底物的磷酸化的條件下，使PBK/TOPK多肽或其功能等價物與被該多肽磷酸化的底物以及作用劑相接觸；
(b) 檢測底物的磷酸化水平；
(c) 將底物的磷酸化水平與不存在作用劑時檢出的底物的磷酸化水平相 比較；和
(d) 選擇降低底物的磷酸化水平的作用劑作為抑制PBK/TOPK多肽的激 酶活性、誘導乳腺癌細胞的凋亡的作用劑，或者作為用於治療或預防乳腺 癌的作用劑。
在一些實施方案中，底物為組蛋白H3多肽。篩選中使用的PBK/TOPK 多肽或其功能等價物，可以採用本領域技術人員公知的方法以重組蛋白或 天然蛋白的形式來製備。多肽可以按照諸如上述的產生多肽的任意公知基 因工禾呈方法(例:^口 Morrison, J Bacteriology 1977， 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu等人)1983， 101: 347-62)來獲得(參 見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞"項)。
而且，在本發明中還可以使用PBK/TOPK蛋白的部分肽，只要其保持 蛋白的激酶活性。這樣的部分肽可以通過基因工程、肽合成的公知方法或 者用適當的肽酶消化天然PBK/TOPK蛋白來產生(參見"核苦酸、多肽、載 體和宿主細力包"項)。
與受試物質和底物相接觸的PBK/TOPK多肽或其功能等價物可以是例 如純化多肽、可溶性蛋白、或者與其它多肽相融合而成的融合蛋白。
底物是能夠接受磷酸基團的任意化合物，例如蛋白、核酸(RNA或DNA) 或小分子。例如，底物可以是組蛋白或者包含磷酸化位點的組蛋白片段。 已經確認組蛋白H3的SerlO可以被PBK/TOPK蛋白磷酸化。因此，組蛋白 H3、或者包含Ser10的組蛋白H3的片段作為底物是有用的。
與PBK/TOPK多肽相似，用於本篩選的組蛋白H3可以以重組蛋白或 天然蛋白的形式來製備。而且，與PBK/TOPK多肽相似，組蛋白H3也可 以以融合蛋白的形式來製備，只要作為結果產生的融合蛋白能夠被 PBK/TOPK多肽磷酸化即可。組蛋白H3的核苷酸序列是本技術領域7>知的。 而且，組蛋白H3也可以商業獲得(例如Roche公司產品)。
在這些實施方案中，容許組蛋白H3多肽的磷酸化的條件可以通過將組 蛋白H3多肽與用於磷酸化組蛋白H3多肽的PBK/TOPK多肽以及ATP — 起溫育來實現。而且，在本發明中，可以將增強PBK/TOPK多肽的激酶活
1性的物質添加到篩選的反應混合物中。如果底物的磷酸化因該物質的添加而增強，則可以以更高的靈敏度來確定底物的磷酸化水平。
PBK/TOPK多肽或其功能等價物、其底物以及受試作用劑的接觸可以在體內或體外進行。體外篩選可以在緩衝液中進行，緩沖液的例子包括但
不限於磷酸緩沖液和Tris緩衝液，只要該緩衝液不抑制PBK/TOPK多肽或其功能等價物引起的底物的磷酸化即可。
在本發明中，底物的磷酸化水平可以採用本技術領域公知的方法來確定(參見"(2)—般篩選方法，，項)。
(9)採用PBK/TOPK與p47間的結合或p97的磷酸化作為指標的篩選在本發明中確認PBK/TOPK蛋白通過作為銜接子(adapter)的p47蛋白與p97蛋白相互作用，從而抑制細胞分裂。因此，採用這樣的PBK/TOPK蛋白與p47間的結合或p97的磷酸化水平作為指標，可以篩選抑制PBK/TOPK蛋白與p47間的結合或p97的磷酸化的化合物。所以，本發明還提供篩選用於抑制PBK/TOPK與p47間的結合，或者降低p97的磷酸化的化合物的方法。而且，本發明還提供一種篩選用於治療或預防乳腺癌的化合物的方法。本方法特別適合於有可能用於治療或預防乳腺癌的作用劑的篩選。更具體地，本方法包括下述步驟
(a) 在存在受試化合物的條件下，使PBK/TOPK多肽或其功能等價物與p47多肽或其功能等價物以及p97多肽或其功能等價物接觸；
(b) 檢測PBK/TOPK多肽與p47多肽間的結合或p97的磷酸化；和
(c) 選4奪抑制PBK/TOPK多肽與p47多肽間的結合、或者降低p97的磷酸化的受試化合物。
在本發明的上下文中，PBK/TOPK或p47或p97多肽的功能等^f介物分別指具有與PBK/TOPK(SEQ ID NO:92)或p47(SEQ ID NO:118)或p97(SEQIDNO:120)等價的生物活性的多肽(參見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞"項)。
作為篩選抑制PBK/TOPK多肽對p47多肽的結合的化合物的方法，可以採用本領域技術人員公知的多種方法。
用於篩選的多肽可以是重組多肽或天然來源的蛋白、或者它們的部分肽。前述任意受試化合物均可以用於篩選。
作為使用PBK/TOPK多肽與p47多肽(或者它們的功能等價物，參見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞，，項)篩選例如與多肽結合的蛋白的方法，可 以採用本領域技術人員公知的多種方法。這種篩選可以使用例如免疫沉澱、
West-Western印跡分析(SkolnikeM/, Cell 65: 83-90(1991))、利用細胞的雙 雜交系統("MATCHMAKER雙雜交系統"、"哺乳動物MATCHMAKER雙雜 交測定試劑盒"、"MATCHMAKER單雜交系統"(Clontech); "HybriZAP雙雜 交載體系統,，(Stratagene);參照"Dalton and Treisman， Cell 68: 597-612 (1992)，，， "Fields and Sternglanz， Trends Genet 10: 286-92 (1994)，，)、親和層 析色譜以及利用了表面等離子共振現象的生物傳感器來進行(參見"(2)—般 篩選方法"項)。
可以使用前述的任意受試化合物(參見(l)"用於篩選的受試化合物"項)。
而且，在本發明中，本篩選方法能夠對p97肽的磷酸化進行檢測。因 此，容許p97多肽的磷酸化的條件可以通過將p97多肽與用於磷酸化p97 多肽的PBK/TOPK多肽和p47多肽以及ATP —起溫育來實現。而且，在本 發明中，可以將增強PBK/TOPK多肽的激酶活性或p97多肽的磷酸化的物 質添加到篩選的反應混合物中。如果p97的磷酸化因該物質的添加而增強， 則可以以更高的靈敏度來確定p97的磷酸化水平。
PBK/TOPK多肽或其功能等價物、p97或其功能等價物以及受試作用劑 的接觸可以在體內或體外進行。體外篩選可以在緩衝液中進行，緩沖液的 例子包括但不限於磷酸緩沖液和Tris緩沖液，只要該緩沖液不抑制 PBK/TOPK多肽或其功能等價物引起的底物的磷酸化即可。
在本發明中，底物的磷酸化水平可以採用本技術領域公知的方法來確 定(參見"(2)—般篩選方法"項)。
(IO)採用PBK7TOPK表達細胞的細胞周期組成(stmcture)和G2/M群體作 為指標的篩選
本發明提供誘導乳腺癌細胞中細胞周期停滯的作用劑的篩選方法。我 們認為誘導乳腺癌細胞的細胞周期停滯的作用劑對於乳腺癌的治療或預防 是有用的。因此，本發明還提供一種篩選治療或預防乳腺癌的作用劑的方 法。本方法特別適用於篩選可用於浸潤性乳腺導管癌(IDC)的治療或預防的
作用劑。
更具體地，本方法包括下述步驟
(a)使候選作用劑與表達PBK/TOPK多肽或其功能等價物的細胞相接觸；
(b) 觀察細胞結構和/或細胞周期上的G2/M群體；和
(c) 選擇使胞間連接改變為長胞間橋的化合物，和/或增大細胞的G2/M 群體的化合物。
這裡，可以使用任意細胞，只要其表達PBK/TOPK多肽或其功能等價 物。在本篩選中使用的細胞可以是天然表達PBK/TOPK多肽的細胞，這其 中包括例如來自乳腺癌(例如IDC)、胸腺和睪丸的細胞、以及由它們建立的 細胞系。可以使用HBC4,HBC5,HBL100，HCC1937,MCF-7,MDA-MB-231， MDA-MB-435S, SKBR3, T47D和YMB1這些乳腺癌細胞系。
或者，篩選中使用的細胞可以是並非天然表達PBK/TOPK多肽和PPla 多肽，而是轉染了表達PBK/TOPK多肽或PBK/TOPK的功能等價物，或表 達PPla的載體的細胞。這樣的重組細胞可以按照諸如上述的公知基因工程 方法(例如Morrison DA.， J Bacteriology 1977， 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu等人)1983， 101: 347-62)來獲得(參 見"核苷酸、多肽、載體和宿主細胞"項)。
前述的任意受試化合物均可以用於本發明的篩選(參見(l)"用於篩選的 受試化合物"項)。但是，優選選擇可滲透至細胞內的作用劑。或者，當受 試作用劑是多肽時，可以通過用包含編碼受試作用劑的核苷酸序列的載體 轉化細胞，在細胞內表達受試作用劑，從而使本篩選中的細胞與受試作用 劑接觸。
在本發明中，可以向篩選的反應混合物中添加使細胞易於觀察的物質 例如DAPI、抗細胞膜蛋白抗體等。在與受試作用劑接觸2天後，可以通過 相位差顯微鏡檢查或時移(time-lapse)顯微鏡檢查來觀察細胞結構。
細胞的細胞周期可以採用本技術領域/>知的常規方法包括FACS等來 確定。當糹企測細胞的細胞周期時，優選在細胞與受試作用劑接觸後對細胞 溫育充分的時間、例如12小時或以上，直至正常細胞經過G2/M期。基於 該規程，當檢測到細胞周期停滯在G2/M期時，可以判定受試作用劑具有抑 制乳腺癌細胞增殖的能力。
根據本發明的 一個方面，本篩選方法所必需的組分可作為試劑盒提供， 用於篩選誘導乳腺癌細胞的凋亡或細胞周期停滯的作用劑或者治療或預防 乳腺癌的作用劑。本試劑盒可以包含例如表達A7322或F3374V1或PBK/TOPK和/或PPla多肽或其功能等價物，或者A7322或AURKB或 F3374V1或PHB2/REA或ERa或PBK/TOPK或組蛋白H3或CDK1或細胞 周期蛋白Bl或p47或p97多肽或其功能等價物的細胞。而且，本試劑盒還 可以包含對照試劑(P日性和/或陰性)、可檢測標記、細胞培養基、篩選所必 需的容器、用於實施本方法的說明書(例如書面文件、磁帶、VCR、 CD-ROM、 其它)等。組成和試劑可以分別包裝在不同的容器中。
根據本發明的篩選方法分離出的化合物是抑制F3374V1、 F3374V1、 PBK/TOPK或AURKB的表達或活性的藥物的候選物，用於治療或預防歸 於例如細胞增殖性疾病(如乳腺癌)的疾病。
根據該篩選方法分離出的化合物是本發明的多肽的拮抗劑的候選。同 樣地，術語"拮抗劑，，通過與本發明的多肽結合抑制該多肽的功能的分子。 而且，通過該篩選分離出的化合物是抑制本發明的多肽與分子(包括DNA 和蛋白)的體內相互作用的化合物的候選。
當在本發明中待檢測的生物活性是細胞增殖時，其可以例如這樣來檢 測製備表達本發明的多肽的細胞，在存在受試化合物的條件下培養細胞， 並測定細胞增殖速度、測定細胞周期等，以及通過如實施例中所述那樣測 量集落形成活性。
除非特別進行定義，本說明書中使用的所有技術術語和科學術語具有 本發明所屬技術領域的技術人員一般理解的含義。當存在矛盾時，以包含 定義的本說明書為優先。 分離的化合物和藥物組合物
通過上述篩選分離的化合物是抑制本發明的BC多肽的活性的候選，並 在乳腺癌的治療中有用。更具體地，當釆用BC蛋白的生物活性作為指標時， 根據本方法篩選出的化合物是用於乳腺癌的治療的藥物的候選。例如，本 發明提供用於治療或預防乳腺癌的組合物，該組合物包含藥學有效量的具 有選自下組的至少1種功能的抑制劑
(a) 抑制A7322與PHB2/REA間、F3374V1與AURKB間、或PBK/TOPK 與組蛋白H3間的結合；
(b) 抑制AURKB引起的F3374V1的磷酸化、或PBK/TOPK引起的組蛋 白H3的磷酸化；
(c) 抑制選自」7322或的基因的表達；和
m(d)抑制PHB2/REA蛋白的核轉移。
化合物的"藥學有效量"是指對於治療或減輕個體中的癌症而言的充 分的量。藥學有效量的一個例子包括當施用於動物時降低A7322或F3374V1 的表達或生物活性所需的量。所述降低可以是例如表達變化至少5%、 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 75%、 80%、 90°/。、 95%、 99°/。或100%。
這樣的抑制選自5C基因和^w^:s中的任一種基因的表達的活性成分
活性成分(c)還可以是針對該基因的抑制性寡核苷酸(例如反義寡核苷酸、 siRNA或核酶)，或者該反義寡核普酸的衍生物如表達載體、siRNA或核酶 等，如上文所述的(參照"反義寡核苦酸"、"siRNA"項)。或者，抑制 AURKB引起的F3374V1的磷酸化的活性成分活性成分(b)可以是例如 F3374V1或PBK/TOPK的顯性負突變體。而且，F3374V1的拮抗劑可以作 為抑制F3374V1與AURKB間結合的活性成分活性成分使用，或者 PBK/TOPK的拮抗劑可以作為抑制PBK/TOPK與組蛋白H3間結合的活性 成分活性成分(a)使用。或者，這樣的活性成分活性成分可以根據諸如上述 的篩選方法來選擇(參見"篩選方法"項)。
其是抑制BC蛋白之一的活性的化合物的部分結構發生增加、缺失和/或取 代而轉變得到的化合物。
通過本發明的任意方法分離得到的作用劑，可以作為藥物施用，或者 可以用於製備藥物(治療性或預防性)組合物，用於人及其它哺乳動物如 小鼠、大鼠、豚鼠(guinea-pig)、兔、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴、狒狒(baboon)、 黑猩猩(chimpanzee))來治療或預防乳腺癌。優選應用通過本發明的方法篩選 出的作用劑治療或預防的癌症包括浸潤性乳腺導管癌(IDC)等。
分離的化合物可以直接給藥，或者可以利用已知的藥物製備方法配製 成劑型。藥物製劑可包括適於口服、直腸、鼻、局部(包括頰或舌下)、陰道 或非消化道(包括肌內、皮下和靜脈內)施用的製劑，以及適於通過吸入或吹 入(insufflation)施用的製劑。例如，根據需要，作用劑可以作為糖衣片劑、 膠嚢劑、酏劑和微膠嚢口服施用；或者用水或任何其它藥學可接受的液體 配製成無菌溶液或懸浮液，以注射劑的形式非口服施用。例如，可以將作 用劑與藥理學可接受的載體或介質一起混合成通常接受的藥物配製方式 (drug implementation)所要求的單位劑型，所述載體或介質具體為無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑、調味劑、賦
形劑(excipient)、溶媒(vehicle)、防腐劑、粘合劑等。這些製劑中活性成分活 性成分的量構成(make)可獲得的指定範圍內的合適劑量。
短語"藥學可接受的載體"是指作為藥物的稀釋劑或溶媒使用的惰性物質。
能夠混合到片劑和膠嚢中的添加劑的例子有粘合劑如明膠、玉米澱 粉、黃蓍膠(tragacanthgum)和阿拉伯膠；賦形劑例如結晶纖維素；溶脹劑例 如玉米澱粉、明膠和海藻酸(alginic acid);潤滑劑例如硬脂酸鎂；增甜劑例 》口蔗衝唐、乳4唐或衝唐衝奮；調p木劑例如薄荷(peppermint)、 Gaw/AeWa a6fe"o^zn'x 油和櫻桃。當單位劑型為膠嚢劑時，上述成分中還可以包括液體載體，例 如油。注射用無菌組合物可以使用溶媒例如注射用蒸餾水按照標準的藥物 配製方式進行配製。
生理鹽水、葡萄糖以及包含輔料(adjuvants)如D-山梨醇、D-甘露糖、 D-甘露醇和氯化鈉的其它等滲液體，可用作注射用水溶液。這些可以與合 適的增溶劑組合使用，所述增溶劑例如醇，特別是乙醇、多元醇例如丙二 醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑，例如Polysorbate 80 (TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油可以作為油質液體使用，並且可以與苯甲酸千酯或苯 甲醇組合使用作為增溶劑，還可與緩衝劑，如磷酸鹽緩衝劑和乙酸鈉緩衝 劑；鎮痛劑，如鹽酸普魯卡因；穩定劑，如苯曱醇、苯酚；以及抗氧化劑 一起配製。製備好的注射劑可以裝入到合適的安瓿(ampoule)中。
適於口服施用的藥物製劑可便宜地作為離散單位提供，所述離散單位 例如膠嚢劑、扁嚢劑(cachet)或片劑，每個單位含有預定量的活性成分； 作為粉末或顆粒；或作為溶液，懸浮液或作為乳液。活性成分還可以以大 丸劑(bolus)、藥糖劑(electuary)或糊劑(paste)的形式提供，以及純的形式，即 沒有載體。用於口服給藥的片劑和膠嚢劑可含有常規賦形劑諸如結合劑、 填充劑、潤滑劑、崩解劑或溼潤劑。片劑可通過壓縮或模製來製備，其中 任選含有一種或多種配方成分。壓縮片劑可通過如下方法製備將活性成 分以自由流動的形式(如粉末或顆粒)任選地與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、 潤滑劑、表面活性劑或分散劑混合，並在適當的機器中進行壓縮。模製片 劑可通過如下方法製備在適當的機器中對利用惰性液體稀釋劑溼潤過的 粉末化合物的混合物進行模製。所述片劑可根據本領域已知的方法進行包覆(coated)。 口服液體製備物可以是例如水性或油性的懸濁液、溶液、乳液、 糖漿或酏劑的形式，或者也可以作為乾燥產物提供，以便在使用前用水或 其它適宜溶媒加以構成。所述液體製備物可含有常規添加劑諸如懸浮劑， 乳化劑，非水性溶媒(可包括食用油)或防腐劑。片劑可任選地配製以提供其 中活性成分的緩釋或控釋。
供非消化道施用的製劑包括水性和非水性的無菌注射溶液，其可含有 抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑(bacteriostat)和使得製劑與目標受者的血液等張 (isotonic)的溶質；以及水性和非水性的無菌懸浮液，其可含有懸浮劑和增稠 劑。所述製劑可以以單位劑量或多劑量容器提供，例如密封的安瓿和小瓶； 還可以在冷凍-乾燥(凍幹的)條件下保存，這樣僅需要在即將使用前添加無 菌液體載體例如鹽水、注射用水。或者，可提供所述製劑用於連續輸注 (continuous infusion)。可由前述的無菌粉末、顆粒及片劑的類型製備即配即 用的注射溶液和懸浮液。
適於直腸給藥的製劑可提供為含有常用載體如可可脂或聚乙二醇的栓
劑(suppository)。用於口內局部給藥，例如頰(buccal)或舌下給藥的製劑包括
錠劑(lozenge)和軟錠劑(pastille),其中錠劑在調味基質，如蔗糖和阿拉伯膠
(acacia)或黃蓍膠中包含活性成分，而軟錠劑在基質，如明膠和甘油或蔗糖
和阿拉伯膠中包含活性成分。鼻內給藥時，通過本發明得到的化合物可以
用作液體噴霧劑或可分散粉末，或採取滴劑(drop)的形式。滴劑可用水性或
非水性基質配製，該基質中也含有一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。 液體噴霧劑便宜地從加壓包裝中遞送。
吸入給藥時，可以由吹入器、霧化器、加壓包裝(pressurized pack)或其 它輸送氣溶膠噴霧的便利裝置方便地輸送化合物。加壓包裝可含有適宜的 推進劑，如二氯二氟曱烷、三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它 適宜氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供輸送計量量(metered amount) 的閥門來確定劑量單位。
或者，通過吸入或吹入給藥時，化合物可以是乾粉組合物的形式，例 如該化合物與適宜粉末基質(如乳糖或澱粉)的粉末混合物。粉末組合物可以 以單位劑型提供，這些劑型例如膠嚢、藥筒(cartridge)、凝膠(gelatin)或發泡 包(blisterpack)，藉助吸入器或吹入器，可由上述劑型施用所述粉末。
需要時，可以採用經過改造而適於緩釋活性成分的上述製劑。藥物組
114合物中還可以含有其它活性成分，諸如抗微生物劑，免疫抑制劑或防腐劑。 優選的單位劑型包含以下列舉的有效量、或活性成分的適宜部分。 可以採用本領域技術人員公知方法將本發明的藥物化合物施用於患 者，所述方法例如動脈注射、靜脈注射、皮內注射的形式，以及作為鼻腔 內給藥、經支氣管給藥、肌肉給藥或口服給藥的形式。施用劑量和施用方 法因患者的體重和年齡、以及施用方法而有變化，但本領域技術人員能夠
按常規對它們進行選擇。若該化合物可被DNA編碼，則可以將該DNA插 入基因治療用載體，並施用該載體來實施治療。施用劑量和施用方法因患 者的體重、年齡和症狀而有變化，但本領域技術人員能夠適當地對它們進 行選擇。
舉例來說，當向標準成年人(體重60 kg)口服給藥時，雖然根據其症狀 存在一些差異，但與本發明的多肽結合併調節其活性的化合物的劑量為約 0.1 mg-約100 mg每天，優選為約1.0 mg-約50 mg每天，更優選為約1.0 mg-約20 mg每天。
當以注射劑形式向標準成年人(體重60 kg)非胃腸道給藥時，雖然根據患 者、靶器官、症狀和給藥方法存在一些差異，但便宜地靜脈內注射約O.Ol mg-約30mg每天，優選約O.l mg-約20mg每天，更優選約O.l mg-約10 mg每天的 劑量。而且，在其它動物的情況下，可以按換算為60kg體重的量施用。
作用劑優選通過口服或注射(靜脈內或皮下)來施用，給患者施用的確切 的量將由主治醫師在考慮包括患者年齡和性別、治療的確切疾患及其嚴重 程度在內的多種因素的基礎上，在其職權範圍內確定。或者，施用途徑也 可能因病情或其嚴重程度而不同。
而且，本發明提供使用針對本發明的多肽的抗體治療或預防乳腺癌的 方法。根據該方法，施用藥學有效量的針對本發明的多肽的抗體。由於BC 蛋白的表達在癌細胞中上調，而且抑制這些蛋白的表達導致細胞增殖活性 降低，因此，我們預計通過抗體與這些蛋白的結合能夠治療或預防乳腺癌。 所以，可以以足夠降低本發明的蛋白的活性的量施用針對本發明的多肽的 抗體，這樣的量在0.1-約250mg/kg每天的範圍內。成人的劑量範圍通常為 約5 mg-約17.5 g/天，優選為約5 mg-約10 g/天，更優選為約100 mg-約3 g/ 天。
通常， 一或多種BC蛋白抑制劑的顯效(efficious)或有效(effective)量是這樣確定的首先施用低量或少量的BC蛋白抑制劑，然後逐漸增加所施用 的一個或多個劑量，和/或視需要追加第二 BC蛋白抑制劑，直至被處理的 受試者中觀察到期望的效果即乳腺癌的抑制或預防，而毒副作用為最小限 度或者不伴隨毒副作用。適用於確定本發明的藥物組合物的合適施用劑量 和施用計劃的方法，i己載於例如Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton，等人，Eds" McGraw-Hill (2006),和in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed.， University of the Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins (2005)，這些均 通過提述併入本說明書。
癌、例如浸潤性乳腺導管癌(IDC)。可以預防性或治療性地施用於存在疾患 風險(或者對疾患易感)或患有該疾患的受試者，其中所述疾患與BC蛋白的 異常磷酸化活性相關。本方法包括降低乳腺癌細胞中BC蛋白的功能。所述 功能可通過施用採用本發明的篩選方法得到的作用劑加以抑制。
這裡，術語"預防"是指為了延緩或預防胂瘤的形成、或者延緩、抑 制或減輕癌症的至少一種臨床症狀，而預防性地施用作用劑。受試者中的 胂瘤的狀況可以採用標準臨床規程來評價。
或者，可以將與胂瘤細胞特異性細胞表面標誌物結合的抗體用作藥物 運輸的工具。例如，以足夠損傷腫瘤細胞的劑量施用綴合有細胞毒劑的抗 體。
誘導抗腫瘤免疫的方法和腫瘤疫苗
本發明還涉及誘導抗胂瘤免疫的方法，該方法包括施用A7322或 F3374V1蛋白或其免疫活性片段、或者編碼該蛋白或其片段的多核香酸的 步驟。A7322或F3374V1蛋白或其免疫活性片段作為針對乳腺癌的疫苗是 有用的。在一些情況下，蛋白質或其片段可以以結合於T細胞受體(TCR) 或由抗原呈遞細胞(APC)，如巨噬細胞、樹突細胞(DC)或B細胞呈遞的形式 進行施用。由於DC具有強抗原呈遞能力，所以在APC中DC是最優選使 用的。
在本發明中，針對乳腺癌的疫苗是指具有接種於動物時誘導抗腫瘤免 疫的能力的物質。 一般而言，抗腫瘤免疫包括諸如以下的免疫應答 - 誘導抗乳腺癌的細胞毒性淋巴細胞，
1- 誘導識別乳腺癌的抗體，和
- 誘導抗乳腺癌細胞因子的產生。
因此，當某蛋白質接種於動物時誘導任一種所述免疫反應時，認為該 蛋白質具有抗腫瘤免疫誘導效果。由蛋白質誘導的抗腫瘤免疫可以通過在 體內或體外觀察宿主中的免疫系統針對該蛋白質的應答而加以^T測。
例如，檢測細胞毒性T淋巴細胞的誘導的方法是公知的。具體地，進
胞。以抗原特異性方式應答於APC所呈遞抗原的T細胞由於該抗原的刺激
而分化為細胞毒性T細胞(或稱細胞毒性T淋巴細胞；CTL)，然後增殖(這 稱為T細胞活化)。因此，某種肽的CTL誘導可以通過將該肽經由APC呈 遞於T細胞，並檢測CTL的誘導來加以評估。此外，APC具有激活CD4+T 細胞，CD8+T細胞，巨嗟細胞，嗜酸粒細胞(eosinophil)和NK細胞的作用。 由於CD4+T細胞和CD8+T細胞在抗腫瘤免疫中也是重要的，可使用這些 細胞的激活效應作為指標來評價肽的抗肺瘤免疫誘導作用。
使用樹突細胞(DC)作為APC來評價CTL誘導作用的方法在本領域中 是眾所周知的。在APC中，DC是具有最強CTL誘導作用的代表性APC。 在該方法中，首先使受試多肽與DC接觸，然後使該DC與T細胞接觸。在 與DC接觸後，如果檢測出具有針對目標細胞的細胞毒性作用的T細胞， 則表示該受試多肽具有誘導細胞毒性T細胞的活性。CTL的抗腫瘤活性可 以例如採用"Cr標記的腫瘤細胞的溶解(lysis)作為指標來進行檢測。或者， 採用3H-胸苷攝取活性或LDH (乳糖脫氫酶)釋放作為指標來評價腫瘤細胞 損傷程度的方法也是眾所周知的。
除DC外，外周血單個核細胞(PBMC)也可用作APC。已才艮道通過在存 在GM-CSF和IL-4的情況下培養PBMC增強了 CTL的誘導。相似地，已 顯示通過在存在鑰孔戚血藍蛋白(KLH)和IL-7的條件下培養PBMC誘導了 CTL。
通過這些方法確定為具有CTL誘導活性的受試多肽是具有DC激活效 應和隨後的CTL誘導活性的多肽。因此，誘導針對腫瘤細胞的CTL的多肽 可用作抗腫瘤疫苗。此外，通過與所述多肽接觸而獲得了誘導針對腫瘤的 CTL的能力的APC可用作抗腫瘤疫苗。此外，通過APC呈遞多肽抗原而獲得了細胞毒性的CTL也可用作抗腫瘤的疫苗。這些利用由APC和CTL 所致的抗腫瘤免疫的腫瘤治療方法稱為細胞免疫療法。
一般來說，當細胞免疫療法使用多肽時，已知通過組合多種具有不同 結構的多肽並使它們與DC接觸可增加CTL誘導的效率。因此，當用蛋白 質片段刺激DC時，使用多種類型的片段的混合物是有利的。
或者，多肽對抗腫瘤免疫的誘導可以通過觀察針對腫瘤的抗體產生的 誘導來加以確認。例如，當用多肽免疫的實驗動物中誘導產生了抗該多肽 的抗體並且這些抗體抑制腫瘤細胞生長時，所述多肽可確定為具有誘導抗 腫瘤免疫的能力。
施用本發明的疫苗誘導抗腫瘤免疫，而該抗肺瘤免疫的誘導使人們能
夠治療和預防BLC。抗癌治療或對癌症發病的預防可以包括任何下述步驟
諸如抑制癌性細胞生長，使癌症退化(involution)以及抑制癌症發作。癌症的
治療或預防還包括降低患有癌症的個體死亡率、降低血液中的腫瘤標記物、
緩解癌症伴發的可檢測症狀等。這樣的治療性和預防性效果優選是統計學
上顯著的。例如，在觀察中，以5%或更低的顯著性水平，其中將疫苗針對
乳腺癌的治療性或預防性效果與未施用疫苗的對照進行比較。例如，可將
Student's t-檢驗，Mann-Whitney U-檢驗或ANOVA用於統計學分析。
上述具有免疫活性的蛋白質或編碼該蛋白質的載體可與佐劑組合。佐 劑是指當與具有免疫活性的蛋白質共同(或相繼)施用時能增強針對該蛋白
質的免疫應答的化合物。佐劑的例子包括但不限於霍亂毒素(cholera toxin)、 沙門氏菌毒素(salmonellatoxin)、明諷(alum)等。或者，本發明的疫苗可適宜 地與藥學可接受的載體組合。這樣的載體的例子有無菌水、生理鹽水、磷 酸鹽緩衝液、培養液等。或者，疫苗可根據需要包含穩定劑，懸浮劑，防 腐劑，表面活性劑等。疫苗可全身或局部地進行施用。疫苗施用可以通過 單次給藥進行，或者通過多次給藥來強化(boost)。
當使用APC或CTL作為本發明的疫苗時，可以例如通過離體方法治療 或預防肺瘤。更具體地說，收集接受治療或預防的受試者的PBMC，使細 胞與多肽在離體條件下接觸，誘導了 APC或CTL之後，可將該細胞施用於 受試者。也可通過將編碼多肽的載體在離體條件下導入PBMC中來誘導 APC。體外誘導的APC或CTL可以在施用前加以克隆。通過克隆和培養具 有高靶細胞破壞活性的細胞，可以更有效地實施細胞免疫治療。或者，以
118該方式分離的APC和CTL不僅可以用於針對提供細胞的受試者進行細胞免 疫治療，還可以用於針對來自其它個體的相似類型的胂瘤進行細胞免疫治療。
此外，本發明提供治療或預防乳腺癌的藥物組合物，其包含藥學有效 量的本發明的多肽。該藥物組合物可以用於激發(raise)抗腫瘤免疫。在正常 組織中，A7322的表達局限在腦；而正常器官中F3374V1的表達局限在睪 丸、胸腺、胎盤和骨髓。因而，可以認為對這些基因的抑制不會給其它器 官造成不良影響。因此，A7322和F3374V1多肽優選用於治療乳腺癌。本 發明中，以足夠誘導抗腫瘤免疫的劑量施用多肽或其片段，劑量範圍為O.l mg-10mg，優選0.3mg-5mg，更優選0.8mg-1.5 mg。反覆進行施用。例如， 為誘導抗腫瘤免疫，可以每2周4次施用lmg肽或其片段。 抑制性顯性失活蛋白
本發明涉及包含MEGISNFKTPSKLSEKKK (SEQ ID NO:98)的抑制性 多肽。在 一 些優選的實施方案中，抑制性多肽包含 MEGISNFKTPSKLSEKKK (SEQ ID NO:98);與該多肽功能等同的多肽；或 編碼這些多肽的多核苷酸；其中所述多肽缺乏由SEQIDNO:92組成的肽的 生物學功能。SEQ IDNO:92中所示胺基酸序列公開在WO2006/028676中。 已知癌細胞增殖能夠通過抑制所述胺基酸序列的表達來調控。然而，本發 明人證明的新發現是包含具有在上述胺基酸序列中特定突變的序列的片段 可抑制癌細胞增殖。
包含本發明所選胺基酸序列的多肽可以是任意長度，只要所述多肽抑 制癌細胞增殖。具體而言，所述胺基酸序列的長度範圍可以是8-70個殘基， 例如8-50,優選8-30，更具體為8-20，還更具體為8-16個殘基。
本發明的多肽可以包含兩個或更多個"所選胺基酸序列"。所述兩個或 更多個"所選胺基酸序列"可以是相同的或不同的胺基酸序列。或者，"所 選胺基酸序列，，可以直接相連。或者，可以在它們之間安排任何間插序歹'J。
NO:98多肽同源(即，具有序列同一性)的多肽。在本發明中，與 MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98多肽同源的多肽是包含選自 一個 或幾個胺基酸殘基的添加、缺失、取代和插入的任何突變、並與 MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98多肽在功能上等價的那些多肽。短語"與MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQIDNO:98多肽在功能上等價"指 具有抑制CDK1和細胞周期蛋白Bl複合物對PBK/TOPK的結合的功能。 在組成與MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98多肽在功能上等價的多 肽的胺基酸序列中優選保守MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98序 列。因此，在本發明中與MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98肽在功 能上等價的多肽優選在MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98序列之外 的位點中具有胺基酸突變。在本發明中與MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98 肽在功能上等價的多肽的胺基酸序列保守 MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQIDNO:98序列，並且與"所選胺基酸序列" 具有60%或更高、通常為70%或更高、優選80°/。或更高、更優選90%或更 高、或者95%或更高、和更優選98%或更高的同源性。胺基酸同源性可以 使用本領域公知的算法來測定，例如，設置為它們的預設設定的BLAST或 ALIGN。
或者，不具體限制可以突變的胺基酸的數目，只要保留 MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98肽的活性。通常，可以突變最多 至約10個胺基酸，更優選最多至約3個胺基酸。同樣，不具體限制突變的 位點，只要所述突變不導致對MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98肽
活性的破壞。
在一個優選的實施方案中，MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98 肽的活性包含在表達PBK/TOPK的細胞(即乳腺癌細胞)中誘導細胞周期停 滯的作用。細胞周期停滯是指在DNA複製和有絲分裂的檢查點(check point) 上停止。用於檢測細胞周期停滯的方法是公知的。例如，可以使用FACS(流 式細胞術)來確認細胞周期停滯。
在另一個實施方案中，MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98肽的 活性包含在表達PBK/TOPK的細胞(即乳腺癌細胞)中誘導凋亡的作用。凋亡 的意思是由細胞自身引起的細胞死亡，有時稱為程序性細胞死亡。在經歷 凋亡的細胞中觀察到核染色體的聚集、核的碎裂或細胞質的濃縮。用於檢 測凋亡的方法是公知的。例如，凋亡可以通過TUNEL染色(Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling沐端脫氧核香 酸轉移酶生物素-dUTP切口端標記)；Gavrieli等，(1992) J. Cell Biol. 119: 493-501; Mori等，(1994) Anat. & Embryol. 190: 21-28)來確認。或者，DNA梯測定法(DNA ladder assay)、膜聯蛋白V染色(Annexin V staining)、胱天蛋 白酶測定法、電子顯微術或對核或細胞膜構象變化的觀察可以用於檢測凋 亡。任何可商購的試劑盒均可以用於;f企測細胞中的這些由凋亡誘導的表現 (behavior)。例如，這些凋亡4企測試劑盒可以從以下供應商處商購
LabChem Inc.,
Promega，
BD Biosciences Pharmingen， Calbiochem，
丁akara Bio Company (CLONTECH Inc,)，
CHEMICON International, Inc,
Medical & Biological Laboratories Co.， Ltd.等。
本發明的多肽可以基於所選胺基酸序列的從任何位置化學合成。在普 通肽化學中使用的方法可以用於合成多肽的方法。具體而言，所述方法包 括在以下文獻和日本專利公告中描述的那些
Peptide Synthesis (肽合成),Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2， Academic Press Inc., New York, 1976;
Peputido gousei (肽合成),Maruzen (Inc.), 1975;
Peputido gousei no kiso to jikken (肽合成基礎和實驗),Maruzen (Inc.), 1985;
Iyakuhin no kaihatsu (藥物開發)，Sequel, Vol. 14: Peputido gousei (肽合 成)，Hirokawa Shoten, 1991;
國際專利公布W099/67288。
或者，本發明的多肽也可以通過已知的遺傳工程技術合成。遺傳工程 技術的一個實例如下。具體而言，將編碼期望的肽的DNA導入適當的宿主 細胞以製備轉化細胞。本發明的多肽可以通過回收由這種轉化細胞產生的 多肽來獲得。或者，期望的多肽可以用體外翻譯系統合成，該系統在體外 重組多肽合成所必需的元件。
當使用遺傳工程技術時，本發明的多肽可以與具有不同胺基酸序列的 肽一起作為融合蛋白表達。表達期望的融合蛋白的載體可以這樣獲得，通 過將編碼本發明多肽的多核苷酸與編碼不同肽的多核苷酸連接，使它們處
於相同的讀碼框中，然後將所得核苷酸導入表達載體。通過用所得載體轉化適當宿主來表達所述融合蛋白。在形成融合蛋白中使用的不同的肽包括
以下肽
FLAG (Hopp等，(1988) BioTechnology 6， 1204-10),
由六個His (組氨酸)殘基組成的6xHis 、 10xHis ，
流感血凝素(HA),
人c-myc片段,
VSV-GP片段，
pl8HIV片段，
T7-標籤，
HSV-標籤，
E-標籤，
SV40T抗原片段， lck標籤， a-微管蛋白片段， B-標籤， 蛋白C片段，
GST (穀胱甘肽-S-轉移酶)， HA(流感血凝素)， 免疫球蛋白恆定區， P-半乳糖苷酶，和 MBP(麥芽糖結合蛋白)。
本發明的多肽可以通過用適當的蛋白酶處理如此產生的融合蛋白，然 後回收期望的多肽來獲得。為了純化所述多肽，預先用與所述融合蛋白結 合的親和層析捕獲融合蛋白，然後可以將捕獲的融合蛋白用蛋白酶處理。 使用蛋白酶處理，使期望的多肽與親和層析分開，並以高純度回收期望的 多肽。
本發明的多肽包括修飾的多肽。在本發明中，術語"務飾的"指，例 如，與其它物質結合。因此，在本發明中，本發明的多肽可進一步包含其 它物質如細胞膜通透性物質。所述其它物質包括有機化合物如肽、脂質、 糖和多種天然存在的或合成的聚合物。本發明的多肽可以具有任何^修飾，
只要所述多肽保留期望的抑制CDK1和細胞周期蛋白Bl複合物與PBK/TOPK結合的活性。在一些實施方案中，所述抑制性多肽能夠直接與 PBK/TOPK竟爭與CDK1和細胞周期蛋白Bl複合物的結合。修飾也可以為 本發明的多肽賦予附加功能。附加功能的實例包括靶向能力(targetability)、 遞送能力和穩定化。
在本發明中修飾的優選實例包括，例如，導入細胞膜通透性物質。通 常，細胞膜使胞內結構與外界隔絕。因此，難以有效率地將胞外物質導入 細胞。可以通過用細胞膜通透性物質修飾本發明的多肽來賦予所述多肽以 細胞膜通透性。這樣一來，通過將本發明的多肽與細胞接觸，可以將所述 多肽遞送至細胞中從而作用於該細胞。
"細胞膜通透性物質"指能夠穿透哺乳動物細胞膜而進入細胞質的物 質。例如，某些脂質體與細胞膜融合，從而將內容物釋放至細胞中。同時， 某些類型的多肽穿透哺乳動物的細胞質膜而進入細胞內部。對於具有這種 細胞進入活性的多肽，本發明中的細胞質膜等優選作為所述物質。具體而 言，本發明包括具有以下通式的多肽。-[D];
其中，代表細胞膜通透性物質；[D]代表包含 MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQIDNO:98的片段序列。在上述通式中，[R] 和[D]可以直接相連，或通過接頭間接相連。肽、具有多個官能團的化合物 等可以用作接頭。具體而言，包含-G-的胺基酸序列可以作為接頭使用。或 者，可以將細胞膜通透性物質和包含所選序列的多肽結合在微粒表面。[R] 可以與[D]的任意位置結合。具體而言，[R]可以與[D]的N末端或C末端結 合，或者與組成[D]的胺基酸的側鏈結合。或者，可以將超過一個[R]分子與 一個分子的[D]結合。[R]分子可以導入[D]分子上的不同位置。或者，[D]可 以用多個連接在一起的[R]修飾。
例如，已經報導了多種天然存在的或人工合成的具有細胞膜通透性的 多肽(Joliot A.和Prochiantz A., Nat Cell Biol. 2004; 6: 189-96)。所有這些已知 的細胞膜通透性物質均可以在本發明中用於修飾多肽。在本發明中，例如， 選自下組的任何物質均可以用作上述的細胞通透性物質
多聚精氨酸；Matsushita等，(2003) J. Neurosci.; 21， 6000-7.[Tat / RKKRRQRRR] (SEQ ID NO: 47) Frankd等，(1988) Cell 55,1189-93.
Green和Loewenstein (1988) Cell 55, 1179-88. (SEQ ID NO: 101)
Derossi等，(1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-50. (SEQ ID NO: 102)
Park等，(2000) Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50. (SEQ ID NO:
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Pooga等，(1998) FASEB J. 12, 67-77. (SEQ ID NO: 104)
Oehlke等，(1998) Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39. (SEQ ID NO: 105)
Lin等，(1995) J. Biol. Chem. 270， 14255-8. (SEQ ID NO: 106)
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Sawada等，(2003) Nature Cell Biol. 5， 352-7. (SEQ ID NO:
107)
Lundberg等，(2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90. (SEQ ID NO: 108)
Elmquist等,(2001) Exp. Cell Res. 269， 237-44. (SEQ ID NO: 109)
Morris等，(2001) Nature Biotechnol. 19, 1173-6. (SEQ ID NO: 110)
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Hong和Clayman (2000) Cancer Res. 60, 6551-6。
124在本發明中，在上列出作為細胞膜通透性物質實例的多聚精氨酸由任
意數目的精氨酸殘基組成。具體而言，例如，其由連續的5-20個精氨酸殘 基組成。精氨酸殘基的優選數目是11個(SEQIDNO:113)。 包含MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98的藥物組合物
本發明的多肽抑制癌細胞的增殖。因此，本發明提供用於癌症治療和/ 或預防的作用劑，其包含作為活性成分的包含 MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98的多肽；或編碼該多肽的多核苦 酸。或者，本發明涉及用於治療和/或預防癌症的方法，其包括施用本發明 的多肽的步驟。或者，本發明涉及本發明的多肽在製造治療和/或預防癌症 的藥物組合物中的用途。能夠通過本發明治療或預防的癌症沒有限制，只 要在癌細胞中PBK/TOPK的表達有所上調。例如，本發明的多肽可用於治 療乳腺癌。
或者，本發明的抑制性多肽可以用於誘導癌細胞的細胞周期停滯。因 此，本發明提供誘導細胞的細胞周期停滯的作用劑，其包含作為活性成分 的包含MEGISNFKTPSKLSEKKK/SEQ ID NO:98的多肽；或編碼該多肽的 多核苷酸。本發明的誘導細胞周期停滯的作用劑可以用於治療細胞增殖性 疾病如癌症。能夠通過本發明治療或預防的癌症沒有限制，只要在癌細胞 中PBK/TOPK的表達有所上調。例如，本發明的多肽可以用於治療乳腺癌。 或者，本發明涉及誘導細胞凋亡的方法，其包括施用本發明的多肽的步驟。 此外，本發明涉及本發明的多肽在製造在細胞中誘導細胞周期停滯的藥物 組合物中的用途。
本發明的抑制性多肽在表達PBK/TOPK的細胞如乳腺癌中誘導細胞周 期停滯。同時，在大多數正常器官中未觀察到PBK/TOPK表達。在一些正 常器官中，PBK/TOPK的表達水平與癌組織相比相對較低。因此，本發明 的多肽可以特異性地在癌細胞中誘導細胞周期停滯。
當向人和其它哺乳動物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、犬、綿羊、豬、 牛、猴、狒狒和黑猩猩施用本發明的多肽(作為製成的藥物)來治療癌症或誘 導細胞中細胞周期停滯時，可以將分離的化合物直接施用，或者使用已知 用於製備藥物的方法配製成適當的劑量形式。例如，如有必要，所述藥物 可以作為糖衣片劑、膠嚢、酏劑和微膠嚢口服施用，或者以注射形式進行 非消化道施用，所述注射形式是含水或任何其它藥學可接受液體的無菌溶液或懸液。例如，所述化合物可以與藥理學可4妄受的載體或介質，具體而 言是無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑、
矯正藥(corrigent)、賦形劑、溶媒、防腐劑和粘合劑混合成製備通常認可的 藥物所必需的單位劑量形式(unit dosage form)。依賴於這些製劑中活性成分 的量，可以決定指定範圍內的合適劑量。
可以混合在片劑和膠嚢中的添加劑的實例是粘合劑如明膠、玉米澱粉、 西黃蓍膠和阿拉伯樹膠；介質如結晶纖維素；膨脹劑如玉米澱粉、明膠和 褐藻酸；潤滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精；和矯正藥如薄 荷、冬青油和櫻桃。當單位劑量形式是膠嚢時，在上述成分中可以進一步 包括液態載體如油。注射用無菌混合物可以使用介質如注射用蒸餾水根據 對常規藥物的認識來配製。
生理鹽水、葡萄糖和含有輔劑(adjuvants)如D-山梨糖醇、D-甘露糖、 D-甘露糖醇和氯化鈉的其它等滲溶液可以用作注射用水溶液。它們可以與 合適的增溶劑聯用，所述增溶劑例如醇，具體而言是乙醇和多元醇如丙二 醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑如Polysorbate 80TM和HCO-50。
芝麻油或大豆油可以用作油性液體，並且還可以與作為增溶劑的苯甲 酸千酯或苯曱醇一起使用。或者，它們可以進一步以下物質一起配製緩 衝液如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩衝液；止痛劑如鹽酸普魯卡因；穩定劑如 苯曱醇和苯酚；以及抗氧化劑。如此製成的注射劑可以裝入合適的安瓿中。
本領域技術人員熟知的方法可以用於向患者施用本發明的藥物化合 物，例如，通過動脈內、靜脈內或皮下注射，以及類似地通過鼻內、經氣 管、肌內或口服施用。劑量和施用方法取決於患者的體重和年齡以及施用 方法而不同。然而，本領域的技術人員能夠按照常M^選擇它們。編碼本發 明的多肽的DNA可以插入用於基因治療的載體，並且可以施用該載體用於 治療。儘管劑量和施用方法依賴於患者的體重、年齡和症狀而有所不同， 但是本領域的那些技術人員能夠適當地選擇它們。例如，當向正常成人(體 重60kg)口服施用時，儘管取決於症狀有些許變化，與本發明的多肽結合從 而調節它們的活性的化合物的劑量是每天約0.1 mg至約100 mg，優選每天 約1.0 mg至約50 mg,更優選約1.0 mg至約20 mg。
當向正常成人(體重60 kg)以注射形式非消化道施用所述化合物時，盡 管取決於患者、靶器官、症狀和施用方法而存在些許變化，方便的是靜脈
1注射每天約0.01 mg至約30 mg,優選每天約0.1 mg至約20 mg，更優選每天約0.1 mg至約10 mg的劑量。類似地，可以按照從60 kg體重所用劑量換算的量向其它動物施用所述化合物。
以下，參照實施例對本發明進行更詳細地說明。然而，以下的材料、方法和實例僅是對本發明的諸方面的示例，而非對本發明範圍的限定。因此，與本說明書中的描述類似或等同的方法和材料，可以用於本發明的實施或研究。
實施例
從上述公開內容可以看出，本發明具有廣泛的應用。相應地，以下實施例是為例示目的而提供的，並不想被理解為以任何方式限制本發明。本領域技術人員將很容易認識到許多種非關鍵性參數，可以對這些非關鍵性參數進行變化或修飾，而得到基本相似的結果。
通過下面的實施例詳細地說明本發明，但本發明並不受這些實施例的限制。
實施例1-材料和方法(1)細胞系及臨床材料
人乳腺癌細胞系HBL100、HCC1937、 MCF畫7、MDA-MB-435S、SKBR3、T47D、 BT-549、 YMB1、 ZR-75-l、 OCUB-F、 MDA-MB-453、 MDA-MB-157、HCC1599、 HCC1500、 HCC1395、 HCC1143、 BT-474、 BT-20以及人胚腎細胞系HEK293T細胞、BTL100和COS7購自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Rockville， MD)。 HBC4、 HBC5、 BSY-1及MDA-MB-231細胞系由日本財團法人癌研究會癌化學療法中心分子藥理部(Division of MolecularPharmacology, Cancer Chemotherapy Center, Japanese Foundation for CancerResearch)矢守博士(Dr. Yamori)惠贈。所有的細胞均根據其各自保藏者的推薦進行培養，即對於HBC4、 HBC5、 BT-483、 SKBR3、 BT-549、 HCC1143、HCC1599、 HCC1500、 HCC1395、 T47D、 YMB1 、 HCC1937、 BSY-1和ZR-75-1使用RPMI-1640(Sigma-Aldrich， St. Louis, MO)(添加2mM的L-穀氨醯胺)；對於HBL100 BT-474和OCUB-F使用Dulbecco改進的Eagle培養基(Invitrogen， Carlsbad, CA);對於MCF-7和BT-20使用含O.lmM必需胺基酸(Roche, Basel, Switzerland), ImM丙酮酸鈉(Roche)、 0.01mg/ml胰島素(Sigma-Aldrich)的 EMEM (Sigma隱Aldrich); 對於 MDA-MB-231 和
127MDA-MB-435S， MDA-MB-453和MDA-MB-157使用L-15 (Roche)。每種培養基都添加有10。/。胎牛血清(Cansera)和1%抗生素/抗真菌溶液(antibiotic/antimycotic solution) (Sigma-Aldrich)。於37。C,在不含CO2的溼潤空氣中維持MDA-MB-231和MDA-MB-435s細胞。於37°C ，在含5% C02的溼潤空氣中維持其它細胞系。得到書面知情同意之後，從外科手術切除的乳腺癌中獲得了組織樣品，以及它們相應的臨床信息。
(2) 半定量RT-PCR分析
本發明人從各乳腺癌臨床樣品中提取了總RNA。本發明人按以前描述的方法從顯微解剖的細胞中提取總RNA,然後進行基於T7的擴增和逆轉錄(Nishidate T等人 Int J Oncol 2004;25:797-819.)。本發明人通過監測作為定量內部對照的甘油醛-3-磷酸脫氫酶0^MG)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(04屍Z)/f)和法呢醯二磷酸酯法呢醯基轉移酶1(FDF7V)，製備了用於後續PCR的各單鏈cDNA的適宜的稀釋物。PCR引物序列如下
用於/^MG : 5'陽AACTTAGAGGTGGGAGCAG陽3， (SEQ ID NO: l)和5，-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3， (SEQ ID NO: 2);
用於^7322: 5，-CTTGACAAGGCCTTTGGAGT-3， (SEQ ID NO: 3)和5'-CAATATGCTTTTCCCGCTTT-3， (SEQ ID NO: 4);
用於5，-AACCAAGCACACCATAGCCTTA-3， (SEQ ID NO: 5)和5'-GGAGATGGGTAGGGATACAAAC國3， (SEQ ID NO: 6),
用於爿W^5: 5'-GGGAGAGCTGAAGATTGCTG-3， (SEQ ID NO: 7)和5，-GACAGATTGAAGGGCAGAGG-3， (SEQ ID NO: 8);
用於: 5，-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3， (SEQ ID NO: 9)和5'畫GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT畫3， (SEQ ID NO: 10);
用於5，-AGTGAAATGCAGGTGAGAAGAAC-3， (SEQ ID NO:ll)和5'畫TCATTCTAGCCAGGATCATACTAAG-3， (SEQ ID NO: 12);
用於戶5^/r(9屍i: : 5，-AGACCCTAAAGATCGTCCTTCTG-3， (SEQ IDNO: 13)和5'隱GTGTTTTAAGTCAGCATGAGCAG-3，(SEQIDNO: 14);以及
用於屍/^2/Rj&4: 5,國GCTGACAACCTTGTGCTGAA-3， (SEQ ID NO: 15)和5，-TGAGAAATCACGCACTGTCC-3， (SEQ ID NO: 16)。
(3) Northern印跡分析按生產商的說明書，使用RNeasy試劑盒(Qiagen， Valencia, CA)從全部的 乳腺癌細胞系中提取了總RNA。在用DNA酶I (Nippon Gene, Osaka, Japan) 處理後，使用mRNA純化試劑盒(GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom)按生產商的說明書分離了 mRNA。將從正常成人的乳腺(Biochain, Hayward, CA)、肺、心臟、肝臟、腎臟和骨髓(BD Biosciences, San Jose, CA) 分離的每種mRNA取l iig等份在1%變性瓊脂糖凝膠上分離並轉移到尼龍 膜上(乳腺癌Northern印跡)。使人類多組織Northern印跡(Human multiple-tissue Northern blots)(BD Biosciences))與通過RT-PCR製備(參考下 述)的[ot32P]-dCTP標記J73" PCR產物進行雜交。按供應商的推薦進行預雜 交、雜交和洗滌。印跡使用增感屏(intensifyingscreen)在-80。C放射自顯影14 天。通過RT-PCR製備針對A7322 (459 bp)和F3374的特異性探針，並採用 megaprime DNA標記系統(GE Healthcare)進行了放射性標記，所述RT-PCR 使用以下引物組
A7322的3'UTR內5，-CAAGCTTGCTTACAGAGACCTG-3， (SEQ ID NO: 17)和5，-GGGCCAAACCTACCAAAGTT-3,(SEQIDNO: 18);
用於F3374: 5，-GCAATCTGCTATGTCAGCCAAC-3， (SEQ ID NO: 19) 和5，-CAGGATCAGCTCAAAGTCTGACA-3， (SEQ ID NO: 20);
5，-AGACCCTAAAGATCGTCCTTCTG-3， (SEQ ID NO: 13)和 5'-GTGTTTTAAGTCAGCATGAGCAG畫3，， (SEQ ID NO: 14)。
(4) cDNA末端5'快速擴增(5' RACE)
按生產商的說明書使用SMART RACE cDNA擴增試劑盒(Takara Clontech)進行了 5'RACE實驗。對於A7322 cDNA5，部分的擴增，基因特異 性引物如下
5，-GCCTCCTTCTGCAGCTTCCTCAGGATTT-3' (SEQ ID NO: 21) 並且使用了試劑盒中提供的通用引物混合物。使用Superscript III反轉錄酶 (Invitrogen),由從MDA-MB-453乳腺癌細胞提取並純化的mRNA合成了 cDNA模板。使用TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆了 PCR產物，通過DNA 序列測定(ABI3700; PE Applied Biosystems， Foster, CA)確定了序列。
(5) 表達載體的構建為了構建A7322、 PHB2/REA或F3374表達載體，使用KOD-Plus DNA 聚合酶(Toyobo, Osaka, Japan)通過PCR擴增了 A7322或cDNA的完整編碼 序列。引物組為
A7322-正向
5，-CGGAATTCATGGAAGAAATCCTGAGGAAGC-3， (SEQ ID NO: 22) (下劃線表示￡co^I位點)和 A7322-反向
5 ，-ATAGTTTAGCGGCCGCACAATGATGTCATAGACACGG-3 ， (SEQ ID NO: 23)(下劃線表示位點)； PHB2/REA-正向
:5，-CGGAATTCCAGACCGTGCATCATGGCCCAGAACTTGAAGGA畫3， (SEQ ID NO: 24)(下劃線表示￡coRI位點)和 PHB2/REA-反向
5，-CCGCTCGAGTTTCTTACCCTTGATGAGGCTGT-3， (SEQ ID NO: 25) (下劃線表示屈ol位點)； ERa-正向
5 ，畫CGGAATTCATGACCATGACCCTCCACACCAAAGCATCC-3' (SEQ ID NO: 26)和
ERa-反向5，-CCGCTCGAGGACCGTGGCAGGGAAACCCTCT-3， (SEQ ID NO: 27)(下劃線表示限制性內切酶的識別位點)； F3374-正向
5，-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGATGCTCTTCAATTCGGTGCT-3， (SEQ ID NO: 28)(下劃線表示TVort位點)和 F3374-反向
5，-CCGCTCGAGTAATTCTGTTGAGTGTTCAGGACC-3， (SEQ ID NO: 29)(下劃線表示Iol位點)。
將PCR產物插入pCAGGS-nH3F表達載體的￡oci I和Wort位點(對於 A7322)、五oaRI和iol位點(對於PHB2/REA)、￡oci I和Wol位點(對於ERa) 或iVofl和為ol位點(對於B3374),並且與N-末端HA-標籤和C-末端Flag-標籤共閱讀才匡。通過DNA序列測定(ABI3700， PE Applied Biosystems， Foster, CA)確認了構建體。
130(6)抗A7322多克隆抗體和抗F3374多克隆抗體的製備
使用pET21a (+)載體(Novagen， Madison， WI)設計了這樣的質粒，用來表 達與N-末端T7-標籤和C-末端組氨酸(His)標籤共閱讀框的兩個A7322片段 (密碼子459-572和799-1200)。在大腸桿菌BL21 codon-plus菌抹(Stratagene， La Jolla， CA)中分別表達兩個重組肽，按供應商的規程使用Ni-NTA樹脂瓊 脂糖(QIAGEN)對其進行了純化。將純化的重組蛋白混合在一起，然後將其 用於4妄種兔(Medical and Biological Laboratories, Nagoya, Japan)。才妻著^1誇免疫 血清按供應商的說明書使用Affigel 15凝膠(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)在抗原親和柱上純化了 。本發明人確認了該抗體可以特異性識別乳腺癌 細胞系(SK-BR-3細胞)中的內源性A7322蛋白。將一種親和純化的抗A7322 抗體用於下述Western印跡、免疫細胞化學染色和免疫組織化學染色分析。 使用pET21載體(Merck， Novagen， Madison， WI)製備了設計成表達C末 端帶His標籤的F3374的一部分的質粒。在大腸桿菌BL21 codon-plus (Stratagene, La Jolla, CA)中表達重組肽(36kDa),按供應商的規程使用 Ni-NTA樹脂(Qiagen)對其進行了純化。為了移除作為汙染物的大腸桿菌蛋 白質，從SDS-PAGE凝膠中切下F3374片段蛋白，使用電洗脫儀(Bio-Rad， Hercules， CA)提取。將提取的蛋白質接種於兔，接著按供應商的說明書使用 A伍gel15凝膠(Bio-Rad)在抗原親和柱上純化了免疫血清。將親和純化的抗 F3374抗體用於下述Western印跡、免疫組織化學和免疫細胞化學分析。 (7)克隆和誘變
為了構建PBK/TOPK表達載體，使用KOD-Plus DNA聚合酶(Toyobo, Osaka, Japan)通過PCR擴增了 PBK/TOPK cDNA的完整編碼序列。用於野 生型PBK/TOPK的引物組為
5，隱CCGGAATTCATGGAAGGGATCAGTAATTTC-3， (SEQ ID NO: 30)和 5，-CCGCTCGAGTCAGACATCTGTTTCCAGAGCTTC-3， (SEQ ID NO: 31)(下劃線表示限制性內切酶的識別位點)。將PCR產物插入pCAGGS-nHA 表達載體的位點和lol位點。按以前描述的方法(Gaudet S，等人，Proc Natl Acad Sci USA 2000， 97:5167-72),進行兩步誘變PCR以產生激酶失活 (kinase-dead)突變體(K64-65A)，其中Lys64和Lys65被置換成丙氨酸。用於 突變體K64-65A的引物組為5，-CATTCTCCTTGGGCTGTAGCAGCGATTAATCCTATATGTAATG-3' (SEQ ID NO: 32)和
5,-CATTACATATAGGATTAATCGCTGCTACAGCCCAAGGAGAATG-3' (SEQIDNO: 33)(下劃線表示^^人野生型置換的核苷酸)。通過DNA序列測定 (ABI3700， PE Applied Biosystems， Foster, CA)確認了所有構建體。 (8)免疫細胞化學染色
為考察乳腺癌細胞中內源性A7322蛋白的亞細胞定位，以lxlO5個細胞 每孔接種了 SK-BR陽3細胞(Lab-Tek II Chamber Slide System; Nalge Nunc International, Naperville, IL)。溫育24小時後，使用含4%多聚曱醛 (paraformaldehyde)的PBS (-)於4 。C固定細胞30分鐘，並用含0.1% Triton X-100的PBS(-)於4。C處理2分鐘以使細胞可通透。接下來，用含3。/。BSA 的PBS (-)覆蓋細胞1小時，以封閉非特異性雜交，接著再與1:250稀釋的 抗A7322多克隆抗體一起溫育1小時。用PBS(-)清洗後，將細胞用1:1000 稀釋的Alexa488-偶聯抗兔第二抗體(MolecularProbe， Eugene, OR)染色1小 時。用4'，6'-二脒基-2'-苯基p引咮二鹽酸(DAPI)對細胞核進行了復染。在TCS SP2 AOBS顯微鏡(Leica， Tokyo, Japan)下獲取了螢光影像。
為考察F3374的亞細胞定位，以5乂104個細胞每孔接種了 HBC5細胞。 然後，使用含4%多聚曱醛(paraformaldehyde)的PBS固定細胞20分鐘，並 用含0.1% Triton X-100的PBS於室溫處理2分鐘以使細胞可通透。接下來， 用含3。/。BSA的PBS於室溫覆蓋細胞l小時，以封閉非特異性雜交。接著， 將細胞與1:100稀釋的兔抗F3374抗體一起溫育。用PBS清洗後，將細胞 用1:1000稀釋的Alexa 488-偶聯抗兔第二抗體(Molecular Probe)進行了染色。 用4'， 6'-二脒基-2'-苯基P引哚二鹽酸(DAPI)對細胞核進行了復染。在TCS SP2 AOBS顯微鏡(Leica， Tokyo， Japan)下獲取了螢光影像。為考察內源性F3374 和AURKB蛋白的亞細胞定位，以lxlS個細胞每孔接種了 T47D細胞。在 上述條件下進行了細胞固定、封閉反應和染色步驟，除了使用1:100稀釋的 抗F3374抗體或1:500稀釋的抗AURKB抗體(Abcam， Cambridge, MA)以外。
為考察乳腺癌細胞系T47D、 BT-20和HBC5中內源性PBK/TOPK蛋白 的亞細胞定位，以2xl05個細胞每孔接種了細胞(Lab-Tek II chamber slide, Nalgen Nunc International, Naperville, IL)。溫育48小時後，使用含4%多聚 甲醛(paraformaldehyde)的PBS (-)固定細胞15分鐘，並用含0.1 % Triton X-100的PBS (-)於4。C處理2.5分鐘以使細胞可通透。接下來，用含3。/。BSA的 PBS (-)於4。C覆蓋細胞12小時，以封閉非特異性雜交，接著再與1:100稀 釋的小鼠抗PBK/TOPK單克隆抗體(BD Biosciences)—起溫育。用PBS(-)清 洗後，將細胞用1:1000稀釋的Alexa 594-偶聯抗小鼠第二抗體(Molecular Probe， Eugene， OR)進行了染色。用4'， 6'-二脒基-2'-苯基p引哚二鹽酸(DAPI) 對細胞核進行了復染。在TCS SP2 AOBS顯微鏡(Leica， Tokyo， Japan)下獲取 了螢光影像。為考察在SerlO處磷酸化的組蛋白H3,用磷酸-組蛋白 H3(Serl0)隱特異性兔多克隆抗體(Cell Signaling Technologies, Berverly, MA)檢 測了所述蛋白。 (9) Western印跡分析
為4企測外源性A7322蛋白，用FuGene 6 (Roche)將pCAGGSnHsF-A7322 表達載體質粒(20嗎)轉染至BT-549細胞。24小時後，在含0.1。/。蛋白酶抑制 劑合劑III (Calbiochem， San Diego， CA)的裂解緩沖液(50mM Tris-HCL, pH 8.0/150mM NaCL/0.1.% NP-40, 0.5% CHAPS)中裂解細胞。用蛋白質一企測試劑 盒(Bio-Rad， Hercules, CA)估計了總蛋白的量，然後將蛋白與SDS樣品緩衝 液混合，煮沸後上樣於6。/。SDS-PAGE凝膠。電泳後，將蛋白印跡在硝酸纖 維素膜(GE Healthcare)上。用封閉液(blocking solution)封閉含蛋白的膜，將 其與抗Flag M2單克隆抗體一起溫育，來檢測外源性A7322蛋白。最後， 將膜與HRP偶聯第二抗體一起溫育，使用ECL檢測試劑(GE Healthcare)使 蛋白條帶可視化。
為考察SK-BR-3細胞中內源性A7322蛋白的表達，用含0.1%蛋白酶抑 製劑合劑III (Calbiochem, San Diego， CA)的裂解緩衝液(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 150mMNaCl， 0.1。/oNP-40和0.5o/oCHAPS)裂解細胞。勻化後，將細胞裂 角牟物在)水上溫育30分4中，14,000 rpm 離心5分鐘，以把上清液和細胞碎片 分開。用蛋白質檢測試劑盒(Bio-Rad)測定了總蛋白的量，然後將蛋白與SDS 樣品緩衝液混合，煮沸5分鐘後上樣於7.5。/。SDS-PAGE凝膠。電泳後，將 蛋白印跡在硝酸纖維素膜(GE Healthcare)上。用封閉液(blocking solution)封 閉含蛋白的膜1小時，將其與純化的抗A7322多克隆抗體一起再溫育1小 時，來檢測內源性A7322蛋白。最後，將膜與HRP偶聯第二抗體一起溫育 1小時，使用ECL檢測試劑(GE Healthcare)使蛋白條帶可視化。為檢測乳腺癌細胞系(HBC4、 BT-549、 HBC5、 HBLIOO、 HCC1937、 MCF-7、 MDA-MB國231、 MDA-MB-453、 SKBR3和T47D、 ZR75曙1)以及人 乳腺上皮細胞(HMEC)中的內源性F3374和AURKB蛋白，在含0.1%蛋白酶 抑制劑合劑III (Calbiochem， San Diego， CA)的裂解緩沖液(50mM Tris-HCl, pH 8.0/150mM NaCl/0.5% NP-40)中裂解細胞。用蛋白質才企測試劑盒(Bio-Rad, Hercules, CA)估計了總蛋白的量，然後將蛋白與SDS樣品緩衝液混合，煮 沸後上樣於10。/。SDS-PAGE凝膠。電泳後，將蛋白印跡在硝酸纖維素膜(GE Healthcare)上。用封閉液(4% BlockAce; Dainippon Pharmaceutical. Co., Ltd, Osaka, Japan)封閉後，將蛋白印跡的膜與1:100稀釋的抗F3374多克隆抗體 或1:100稀釋的抗AURKB兔多克隆抗體(abcam， Cambridge, UK)—起溫育， 來檢測內源性F3374或AURKB蛋白。最後，將膜與HRP偶聯第二抗體一 起溫育，使用ECL檢測試劑(GEHealthcare)使蛋白條帶可視化。還考察了卩-肌動蛋白(Beta-actin)作為上樣對照(loading control)。
為檢測乳腺癌細胞(BT-20 、 HBC4 、 HBC5 、 HBL-100 、 MCF-7 、 MDA-MB-231 、 SKBR3和T47D)中的內源性PBK/TOPK蛋白，在含0.1 %蛋 白酶抑制劑合劑III (Calbiochem, San Diego， CA)的裂解緩衝液(50mM Tris-HCl，pH8.0/150mMNaCl/0.5。/。NP-40)中裂解細胞。勻化後，將細胞裂 解物在冰上溫育30分鐘，14,000 rpm離心15分鐘，以僅將上清液和細胞碎 片分開。用蛋白質檢測試劑盒(Bio-Rad， Hercules, CA)估計了總蛋白的量，然 後將蛋白與SDS樣品緩衝液混合，煮沸後上樣於10。/。SDS-PAGE凝膠。電 泳後，將蛋白印跡在硝酸纖維素膜(GE Healthcare)上。用封閉液(blocking solution)封閉蛋白印跡的膜，將其與抗PBK/TOPK單克隆抗體(BD Biosciences)—起溫育，來檢測內源性PBK/TOPK蛋白。最後，將膜與HRP 偶聯第二抗體一起溫育，使用ECL檢測試劑(GE Healthcare)使蛋白條帶可視 化。還考察了 P-肌動蛋白作為上樣對照。
通過使用pCAGGS-nHA表達載體轉染T47D細胞外源性表達了野生型 和激酶失活(kinase-dead) PBK/TOPK蛋白。轉染後48小時收集了全細胞裂 解物。在上述細胞裂解緩衝液中裂解細胞。後面的步驟與上文所述相同， 只是抗體反應使用的是抗HA大鼠高親和性抗體(Roche)。此外，為了內源 性檢測活化的PBK/TOPK蛋白，在收集之前，將T47D細胞分別用100 nM 岡田酉交(okadaic acid, OA) (Calbiochem)或0,3 jxg/mL諾考達峻(nocodazole)(Sigma-Aldrich)處理6小時或18小時(見正文)。後面的步驟也如上述進行。 通過使用1U X蛋白磷酸酶(New England Biolabs， Ipswich， MA)於3(TC處理2 小時確認了磷酸化蛋白。
(10) X磷酸酶測定
為考察乳腺癌細胞中F3374蛋白的磷酸化狀態，本發明人用人磷酸酶 (New England Biolabs， Beverly, MA)處理了來自T47D細胞的細胞提取物。用 NP-40裂解緩衝液(50mM Tris-HCL(pH8.0)， 150mM NaCL， 0.5% NP-40)裂解 細胞，在含50mMTris-HCL(pH7.5)、 0.1 mMNa2EDTA、 5mM二硫蘇糖醇、 2 mM MgCL2和0.01% Brij-35的磷酸酶緩沖液中用400單位蛋白磷酸酶 (New England Biolabs)於30。C處理細胞裂解物2小時。此外，為明確F7433 蛋白的磷酸化位點(們)，以每個10cm皿2xl(^個細胞接種了 HEK293T細胞。 24小時後，本發明人使用FuGENE 6轉染試劑(Roche)按生產商的說明書用 8嗎的pCAGGS-F3374-Al-HA、A2和A3瞬時轉染HEK293T細胞。用NP-40 緩衝液(0.5。/。NP-40、 150mMNaCl、 50mMTris-HCl(pH7.5)),磷酸酶緩沖液 (含50 mM Tris-HCl， pH 7.5， 0.1 mM Na2EDTA， 5 mM 二石克蘇糖醇，2 mM MgCl2和0.01。/。Brij-35)裂解細胞。轉染後48小時，用NP-40裂解緩衝液裂 解細胞。然後用400單位蛋白磷酸酶(P0753S New England Biolabs)於30°C 處理裂解的細胞2小時。
為考察PBK/TOPK蛋白的磷酸化，將10ng活性PBK/TOPK蛋白和15 (ig和總有絲分裂細胞裂解物按生產商的說明書與2單位入PPase和PPla重 組蛋白質一起溫育。30。C溫育2小時後，加入SDS樣品緩衝液並煮沸來終 止反應。最後電泳蛋白質樣品，如上所述對其進行免疫印跡。
(11) A7322、 F3374V1或PBK/TOPK特異性siRNA表達栽體的構建 本發明人按以前描述的方法(Taniuchi K等人Cancer Res.， 65:105-112.
2005.)，使用psiU6BX3.0 siRNA表達載體建立了基於載體的RNAi (RNA幹 擾)表達系統。通過將雙鏈寡核苷酸克隆至psiU6BX3.0載體中的S&I位點， 製備了針對爿7322 (psiU6BX3.0-A7322)、 FW74r7 (psiU6BX3.0-F3374Vl)、 EGFP (psiU6BX3.0隱EGFP)、亂序(scramble) (psiU6BX3.0陽SCR)和模擬(Mock) (psiU6BX3.0-Mock)的siRNA表達載體。用於siRNA的合成寡核普酸的靶標 序歹ll^口下用於A7322: si-#2; 5,畫AAGAAAGCATCGCAGTCTCAG-3， (SEQ ID NO:
34)，
si-#3; 5，-AAGATGCGTTCTCTGCCACAC-3， (SEQ ID NO: 35)和 si-#m3; 5'-AAi;ATi:CGATCTCTGCCACAC-3, (SEQ ID NO: 36)(下劃線 表示針對si-#3的錯配序列)；
用於F3374: si-#l; 5'-GATCATGTCTCCGAGAAAA陽3， (SEQ ID NO: 37)，
si-#4; 5，-GGAAGCCATAGAATTGCTC-3， (SEQ ID NO: 38);
用於PBK/TOPK: si-#2; 5'-CTGGATGAATCATACCAGA畫3' (SEQ ID NO:
39),
si-#3; 5，-GTGTGGCTTGCGTAAATAA-3， (SEQ ID NO: 40);
用於對照si-亂序；5，-GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3， (SEQ ID NO: 41)
和
si-EGFP; 5'畫GAAGCAGCACGACTTCTTC-3, (SEQ ID NO: 42)。 所有構建體也通過DNA序列測定進行了確認。
關於細胞生長對於針對p97的siRNA的影響，以每60個mm皿lxl05 個細胞接種了 T47D細胞。溫育2天後，使用Lipofectamine RNAiMAX試 劑按生產 商的說明 書 用 si-EGFP 和 si-p97 (5，-AAGUAGGGUAUGAUGACAUUG-3， SEQ ID NO: 121; W6jcik C等人，J Cell Sci 117; 281-292 (2004))的siRNA雙鏈體各100 pmol轉染。siRNA轉染 2天後，使用相差顯微鏡(phase contrast microscopy)觀察細胞形態。然後收 集細胞，將等量總蛋白用抗TOPK單克隆抗體(l:3,000)抗P-肌動蛋白單克隆 抗體(1:10，000)進行免疫印跡。
表1
SEQ ID No.
5，-CACCAAGAAAGCATCGCAGTCTCAGTTC ^ AAGAGACTGAGACTGCGATGCTTTCTT-3' 5 ， -AAA AAAGA AAGCATCGC AGTCTCAGTCT CTTGAACTGAGACTGCGATGCTTTCTT-3' AAGAAAGCATCGCAGTCTCAGTTCAAGAGACTG AGACTGCGATGCTTTCTT 5 ， -C ACC A AGATGCGTTCTCTGCC AC ACTTC AAGAGAGTGTGGCAGAGAACGCATCTT-3' 5 ， - AAAAAAGATGCGTTCTCTGCC AC ACTCT CTTGAAGTGTGGC AGAGAACGC ATCTT-3' AAGATGCGTTCTCTGCCACACTTCAAGAGAGTGT GGCAGAGAACGCATCTT
136
A7322
F
#2 R
髮夾 F
#3 R 髮夾F
#1 R
F3374
#4
PBK/TO PK
髮夾 F R 髮夾 F
#2 R 髮夾 F
#3 R 髮夾
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
5 ，-CACCGATCATGTCTCCGAGAAAATTC AAGAGATTTTCTCGGAGAC ATGATC-3' 5 ，陽AAAAGATCATGTCTCCGAGAAAATCT CTTGAATTTTCTCGGAGAC ATGATC-3' GATCATGTCTCCGAGAAAATTCAAGAGATTTTCT CGGAGACATGATC
5 ，陽C ACCGGAAGCC ATAGA ATTGCTCTTC AAGAGAGAGC AATTCTATGGCTTCC-3' 5 ，-AAAAGGAAGCCATAGAATTGCTCTCT CTTGAAGAGCAATTCTATGGCTTCC-3'3' GGAAGCCATAGAATTGCTCTTCAAGAGAGAGCA ATTCTATGGCTTCC
5 ， -C ACCCTGG ATGAATC ATACC AGATTC AAGAGATCTGGTATGATTCATCCAG-3' 5 ， - AAA ACTGGATGAATC ATACC AGATCTC TTGAATCTGGTATGATTCATCC AG-3' CTGGATGAATCATACCAGATTCAAGAGATCTGGT ATGATTCATCCAG
5 ，-C ACCGTGTGGCTTGCGTAAATAATTC AA GAGATTATTTACGCAAGCC ACAC層3' 5 ，隱AAAAGTGTGGCTTGCGTAAATAATCTCTT GAATTATTTACGCAAGCCACAC-3' GTGTGGCTTGCGTAAATAATTCAAGAGATTATTTA ___CGCAAGCCACAC__
(12) A7322、 F3374V1、 AURKB或PBK/TOPK的基因沉默效應
將人乳腺癌細胞系BT-549和BT-474 (用於A7322)以及T47D和HBC4 (用於F3374)鋪在10-cm皿上(2 x 106個細胞/皿)，如上所述使用FuGENE6 試劑(Roche)，轉染了 psiU6BX3.0-Mock(無插入物)、psiU6BX3.0-A7322 (#2、 #3以及#3中含3個鹼基置換的錯配構建體(nrf3))、psiU6BX3.0-F3374Vl (#1, 和糾)、psiU6BX3.0-EGFP、 psiU6BX3.0-SCR各8 (iig。本發明人分別使用含 0.2 mg/ml或1 mg/ml新黴素(Geneticin, Gibco BRL, Carlsbad， CA)的培養基選 擇了 psiU6BX3.0導入的BT-549、 BT-474、 T47D和HBC4。用遺傳黴素 (geneticine)處理後第48小時，將細胞再接種，用於集落形成試-瞼(2 x 106個 細胞/10 cm皿)、RT-PCR (2 x 106個細胞/10 cm皿)和MTT測定(2 x 105個細 胞/孔)。為評價siRNA的效應，從新黴素溫育第4天的細胞中提取了總RNA， 然後，通過半定量RT-PCR考察了 siRNA的基因敲低(knockdown)效應，所 述半定量RT-PCR使用以下的特異性引物組
對於作為內部對照的A2MG : 5，-AACTTAGAGGTGGGAGCAG-3， (SEQ ID NO: l)和
5，-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3， (SEQ ID NO: 2)以及對於」73": 5'-GCCCTTGAAGCCAATATTCC-3， (SEQ ID NO: 61)和
5，-AGATGGTTTCAGTGGGCTTG-3， (SEQ ID NO: 62);
對於FB74F7: 5，-GCAATCTGCTATGTCAGCCAAC-3，(SEQIDNO: 19)
和
5,-CAGGATCAGCTCAAAGTCTGACA-3， (SEQ ID NO: 20)。 表達siRNA的轉染子在含新黴素的選擇培養基中生長了 4周，然後用 4%多聚甲醛固定15分鐘，之後用Giemsa溶液(Giemsa，s solution) (Merck， Whitehouse Station, NJ)染色以評價集落數量。為定量細胞的生存力，在轉染 後4天，使用細胞計數試劑盒-8(Wako， Osaka, Japan),按照生產商的推薦進 行了 MTT測定。用Microplate Reader 550 (Bio-Rad)測定了 570 nm波長處的 吸光度。這些實驗一式三份地進行。
此外，由於siRNA寡核苷酸(Sigma Aldrich Japan KK, Tokyo, Japan)具有 高轉染效率，本發明人使用其以進一步驗證在A7322基因已被siRNA敲低 的細胞中PHB2/REA蛋白的亞細胞定位。靶向A7322的序列或模擬如下 si-A7322; 5，-GAUGCGUUCUCUGCCACACUU-3， (SEQ ID NO: 63)， siEGFP (對照)；5，-GCAGCACGACUUCUUCAAG-3， (SEQ ID NO: 64)。 在 Optimem (Invitrogen)培養基中使用 Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA)按照生廠商的說明書用那些siRNA轉染了 MCF-7 細胞(10cm皿中2.5 x 15個細胞以供FACS分析)。轉染後48小時，用lpM E2 (卩-雌二醇(卩-estradiol); Sigma-Aldrich)處理細胞，然後使用抗PHB2/REA 多克隆抗體(abcam， Cambridge, UK)、抗A7322抗體和抗ERa單克隆抗體 (LAB VISION, Fremount， CA),按照免疫細胞化學染色分析部分所述進行免 疫細胞化學染色和western印跡分析。在TCS SP2 AOBS顯樣i4竟下獲取了熒 光影像。
或者，由於siRNA寡核苷酸(Sigma Aldrich Japan KK, Tokyo, Japan)具有 高轉染效率，本發明人使用它們來進一步在細胞形態學上驗證和 jt/i^fi的敲低效應。靶向各基因的序列如下
用於siF3374: 5，-ACUCCUACGUUCUCUAUUA-3， (SEQ ID NO: 65)， 用於siAURKB : 5，-AAGGUGAUGGAGAAUAGCAGU-3， (SEQ ID NO:
66)，用於siEGFP (對照)5，-GCAGCACGACUUCUUCAAG-3， (SEQ ID NO:
64)。
<吏用Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen)在Optimem i咅養基(Invitrogen) 中按照生廠商的說明書用那些siRNA轉染了 T47D或HBC4細胞(10cm皿中 2.5xl5個細胞，以供FACS分析)。轉染後48小時，使用AlexaFluor 594 Phalloidin (鬼筆環肽)(Molecular Probe),用顯微鏡檢查和免疫細胞化學染色 分析考察了 HBC4細胞的形態學變化。
_乾標序列_ SE(j ID No.
F3374 siF3374 ACTCCTACGTTCTCTATTA 67 "~""
AURKB siAURKB AAGGTGATGGAGAATAGCAGT 68 EGFP siEGFP GCAGCACGACTTCTTCAAG 69
將人乳腺癌細胞系T47D和BT-20鋪在15-cm皿上(4 x 106個細胞/皿)， 使用 FuGENE6試劑(Roche), 按生產商的說明書，轉染了 psiU6BX3.0-Mock(無插入物)和psiU6BX3.0畫PBK/TOPK (#2和#3，表1)各 16昭。轉染後24小時，將細胞再接種，用於集落形成試驗(2乂106個細胞/10 cm皿)、RT-PCR (2xl06個細胞/ 10 cm皿)和MTT測定(l x 105個細胞/孔)。 分別使用含0.7 mg/ml或0.6 mg/ml新黴素(Geneticin， Invitrogen, Gibco BRL, Carlsbad, CA)的培養基選擇了 psiU6BX3.0導入的T47D或BT-20細胞。每 周更換兩次培養基。為了評價siRNA的效應，從新黴素溫育第ll天的細胞 中提取了總RNA,然後，通過半定量RT-PCR考察了 siRNA的敲低 (knockdown)效應，所述半定量RT-PCR使用以下特異性引物組
對於內部對照a4屍D/f : 5，-ATGGAAATCCCATCACCATCT-3， (SEQ ID NO: 70)和
5 ，-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3 ， (SEQ ID NO: 10)，以及 對於屍SA/r(9/^基因5'-GCCTTCATCATCCAAACATT-3，(SEQIDNO: 71)和
5'畫GGCAAATATGTCTGCCTTGT畫3， (SEQ ID NO: 72)。 將表達siRNA的轉染體在含新黴素的選擇培養基中生長了 3周，然後 用4%多聚曱醛固定15分鐘，然後用Giemsa溶液(Merck, Whitehouse Station, NJ)進行了染色以評價集落數目。為定量細胞的生存力，使用細胞計數試劑 盒-8 (Wako, Osaka, Japan),按照生產商的推薦進行了 MTT測定。用Microplate Reader 550 (Bio-Rad)測定了 570 nm波長處的吸光度。這些實驗 一式三份進行。
(13) 使用pCAGGS-HA載體構建截短型F3374V1蛋白
為確定F3374V1蛋白的磷酸化區域，使用以下引物組製備了缺失構建 體dF3374Vl-F703-iVo/I;
5 ，-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCTGTGGATGGGATAATCAAA-3 ，(SE Q ID NO: 73)和dF3374Vl誦R721-眉ol;
5，-CCGCTCGAGTTTGATTATCCCATCCACAGC畫3， (SEQ ID NO: 74)用 於A-l構建體(第一個下劃線表示M rt位點，第二個下劃線表示，ol位點), dF3374Vl-F1162-iVo/I;
5，-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTGGCGCTTGAATAGAGGC-3, (SEQ ID NO: 75)和dF3374Vl陽R1203匿J^zol;
5，-CCGCTCGAGATCACCTCCTGGTTTCTCCTC隱3， (SEQ ID NO: 76)用 於A-2構建體(第一個下劃線表示M fl位點，第二個下劃線表示屈ol位點)， dF3374Vl畫F1729畫iVWI;
5，-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTTGATGGCCAAGTTGAAAAT-3 ， (SEQIDNO: 77)和dF3374Vl-R1770-J^oI;
5 ，-CCGCTCGAGGCAGCACAGATCCAAATGAAG腸3 ， (SEQ ID NO: 78) 用於A-3構建體(第一個下劃線表示iVort位點，第二個下劃線表示^Y7zoI位 點)。通過DNA序列測定(ABB700， PE Applied Biosystems, Foster, CA)確認 了構建體。
(14) 免疫組織化學染色
為考察乳腺癌和正常組織中A7322蛋白的表達，本發明人製備了石蠟 包埋的乳腺癌組織切片(樣品號240、 241、 238、 242和290)、正常乳房組 織切片(樣品號453)及其他商品化正常人類組織(肺、心臟和肝臟)(BioChain) 的載玻片。用二甲苯和乙醇處理使標本脫石蠟，然後在高pH抗原修復溶液 (DAKO Cytomation， Glostrup， Denmark)中高壓蒸汽108。C處理標本15分鐘 進行抗原^務復，並用過氧化物酶封閉劑(DAKO Cytomation)處理1小時。將 組織切片與1:150稀釋的抗A7322多克隆抗體一起溫育1小時，接著與辣 根過氧化物酶偶聯第二抗體(DAKO Cytomation)—起溫育30分鐘。用過氧化 物酶底物(3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride， 3, 3，-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽)(DAKO liquid DAB+ chromogen; DAKO Cytomation)使特異性免疫染 色可視化。最後，用蘇木精(hematoxylin)染色組織標本，以將細胞核與細胞 質區分開來。
按以前描述的方法(Togashi A等人，Cancer Res 2005， 65:4817-26)，考察 了乳腺癌及正常人類組織中F3374V1蛋白的表達圖式。用二曱苯和乙醇處 理石蠟包埋的乳腺癌(10005T、 10317T、 10069T、 10571T、 10164T和10185T) 標本、正常乳房組織(10441N)標本及正常人類組織(肺、心臟、肝臟、腎臟、 結腸、胰臟、骨骼肌、小腸和睪丸)標本的載玻片，以除去石蠟。在Target Retrieval Solution High pH (DAKQ， Carpinteria， CA)中高壓滅菌器121。C處理 15分鐘進行抗原修復。使用ENVISION+ Kit/HRP (Dakocytomation， Kyoto, Japan)檢測了 F3374;用內源性過氧化物酶和蛋白封閉反應後，加入1:50稀 釋的親和純化的兔抗F3374pAb作為第一抗體，用HRP標記抗兔IgG處理 混合物。最後，加入基質-色原(substmte-chromogen)，用蘇木精對組織標本 進行復染，以將細胞核與細胞質區分開來。
按以前描述的方法(Togashi A等人，Cancer Res 2OO5, 65:4817-26),使用 抗PBK/TOPK小鼠單克隆抗體(BD Biosciences)研究了乳腺癌及正常組織中 PBK/TOPK蛋白的表達圖式。為了研究正常器官，購買了心臟、肺、肝臟、 腎臟及睪丸的商品化組織切片(Biochain)。具體地，用二曱苯和乙醇處理石 蠟包埋的標本，用蛋白封閉試劑(Dako Cytomation, Carpinteria, CA)進行了 封閉。加入含單克隆抗體的抗體稀釋溶液(1:50)，用基質-色原 (substrate-chromogen) (DAKO liquid DAB chromogen, DakoCytomation)進4亍 了染色。最後，用蘇木精染色組織標本，以將細胞核與細胞質區分開來。
(15)螢光活化細胞分選(FACS)分析
如上面所述地進行了 siRNA實驗的BT-474乳腺癌細胞在含1.0 mg/ml 新黴素的選擇培養基中溫育2天後收集。收集細胞並用冷的70%乙醇固定， 使用前維持在4°C。將細胞於37。C在含10 mg/ml RNase I的PBS (-)中溫育 30分鐘，室溫下用50 碘化丙錠(propidium iodide, PI)染色30分鐘。使用 流式細胞儀(FACS calibur; Becton Dickinson, San Diego, CA)分析了細月包懸液 的DNA含量。用CELLQuest軟體(BD Biosciences)分析數據。試驗一式三 份獨立進行。
141用2 |ig/ml阿非科林(aphidicolin) (Sigma-Aldrich)處理24小時，使培養 的T47D乳腺癌細胞的細胞周期同步。接下來，用PBS (-)清洗細胞5次， 加入新鮮培養基以解除細胞周期停滯。解除細胞周期停滯後，收集細胞， 用70%乙醇固定，然後保持在4。C直至使用。將細胞於37。C在含10 mg/ml RNase I的PBS (-)中溫育30分鐘，室溫下用50 pg碘化丙錠染色30分鐘。 用FACscan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)分4斤了各時間點的細月包懸 液。另外，為考察內源性F3374蛋白的表達水平，本發明人使用抗F3374 多克隆抗體對每3小時收集的細胞進行了 western印跡，如western印跡分 析部分中所述。
對於PBK/TOPK ，對培養的T47D乳腺癌細胞通過阿非科林 (Sigma-Aldrich)處理16小時使其細胞周期同步，用PBS (-)清洗5次，加入 新鮮培養基以解除細胞周期停滯。在解除後15個小時(每3個小時)中，收 集細胞，用70%乙醇固定，然後保持在4。C直至使用。將細胞與含10mg/ml RNase I的PBS (-)於37。C一起溫育30分鐘，室溫下用50 pg碘化丙錠染色 30分鐘。用FACscan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)分析了各時間點 的細胞懸液。
為收集G2/M停滯的細胞，在收集前最後16小時內用0.3嗎/mL諾考 達哇(nocodazole) (Sigma畫Aldrich)處理i告養基。 (16)共免疫沉澱及免疫印跡分析
為確定A7322蛋白的相互作用蛋白，將BT-549人乳腺癌細胞鋪在15 cm 皿上(l x 107個細胞/亞)，使用FuGENE6試劑(Roche)，按照生產商的說明書， 分別轉染了 20 pg pCAGGSnH3F-Mock (無插入物)和pCAGGSnH3F-A7322。 本發明人為每個構建體轉染了 6個皿。48個小時後，如Western印跡分析 部分所述，用0.1% NP-40裂解緩沖液裂解細胞。用正常小鼠IgG和 rec-Protein G Sepharose 4B (Zymed， San Francisco, CA)於4。C預清潔細胞裂解 物1小時。接著，於4。C使裂解物與抗FLAG M2瓊脂糖(Sigma-Aldrich)— 起溫育過夜。用裂解緩衝液清洗5次後，用SDS樣品緩沖液煮沸5分鐘洗 脫珠子上的蛋白質。使用NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)通過 SDS-PAGE分離洗脫的蛋白質樣品。使用SilverQuest Silver Staining Kit (Invitrogen)，按照生產商的說明書銀染聚丙烯醯胺凝膠中的蛋白質。用清潔、 鋒利的手術刀切下模擬和A7322轉染的泳道之間的差異條帶，使用MALDITOF-MS進行了 PMF (Peptide Mass Fingerprint,肽質量指紋圖譜)分析 (Shimadzu Biotech, Tsukuba， Japan)。
用pCAGGSn3FC-A7322、 pCAGGSnHC-PHB2/REA單獨或者兩個一起 瞬時轉染COS-7細胞。轉染後48小時，如Western印跡分析部分所述，用 0.1。/。NP-40裂解緩沖液裂解細胞。於4。C預清潔細胞裂解物1小時，接著於 4。C使細胞裂解物與抗FLAG M2瓊脂糖(Sigma-Aldrich)或單克隆抗HA瓊脂 糖偶聯物(Sigma-Aldrich)—起溫育過夜。如前所述清洗珠子並洗脫蛋白質。 最後，本發明人使用抗HA高親和性(3F10)大鼠單克隆抗體(Roche)或抗 FLAGM2單克隆抗體(Sigma-Aldrich)進行了 Western印跡分析，以分別檢測 外源性表達的PHB2/REA或A7322蛋白。
將HEK293T細胞鋪在5個皿上(8 x 1(^個細胞/15cm皿)，共轉染了 8昭 表達F3374 (pCAGGSn-F3374-HA)和AURKB (pCAGGSn-AURKB隱3F)的質 粒。pCAGGSn-AURKB-3F質粒是以前製備的(未公開數據；Daigo Y和 NakamuraY)。轉染48小時後，用免疫沉澱緩衝液(50mM Tris-HCL (pH 7.5)、 150mM NaCL、 0.5% NP隱40、 50mM NaF、 lmM NaV03和lmM 二石克蘇衝唐醇) 在蛋白酶抑制劑(Calbiochem)存在下裂解細胞。於4。C在200 pl蛋白G-瓊脂 糖珠子(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA)中與3.75嗎正常小鼠 IgG—起溫育3小時，來預澄清細胞裂解物。於4°C 14,000 rpm離心1分鐘 後，將上清液與30嗎抗Flag M2或小鼠正常IgG於4。C一起溫育1小時， 然後加入100|^1蛋白G-瓊脂糖珠子。14,000 rpm離心1分鐘從各樣品中收集 珠子，並用1 ml免疫沉澱緩沖液清洗5次後，將它們用30lalLaemmli樣品 緩沖液洗脫並煮沸5分鐘。在8% SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad)上分離蛋白質。 電泳後，按照western印跡分析部分所述的方法，用 western 印跡分析檢測 了蛋白質。
為考察內源性F3374V1和AURKB蛋白的相互作用，以6x 106個細胞 /15cm皿接種了 T47D細胞。兩天後，在免疫沉澱緩衝液(50mM Tris-HCL (pH 7.5)、 150mMNaCL、 0.5% NP-40、 50mMNaF、 lmM NaV03和lmM DTT) 中有蛋白酶抑制劑(Calbiochem)存在下裂解細胞。於4。C在750 pl蛋白G-瓊 脂糖珠子中與7.5嗎正常小鼠IgG—起溫育3小時，來預澄清細胞裂解物。 將上清液與30嗎抗F3374V1抗體或兔正常IgG於4。C一起溫育1小時，然 後加入100^1蛋白G-瓊脂糖珠子。14,000 rpm離心1分鐘從各樣品中收集珠子，並用1 ml免疫沉澱緩衝液清洗5次後，將它們用30jilLaemmli樣品緩 衝液洗脫並煮沸5分鐘。在8。/。SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad)上分離蛋白質。電 泳後，按照western印跡分析部分所述的方法，用western印跡分析;險測了 蛋白質。
為檢測PBK/TOPK(WT、 T9A、 KD、 T9A/KD)、 p47、 p97或PPlg蛋白 的表達，按照以前的報導(Park等人，2006)進行了免疫印跡。簡單地說，在 裂解緩沖液(50mM Tris-HCl， pH 8.0/150mM NaCl/0.5% NP-40)中裂解細胞之 後，勻化並在水上溫育30分鐘，通過離心僅從細胞碎片中分離可溶性級分。 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,十二烷 基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)後，將蛋白質印跡到硝酸纖維素膜(GE Healthcare, Buckinghamshire, United ICingdom)上，與相應的抗體一起溫育, 使用ECL檢測試劑盒(GE Healthcare)使之可視化。為收集有絲分裂細胞 (mitotic cells),本發明人使用了前人描述(Dechat T等人，EMBO J 17: 4887-902 (1998))的"有絲分裂搖落(mitotic shake-off)"方法。使用FuGene6 試劑(Roche)用上述感興趣的構建體共轉染COS-7細胞後，通過免疫沉澱考 察了蛋白質相互作用，所用方法如以前描述的(Shimo A等人，Cancer Sci 98: 174-81 (2007))，不同之處是對沉澱的p97/VCP-myc-6xHis蛋白4吏用抗6xHis 抗體(Santa Cruz Biotechnology)。用裂解緩沖液清洗5次後，將免疫複合物 上樣到SDS-PAGE凝膠上，如上所述進行免疫印跡。 (17)體外及體內激酶測定
為考察AURKB對F3374V1的磷酸化，本發明人使用F3374的C末端 重組蛋白質(胺基酸437-730)和AURKB的全長重組蛋白質(Upstate, Temecula, CA)進行了體外激酶測定。按照抗F3374多克隆抗體的製備部分 所述的方法進行了 F3374重組蛋白質的製備。簡單地說，將l嗎AURKB在 20|il激酶測定緩衝液(50 mM Tris-HCL (pH 7.5)、 10 mM MgCL2、 2 mM 二硫 蘇糖醇、1 mM EGTA、 0.01% Brij35、 500 ATP)中溫育，然後添加 5pCi[32P-a] ATP (GE Healthcare)。 對於底物，本發明人向反應液中加入了 1嗎F3374重組蛋白質。30。C溫育10分鐘後，加入SDS樣品緩衝液終止反 應。將蛋白質樣品煮沸後，在10。/。SDS凝膠上電泳，然後進行放射自顯影。
為評估PBK/TOPK的激酶活性，使用全長重組PBK/TOPK蛋白 (Invitrogen, Carlsbad, CA)進行了體外激酶測定。具體地，將1嗎PBK/TOPK蛋白在30 fil激酶測定緩沖液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5 / 150 mM NaCl / 10 mM MgCl2 / 10 mM NaF / 1 mM Na3V04 / 1 mM EDTA / ImM DTT / 50uM ATP)中溫育，然後添加5 pCi of (32P-y)-ATP (GE Healthcare)。在反應液中加 入5 jig組蛋白混合物或2.5嗎組蛋白H3 (Roche)作為底物。30。C溫育30分 鍾後，加入SDS樣品緩沖液終止反應。將蛋白質樣品煮沸後，在10-20%梯 度凝膠(Bio-Rad)上電泳，然後進行放射自顯影。為進一步考察是否 PBK/TOPK將組蛋白H3(Serl0)磷酸化，將野生型蛋白質和激酶失活 (kinase-dead)突變體(K64-65A)轉染至T47D細胞。培養48小時後，用100nM OA處理細胞6小時，以活化PBK/TOPK蛋白。分別用抗組蛋白H3 (Abcam， Cambridge, UK)和抗-磷酸-H3(Serl0)抗體(Ce11 Signaling Technologies)考察 了 H3蛋白的總量以及其磷酸化程度。
對於體外激酶測定，在添加5 pCi 32P-Y-ATP (GE Healthcare)的30 pl反 應緩衝液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5/10 mM MgCl2 / 2mM 二硫蘇糖醇/ 1 mM EGTA/ 0.01% Brij 35 / 50pM冷ATP)中，將用大腸桿菌表達系統製備的0.5 昭非活化重組PBK/TOPK蛋白與0.5單位CDKl-細胞周期蛋白Bl (New EnglandBiolabs)—起溫育。30。C溫育30分鐘後，加入SDS樣品緩衝液終止 反應。將蛋白質樣品煮沸後，電泳，並進行放射自顯影。
為考察p97是PBK/TOPK激酶的底物，我們進行了體外激酶測定。簡 單地說，按照上述方法使被沉澱的p97蛋白與1嗎重組TOPK蛋白反應。 (18)無雌激素條件下的細胞培養及轉染
分別用以下培養基培養了 MCF-7或SK-BR-3細胞無酚紅D-MEM/F-12 或RPMI-1640 (Invitrogen), 添力口 了用minisart-plus (Sartorius AQ Goettingen, Germany)過濾的10% FBS (Cansera International)和1%抗生素/抗真菌溶液 (Sigma-Aldrich)。細胞維持於37。C，在含5% C02的溼潤空氣的氣氛中。用 無酚紅Opti-MEM (Invitrogen),使用FuGENE6轉染試劑(Roche),按照生產 商的說明書進行轉染。轉染後24小時，用含lpM E2 (p-雌二醇； Sigma-Aldrich)的無酚紅Opti-MEM更換培養基，再溫育24小時。分別使用 1:500稀釋的抗HA高親和性(3F10)大鼠單克隆抗體(Roche)和抗FLAG兔多 克隆抗體(Sigma-Aldrich),以及分別使用1:1000稀釋的Alexa 488偶聯抗大 鼠小鼠第二抗體和Alexa 594偶聯抗兔或抗大鼠第二抗體(Molecular Probe, Eugene, OR)進行了免疫細胞化學染色。(19) 雌激素應答元件(ERE)報導基因測定
ERE報導基因構建質粒及螢光SEAP檢測試劑盒購自Clontech (Takara， Kyoto, Japan)。使用FUGENE轉染試劑(Roche),分別用FLAG標籤的A7322 (FLAG-A7322)構建體和雌激素應答報導基因(pERE-TA-SEAP)構建體或者 模擬對照和pERE-TA-SEAP報導基因構建體共轉染MCF-7 (ER+)或者 SK-BR-3 (ER-)細胞。轉染後48小時，用lpME2 (卩-雌二醇；Sigma-Aldrich) 處理細胞，再溫育48小時和72小時，分別用於SEAP測定和western印跡 分析。按照供應商的推薦，使用SEAP測定試劑盒(Clontech)進行了 SEAP 報導基因測定。
(20) 統計分析
使用Statview 5.0軟體(SAS Institute, Cary， NC),通過Student's t才企驗 (Student's t test)計算了統計顯著性(Statistical significance).認為P< 0.05的差 異是統計學上顯著的。
(21) 蛋白質、構建體、抗體及試劑
活性重組PBK/TOPK蛋白購自Invitrogen (Carlsbad, CA)，組蛋白H3和 蛋白磷酸酶l-a(PPla)的重組蛋白來自Upstate Biotechnology (Lake Placidy, NY)。細胞周期蛋白依賴性激酶l(Cyclin-dependent kinase-1, CDKl激酶) (cdc2/細胞周期蛋白Bl)及X蛋白磷酸酶(人PPase)來自New England Biolabs (Ipswich, MA)。按照以前的報導(Lin等人，2007),在大腸桿菌中表達帶有谷 胱甘肽S-轉移酶(GST)標籤的PBK/TOPK (GST-PBK/TOPK)蛋白，並用 Glutathione Sepharose 4B珠子(GE Heath care, Buckinghamshire, United Kingdom)純化。按照以前的報導(Park等人，2006)，分別使用pCAGGSnHA、 pCAGGS-nGST和pCAGGS-cGST表達載體構建了 N末端HA標籤的 PBK/TOPK (HA-PBK/TOPK)、 N末端GST標籤的PPla (GST-PPlc0和C末 端GST標籤的p47 (p47-GST)蛋白。使用pCAGGSnHA構建了 N末端HA 標籤的Thr9 (T9A)處丙氨酸置換的突變體、激酶失活(kinase-dead， KD)及雙 重突變體(T9A/KD)蛋白。還使用pCDNA3.1-myc-His載體(Invitrogen)構建了 C末端myc-6xHis標籤的p97/VCP-myc-6xHis (p97/VCP-myc-His)。針對 PBK/TOPK、卩-肌動蛋白(beta-actin)和HA的單克隆抗體分別購自BD Biosciences (San Jose, CA)、 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)和Roche (Basel, Switzerland)。針對總PP1 a 、磷酸-PPla (T320)的多克隆抗體購自CellSignaling Technologies (Berverly， MA)，總Rb、碌酸-Rb (Ser807/811)和 p97/VCP來自Santa Cmz Biotechnology (Santa. Cruz， CA)。岡田酸(Okadaic acid, OA)、 CDK1抑制劑(CGP74514A)和蛋白酶抑制劑合劑III購自 Calbiochem (San Diego, CA)。
(22) PBK/TOPK、 CDKl-細胞周期蛋白Bl、 p47、 p97及PPla的免疫細胞 化學染色
將T47D細胞以5乂104個細胞接種在帶有col-I包被的玻璃的35 mm皿 中(IWAKI)。溫育兩天後，用0.3 pg/mL諾考達唑(nocodazole) (Sigma-Aldrich) 再處理18小時，以研究有絲分裂細胞。經固定和封閉之後，將細胞用1:100 稀釋的抗TOPK單克隆抗體(BD Biosciences)或者1:300稀釋的抗CDK1單 克隆抗體(BD Biosciences)和細胞周期蛋白Bl單克隆抗體(Santa Cruz)進行 免疫染色。最後，將細胞用1:1000稀釋的Alexa594 (PBK/TOPK)或488-偶 聯(CDK1和細胞周期蛋白Bl)抗小鼠第二抗體(MolecularProbe)染色。用4', 6'-二脒基-2'-苯基吲哚二鹽酸(DAPI)對細胞核進行了復染。在共聚焦顯微鏡 (Leica)下獲取了螢光影像。
為考察外源表達的p47、 p97或PPl(x蛋白的亞細胞定位，我們向帶有 col-l包被的載玻片的6孔板中，以lxlS個細胞每孔接種了 T47D細胞。轉 染後48小時，用含4%多聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS(-)固定細胞15分 鍾，並用含0.1°/。 Triton X-100的PBS (-)於4。C處理2.5分鐘以使細胞可通透。 接下來，用含3。/。BSA的PBS(-)於4。C覆蓋細胞12小時，以封閉非特異性 雜交，接著與用含3% BSA的PBS (-)稀釋的第一和第二螢光標記抗體一起 各溫育1小時(Park等人，2006)。
(23) 細胞通透性肽處理及PBK/TOPK在Thr9處的磷酸化的抑制
為抑制PBK/TOPK在Thr9處被CDKl-細胞周期蛋白Bl磷酸化，我們 設計了與 PBK/TOPK 的 N 末端相同的可通透的肽 (RRRRRRRRRRR-G畫MEGISNFKTPSKLSEKKK: SEQ ID NO: 99) (ppl-18), 由Sigma-Aldrich合成。根據體外激酶部分所述，通過體外激酶測定估計了 所述肽阻斷CDKl-細胞周期蛋白Bl引起的PBK/TOPK磷酸化的效力。如 上所述將非活性的PBK/TOPK和CDKl-細胞周期蛋白Bl的重組蛋白進行 溫育，除了分別以0|aM、2.5(iM、5|iM、 10pM和20 的各種濃度加入ppl-18 肽以外。通過SDS-PAGE和放射自顯影觀察到了 PBK/TOPK和細胞周期蛋白Bl的磷酸化。對於細胞增殖測定，以1.3乂104個細胞在12孔板中分別接 種了 T47D和HMEC細胞。次日，每天處理(treated everyday)各濃度的ppl-18 肽(0(iM、 2.5(iM、 5(iM和10^iM),第5天通過MTT測定法測定了細胞生存 力(cell viability)。通過Student's t檢驗在統計學上估計了 ppl-18肽抑制T47D 細胞生長的顯著性。為通過使用ppl-18肽來抑制有絲分裂細胞中 PBK/TOPK的磷酸化，將T47D細胞以lx105個細胞接種在60 mm皿中。溫 育後兩天，用諾考達唑(0.3 pg/mL)和可通透的肽(10 jiM)再處理18小時或24 小時之後收集，然後使用抗-PBK/TOPK單克隆抗體通過western印跡和 FACS分析研究了 PBK/TOPK的磷酸化。處理後第5天，用相差顯微鏡觀察 了用50 pMppl-18肽處理的T47D細胞的細胞形態。
(24) GST下拉(GST pull-down)試驗
將GST標籤的PPla和p47蛋白與/不與HA標籤的PBK/TOPK蛋白在 COS-7細胞中共表達。如以上部分所述，使用裂解緩衝液製備各細胞裂解 物。將總蛋白與經平衡的Glutathione Sepharose 4B珠子(GE Healthcare)於4 。C一起溫育1小時。用裂解緩衝液清洗5次後，將最終沉澱的珠子保持在-20 °C,之後用於SDS-PAGE。
(25) 細胞結構變化的觀察
用siRNA轉染後2天，用相差顯微鏡(Olympus)觀察了細胞形態。 在RNAi-拯救實驗中，如以前所述(Zhu C等人,Proc Natl Acad Sci U S A 103: 6196-201 (2006)), 在用各siRNA轉染前24 小時，用 pCAGGS-PBK/TOPK-HA構建體轉染了 T47D細胞。以lx105個細胞在60mm 皿中接種T47D細胞。溫育兩天後，用100 pmol si-EGFP或siPBK/TOPK-#3 轉染細胞，用時移顯微鏡(Sanyo)測量了細胞有絲分裂的持續時間。 實施例2-A7322
(1) A7322作為在乳腺癌中上調的基因的鑑定
為鑑定能用作新型治療性藥物靶點的分子，本發明人以前使用代表 27,648個cDNA的cDNA微陣列，建立了 81例乳腺癌患者的全基因組基因 表達模式(Nishidate T等人 Int J Oncol 2004;25:797-819.)。在上調基因中， 本發明人著眼於在大多數乳腺癌標本中表達上調的A7322。隨後的半定量 RT-PCR和northern印跡分析證實，A7322在乳腺癌標本(圖IA)以及乳腺癌細胞系(14/22)中是明顯上調的，但是在正常器官(除了腦之外)中不表達(圖1 B和圖1 D)。
如圖1D所示，與來自northern印跡分析的約15kb轉錄物相比，NCBI 資料庫中A7322的裝配cDNA序列更短，所以本發明人進行了外顯子連接 和5，RACE實驗，以獲得全長A7322 mRNA。本發明人最後獲得了 14，763 個核苷酸的cDNA序列(Genbank登錄號AB252196) (SEQ ID NO: 23),含 有編碼2,177個胺基酸蛋白質的6534個核苷酸的可讀框(SEQ ID NO: 24)。 簡單模塊構架搜索工具(simple modular architecture research tool, SMART) 程序顯示，預測的A7322蛋白在密碼子586和798之間包含一個Sec7域， 該域對於蛋白質正確地轉運穿過高爾基體可能是必需的(Chardin P等人 Nature 1996;384:481-4; Jackson CL等人Trends Cell Biol 2000;10:60-7; Shin HW等人J Biochem (Tokyo) 2004;136:761-7)。
為考察A7322的外源性表達，本發明人將A7322表達載體轉染至BT549 乳腺癌細胞中，然後在轉染後24小時進行了 western印跡分析。圖1G表明， 轉染後24小時在BT549中4企測到大約250kDa的A7322。
(2) A7322的免疫細胞化學及免疫組織化學分析
為研究內源性A7322蛋白，本發明人製備了抗A7322多克隆抗體(參見 (6)抗A7322多克隆抗體和抗F3374多克隆抗體的製備)。本發明人首先確 證了純化的A7322多克隆抗體可以識別乳腺癌細胞系(SK-BR-3)中大約 250-kDa的內源性A7322蛋白，不產生任何非特異性條帶(圖2A)。本發明 人使用SK-BR-3乳腺癌細胞，用抗A7322多克隆抗體進行了免疫細胞化學 染色分析，發現該抗體能檢測出細胞質中內源性A7322蛋白的強信號(圖 2B)。雖然本發明人使用MitoTracker或抗高爾基體單克隆抗體復染了線粒 體或高爾基體，但A7322在這兩種細胞器中都不是共定位的(圖2C和圖 2D)。
此外，本發明人使用乳腺癌和正常組織切片進行了免疫組織化學染色 實驗。本發明人在兩種不同組織學亞型的乳腺癌兩個乳頭管狀癌 (papillotubular carcinomas)和三個實't生管^大癌(solid-tubular carcinomas)的細 胞質中觀察到了強染色(圖2E)。但是，在正常乳房導管(圖2E)或心臟、肺 和肝臟(圖2E)中沒有觀察到染色。
(3) 針對A7322的siRNA的生長抑制作用為評價A7322的生長促進作用，本發明人通過基於哺乳動物載體的 RNA幹擾(RNAi)技術(參見(ll) A7322、 F3374V1或PBK/TOPK特異性的 siRNA表達載體的構建及(12) A7322、 F3374V1、 AURKB或PBK/TOPK的
基因沉默效應)，在已經顯示A7322過表達的乳腺癌細胞系BT-549和BT-474 中敲低了內源性A7322的表達。
本發明人通過半定量RT-PCR分析考察了 A7322的表達水平。與對照 siRNA構建體(psiU6BX-Mock (模擬))相比，A7322特異性siRNA (si-#2和 siJ3)明顯地抑制各基因的表達(圖5A、圖5D和圖5G)。為了確證A7322 特異性siRNA的細胞生長抑制，本發明人分別進行了集落形成(圖5C和圖 5F)及MTT測定(圖5B、圖5E和圖5H)。本發明人還製備了在si-#3中含 3bp置換的siRNA (si-A7W^錯配(m弁3),參見"材料和方法")，並發現這 對A7322的表達或BT-549和BT-474細胞的生長沒有抑制作用(圖5D、圖 5E、圖5F、圖5G和圖5H),暗示該si-#2構建體對A7322有特異的敲低效 應。si-#2和si-#3構建體的導入抑制了 BT-549和BT-474細胞的生長，這與 以上表達降低的結果一致。每個結果得到了 3個獨立實驗的驗證。這些發 現提示，A7322在乳腺癌細胞的細胞生長中具有重要功能。
或者，由於A7322的耗竭導致集落數目和細胞生存力顯著降低，所以 本發明人研究了細胞凋亡的關係。本發明人進行了螢光活化細胞分選(FACS) 分析，以檢測凋亡細胞群的比例。結果顯示，與模擬相比(圖51)，由si-#3 導致的凋亡(sub-Gl)細胞群顯著增加，表明A7322表達的抑制引起了細胞 凋亡。
(4)PHB2/REA作為A73"的相互作用蛋白的鑑定
由於A7322的生物學功能是完全未知的，所以本發明人通過免疫沉澱 法和質譜法分析(參見(16)共免疫沉澱及免疫印跡分析)搜尋了與A7322相 互作用的蛋白質，以研究乳腺癌細胞中A7322蛋白的生物學功能。提取了 用pCAGGSnH3F-A7322載體或pCAGGSnH3F-Mock (模擬對照)轉染的 BT-549細胞的裂解物，並用抗FLAG M2單克隆抗體進行了免疫沉澱(參見 (16)共免疫沉澱及免疫印跡分析)。在SDS-PAGE凝膠上4艮染蛋白質複合 物。提取了一個大約30-kDa的蛋白質，它在用FLAG標籤A7322質粒轉染 的細胞裂解物的免疫沉澱物中可見，但在用模擬對照質粒轉染的細胞裂解 物免疫沉澱物中不可見，通過質譜法分析確定了其肽序列(圖8A)。該方法將抑制素2 (prohibitin)/雌激素受體活性抑制物(PHB2/REA)鑑定為與A7322 相互作用蛋白質的候補者(圖8A)。隨後的半定量RT-PCR確認了在考察的 10例乳腺癌臨床樣品中的9例和22例乳腺癌細胞系中的16例中PHB2/REA 的表達，類似於A7322的表達(圖8B)。為研究A7322和PHB2/REA蛋白之 間的相互作用，本發明人構建了設計成表達FLAG標籤的A7322 (A7322-FLAG)和HA標籤的PHB2/REA (PHB2/REA-HA)的質粒(參見(5)表 達載體的構建)。將這些質粒共轉染至COS-7細胞，然後用抗FLAG抗體免 疫沉澱蛋白質。使用抗HA抗體的沉澱物免疫印跡表明，A7322-FLAG與 PHB2/REA-HA共沉澱(圖8C:左圖面)。反之，本發明人使用抗HA抗體進 行了免疫沉澱，然後使用抗FLAG抗體對沉澱物進行了免疫印跡。結果表 明，PHB2/REA-HA與A7322-FLAG共沉澱(圖8C:右圖面)。或者，為考察 乳腺癌細胞系(SK-BR-3)中內源性PHB2/REA和A7322蛋白的定位，本發明 人使用抗PHB2/REA多克隆抗體進行了免疫細胞化學染色分析(參見(8)免 疫細胞化學染色)。本發明人觀察到了 PHB2/REA以及A7322在大多數細胞 中主要定位於細胞質中(圖8D)，但在少量細胞中，在細胞質和細胞核中都 觀察到了其表達(圖8D，箭頭)，提示在乳腺癌細胞中那些蛋白質可能部分 地共定位在細胞質處。
PHB2/REA是一種被募集至激素所佔據的雌激素受體a (ERa)的蛋白質 (Osborne CK. Breast Cancer Res Treat 1998;51:227-38)，據報導，其通過在細 胞核中的相互作用選擇性抑制ERcx的轉錄活性(Montano MM，等人Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:6947-52; Delage-Mourroux R,等人J Biol Chem 2000;275:35848-56)，所以本發明人研究了 A7322除PHB2/REA外還與ERa 蛋白結合的可能性。為考察A7322和ERa蛋白之間的相互作用，本發明人 構建了設計成表達FLAG標籤的ERa和HA標籤的A7322的質粒(參見(5) 表達載體的構建)。將這些質粒共轉染至COS-7細胞，然後用抗FLAG抗體 免疫沉澱蛋白。使用抗HA抗體對沉澱物進行免疫印跡表明，這兩種蛋白沒 有共免疫沉澱(圖9A:左圖面)。當本發明人用抗HA抗體進行免疫沉澱並 用抗FLAG抗體進行免疫印跡時，本發明人仍未觀察到這些蛋白的相互作 用(圖9A:右圖面)。此外，免疫細胞化學分析顯示了在有或沒有雌二醇(E2) 存在下，A7322在細胞質表達，ERa在細胞核表達，支持這兩種蛋白沒有 相互作用(圖9B)。另外，當本發明人使用顯示無ER表達(ER-)的SK-BR-3
151細胞時，觀察到了類似的結果(圖9C)。綜上所述，本發明人推斷A7322直接與PHB2/REA結合，而其顯示與ERa蛋白沒有直接的結合，不管乳腺癌細月包的ER狀態如^f可。(5) A7322抑制PHB2/REA的核轉運
據報導，PHB2/REA主要定位在細胞質，在E2和ERa存在下轉移至細胞核(Kasashima K,等人J Biol Chem 2006;281:36401-10)。由於本發明人觀察到不管有沒有E2存在，A7322都定位在細胞質，所以本發明人假設在細胞質中A7322可能與PHB2/REA相互作用並幹擾PHB2/REA的核轉運。為考察該假設，本發明人研究了在有或沒有A7322表達存在下，PHB2/REA蛋白的亞細胞分布。本發明人將HA標籤的PHB2/REA(HA-PHB2/REA)、FLAG標籤的ERa (FLAG- ERa)及FLAG標籤的A7322 (FLAG-A7322)的構建體或模擬對照轉染至MCF-7 (ER+)細胞中，然後進行了免疫細胞化學染色(參見
(5) 表達載體的構建及(8)免疫細胞化學染色)。
結果表明，在沒有A7322存在下，PHB2/REA以及ERa轉移至細胞核(圖10A:左圖面，箭頭)，而在A7322存在下，用E2處理下仍然在細胞質(圖10A:右圖面)。在SK-BR-3 (ER-)細胞中也觀察到了有或沒有A"22時PHB2/REA亞細胞定位的差異(圖IOB)。此外，本發明人研究了 A7^t敲低的MCF-7細胞中內源性PHB2/REA的亞細胞定位。圖10C顯示了 MCF-7細胞中A7322表達敲低的確認。如本發明人所預期的，在A7322-敲低的細胞中E2處理後48小時，觀察到PHB2/REA在細胞核中，但是在對照siRNA(si-EGFP)-處理的細胞中觀察到PHB2/REA仍在細胞質中(圖IOD)。因此，這些結果暗示著A7322與PHB2/REA結合，抑制了 PHB2/REA的核轉運，降低了 ERa-PHB2/REA相互作用，可能導致ERa轉錄活性增強。
(6) 通過抑制內源性PHB2/REA的核轉運增強ER轉錄活性
如上所述，本發明人觀察到，A7322通過在細胞質中與PHB2/REA相互作用幹擾PHB2/REA的核轉運，所以本發明人假設在乳腺癌細胞中A7322蛋白通過抑制PHB2/REA的核轉運從而增強ER轉錄活性。為檢驗該假設，
道基因(pERE-TA-SEAP)構建體或模擬對照和pERE-TA-SEAP報導基因構建體共轉染至MCF-7 (ER+)或SK-BR-3 (ER-)細胞，然後使用SEAP檢測試劑盒進行了報導基因測定(參見(19)雌激素應答元件(ERE)報導基因測定)。本發明人通過western印跡分析確定了在那些細胞中外源性A7322和內源性PHB2/REA蛋白的表達(圖IIA)。意料之中，A7322蛋白的導入明顯增強了 E2處理後48小時MCF7 (ER+)細胞中的ER轉錄活性，而未增強SK-BR-3(ER-)細胞中的ER轉錄活性(圖IIB)。這些發現提示，A7322蛋白可能通過抑制乳腺癌細胞中PHB2/REA的核轉運^^人而增強ER轉錄活性。討論
在過去20年裡，癌相關基因及其產物的鑑定和表徵已經促進了用於癌症治療的分子靶向藥物的開發。但對目前可採用的治療顯示出有效反應的患者比例仍然不高(Taniuchi K，等人Cancer Res 2005;65:3092-9)。因此，迫切需要開發對惡性細胞高特異性、不良反應極輕或沒有不良反應的新型抗癌藥。在本文中，通過對乳腺癌的表達模式的精確分析，本發明人鑑定了A7322，其在大多數乳腺癌病例及乳腺癌細胞系中明顯過表達。並且，northern印跡分析顯示，在考察的任何正常人類組織(除腦夕卜)中幾乎不能檢測到A7322的表達。使用抗A7322多克隆抗體的免疫組織化學染色實驗明確地表明了乳腺癌細胞中A7322表達的上調，但是在周圍的正常細胞或重要器官中沒有表達。
本發明人還表徵了 A7322蛋白的一些生物學功能，表明其將會是一種用於乳腺癌治療的優良候選分子靶標。本發明人通過siRNA技術證明，內源性A7322表達的敲低導致了乳腺癌細胞顯著的生長抑制。此外，本發明人通過我們的cDNA微陣列分析發現，通常在幾乎所有癌症中A7322都是上調的，所述癌症包括膀胱癌(bladder cancer)、結腸癌(colon cancer)、非小糹田月包月申癌(non隱small cell lung cancer)、 前歹寸&泉癌(prostate cancer)及乳&泉癌(breast cancer)。這些結果表明，該基因將充當 一種有價值的靶標，用來開發用於多種類型臨床癌症的抗癌劑。
為找到乳腺癌細胞中A7322生物學意義的線索，本發明人通過免疫沉澱和質語法尋找了可能與A7322相互作用的蛋白，並將PHB2/REA鑑定為A7322-相互作用性蛋白。本發明人證明了在乳腺癌細胞的細胞質A7322和PHB2/REA的體內相互作用及共定位。已知PHB2/REA是一種雌激素受體a(ERa)-選擇性調節因子，抑制以雌二醇為配體的ERa的轉錄活性(KasashimaK, J Biol Chem 2006;281:36401-10)。因此，本發明人假設A7322通過抑制ERa和PHB2/REA的相互作用/人而激活ERa的轉錄活性(圖11C),導致ER-
下遊基因的可能活化。
總之，我們的發現明確地提示了， A7322在乳腺癌標本和癌細胞系中都 是過表達的，其與PHB2/REA的相互作用可能在促進乳腺癌細胞生長中發 揮顯著作用。最近開發抗癌藥的策略已經著眼於關鍵地參與致癌途徑的靶 分子，例如曱磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)及曲妥J朱單抗(trastuzumab)。 本發明人發現，用siRNA處理所致的A7322下調顯著抑制了乳腺癌的細胞 生長，表明其在乳腺癌的增殖和腫瘤形成中的關鍵作用。特別是，本發明 人提出了 A7322在乳腺癌發生中通過抑制PHB2/REA蛋白的核轉運使ERa 再活化，從而發揮作用的可能性。這些數據將促進對乳腺癌發生的更好理 解，並提示A7322是用於乳腺癌治療的有希望的分子靶標。
實施例3- F3374
(1)將F3374鑑定為在乳腺癌中上調的基因
為鑑定能用作新型治療性藥物靶點的分子，本發明人以前使用代表 27,648個cDNA的cDNA微陣列，建立了 81例乳腺癌患者的全基因組基因 表達模式(Nishidate T等人InU Oncol 2004;25:797-819.)。在上調基因中，本 發明人著眼於在多數乳腺癌標本中表達上調的F3374。隨後的半定量 RT-PCR和northern印跡分析證實，F3374在12例乳腺癌標本的10例中(圖 1A)和所有乳腺癌細胞系(圖1B)中是明顯上調的，但是在正常器官(除了睪 丸和胸腺、胎盤、骨髓之夕卜)中不表達(圖1C和圖1D)。
F3374V1的全長cDNA序列包括4,221個核苷酸，含有編碼730個氨基 酸的多肽的2，193個核香酸的可讀框(圖1E)。接著，為確定乳腺癌細胞系和 正常人類組織中F3374V1的表達圖式，本發明人使用識別F3374W的引物 組進行了半定量RT-PCR。 RT-PCR的結杲顯示，與正常人類組織相比，在 乳腺癌細胞中主要地過表達F3374P7 (1,296bp)，而其他變異體在乳腺癌細 胞中不表達。因此，本發明人著眼於F3374 VI轉錄物用於進一步分析(圖 1F)。
為考察內源性F3374蛋白的表達模式，本發明人首先開發了一種針對 F3374蛋白的特異性多克隆抗體。接著使用細胞裂解物進行了 western印跡 分析，所述細胞裂解物來自於乳腺癌細胞系HBC4、 HBC5、 HBUOO、HCC1937、 MCF-7、 MDA-MB-231、 SKBR3、 T47D和YMB1以及HMEC (Human mammalian epithelial cell ，人哺乳動物上皮細月包)細月包。圖ID顯示， 在大多數細胞系中明確地檢測到了強烈的條帶，但在HMEC細胞中幾乎檢 測不到。
有趣的是，BT-549、 MCF-7和MDA-MB231顯示出不表達F3374蛋白 或者F3374蛋白變短，儘管F3374 mRNA在這些細胞系中過表達(圖3A)。 這提示可能存在某些突變，由於在這些細胞系中選擇性剪接而產生截短的 蛋白，但有必要進行序列分析。
此外，western印跡結果顯示一條額外條帶以及一條79.5kDa-條帶，符 合F3374蛋白的預期大小(圖3A)。為檢測該額外條帶是否代表被磷酸化修 飾的F3374蛋白的一種形式，本發明人用X-磷酸酶處理了來自T47D細胞的 細胞提取物，之後進行了免疫印跡。由於人-磷酸酶處理後沒有出現所述額 外條帶，所以本發明人判斷，F3374在乳腺癌細胞中是磷酸化的(圖3B)。 為確定F3374的磷酸化區域，本發明人設計了 F3374的3-片段(圖3C)。結 果顯示，當用A-3構建體瞬時表達時，用磷酸酶處理後額外條帶消失了， 但是當用其他構建體表達時沒有變化(圖3D)。這些發現表明，C末端區 (Wl-"0位胺基酸)在細胞中是磷酸化的。 (2) F3374V1的免疫細胞化學及免疫組織化學分析
為考察乳腺癌細胞系HBC5中內源性F3374V1蛋白的亞細胞定位，本 發明人使用抗F3374多克隆抗體進行了免疫細胞化學染色分析。有趣的是， 內源性F3374V1顯示出細胞周期依賴性定位(圖3E)。在間期，其定位在細 胞核中，然後在前期定位在染色體上。在後期，F3374V1集中於細胞的後 期紡錘體中央區(midzone)中成為一系列窄帶(圖3E)。最後，在所有乳腺癌 細胞中該蛋白被累積至末期的中間體。當細胞沿著有絲分裂過程推進時， F3374V1經歷了顯著的再分布。這些發現提示，F3374V1可能在乳腺癌細 胞的細胞周期特別是胞質分裂期間發揮重要作用。
為進一步研究乳腺癌和正常組織切片中F3374的表達，本發明人用抗 F3374抗體進行了免疫組織化學染色。本發明人確定了乳腺癌的三種不同組 織學亞型即乳頭管狀癌(papillo-tubular carcinoma)、實性小管狀癌(solid tubular carcinoma)和硬癌(scirrhous carcinoma)在細胞核和糹田胞質中高表達, 但在正常乳腺導管細胞中幾乎不可檢測到其表達(圖3F，左圖面)。此外，本發明人進行了乳腺癌組織微陣列分析，驗證了 39例浸潤性導管癌(infiltrating ductal carcinomas)的33例中F3374V1正染色，而5例包括導管細胞的正常 乳房組織中觀察不到染色(數據未顯示)。在本發明人考察的9例正常組織中， 與northern印跡分析的結果一致，在睪丸中檢測到其表達，但在心臟、肝臟、 腎臟、肺、結腸、胰臟、骨骼肌、小腸中幾乎檢測不到其表達(圖3F，右圖 面)。這些結果提示，F3374V1蛋白在體內乳腺癌細胞中是過表達的。
(3) F3374的細胞周期依賴性表達
為考察F3374蛋白在細胞周期各階段的表達，在用阿非科林處理使細 胞周期同步之後，本發明人使用T47D細胞進行了 FACS分析和western印 跡分析。F3374蛋白的表達在從Gl期至S期的過渡階段(0-6小時)較高，在 剛從細胞周期停滯中解除後的點最高(圖12A和圖12B)。另一方面，在9-12 小時的點(此時大多數細胞處於G2/M期時)其表達明顯降低。有趣的是，在 Gl/S期時，大多數F3374蛋白是非磷酸化的，但在G2/M期(9-12小時)時， 其有顯著的比例被變成磷酸化形式(圖12B),提示內源性F3374蛋白顯示了 細胞周期依賴性定位和修飾，可能在乳腺癌細胞的細胞周期進程中發揮重 要作用。
(4) 針對F"W1的siRNA的生長抑制作用
為評價F3374V1的促生長作用，本發明人通過基於哺乳動物載體的 RNA幹擾(RNAi)技術(參見材料和方法)，在已顯示F3374V1過表達的乳腺 癌細胞系T47D和HBC4中敲低了內源性F3374V1的表達。本發明人通過 半定量RT-PCR分析考察了 F3374V1的表達水平。在所考察的每種基因的 兩種siRNA構建體中，與對照siRNA構建體(psiU6BX-EGFP (s正GFP)和 psiU6BX-SCR (siSCR))相比，F3374V1特異性siRNA (si-弁l和si-弁4)明顯且 適度地抑制了每種基因的表達(圖6A和圖6D)。為確定F3374V1特異性 siRNA的細胞生長抑制作用，本發明人分別進行了集落形成(圖6B和圖6E) 和MTT測定(圖6C和圖6F)。 F3374V1 (Si-#1和Si-存4)構建體的導入明顯抑 制T47D和HBC4細胞的生長，與上文表達降低的結果一致。每個結果得到 了 3個獨立實驗的驗證。這些發現提示，F3374V1在乳腺癌細胞的細胞生 長中具有重要功能。
此外，本發明人考察了用F3374特異性siRNA寡核苷酸(siF3374)轉染 的HBC4細胞的形態學改變(參見(12) A7322、 F3374V1 、 AURKB或
156PBK/TOPK的基因沉默效應)，確定了在蛋白水平上的明顯敲低效應(圖 6G)。有趣的是，本發明人觀察到其敲低導致兩個分離的細胞之間出現細胞 間橋(圖6H: siF3374圖面中的箭頭)，表明在胞質分裂過程晚期的功能障礙。 本發明人還觀察到，與用對照s正GFP轉染的那些細胞相比，用siF3374轉 染的細胞大小增加(圖6H)。在T47D細胞中也得到了類似結果(數據未顯示)， 表明胞質分裂過程的功能障礙。這些發現表明，F3374的缺乏引起了胞質分 裂障礙，導致G2/M期細胞的停滯，然後引起細胞死亡。 (5) Aurora激酶-B調節F3374蛋白
上文已經提到，當乳腺癌細胞中細胞處於末期和胞質分裂期時，F3374 被磷酸化併集中在收縮環(contractile ring)。已知Aurora-B激酶(AURKB) 是一種染色體過客蛋白(chromosome passenger protein)，其在HeLa細胞中後 期從中心體移動到中央區(midzone)紡錘體，在末期和胞質分裂中移動至中 間體並(Terada Y. Cell Struct Funct 2001;26:653-7; Adams RR,等人Trends Cell Biol 2001;11:49-54; Carmena M,等人 Nat Rev Mol Cell Biol
胞定位。另外，如圖13A所示，本發明人在F3374中觀察到磷酸化的C末 端區域(胺基酸591-730)內發現了 3個共有的Aurora激酶-B磷酸化位點 ([R/K風T/S]及[R/K風T/S][I/L/V]; Cheeseman IM，等人Cell 2002;111:163-72; OhashiS，等人Oncogene 2006;25:7691-702)(圖2D)。因此，考察了乳腺癌細 胞中F3374蛋白與AURKB可能的相互作用。
本發明人首先通過半定量RT-PCR分析比較了 和j 的表達
圖式，確定了在考察的全部10個乳腺癌細胞系中i^37^和」0/^幾乎都 是上調的(圖13B)。為研究F3374和AURKB蛋白之間的相互作用，本發明 人構建了設計成表達HA-標籤F3374 (HA-F3374)和Flag-標籤AURKB (Flag-AURKB)的質粒(參見(5)表達載體的構建)。將這些質粒共轉染至 HEK293T細胞中，然後用抗-Flag抗體免疫沉澱蛋白。使用抗-HA抗體對沉 澱物進行免疫印跡表明，Flag-AURKB與HA-F3374共沉澱(圖13C)。此外， 免疫細胞化學染色實驗確定了兩種蛋白質在T47D細胞胞質分裂中都累積 到中間體(圖13F)。
為進一步研究F3374是否被AURKB磷酸化，本發明人使用純化的C 末端F3374 (胺基酸437-730)重組蛋白和全長AURKB重組蛋白，進行了體外激酶測定(參見(17)體外及體內激酶測定)，發現了 F3374蛋白在體外被 AURKB磷酸化(圖13D)。為進一步研究F3374與AURBK蛋白之間的相互 作用及其被AURKB的磷酸化的可能扮演什麼樣的角色，將siRNA-AURKB (siAURKB)轉染至T47D細胞中，然後進行western印跡分析。觀察到與那 些用對照siEGFP轉染的細胞相比，用siAURKB轉染的T47D細胞中總 F3374蛋白以及磷酸化的F3374蛋白顯著降低(圖13E),暗示著這樣一種可 能性，即在有絲分裂晚期，AURKB對F3374的磷酸化可穩定F3374 (圖13F)。 討論
在過去20年裡，通過癌相關基因及其產物的鑑定和表徵，用於癌症治 療的分子靶向藥物已得到開發，但通過目前可採用的治療能夠受益的患者 比例仍然非常有限(Navolanic PM，等人Int J Oncol 2005;27:1341-4; Bange J， 等人NatMed 2001 ;7:548-52)。因此，迫切需要開發對惡性細胞高特異性而 不良反應風險最小的新型抗癌藥。在本研究中，本發明人通過乳腺癌的詳 細表達模式分析，鑑定了 F3W,其在臨床乳腺癌病例及乳腺癌細胞系中明 顯過表達，但在考察的任何正常人類組織中幾乎不能檢測到，除了在少數 器官中低水平表達之外。隨後的northern印跡和免疫組織化學染色分析明確 地表明了在乳腺癌細胞中F3374表達在轉錄水平和蛋白質水平均上調，但 是在周圍的正常細胞中沒有表達。
F3374基因編碼推定的730個胺基酸的蛋白質，其N末端包含6個高 度保守的WD40-重複結構域及共有核定位信號。我們的結果還證明，F3374 蛋白主要定位在間期細胞的細胞核，在後期細胞中紡錘體中央區(midzone) 累積成為一系列窄帶，最終在末期和胞質分裂期被集中於收縮環。這些發 現提示該蛋白在細胞周期進程中的重要作用。
本發明人通過siRNA技術證明，內源性表達的敲低顯著抑制了 乳腺癌細胞系(T47D和HBC4)的細胞生長，這是由於異常細胞分裂和隨後 的細胞死亡，而這二者可能由於細胞動力學過程中的功能障礙。本發明人 還證明，在siF3374轉染的細胞中尺寸更大的細胞比例增加，但本發明人沒 有發現多核細胞(multinucleated cdls)的增加。由於據報導，在無應激 (unstressed) HeLa細胞中F3374的失活導致p53的穩定化(Banks D，等人Cell Cycle 2006;5:1719-29)，所以在乳腺癌細胞系HBC4中通過F3374的敲低導致的G2/M細胞累積可能是由於檢驗點系統(checkpoint system)被p53活化所致。
由於其在乳腺癌細胞中的某些細胞周期階段的亞細胞定位的相似性及 其在乳腺癌細胞中的共表達，本發明人著眼於Aurora-B (AURKB)絲氨酸-蘇氨酸激酶作為F3374相互作用蛋白候選。本發明人通過RNAi實驗證實了 與AURKB的體內相互作用，以及其在體外被AURKB磷酸化，以及AURKB 對其可能的穩定作用。另外，據報導，由於胞質分裂缺損，AURKB的敲低 也可抑制HeLa細胞的生長(Goto H，等人J Biol Chem 2003;278:8526-30; SeversonAF,等人Curr Biol 2000;10:1162-71)類似於F3374的耗竭。總之， 本發明人在此首次證明，F3374和AURKB的相互作用可能在胞質分裂中發 揮重要作用。此外，據報導，在輻射誘發的G2/M檢驗點(checkpoint)起始 中，需要F3374作為CUL4-DDB1遍在蛋白E3連接酶複合物的組分(Sansam CL,等人 Genes Dev 2006;20:3117-29; Higa LA，等人 Cell Cycle 2006;5:1675-80; HigaLA，等人Nat Cell Biol 2006;8:1277-83)，提示F3374在 細胞周期進程中的多重作用。
因此，由於對它們的結合的抑制可能導致乳腺癌細胞中胞質分裂障礙， 隨後導致細胞死亡，所以對它們的結合的抑制劑將是開發針對乳腺癌的物 質可能有價值的目標。
總之，我們的結果已表明，F3374與AURK的相互作用及其被AURKB 磷酸化可能在乳腺癌細胞的胞質分裂中發揮重要作用。本發明人還發現， 用siRNA下調i^W顯著抑制了乳腺癌細胞的生長，表明其在乳腺癌細胞 增殖中的重要作用。我們的數據會促進對乳腺癌發生的更好理解，暗示著 F3374可能是用於乳腺癌治療的有希望的分子靶標。此外，值得注意的是， 我們的cDNA微陣列數據確定了 i^374在許多類型臨床癌症中普遍上調， 這些臨床癌症包括膀胱癌(bladder cancer)、月旦管上皮癌(cholangiocarcinoma)、 肺癌(lung cancers)和腎糹田月包癌(renal cell carcinoma)以及乳&泉癌(breast cancers)(數據未顯示)。這些結果顯示，該基因可充當一種有價值的靶點， 用於開發應用於廣泛的人類癌症的抗癌劑。 實施例4- PBK/TOPK (1)乳腺癌細胞中PBK/TOPK的上調
159本發明人以前使用cDNA微陣列進行了 81例乳腺癌病例的全基因組表 達模式分析(Nishidate T等人，Int J Oncol 2004, 25: 797-819)。在乳腺癌中上 調的基因中，搜尋了編碼含激酶區域的蛋白質的基因，或者根據報導的信 息，或者依照通過蛋白質基序(protein-motif)程序SMART的預測 (http:〃smart.embl畫heidelberg.de) (Schultz J等人，Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95: 5857-64; Letunic I等人，Nucleic Acids Res 2004, 32: D142-4)。在所搜尋
的基因中，本發明人著眼於屍萬i^roi^基因，其高水平的反式激活
(transactivation)可在大多數乳腺癌細胞中得到確認(圖IA)。 10個乳腺癌細胞 系及6個正常器官的Northern印跡分析進一步確定，/^iGT(9i^:在考察的 所有IO個乳腺癌細胞系中特異地上調，但在肺、心臟、肝臟、腎臟、骨髓 及乳腺中幾乎檢測不到其表達(圖ID)。
為進一步考察屍5^/10屍《基因在各正常組織中的表達模式，使用來自 23個組織的mRNAs進行了 Northern印跡分析，鑑定了在睪丸和胸腺中特 有的(exclusive)兩個轉錄物(圖1C)。根據NCBI資料庫，兩種代表性的1,899 個核香酸(GenBank Accession No. NM—018492)和1,548個核苷酸(弁AF 189722) 的轉錄物似乎對應於在Northern分析中觀察到的那兩個條帶。上述兩種轉 錄物共有相同的編碼322個胺基酸多肽的可讀框。 (2) PBK/TOPK的免疫細胞化學及免疫組織化學分析
使用HMEC (Human Mammalian Epithelial Cell,人哺乳動物上皮細胞) 作為實驗對照，通過Western印跡分析考察了來自乳腺癌細胞系BT-20、 HBC4、 HBC5、 HBL-IOO、 MCF-7、 MDA-MB-231、 SKBR3和T47D的細 胞裂解物中內源性PBK/TOPK蛋白表達(圖4A)。所有乳腺癌細胞系都顯示 了高水平戶5A/rOi^表達，而正常乳腺上皮細胞系HMEC細胞顯示無表達。 隨後使用抗-PBK/TOPK單克隆抗體進行的乳腺癌細胞系T47D、 BT-20和 HBC5的免疫細胞化學分析表明，內源性PBK/TOPK主要定位在細胞質中 (圖4B)。
為進一步研究乳腺癌和正常組織切片中PBK/TOPK表達，使用抗-PBK/TOPK單克隆抗體進行了免疫組織化學染色。在乳^腺癌的三種不同組
織學亞型--導管內癌(intraductal carcinoma)、乳頭管狀癌(papillo-tubular
carcinoma)和硬癌(scirrhous carcinoma)的細月包質中4企測到強染色(圖4C (l)-(3))，但在正常乳腺組織中幾乎檢測不到其表達(圖4C (4))。此外，與Northern印跡分析的結果一致，在睪丸細精管的外細胞層檢測到了 PBK/TOPK蛋白的強染色，而在心臟、肺、肝臟或腎臟中觀察不到表達(圖 4D (1)-(4》。
(3) 內源性PBK/TOPK的敲低效應
為研究乳腺癌細胞中PBK/TOPK基因的生長促進作用，通過RNA千擾 (RNAi)技術，在兩種乳腺癌細胞(T47D和BT-20)中敲低了內源性PBK/TOPK 的表達(圖7A和圖7B)。半定量RT-PCR實驗檢測到了用PBK/TOPK-si-#2 和si-#3轉染的細胞中PBK/TOPK顯著的敲低效應，但用對照siRNA(模擬) 轉染的細胞中沒有檢測到。與其顯示的敲低效應一致，集落形成和MTT測 定明確地揭示了兩種siRNA(PBK/TOPK-si-#2和si^3)抑制乳腺癌細胞生長 ——相比於兩種不顯示敲低作用的、用來排除PBK/TOPK-siRNA (si-")的 脫靶效應(off-targeteffect)之可能性的siRNA(圖7A和圖7B)。這些結果暗示 著PBK/TOPK在乳腺癌細胞生長中起關鍵作用。
另外，觀察到了用顯示明顯敲低效應的siRNA轉染的細胞的表型改變 (phenotypic alterations)。在其中的PBK/TOPK表達受抑制的T47D細胞中， 觀察到了延長的中間體以及由異常胞質分裂導致的錯誤細胞分裂(圖7C和
細胞中凋亡(sub-Gl)細胞群的增加，但在那些用模擬構建體轉染的細胞中沒 有觀察到表型改變或sub-Gl群增加(圖7E和圖7F),暗示著PBK/TOPK對 於乳腺癌細胞的增殖以及有絲分裂和/或胞質分裂的不可或缺的作用。
(4) PBK/TOPK的細胞周期依賴性表達
據報導PBK/TOPK可能是一種有絲分裂激酶(Gaudet S等人，Proc Natl AcadSciUSA2000，97: 5167-72)，所以本發明人研究了其與細胞周期進程的 關係。用阿非科林使細胞周期同步之後，考察了 T47D細胞中PBK7TOPK 蛋白的表達。FACS分析顯示，從細胞周期停滯中解除後6小時，處於G2/M 期的細胞比例顯著增力口(圖14A)。有趣的是，9-12小時以後，當多數細胞 處於G2/M期時，Western印跡分析檢測到了 一條額外的高分子量PBK/TOPK 的條帶。在15小時的時間點，高分子量條帶的強度降低(圖14B)。免疫化 學分析還顯示在處於有絲分裂(尤其是前期和中期)的細胞中PBK/TOPK蛋 白的亞細胞定位是位於凝聚染色體的周圍(圖14C)。為進一步研究高分子量PBK/TOPK在細胞周期進程中的作用，用諾考 達唑(nocodazole)處理了 T47D乳腺癌細胞，以進行Western印跡和FACS分 析。同預期的一樣，用諾考達唑(nocodazole)處理後，T47D細胞中內源性 PBK/TOPK的額外的高分子量條帶的強度以時間相關的方式(6-18小時)上 升(圖"D,左圖面)，經人磷酸酶處理後條帶消失(圖右圖面)。另夕卜， FACS分析顯示，從細胞周期停滯解除後6-18小時，處於G2/M期的細胞比 例提高了 (圖14E),表明磷酸化的PBK/TOPK在有絲分裂中的重要作用。 (5) PBK/TOPK在體外及體內磷酸化組蛋白H3(Serl0)
PBK/TOPK蛋白主要定位在有絲分裂細胞(特別是前期和中期)中染色 體表面的周圍，所以本發明人著眼於組蛋白作為PBK/TOPK蛋白的候選底 物。使用純化的重組PBK/TOPK及混合組蛋白(H2a、 H2b、 H3和H4)進行 了體外激酶測定，檢測出一種大約15 kDa的磷酸化蛋白(泳道2)，表明 PBK/TOPK蛋白可能基於其分子大小而磷酸化組蛋白H3蛋白(圖15A，左 圖面)。進一步，^f吏用組蛋白-H3重組蛋白質進行了體外激酶測定，以確定 PBK/TOPK蛋白磷酸化組蛋白H3 (圖15A，右圖面)。另外，通過體外激酶 測定衝企測到了大約40kDa的自磷酸化PBK/TOPK，如圖15A所示(用星號標 明)。
PBK/TOPK定位在染色體周圍以及其在有絲分裂的早期磷酸化提高， 提示乳腺癌細胞中組蛋白H3被PBK/TOPK磷酸化的生理學作用。因此， 首先將野生型或激酶失活(K64-65A)的PBK/TOPK轉染至T47D細胞，然 後用岡田酸(okadaic acid， OA)處理細胞來刺激它們，已知這種處理可誘發過 早有絲分裂(premature mitosis) (Gaudet S等人，Proc Natl Acad Sci USA 2000， 97: 516;72)。 0,通過使用抗HA大鼠抗體的Western印跡分析，4企測到 了野生型PBK/TOPK和激酶失活PBK7TOPK經OA處理後以相同的水平被 磷酸化。但與激酶失活的突變蛋白相比，野生型蛋白的組蛋白H3 Serl0處 磷酸化增強(圖15B)。另外還確定，與才莫擬-siRNA轉染的細胞相比，在由 siRNA(si-#3)所致的PBK/TOPK-耗竭的T47D細胞中，組蛋白H3 Ser10的 磷酸化被特異性降低(圖15C)。
此外，考察了內源性PBK/TOPK蛋白和磷酸化組蛋白H3的定位。具體 地，用阿非科林使T47D和HBC5細胞同步，然後使用抗PBK/TOPK和抗-磷酸-Serl0H3抗體進行了免疫細胞化學染色。如圖15D所示，觀察到在前期細胞中凝聚染色體周圍PBK/TOPK與磷酸化組蛋白H3部分重疊、在中 期細胞中兩種蛋白質重疊(圖15E)，在後期兩者消失(圖15F)。將這些結果 結合起來，確定了在乳腺癌細胞中有絲分裂期間(特別是前期至中期)，內源 性PBK/TOPK能夠特異性地在SerlO處磷酸化組蛋白H3。 (6) Thr9的磷酸化對細胞增殖是重要的
以前已經證明了 PBK/TOPK在乳腺癌中是上調的，且在乳腺癌細胞中 有絲分裂期間從細胞質轉移到細胞核(Park JH等人，Cancer Res 66: 9186-95 (2006))。此外，據報導，在有絲分裂細胞中CDKl-細胞周期蛋白Bl複合物 蛋白也發生核轉運。因此，本發明人首先做了免疫細胞化學，以分別確定 乳腺癌細胞中PBK/TOPK、 CDK1和細胞周期蛋白Bl的亞細胞定位。觀察 到了 T47D乳腺癌細胞的有絲分裂期間那些蛋白質的類似的核轉運，提示乳 腺癌細胞中PBK/TOPK和CDKl-細胞周期蛋白Bl複合物之間可能的信號 轉導(圖16A)。雖然據報導，使用CDK1的免疫沉澱物通過免疫複合物激酶 測定，PBK/TOPK可以在Thr9處被CDKl-細胞周期蛋白Bl磷酸化，但仍 然未解釋其磷酸化是否是直接的(Matsumoto等人，Biochem Biophys Res Commun 325: 997-1004 (2004))。用大腸桿菌表達系統製備了 PBK/TOPK的 野生型無活性重組蛋白及T9A突變體。證明了野生型PBK/TOPK重組蛋白 被CDKl-細胞周期蛋白Bl重組蛋白複合物磷酸化，而PBK/TOPK重組蛋 白的Thr9 (T9A)被丙氨酸置換的突變體未被CDKl-細胞周期蛋白Bl重組蛋 白複合物磷酸化(圖16B)，提示體外PBK/TOPK在Thr9處被CDKl-細胞周 期蛋白Bl複合物直接磷酸化。
為研究乳腺癌發生中PBK/TOPK Thr9處磷酸化的生物學意義，通過使 用合成肽來試圖抑制其磷酸化。本發明人設計了 PBK/TOPK肽的N末端 (ppl-18); SEQ ID NO: 98，將其與精氨酸(R)-重複序列偶聯以促進細胞通透 性。圖16C顯示，加入ppl-18肽使得CDKl-細胞周期蛋白Bl重組蛋白對 重組PBK/TOPK蛋白的磷酸化以劑量依賴性方式降低。進一步，通過用這 種肽處理癌症和正常人類乳房上皮細胞(HMEC)考察了該肽是否可抑制癌 細胞生長。ppl-18肽處理明顯地以劑量依賴性方式抑制了 T47D乳腺癌細胞 的生長，但顯示對HMEC細胞的生長沒有影響(5 pmol/mL， t檢驗(Student t-test); p=0.0096),從而排除了該肽脫靶效應(off-target effect)的可能性(圖 16D)。接著，我們進一步研究了該肽是否抑制有絲分裂細胞中PBK/TOPK的磷酸化。用諾考達唑處理了 T47D細胞，接著向T47D細胞加入ppl-18 肽。圖16E顯示，通過1(^M ppl-18肽處理，有絲分裂細胞中PBK/TOPK 的磷酸化明顯以時間依賴性降低。此外，諾考達唑處理後第24小時，用該 肽處理阻滯了細胞周期向G2/M期的轉移(圖16E,下圖面)。此外，在ppl-18 處理的(50|_1]^)- T47D細胞中(圖16F)，以及如以前描述的在PBK/TOPK敲 低的T47D細胞中(Park JH等人，Cancer Res 66: 9186-95 (2006)),觀察到了異 常的胞質分裂所致的延長的中間體。 一併考慮，這些發現提示，PBK/TOPK 在Thr9處被CDKl-細胞周期蛋白Bl磷酸化可能在乳腺癌細胞生長中發揮 關鍵作用，儘管該肽可能通過其N末端區域抑制與其他PBK/TOPK相互作 用夥伴蛋白質(interacting partners)的可能的相互作用。
(7) 有絲分裂細胞中PBK/TOPK的自磷酸化
為研究有絲分裂期間PBK/TOPK的磷酸化作用，本發明人通過"有絲分 裂搖落(mitotic shake-off)"方法分離了有絲分裂細胞(參見實施例1-材料和方 法(16)共免疫沉澱及免疫印跡分析)(圖HA,上圖面)，並使用有絲分裂 細胞裂解物進行了免疫印跡分析。用X磷酸酶處理後高分子量條帶完全移 位，所以說在乳腺癌細胞中細胞有絲分裂期間，該蛋白質是被高度磷酸化 的(圖17A)。為進一步研究在有絲分裂細胞中PBK/TOPK的這種高度磷酸化 是否僅是由於CDKl-細胞周期蛋白Bl複合物的作用而在其Thr9處發生的， 分別將T9A、激酶失活(kinase-dead， KD)和雙重(T9A/KD)突變體構建體以及 野生型PBK/TOPK構建體轉染至T47D乳腺癌細胞中。有趣的是，諾考達 唑處理後，T9A蛋白的磷酸化條帶仍保留，而KD和雙重(T9A/KD)突變體 以及用X磷酸酶處理的細胞中的磷酸化條帶完全消失(圖17B)。這些結果有 力地提示，在有絲分裂細胞中，PBK/TOPK蛋白可能被其自身自磷酸化。
(8) PPla調節PBK/TOPK的磷酸化
以前也已證明，在T47D乳腺癌細胞中，除了諾考達唑處理外，用岡田 酸(OA)處理也可導致PBK/TOPK蛋白的磷酸化，岡田酸是Ser/Thr蛋白磷酸 酶的一種強抑制劑(Park JH等人，Cancer Res 66: 9186-95 (2006))。然而，在 乳腺癌細胞中用OA處理是如何導致其磷酸化的仍不詳。因為據報導，蛋白 磷酸酶lcKPPlq)對OA有相對較高的IC50值，而且在細胞有絲分裂期間是 被去活性的(Kwon YG等人,Proc Natl Acad Sci U S A 94: 2168-73 (1997); Ammosova T等人，Retrovirology 2:47(2005)),促使本發明人在人類蛋白磷
164酸酶之中著眼於PPla作為PBK/TOPK磷酸化的潛在調節劑。首先，本發明 人用高濃度(100nM)或低濃度(小於100nM) OA處理T47D細胞，發現用 100nM OA處理9小時導致PBK/TOPK磷酸化(圖17C),但用低濃度處理 沒有導致PBK/TOPK磷酸化(數據未顯示)。接著，為考察PBK/TOPK與PPla 的相互作用，將GST標籤的PPla (PPla-GST)和HA標籤的PBK/TOPK (HA-PBK/TOPK)構建體共表達至COS-7細胞，接著進行GST下拉(GSTpull down)試驗。圖17D顯示，用HA-PBK/TOPK明顯地拉下了 PPla-GST(上圖 面)，而反過來，HA-PBK/TOPK與PPla-GST共免疫沉澱(下圖面)，表明兩 種蛋白質之間相互作用。進一步考察了 PPla蛋白是否使PBK/TOPK蛋白直 接脫去磷酸。與重組PPla蛋白以及入磷酸酶一起溫育後，活化的重組 PBK/TOPK蛋白脫去磷酸(圖〃E，上圖面)。此外，通過PPla蛋白處理， 來自T47D細胞的有絲分裂細胞裂解物中的內源性PBK/TOPK蛋白也脫去 了磷酸(圖17E，下圖面)。這些發現暗示著在有絲分裂期間，PPla可能通 過它們的相互作用調節PBK/TOPK的自磷酸化。 (9) CDKl-細胞周期蛋白Bl通過PPla失活來活化PBK/TOPK
上文的描述表明了在有絲分裂細胞中，PBK/TOPK被CDKl-細胞周期 蛋白Bl激酶複合物磷酸化，且其磷酸化受PPla調節。此外，已知PPla 在有絲分裂細胞中通過其被CDKl-細胞周期蛋白Bl複合物磷酸化而失活 (Kwon YG等人,Proc Natl Acad SciUSA94: 2168-73 (1997))。因此，進一步 更詳細地考察了有絲分裂期間PBK/TOPK是如何被CDKl-細胞周期蛋白Bl 或PPla調節的。用諾考達唑處理16小時使得T47D細胞在G2/M期同步 (61 70%)，接著將T47D細胞與CDKl抑制劑一起溫育直到4小時(圖17F 和圖17G)。接下來，通過免疫印跡分析考察了 PBK/TOPK或PPla的磷酸 化水平。發現了用CDKl抑制劑(0-4小時)處理後，由G2/M阻滯(O小時) 導致的PBK/TOPK的磷酸化以時間相關的方式減少(圖17H,第1圖面)。同 時，本發明人發現除以前研究中的結果外，PPla在Thr320處磷酸化減少， 已知此處被CDKl-細胞周期蛋白Bl複合物磷酸化並致失活(圖17H,第3 圖面)。Rb蛋白在Ser807和811處的磷酸化程度降低證實了 CDKl失活(圖 17H，第4圖面)。 一併考慮，這些發現提示，在有絲分裂細胞中PBK/TOPK 是通過其直接自身磷酸化和PPla (其抑制PBK/TOPK自身磷酸化)的失活而活化的；而PPla的失活系由有絲分裂開始之前維持在穩定水平的CDK1-細胞周期蛋白Bl所致。
(10)由siRNA所致的PBK/TOPK耗竭導致有絲分裂障礙和Gl停滯
由於以前在乳腺癌細胞中觀察到了由PBK/TOPK沉默引起的胞質分裂 缺陷和延遲，所以通過RNAi實驗更詳細地考察了有絲分裂細胞中 PBK/TOPK的生物學作用。用PBK/TOPK-特異性siRNA或作為對照的 si-EGFP寡核苦酸處理2天後，在PBK/TOPK-特異性siRNA處理的細胞中 確認了 PBK/TOPK蛋白表達的敲低(圖18A)。如圖18B所示，本發明人利 用顯微鏡檢和螢光鬼筆環肽的免疫細胞化學染色，在PBK/TOPK-siRNA處 理的細胞中觀察到了較長的胞間橋，但在si-EGFP處理的細胞中沒有觀察 到，表明因PBK/TOPK表達耗竭導致胞質分裂缺陷(圖18B,白色箭頭)。此 外，為考察PBK/TOPK表達的敲低對細胞周期的影響，對用PBK/TOPK-特 異性siRNA或si-EGFP寡核苷酸處理的細胞進行了 FACS分析。s正GFP處 理的細胞顯示出明顯的從Gl峰至G2/M峰的遷移。而另一方面， siPBK/TOPK處理的細胞用諾考達唑處理引起有絲分裂停滯後，不顯示從 Gl峰至G2/M峰的遷移(圖18C),提示PBK/TOPK的敲低可能會發生Gl-停滯。為進一步詳細地將PBK/TOPK耗竭的細胞中的胞質分裂缺陷歸類， 本發明人用時移顯微鏡檢(Time-lapse-microscopy )，考察了無PBK/TOPK 存在下，乳腺癌T47D細胞的實時圖像。圖18D顯示，在EGFP-轉染的細 胞中細胞分裂從後期至末期拍攝了(was taken for) 1.5分鐘(如白色箭頭所 示)。另一方面，在PBK/TOPK-耗竭的細胞中，細胞分裂從後期至末期拍攝 了 4.5分鐘，特別是在胞質分裂步驟拍攝了 5分鐘，然後最終裂開(如圖18E 中箭頭所示)。
此外，為驗證該結果，本發明人分別通過導入野生型PBK/TOPK和激 酶失活形式做了 RNAi-拯救實驗。圖18F顯示，通過導入野生型PBK/TOPK 蛋白恢復了因PBK/TOPK耗竭所致的細胞動力學障礙(用箭頭表示)，而導入 激酶失活型則不能夠恢復(用箭頭表示)，支持了 PBK/TOPK的激酶活性對於 胞質分裂是必不可少的。
(11) PBK/TOPK通過p47作為銜接蛋白(adopter protein)體外磷酸化 p97/VCP蛋白因為PBK/TOPK的激酶活性對於乳腺癌細胞的胞質分裂是重要的，所 以本發明人試圖使用GST融合PBK/TOPK (GST-PBK/TOPK)重組蛋白和作 為對照的GST蛋白進行體外蛋白下拉(pull-down)試驗來鑑定PBK/TOPK-特 異性底物。對含有拉下的蛋白質的SDS-PAGE凝膠的銀染色結果進行比較， 鑑定了一個大約47kDa的蛋白質，其特異性地出現在與GST-PBK/TOPK蛋 白共免疫沉澱的蛋白質的相應泳道中，而用GST作為對照的泳道中沒有發 現(數據未顯示)。MALDI-TOF分析確定了這個47-kDa的蛋白質為p47蛋白， 其是p97/VCP (valosin-containing protein,含纈酪肽的蛋白質)的銜接蛋白 (adaptor protein), p97/VCP屬於細胞有絲分裂中涉及的AAA ATP酶家族。 用半定量RT-PCR考察了乳腺癌細胞系中轉錄水平上p47的表達圖式，發 現p47在考察的所有乳腺癌細胞中均有表達(數據未顯示)。
為驗證PBK/TOPK和P47蛋白之間的相互作用，進行了體外下拉 (pull-down)試驗。將HA-標籤的PBK/TOPK (HA-PBK/TOPK)構建體轉染至 COS-7細胞中，然後用裂解緩衝液裂解細胞。接下來，將細胞裂解物與GST 標籤的p47(GST-p47)重組蛋白混合在一起，然後用GST-珠子下拉。使用抗 HA抗體進行的沉澱物免疫印跡表明，GST-p47與HA-PBK/TOPK共沉澱(圖 19A)。此外，本發明人做了免疫細胞化學染色，觀察到內源性PBK/TOPK 和外源表達的FLAG標籤的p47蛋白在T47D細胞中細胞質處共定位。諾考 達唑處理後，本發明人發現它們共定位在細胞的細胞核中(特別是有絲分裂 細胞的細胞核)，提示PBK/TOPK蛋白與p47相互作用(圖19B)。由於已知 p47與p97蛋白形成緊密複合物，所以本發明人認為PBK/TOPK可能與 p47/p97蛋白複合物結合。使用抗p97抗體，通過western印跡分析首先考 察了乳腺癌細胞系以及HBL-100和HMEC中內源性p97蛋白的表達，發現 內源性p97蛋白在考察的所有乳腺癌細胞系以及HBL-100和HMEC中表達 (圖19C)。接下來，通過co-IP實驗考察了 PBK/TOPK和p97/p47複合物的 是否相互作用。將HA-PBK/TOPK和myc標籤的p97 (myc-p97)構建體共轉 染至COS7細胞，然後與HA標籤的抗體共免疫沉澱。結果顯示， HA-PBK/TOPK不直接與myc-p97相互作用(圖19D)。另一方面，當將 myc-p97、 GST-p47和HA-PBK/TOPK構建體共轉染至COS-7細胞中，然後 用myc標籤的抗體免疫沉澱並分別用各標籤抗體進行western印跡時，檢測
167到HA-PBK-TOPK與GST-p47/myc-97複合物共免疫沉澱(圖19E)。綜合起 來，這些發現提示，PBK-TOPK通過p47作為銜接子與p97蛋白相互作用。 此外，使用重組活化PBK/TOPK蛋白，通過免疫複合物激酶測定考察 了 p97被PBK/TOPK磷酸化。圖19F顯示，PBK/TOPK重組蛋白磷酸化了 乳腺癌細胞中免疫沉澱的p97。為進一步考察p97對胞質分裂的作用，通過 使用PBK-TOPK-siRNA在T47D細胞中敲低了 p97的表達(圖19G)。結果顯 示，和PBK/TOPK的耗竭一樣，p97的耗竭也致使胞質分裂缺損(depletion of p97 occurred to cytokinesis defects as well as the depletion of PBK/TOPK)(圖 19H)。據報導，p97/VCP (valosin-containing protein,含纈酪肽的蛋白質)屬 於AAA ATP酶家族，例如在末期曾經破碎並重新裝配的高爾基體(Golgi apparatus)的再生(Uchiyama K等人，J Biochem (Tokyo) 137: 115-9 (2005》，以 及有絲分裂結束時的微管動力學(CaoK等人，Cell 115:355-67(2003))。這些 發現表明，p97/VCP可能調節細胞的形態發生，可能在胞質分裂中的M至 Gl轉變期間起作用(CaoK等人，Cell Cycle 3: 422-4 (2004))。因此，綜上所 述，我們的結論是PBK/TOPK在癌細胞中可能通過p97/p47的磷酸化來調 節胞質分裂(特別是有絲分裂的退出(exit))。 討論
本發明人以前報導，PBK/TOPK (PDZ-結合激酶/源自T-LAK細胞的蛋 白激酶在有絲分裂期間是明顯上調和磷酸化的，並參與乳腺癌的細胞生長。 但PBK/TOPK在細胞有絲分裂中的生物學作用及其在乳腺癌發生中的病理 生理學作用仍然未知。證明了 PBK/TOPK通過對其底物p97/VCP的磷酸化 及CDKl/細胞周期蛋白Bl複合物對其的調節，來調節有絲分裂(特別是胞 質分裂)的進程。 工業實用性
新的人基因」73"和i^374W的表達在乳腺癌中與非癌性的人類組織 相比明顯增強。因而，這些基因可以充當癌症的診斷標誌，而其編碼的蛋 白可能用在癌症的診斷測定中。
本說明書中顯示，新蛋白A7322和F3374V1的表達促進細胞生長，而 對應於和FB74W基因的反義寡核苷酸或小幹擾RNA抑制細胞生 長。這些發現提示，A7322和F3374V1蛋白各自均可刺激致癌活性。因此， 這些新癌蛋白中的分別均是用於開發抗癌藥物的有用的靶標。例如，阻斷A7322和F3374V1表達或者抑制其活性的作用劑可能具有作為抗癌劑，特 別是用於治療乳腺癌的抗癌劑的治療用途。這樣的物質的例子包括反義寡 核苷酸、小幹擾RNA,以及識別A7322和F3374V1的抗體。
本說明書提及的所有出版物、資料庫、Genbank序列、專利和專利申請 皆在此通過提述併入本說明書。
儘管已經詳細地並且參考本發明的具體實施方案描述了本發明，但對 本領域技術人員來說，顯然可對本發明進行各種變化和修飾而不背離本發 明的精神和範圍，本發明的界限系由附隨的權利要求限定。
本發明是基於體外和體內PBK/TOPK在SerlO處磷酸化組蛋白H3的新 機制這一發現。由於PBK/TOPK是癌症/睪丸抗原，其激酶功能有可能與其 致癌活性有關，所以認為該蛋白是用於乳腺癌治療的有希望的分子靶標。
由於通過上述方法篩選的物質引起乳腺癌細胞中細胞凋亡的可能性較 高，所以篩選的物質充當用於治療或預防乳腺癌的候選。
本申請提及的所有專利、專利申請和出版物皆通過提述全文併入本申請。
另外，儘管已經詳細地並且參考本發明的具體實施方案描述了本發明， 但可理解的是上述說明書實際上是例示性和解釋性的，意欲闡明本發明及 其優選實施方案。通過常規的實驗，本領域技術人員將容易地認識到，可 對本發明進行各種變化和修飾而不背離本發明的精神和範圍。因此，本發 明並不意欲受到上述說明的限定，而由如下權利要求及其等同物限定。
169
權利要求
1.選自下組的基本上純的多肽(a)包含SEQ ID NO80所示胺基酸序列的多肽；(b)包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ IDNO80所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO80所示胺基酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽；和(c)由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO79所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO80所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性。
2. 分離的多核苷酸，其編碼權利要求l的多肽。
3. 包含權利要求2的多核香酸的載體。
4. 宿主細胞，其攜帶權利要求2的多核苷酸或者攜帶包含權利要求2 的多核苷酸的載體。
5. 用於產生權利要求1的多肽的方法，該方法包括下述步驟(a) 培養下述宿主細胞，所述宿主細胞攜帶編碼權利要求1的多肽的多 核苷酸或者攜帶包含編碼權利要求1的多肽的多核苷酸的載體；(b) 使所述宿主細胞表達所述多肽；(c) 收集表達的多肽。
6. 與權利要求1的多肽結合的抗體。
7. —種多核苷酸，其與權利要求2的多核苷酸或其互補鏈互補，並且 包含至少15個核苦酸。
8. 針對權利要求2的多核普酸的反義多核苷酸或小分子幹擾RNA。
9. 權利要求8的小分子幹擾RNA，其有義鏈選自SEQ ID NO:34和35 的核苦酸序列。
10. —種診斷乳腺癌的方法，該方法包括下述步驟(a) 檢測樣本的生物樣品中編碼SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列的 基因的表達水平；和(b) 將表達水平的上升與乳腺癌相關聯。
11. 權利要求10的方法，其中，釆用選自下組的任何一種方法^^測所 述表達水平(a) 檢測編碼SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列的mRNA;(b) 檢測包含SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列的蛋白質；和(c) 檢測包含SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列的蛋白質的生物活性。
12. —種篩選用於治療乳腺癌的化合物的方法，該方法包括下述步驟(a) 使受試化合物與選自下組的多肽接觸(1) 包含SEQIDNO:80或82所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 80或82所示氨 基酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽，和(3) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 79或81所示核苷酸序列組成 的多核苷酸雜交的多核香酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測受試化合物與所述多肽之間的結合活性；和(c)選擇與所述多肽結合的受試化合物。
13. —種篩選用於治療乳腺癌的化合物的方法，該方法包括下述步驟(a) 使表達包含SEQ ID NO:79或81所示核苷酸序列的一種或多種多核 苷酸的細胞與候選化合物接觸；和(b) 選擇這樣的化合物與不存在該受試化合物時檢出的表達水平相 比，所述化合物降^^包含SEQ ID NO:79或81所示核苷酸序列的一種或多 種多核苷酸的表達水平。
14. 一種篩選用於治療乳腺癌的化合物的方法，該方法包括下述步驟(a) 使受試化合物與選自下組的多肽接觸(1 )包含SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列的多肽，(2 )包含取代、缺失、插入和/或添加了 一個或多個胺基酸的SEQ IDNO:80或82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 80或82所示胺基酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽，和(3)由在嚴緊條件下與由SEQ IDNO:79或81所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ IDNO:80或82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和(c) 選擇與不存在該受試化合物時檢出的生物活性相比，抑制所述多肽的生物活性的化合物。
15. 權利要求14的方法，其中，所述生物活性為細胞增殖活性。
16. —種篩選用於治療乳腺癌的化合物的方法，該方法包括下述步驟(a) 使導入了載體的細胞與候選化合物接觸，其中所述載體含有」7^2 或FW74F7基因的轉錄調控區和在該轉錄調控區的調控下表達的報導基 因；(b) 測定所述報導基因的表達或活性水平；和(c) 選擇這樣的化合物與不存在該受試化合物時檢出的所述報導基因 的表達或活性水平相比，該化合物降低所述報導基因的表達或活性水平。
17. —種用於篩選針對F3374V1或其功能等同物的磷酸化水平的抑制 劑的方法，該方法包括下述步驟(a) 使受試化合物與表達選自下組的多肽的細胞接觸(1) 包含SEQIDNO:82所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列 組成的蛋白等價的生物活性的多肽，和(3) 由在嚴緊條件下與由SEQ IDNO:81所示核苦酸序列組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:82 所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測所述多肽的磷酸化水平；(c) 比較所述多肽的磷酸化水平與不存在該化合物時檢出的該多肽的 磷酸化水平；(d) 選擇降低該多肽的磷酸化水平的化合物作為針對F3374V1的磷酸化水平的抑制劑。
18. —種用於篩選針對F3374V1或其功能等同物的磷酸化水平的抑制 劑的方法，該方法包括下述步驟(a)使受試化合物與選自下組的多肽或其包含磷酸化位點的片段在容 許所述多肽的磷酸化的條件下接觸(1) 包含SEQIDNO:82所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽，和(3)由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:81所示核苷酸序列組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:82 所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測所述多肽或其片段的磷酸化水平；(c) 比較底物的磷酸化水平與不存在該受試化合物時檢出的所述多肽 的磷酸化水平；和(d) 選擇降低所述多肽的磷酸化水平的化合物作為針對F3374V1的磷酸化水平的抑制劑。
19. 一種篩選用於治療或預防乳腺癌的化合物的方法，該方法包括下述 步驟(a) 使受試化合物與表達選自下組的多肽的細胞接觸(1) 包含SEQIDNO:82所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列 組成的蛋白等價的生物活性的多肽，和(3) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:81所示核苦S交序列組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:82 所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測所述多肽的磷酸化水平；(c) 比較所述多肽的磷酸化水平與不存在該受試化合物時檢出的該多 肽的磷酸化水平；(d) 選擇降低所述多肽的磷酸化水平的化合物作為用於治療或預防乳腺癌的化合物。
20. —種篩選用於治療或預防乳腺癌的作用劑的方法，該方法包括下述 步驟(a)使受試化合物與選自下組的多肽或其包含磷酸化位點的片段在容 許該多肽的磷酸化的條件下接觸(1) 包含SEQIDNO:82所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽，和(3)由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:81所示核苷酸序列組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:82 所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性； (b)檢測所述多肽或其片段的磷酸化水平；(c) 比較底物的磷酸化水平與不存在該受試化合物時檢出的所述多肽 的磷酸化水平；(d) 選擇降低所述多肽的磷酸化水平的化合物作為用於治療或預防乳腺癌的化合物。
21. 用於治療乳腺癌的組合物，該組合物含有藥學有效量的針對編碼選 自下組的多肽的多核苷酸的反義多核普酸或小分子幹擾RNA作為活性成 分，並且含有藥學可接受的載體(a) 包含SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列的多肽，(b) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 80或82所示氨基 酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽，和(c) 由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:79或81所示核苦酸序列組成的 多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性。
22. 權利要求21的組合物，其中，所述小分子幹擾RNA包含對應於選 自SEQ ID NO:34、 35、 37、 38、 67和68中的核苦酸序列的核糖核苦酸序 列作為耙標序列。
23. 根據權利要求22所述的組合物，其中所述小分子幹擾RNA具有通 式5'-[A]冊[A,]-3，，其中[A]為對應於SEQIDNO:34、 35、 37、 38、 67或68所示核苷酸序列的核糖核苷酸序列，[B]為由3-23個核苦酸組成的核糖核苷酸序列，且 [A，]為與[A]互補的核糖核苷酸序列。
24. 用於治療乳腺癌的組合物，該組合物含有藥學有效量的針對選自下 組的多肽的抗體作為活性成分，並且含有藥學可接受的載體(a) 包含SEQIDNO:80或82所示胺基酸序列的多肽，(b) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ IDNO:80或82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 80或82所示氨基 酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽，和(c)由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:79或81所示核苷酸序列組成的 多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性。
25. 用於治療乳腺癌的組合物，該組合物含有藥學有效量的抑制由SEQ ID NO:82的胺基酸序列組成的多肽的磷酸化的化合物作為活性成分，並且 含有藥學可接受的載體。
26. —種治療乳腺癌的方法，該方法包括下述步驟施用藥學有效量的 針對編碼選自下組的多肽的多核苦酸的反義多核苷酸或小分子幹擾RNA:(a) 包含SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列的多肽，(b) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 80或82所示氨基 酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽，和(c) 由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:79或81所示核苷酸序列組成的 多核苦酸雜交的多核香酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性。
27. 權利要求26的方法，其中所述小分子幹擾RNA包含對應於選自 SEQIDNO:34、 35、 37、 38、 67和68中的核普酸序列的核糖核苷酸序列作 為耙標序列。
28. 根據權利要求27所述的方法，其中所述小分子幹擾RNA具有通式 5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]為對應於SEQIDNO:34、 35、 37、 38、 67或68 所示核苷酸序列的核糖核芬酸序列，[B]為由3-23個核苷酸組成的核糖核普酸序列，且 [A ，]為與[A]的互補的核糖核苷酸序列。
29. —種治療乳腺癌的方法，該方法包括下述步驟施用藥學有效量的 針對選自下組的多肽的抗體(a )包含SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列的多肽，(b)包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ IDNO:80或82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 80或82所示胺基酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽，和(c)由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:79或81所示核苷酸序列組成的 多核苷酸雜交的多核苦酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性。
30. —種治療乳腺癌的方法，該方法包括下述步驟施用藥學有效量的 抑制由SEQ ID NO:82的胺基酸序列組成的多肽的磷酸化的化合物。
31. —種治療或預防乳腺癌的方法，所述方法包括施用藥學有效量的選 自由(a)-(c)組成的組的多肽或編碼該多肽的多核苷酸的步驟(a) 包含SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列的多肽或其片段；(b) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 80或82所示氨基 酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽，或其片段；(c) 由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:79或81所示核苷酸序列組成的 多核苷酸雜交的多核苦酸所編碼的多肽或其片段，其中該多肽具有與由 SEQ IDNO:80或82所示胺基酸序列組成的多肽等i"介的生物活性。
32. —種用於誘導針對乳腺癌的抗腫瘤免疫的方法，該方法包括使選自 由(a)-(c)組成的組的多肽與抗原呈遞細胞接觸，或者將編碼該多肽的多核芬 酸或包含該多核香酸的載體導入抗原呈遞細胞的步驟(a) 包含SEQIDNO:80或82所示胺基酸序列的多肽，或其片段；(b) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 80或82所示氨基 酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽，或其片段；(c) 由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:79或81所示核苷S吏序列組成的 多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽或其片段，其中該多肽具有與由 SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性。
33. 權利要求32的用於誘導抗腫瘤免疫的方法，其中該方法還包括給 受試者施用抗原呈遞細胞的步驟。
34. —種用於治療或預防乳腺癌的藥物組合物，該藥物組合物含有藥學 有效量的選自由(a)-(c)組成的組的多肽或編碼該多肽的多核苷酸作為活性 成分，並且含有藥學可接受的載體(a) 包含SEQIDNO:80或82所示胺基酸序列的多肽，或其片段；(b) 包含取代、缺失、插入和/或添加了一個或多個胺基酸的SEQ IDNO:80或82所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 80或82所示氨基 酸序列組成的蛋白等價的生物活性的多肽，或其片段；(c)由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:79或81所示核香酸序列組成的 多核苦酸雜交的多核苦酸所編碼的多肽或其片段，其中該多肽具有與由 SEQ ID NO:80或82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性。
35. 權利要求34的藥物組合物，其中所述多核香酸被納入表達載體中。
36. —種雙鏈分子，包含有義鏈和反義鏈，其中所述有義鏈含有對應於 選自SEQIDNO:34、 35、 37、 38、 67或68的靶標序列的核糖核香酸序列， 且其中反義鏈含有與所述有義鏈互補的核糖核苦酸序列，其中所述有義鏈 和所述反義鏈相互雜交形成所述雙鏈分子；而且其中該雙鏈分子當被導入 表達J7322、 FB74F7或JC/i^基因的細胞時，抑制所述基因的表達。
37. 權利要求36的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子為長度小於約100個 核苷酸的寡核苷酸。
38. 權利要求37的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子為長度小於約75個核 苷酸的寡核苷酸。
39. 權利要求38的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子為長度小於約50個核普酸的寡核苷酸。
40. 權利要求39的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子為長度小於約25個核香酸的寡核苷酸。
41. 權利要求36的雙鏈分子，其中所述耙標序列含有來自SEQ ID NO:79或81的核苷酸序列的約19-約25個連續的核苷酸。
42. 權利要求41的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子為單一核糖核普酸轉 錄物，該單一核糖核苷酸轉錄物包含通過單鏈核糖核苷酸序列連接起來的 有義鏈和反義鏈。
43. 編碼權利要求36的雙鏈分子的載體。
44. 權利要求43的載體，其中該載體編碼具有二級結構的轉錄物，並 且包含所述有義鏈和所述反義鏈。
45. 權利要求43的載體，其中所述轉錄物還包含連接該有義鏈和該反 義鏈的單鏈核糖核苷酸序列。
46. —種載體，該載體表達包含有義鏈核酸和反義鏈核酸的組合的多核 普酸，其中，該有義鏈核酸包含SEQ ID NO:34、 35、 37、 38、 67或68的核芬酸序列，該反義鏈核酸由與有義鏈互補的序列組成。
47. 權利要求46的載體，其中，所述多核苷酸具有通式 5'畫[AHB]-[A，]-3，，其中[A]為SEQIDNO:34、 35、 37、 38、 67或68所示的 核苷酸序列，[B]為由3-23個核苦酸組成的核苦酸序列，且 [A ，]為與[A]的互補的核苷酸序列。
48. —種篩選針對F3374V1與AURKB的結合的抑制劑的方法，該方法 包括下述步驟(a) 在受試化合物的存在下，使AURKB多肽或其功能等價物與F3374V1 多肽或其功能等價物相接觸；(b) 檢測步驟(a)的多肽間的結合；和(c) 選擇抑制AURKB多肽與F3374V1多肽間的結合的受試化合物。
49. 一種篩選治療或預防乳腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a) 在受試化合物的存在下，使AURKB多肽或其功能等價物與F3374V1 多肽或其功能等價物相接觸；(b) 檢測步驟(a)的多肽間的結合；和(c) 選擇抑制AURKB多肽與F3374V1多肽間的結合的受試化合物。
50. 權利要求48或49的方法，其中，所述F3374V1多肽的功能等價 物包含AURKB結合區的胺基酸序列。
51. 權利要求50的方法，其中，所述F3374V1多肽的功能等價物包含 SEQIDNO:82的C末端區域(第591~730位胺基酸)(SEQ IDNO:122)的氨基 酸序列。
52. 權利要求48或49的方法，其中，所述AURKB多肽的功能等價物 包含F3374V1結合區的胺基酸序列。
53. —種用於篩選治療或預防乳腺癌的化合物的試劑盒，該試劑盒包含 以下組分(a) AURKB多肽或其功能等價物，和(b) F3374Vl多肽或其功能等價物。
54. —種篩選針對AURKB介導的F3374V1的磷酸化的抑制劑的方法， 該方法包括下述步驟(a) 在受試化合物的存在下，在適於AURKB將F3374V1磷酸化的條件下，對F3374V1和AURKB進行溫育，其中所述F3374V1是選自下組的多肽(1 )包含SEQIDNO:82(F3374Vl)所示胺基酸序列的多肽，(2 )包含取代、缺失或插入了 一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性，(3 )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 81所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交的多核苦酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ IDNO: 82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測F3374Vl的磷酸化水平；(c) 將F3374Vl的磷酸化水平與對照水平相比較；和(d) 選擇這樣的化合物與不存在受試化合物時檢出的對照水平相比，所述化合物降低F3374V1的磷酸化水平。
55. —種篩選用於治療或預防乳腺癌的化合物的方法，該方法包括下述步驟(a) 在受試化合物的存在下，在適於AURKB將F3374V1磷酸化的條件下，對F3374V1和AURKB進行溫育，其中所述F3374V1是選自下組的多肽(1 )包含SEQIDNO:82(F3374Vl)所示胺基酸序列的多肽，(2 )包含取代、缺失或插入了 一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性，(3 )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 81所示核苷酸序列組成的多核香酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ IDNO: 82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測F3374Vl的磷酸化水平；(c) 將F3374Vl的磷酸化水平與對照水平相比較；和(d) 選擇這樣的化合物與對照水平相比，所述化合物降低F3374V1的磷酸化水平。
56. 權利要求54或55的方法，其中，所述F3374V1的磷酸化水平是在SEQ ID NO:82的C末端區域(第591位 730位胺基酸)(SEQ ID NO:122)或者該多肽的同源位置檢測的。
57. —種用於篩選治療或預防乳腺癌的化合物的試劑盒，該試劑盒包含以下組分(a) 選自下組的多肽(1 )包含SEQIDNO:82(F3374Vl)所示胺基酸序列的多肽，(2 )包含取代、缺失或插入了 一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性，和(3 )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 81所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ IDNO: 82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 選自下組的多肽(1 )包含SEQ ID NO:88 (AURKB)所示胺基酸序列的多肽，(2)包含取代、缺失或插入了一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 88所示胺基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 88所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性，和(3 )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 87所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ IDNO: 88所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(c) 用於檢測F3374V1的磷酸化水平的試劑。
58. —種用於篩選治療或預防乳腺癌的化合物的試劑盒，該試劑盒包含以下組分(a)表達選自下組的多肽的細胞(1 )包含SEQIDNO:82(F3374Vl)所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含取代、缺失或插入了一個或多個胺基酸的SEQIDNO: 82所示胺基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性，和(3) 由在嚴緊條件下與由SEQIDNO: 81所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交的多核苦酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 82所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；和(b)用於檢測F3374V1的磷酸化水平的試劑。
59. 權利要求58的試劑盒，其中，所述細胞還表達選自下組的多肽 (1 )包含SEQ ID NO:87 (」W ^8)所示胺基酸序列的多肽，(2 )包含取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ ID NO: 88所示 胺基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 88所示胺基酸序 列組成的多肽等價的生物活性，和(3 )由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO: 87所示核苷酸序列組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，並且該多肽具有與由SEQ ID NO: 88 所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性。
60. 權利要求58的試劑盒，其中所述細胞為乳腺癌細胞。
61. 權利要求57或58的試劑盒，其中所述用於檢測F3374V1的磷酸 化水平的試劑為識別在SEQ ID NO:82的C末端區域(第591 730位氨基 酸)(SEQ ID NO:122)的磷酸化的抗體。
62. —種抗體，其識別在SEQ ID NO:82的C末端區域(第437 730位氨 基酸)(SEQ ID NO:93)的磷酸化。
63. —種用於治療或預防受試者中的乳腺癌的方法，該方法包括施用具 有選自下組中的至少任一種功能的抑制劑的步驟(a) 抑制F3374V1與AURKB間的結合；(b) 抑制AURKB對F3374V1的磷酸化；和(c) 抑制選自」7322、屍3374K7和^ W X5中的任一種基因的表達。
64. —種用於預防和治療乳腺癌的組合物，該組合物含有藥學有效量的 具有選自下組中的至少任一種功能的抑制劑(a) 抑制F3 3 74V1與AURKB間的結合；(b) 抑制AURKB對FBMVl的磷酸化；和(c) 抑制選自屍3374W和爿t//^5中的任一種基因的表達。
65. —種用於篩選誘導表達TOPK的細胞的凋亡的作用劑的方法，該方 法包括下述步驟(a)使表達選自下組的多肽的細胞與作用劑接觸(1) 包含SEQIDNO:9Z所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 92所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:91所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92所示 胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測所述多肽的激酶活性；(c) 將所述多肽的激酶活性與在不存在所述作用劑的條件下檢出的所 述多肽的激酶活性相比較；和(d) 選擇降低所述多肽的激酶活性的作用劑作為誘導乳腺癌細胞的凋 亡的作用劑。
66. —種篩選誘導乳腺癌細胞的凋亡的作用劑的方法，該方法包括下述 步驟(a) 使表達選自下組的多肽的細胞與作用劑接觸(1) 包含SEQIDNO:92所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 92所示胺基酸序列組成的多肽 等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:91所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92所示 胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測所述多肽的磷酸化水平；(c) 將所述多肽的磷酸化水平與在不存在所述作用劑的條件下檢出的 所述多肽的磷酸化水平相比較；和(d) 選擇降低所述多肽的磷酸化水平的作用劑作為誘導乳腺癌細胞的 凋亡的作用劑。
67. —種篩選誘導表達TOPK的細胞的凋亡的作用劑的方法，該方法包 括下述步驟(a)使選自下組的多肽、被該多肽磷酸化的底物以及作用劑在容許所述底物的磷酸化的條件下接觸(1) 包含SEQIDNO:92所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 92所示胺基酸序列組成的多肽 等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:91所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92所示 胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 4企測所述底物的磷酸化水平；(c) 將所述底物的磷酸化水平與在不存在所述作用劑的條件下檢出的 所述多肽的磷酸化水平相比較；和亡的作用劑。
68. —種篩選誘導乳腺癌細胞的凋亡的作用劑的方法，該方法包括下述 步驟(a) 使選自下組的多肽、被該多肽磷酸化的底物以及作用劑在容許該底 物的磷酸化的條件下接觸(1) 包含SEQIDNO:92所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQIDNO: 92所示胺基酸序列組成的多肽 等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:91所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92所示 胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) -檢測所述底物的磷酸化水平；(c) 將所述底物的磷酸化水平與在不存在所述作用劑的條件下檢出的 所述底物的磷酸化水平相比較；和(d)選擇降低所述底物的磷酸化水平的作用劑作為誘導乳腺癌細胞的 凋亡的作用劑。
69. 權利要求67或68的方法，其中，所述底物為組蛋白或組蛋白的至 少包含其磷酸化位點的片段。
70. 權利要求69的方法，其中，所述磷酸化位點為組蛋白H3的SerlO。
71. —種篩選抑制TOPK的激酶活性的作用劑的方法，該方法包括下述 步驟(a) 使選自下組的多肽與作為底物的組蛋白H3或組蛋白H3的至少包 含其磷酸化位點的片段接觸(1) 包含SEQIDNO:92所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQIDNO: 92所示胺基酸序列組成的多肽 等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:91所示核香S交序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92所示 胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) ^r測所述底物的磷酸化水平；(c) 將所述底物的磷酸化水平與在不存在所述作用劑的條件下檢出的 所述底物的磷酸化水平相比較；和(d) 選擇降低所述底物的磷酸化水平的作用劑作為抑制劑。
72. 權利要求71的方法，其中，所述磷酸化位點為組蛋白H3的Ser10。
73. —種篩選用於預防或治療乳腺癌的作用劑的方法，該方法包括下述 步驟(a)使表達選自下組的多肽的細胞與作用劑接觸(1) 包含SEQIDNO:92所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 92所示胺基酸序列組成的多肽 等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多肽，和(4)由在嚴緊條件下與由SEQ IDNO:91所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92所示 胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測所述多肽的磷酸化水平；(c) 將所述多肽的磷酸化水平與在不存在所述作用劑的條件下檢出的 所述多肽的磷酸化水平相比較；和(d) 選擇降低所述多肽的磷酸化水平的作用劑作為用於治療或預防乳腺癌的作用劑。
74. —種篩選用於預防或治療乳腺癌的作用劑的方法，該方法包括下述 步驟(a) 使選自下組的多肽、被該多肽磷酸化的底物以及作用劑在容許該底 物的磷酸化的條件下接觸(1) 包含SEQIDNO:92所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 92所示胺基酸序列組成的多肽 等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:91所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92所示 胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測所述底物的磷酸化水平；(c) 將所述底物的磷酸化水平與在不存在所述作用劑的條件下檢出的 所述底物的磷酸化水平相比較；和(d) 選擇降低所述底物的磷酸化水平的作用劑作為用於治療或預防乳腺癌的作用劑。
75. 權利要求74的方法，其中所述底物為組蛋白或組蛋白的至少包含 其磷酸化位點的片段。
76. 權利要求75的方法，其中，所述磷酸化位點為組蛋白H3的Ser10。
77. —種篩選用於治療或預防乳腺癌的化合物的方法，該方法包括下述步驟(a) 在存在受試化合物的條件下，使A7322與PHB2/REA或其功能等價 物相接觸，其中所述A7322為選自下組的多肽(1) 包含SEQ ID NO:80 (A7322)所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:80所示氨 基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 80所示胺基酸序列 組成的多肽等價的生物活性，(3) 由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:79所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQIDNO:80所 示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測步驟(a)的多肽之間的結合；和(c) 選擇抑制所述A7322多肽與PHB2/REA多肽之間的結合的受試化合物。
78. —種以PHB2/REA的細胞定位為指標來篩選針對A7322與 PHB2/REA之間的結合的抑制劑的方法，該方法包括下述步驟(a) 使候選化合物與表達A7322以及PHB2/REA蛋白的細胞相接觸，其 中所述A7322為選自下組的多肽(1) 包含SEQ IDNO:80 (A7322)所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ IDNO:80所示氨 基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 80所示胺基酸序列 組成的多肽等價的生物活性，(3) 由在嚴緊條件下與由SEQIDNO:79所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQIDNO:80所 示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 4全測PHB2/REA蛋白的亞細胞定位；和(c) 選擇這樣的化合物與不存在所述受試化合物時檢出的該蛋白的水 平相比，所述化合物降低細胞核內的PHB2/REA蛋白的水平。
79. —種篩選針對A7322與PHB2/REA之間的結合的抑制劑的方法， 其中以ERa的轉錄活性為指標，該方法包括下述步驟(a)在E2處理下使候選化合物與細胞相接觸，所述細胞表達A7322以及 PHB2/REA蛋白，且導入了包含雌激素應答性轉錄調控區以及在該轉錄調控區的調控下表達的報導基因的載體；(b) 測定所述報導基因的表達或活性水平；和(c) 選擇這樣的化合物與不存在該受試化合物時檢出的所述報導基因 的表達或活性水平相比，該化合物降低該報導基因的表達或活性水平。
80. —種治療乳腺癌的方法，該方法包括施用藥學有效量的抑制A7322 多肽與PHB2/REA多肽之間的結合的化合物，其中，所述A7322為選自下 組的多肽(1) 包含SEQ ID NO:80 (A7322)所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQIDNO:80所示氨 基酸序列的多肽，條件是所述多肽具有與由SEQ ID NO: 80所示胺基酸序列 組成的多肽等價的生物活性，(3) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:79所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQIDNO:80所 示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性。
81. —種治療乳腺癌的方法，該方法包括施用藥學有效量的抑制 PHB2/REA蛋白的核轉移的化合物，其中，所述A7322為選自下組的多肽(1) 包含SEQ ID NO:80 (A7322)所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:80所示氨 基酸序列的多肽，條件是具有與由SEQ ID NO: 80所示胺基酸序列組成的多 肽等價的生物活性，(3) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:79所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQIDNO:80所 示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性。
82. —種篩選用於抑制TOPK的磷酸化水平的作用劑的方法，該方法包 括下述步驟(a)在容許磷酸化的條件下，使選自下組的多肽與CDK1 (SEQ ID NO:95)、細胞周期蛋白Bl (SEQ ID NO:97)以及作用劑相接觸(1) 包含SEQIDNO:92所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQIDNO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 92所示胺基酸序列組成的多 肽等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:91所示核苦酸序列組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92 所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測(a)所述蛋白中蘇氨酸9殘基處的磷酸化水平；(c) 將所述蛋白中蘇氨酸9殘基的磷酸化水平與不存在所述作用劑時檢 出的所述蛋白中蘇氨酸9殘基的磷酸化水平相比較；和(d) 選擇降低SEQ ID NO:92的胺基酸序列中蘇氨酸9殘基的磷酸化水平 的作用劑作為用於抑制劑的作用劑。
83. —種篩選用於預防或治療乳腺癌的作用劑的方法，該方法包括下述 步驟(a) 在容許磷酸化的條件下，使選自下組的多肽與CDK1 (SEQ ID NO:95)、細胞周期蛋白Bl (SEQ ID NO:97)以及作用劑相接觸(1) 包含SEQIDNO:92所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQIDNO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQIDNO: 92所示胺基酸序列組成的多 肽等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:91所示核香酸序列組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92 所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測(a)所述蛋白中蘇氨酸9殘基處的磷酸化水平；(c) 將所述蛋白中蘇氨酸9殘基的磷酸化水平與不存在作用劑時檢出的 所述蛋白中蘇氨酸9殘基的磷酸化水平相比較；和(d) 選擇降低SEQ ID NO:92的胺基酸序列中蘇氨酸9殘基的磷酸化水平 的作用劑作為用於治療或預防乳腺癌的作用劑。
84. —種包含SEQIDNO:98的多肽，或者與該多肽在功能上等價的多 肽的胺基酸序列，其中所述多肽抑制由SEQ ID NO:92組成的肽的生物功能。
85. 權利要求84的多肽，其中所述生物功能為細胞增殖活性。
86. 權利要求84的多肽，其中所述多肽由8-50個殘基組成。
87. 權利要求84的多肽，其中所述多肽被細胞膜通透性物質所修飾。
88. 權利要求84的多肽，其具有下述通式 [R]-[D]其中，[R]表示細胞膜通透性物質；並且[D]表示包含SEQIDNO:98的片段序列的胺基酸序列；或者與包含所述片段序列的多肽在功能上等價的 多肽的胺基酸序列，其中[R]和[D]直接連接或者通過接頭間接連接， 其中該多肽抑制由SEQ ID NO:92組成的肽的生物功能。
89. 權利要求88的多肽，其中所述接頭具有G的胺基酸序列。
90. 權利要求88的多肽，其中，所述細胞膜通透性物質為選自下組中 的任一種多聚精氨酸；Tat / RKKRRQRRR/SEQ ID NO: 100;Penetratin / RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO: 101;Buforin II / TRSSRAGLQFPVGRVHRIXRK/SEQ ID NO: 102;Tmnsportan / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO:103;MAP (模型兩親肽)/ KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO: 104; K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO: 105; Ku70 / VPMLK/SEQ ID NO: 106pVEC / LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO:畫；Pep-1 / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO: 109;SynBl / RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO: 110;Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO: 111;麗-l / TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO: 112;和Ku70 / PMLKE/SEQ ID NO: 114。
91. 權利要求90的多肽，其中所述多聚精氨酸為Argil (SEQ ID NO:113)。
92. 權利要求91的多肽，其中所述多肽包含胺基酸序列SEQIDNO:99。
93. —種用於治療和/或預防乳腺癌的作用劑，其含有包含SEQ ID NO:98的多肽；與該多肽功能上等價的多肽；或者 編碼這些多肽的多核苷酸作為活性成分活性成分，其中該多肽抑制由SEQIDNO:92組成的肽的生物活性。
94. 權利要求93的作用劑，其中所述生物功能為細胞增殖活性。
95. 權利要求93的作用劑，其中所述多肽由8 50個殘基組成。
96. 權利要求93的作用劑，其中所述活性成分為所述多肽，且該多肽 被細胞膜通透性物質所修飾。
97. 權利要求96的作用劑，其中所述多肽具有下述通式 [R]-[D]其中，[R]表示細胞膜通透性物質；並且[D]表示包含SEQ ID NO:98的 片段序列的胺基酸序列；或者與該多肽功能上等價的多肽，其中[R]和[D] 直接連接或者通過接頭間接連接，
98. 權利要求97的作用劑，其中所述接頭具有G的胺基酸序列。
99. 權利要求98的多肽，其中所述細胞膜通透性物質為選自下組中的 任一種多聚精氨酸；Tat / RKKRRQRRR/SEQ ID NO: 100;Penetratin / RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO: 101;Buforin II / TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO: 102;Transportan / GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO:103;MAP (模型兩親肽)/ KLALKLALKALKAALKXA/SEQ ID NO: 104; K-FGF / AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO: 105; Ku70 / VPMLK/SEQ ID NO: 106Prion / MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO: 107; pVEC / LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO: 108; Pep畫l / KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO: 109; SynBl /RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQIDNO: 110;Pep-7 / SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO: 111; 麗-1 / TSPLNI麗GQKL/SEQ ID NO: 112;和 Ku70 / PMLKE/SEQ ID NO: 114。
100. 權利要求99的作用劑，其中所述多聚精氨酸為Argil (SEQ ID NO:113)。
101. 權利要求100的作用劑，其中所述多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:99。
102. —種用於治療和/或預防乳腺癌的方法，包括施用 包含SEQ ID NO:98的多肽；與該多肽功能上等價的多肽；或者 編碼這些多肽的多核苷酸的步驟，其中所述多肽抑制由SEQIDNO:92組成的肽的生物活性。
103. 包含SEQIDNO:98的多肽、 與該多肽功能上等價的多肽、或者 編碼這些多肽的多核苦酸在製造用於治療和/或預防乳腺癌的藥物組合物中的用途，其中所述多 肽抑制由SEQ ID NO:92組成的肽的生物活性。
104. —種藥物組合物，該組合物含有包含SEQIDNO:98的多肽或者與 該多肽功能上等價的多肽，以及藥學可接受的載體，其中所述多肽抑制由 SEQ ID NO:92組成的肽的生物活性。
105. —種篩選用於預防或治療乳腺癌的作用劑的方法，該方法包括下 述步驟(a)使候選作用劑與表達蛋白磷酸酶la (SEQ ID NO:l 16)以及選自下組 的多肽的細胞相接觸(1) 包含SEQIDNO:92所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQIDNO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 92所示胺基酸序列組成的多 肽等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQIDNO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:91所示核苷酸序列組成的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92 所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測(a)所述蛋白的磷酸化水平；(c) 將所述蛋白的磷酸化水平與在不存在作用劑的條件下檢出的所述 蛋白的磷酸化水平相比較；和(d) 選擇降低所述蛋白的磷酸化水平的作用劑作為用於治療或預防乳 腺癌的作用劑。
106. —種篩選用於預防或治療乳腺癌的作用劑的方法，包括下述步驟(a) 使選自下組的多肽與p47 (SEQ ID NO:118)、 p97 (SEQ ID NO:120) 以及作用劑接觸(1) 包含SEQIDNO:^所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQIDNO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQ ID NO: 92所示胺基酸序列組成的多 肽等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ IDNO:91所示核香酸序列組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92 所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測所述多肽間的結合或p97(SEQIDNO:120)的磷酸化；和(c) 選擇抑制所述多肽間的結合或p97 (SEQ ID NO:120)的磷酸化的受 試化合物。
107. —種篩選用於預防或治療乳腺癌的作用劑的方法，該方法包括下 述步驟(a) 使候選作用劑與表達PBK/TOPK的細胞相接觸；(b) 觀察細胞結構和/或細胞周期上的G2/M群體；和(c) 選擇使胞間連接改變為長胞間橋和/或增加細胞的G2/M群體的化合物。
108. —種篩選用於增強磷酸酶la介導的TOPK去磷酸化的作用劑的方 法，該方法包括下述步驟(a)使候選作用劑與表達蛋白磷酸酶la (SEQ ID NO:116)以及選自下組的多肽的細胞接觸(1) 包含SEQIDNO:92所示胺基酸序列的多肽，(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQIDNO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQIDNO: 92所示胺基酸序列組成的多 肽等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:91所示核苷酸序列組成的多核 苷酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92 所示胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b)檢測(a)所述蛋白的磷酸化水平；蛋白的磷酸化水平相比較；和(d)選擇降低所述蛋白的磷酸化水平的作用劑作為用於治療或預防乳腺癌的作用劑。
109. —種篩選用於抑制TOPK介導的p97磷酸化的作用劑的方法，該 方法包括下述步驟(a) 使選自下組的多肽與p47 (SEQ ID NO:118)、 p97 (SEQ ID NO:120) 以及作用劑接觸(1) 包含SEQIDNO:W所示胺基酸序列的多肽；(2) 包含添加、取代、缺失或插入一個或多個胺基酸的SEQ ID NO:92 所示胺基酸序列，並且具有與由SEQIDNO: 92所示胺基酸序列組成的多肽 等價的生物活性的多肽，(3) 包含與SEQ ID NO:92具有至少約80%同源性的胺基酸序列的多 肽，和(4) 由在嚴緊條件下與由SEQ ID NO:91所示核苷酸序列組成的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由SEQIDNO:92所示 胺基酸序列組成的多肽等價的生物活性；(b) 檢測所述多肽間的結合或p97 (SEQ ID NO:120)的磷酸化；(c) 選擇抑制多肽間的結合或p97 (SEQ ID NO:120)的磷酸化的受試化 合物。(c)將所述蛋
全文摘要
本申請提供新的人基因A7322，其表達在乳腺癌中顯著提高。本申請還提供人基因F3374，其表達在乳腺癌中顯著提高。這些基因及由其編碼的多肽可以例如用在乳腺癌的診斷中，還可以用作開發抗乳腺癌藥物的靶分子。本發明突出展示篩選PBK/TOPK激酶活性調節劑的方法。本發明進一步提供預防或治療癌症(例如乳腺癌)的藥劑的篩選方法。
文檔編號C07K14/43GK101528768SQ20078003801
公開日2009年9月9日 申請日期2007年8月10日 優先權日2006年8月10日
發明者中村佑輔, 中鶴修一, 片桐豐雅 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司