Gr2酶基因在培育抗光氧化脅迫轉基因植物中的應用的製作方法

2024-01-19 12:51:15 3

專利名稱：：Gr2酶基因在培育抗光氧化脅迫轉基因植物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，特別涉及GR2酶基因在培育抗光氧化脅迫轉基因植物中的應用。
背景技術：
：植物的光合作用和呼吸作用都會產生活性氧，脅迫條件下，如高光、低溫等都會引起活性氧的產生明顯增加，大量積累的活性氧若不及時清除，就會對植物造成光氧化脅迫傷害(Noctor,G.andFoyer,C.H.(1998)Ascorbateandglutathione:keepingactiveoxygenundercontrol.Annu.Rev.PlantPhysiol.屍/awfMb/.5w/.,49:249-79)。植物體內存在抗氧化系統，能及時清除過量的活性氧，以維持體內正常的代謝。抗壞血酸一穀胱甘肽循環是植物清除11202的重要途徑(Mittler,R.(2002)Oxidativestress,antioxidantsandstresstolerance.7>e"&;/aWsc/e"ce7:405-410)。在此循環中，抗壞血酸過氧化物酶(APX)催化11202與抗壞血酸(ASC)反應，生成單脫氫抗壞血酸(MDA)禾口H20。單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR)可以利用NADPH將MDA還原生成ASC。MDA也可以裂解形成脫氫抗壞血酸(DHA)，DHAR利用還原性穀胱甘肽(GSH)將DHA還原，生成ASC，同時GSH被氧化生成氧化型穀胱甘肽(GSSG)，穀胱甘肽還原酶(GR)可以利用NADPH還原GSSG，生成GSH。葉綠體、細胞質、線粒體、過氧化物體、外質體都存在抗壞血酸-穀胱甘肽循環途徑。植物體中GR酶有多種同工酶，分布在細胞的葉綠體、線粒體和細胞質中(FoyerC.H.andHalliwell,B.(1976)Thepresenceofglutathioneandglutathionereductaseinchloroplast:Aproposedroleinascorbicacidmetabolism.ZVa齒,133:21-25;Edwards,E.A.,Rawsthorne，S.andMullineaux，P.M.(1990)Subcellulardistributionofmultipleformsofglutathionereductaseinleavesofpea(P&畫虛/v應L.).屍/a她,180:278-284)。植物中的GR酶編碼基因可能為一個基因家族(Edwardsetal.，1990;Madamanchi,N.R.,Aderson,J.V.,Alscher,R.G.，Cramer,C丄.andHess,J丄.(1992)Purificationofmultipleformsofglutathionereductasefrompeaseedlingsandenzymelevelsinozone-fumifatedpealeaves.屍/fl^屍A，Zo/.,100:138-145)。在菸草中已經發現兩種GR酶編碼基因，分別編碼細胞質中GR酶(GR1)和葉綠體GR酶(GR2)(Creissen,G.P.andMullineauxP.M.(1995)CloningandcharacterizationofglutathionereductasecDNAsandidentificationoftwogenesencodingthetobaccoenzymes.屍/a她,197:422-425)。本發明的目的在於提供一種培育抗光氧化脅迫轉基因植物的方法。本發明提供培育抗光氧化脅迫轉基因植物的方法是將所述GR2酶基因導入植物中，得到的抗光氧化脅迫植物。上述GR2酶基因序列是Genbank號為X76293(gi:431954)的自5'端第1-1675位的核苷酸序列。所述植物為菸草。所述GR2酶基因通過表達載體導入植物中，所述表達載體是將GR2酶基因插入pCAMBIA1301的多克隆位點，得到的重組載體。本發明的另一目的在於提供一個DNA片段，是雙鏈DNA片段，其名稱為igr,由基因片段A、B和C依次連接組成；所述基因片段A的核苷酸序列為序列表中的序列1(名稱為igrl)，所述基因片段C的核苷酸序列為序列表中的序列2(名稱為igr2);所述基因片段B是內含子。上述內含子的核苷酸序列是序列表中序列3。含有上述DNA片段的重組載體屬於本發明的保護範圍。上述重組載體是將上述的DNA片段插入pART27的多克隆位點，得到的重組載體，該重組載體具體可以是圖2所示的pARTigr。含有上述DNA片段的轉基因細胞系或重組菌也屬於本發明的保護範圍。本發明的另一目的在於提供一種DNA分子，其核苷酸序列是序列表中的序列1。本發明的又一目的在於提供一種DNA分子，其核苷酸序列是序列表中的序列2。本發明還提供了上述DNA片段或上述重組載體在培育光氧化脅迫敏感型轉基因植物中的應用。上述光氧化脅迫敏感型轉基因植物是抗光氧化脅迫能力降低的轉基因植物。本發明利用RNAi技術，將igr導入菸草中，獲得了低溫條件下抗氧化能力大大降低的轉基因菸草。該轉基因菸草與野生型對照相比，GR2酶的酶活降低，^r^的轉錄水平降低，GR2酶的表達量降低。在低溫條件下，轉基因菸草的每株鮮重、葉綠素含量以及光合作用能力也明顯低於野生型對照；轉基因菸草抗光氧化的能力大大降低，活性氧和MDA明顯積累。該DNA片段導入菸草中獲得的抗光氧化脅迫能力降低的轉基因植物可以作為模式植物或者篩選材料，用來篩選能夠提高植物抗光氧化脅迫的激素或化合物或者基因。將GR2酶基因導入菸草中，可使GR2酶過表達，提高了菸草抗光氧化脅迫能力，因此有利於農作物產率的提高。圖1為RT-PCR獲得菸草GR2酶的基因的部分片段，其中M為DNA分子量標準，1為primerigrl的RT-PCR產物，2為primerigr2的RT-PCR產物。圖2為菸草GR2酶基因的RNAi雙元轉化載體構建流程圖。圖3為質粒的雙酶切鑑定圖，其中A為pKAigr的雙酶切鑑定，B為植物雙元轉化質粒pARTigr的雙酶切鑑定，其中M均為DNA分子量標準；1均為大腸桿菌轉化株系的質粒DNA雙酶切(EcoRI，Xbal)結果。圖4為pARTigr根癌農桿菌質粒的PCR檢測圖，其中M為DNA分子量標準；l為不同的根癌農桿菌轉化菌株。圖5為菸草轉化及Tl代種子在Kan抗性培養基上的萌發圖片，其中A為農桿菌浸染後的葉圓片在Kan抗性培養基上的分化圖；B為分化幼苗的生根圖；C為Tl代菸草種子在Kan抗性培養基上的萌發圖。圖6為轉pARTigr菸草的PCR檢測，其中M為DNA分子量標準，wt為野生型對照菸草，iT為轉化pART27的菸草，i2-i46為不同igr轉基因菸草。圖7為轉pARTigr菸草的RT-PCR檢測，其中A為RNA電泳圖；B為RT-PCR電泳圖。圖8為不同轉pARTigr菸草GR酶總蛋白在垂直聚丙烯醯胺凝膠電泳上的Western雜交結果圖，其中wt,iT，i2,i21，i28，i42的電泳上樣量為15tig蛋白，1/2wt，1/4wt分別是野生型對照菸草上樣量的1/2和1/4。圖9為低溫條件下轉基因菸草的生長。圖10為低溫條件下不同轉pARTigr菸草中MDA和活性氧的積累。圖11為低溫條件下不同轉pARTigr菸草中活性氧清除途徑穀胱甘肽-抗壞血酸途徑中抗氧化酶的變化。圖12為低溫條件下不同轉pARTigr菸草中活性氧清除途徑穀胱甘肽-抗壞血酸途徑中抗氧化物的變化。其中，圖7、圖8、圖9、圖10、圖11和圖12中wt均為野生型對照菸草，iT均為轉化pART27的菸草，i2，i21，i28，i42均為不同轉pARTigr菸草株系。圖13為RT-PCR獲得菸草GR2酶基因的片段，M為DNA分子量標準，1為RT-PCR產物。圖14為pCAMBiA1301gr的雙酶切鑑定，M為DNA分子量標準，1為pCAMBIA1301gr經NcoI、BstEII酶切結果。圖15為pCAMBIA1301gr根癌農桿菌質粒的PCR檢測，M為DNA標準；1為根癌農桿菌轉化菌株。圖16為eGR轉基因菸草基因組的PCR檢測，wt為野生型對照菸草；el、e2等為不同轉pCAMBIA1301gr菸草，eT為轉化pCAMBIA1301質粒的轉基因菸草。圖17為MV處理對不同eGR轉基因菸草的傷害。wt為野生型對照菸草，e6、e8為不同轉pCAMBIA1301gr菸草，eT為轉化pCAMBIA1301質粒的轉基因菸草。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不限於以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1.培育轉pARTigr菸草及其檢測一、轉基因菸草的獲得1、轉化載體的構建1)目的基因的克隆取菸草幼苗葉片約0.2g，用Trizol方法提取菸草RNA，進行反轉錄生成第一鏈DNA，根據Genbank中已知的菸草GR2酶的基因序列設計引物，該序列是Genbank號為X76293(gi:431954)的5'端第130-1098位的核苷酸序列，設計的引物序列如下primerigrl:upper:5'-TTCGAATTCTTCTCACCCACTCCCGTA畫3';EcoRllower:5'-CACGGTACCTTGTCATTTTCACTCCCACT-3，。Kpnlprimerigr2:upper:5，-GATTCTAGATTCTCACCCACTCCCGTA-3，。Xballower:5，-GGCGATCGATTTGTCATTTTCACTCCCACT-3，。Clal分別以上述primerigrl和primerigr2為引物，以反轉錄產生的第一鏈DNA為模板進行PCR擴增，反應程序為94。C3min;94°C變性45s;，59°C45s;卜25個循環72°C延伸30s;J72°C延伸lOmin;PCR擴增獲得兩條片段igrl和igr2，igrl的核苷酸序列是序列表中的序列1，igr2的核苷酸序列是序列表中的序列2，兩條片段大小均為960bp左右(如圖1)。分別回收PCR產物，連接於pGEM-TEasyvector(Promega公司)，生成pGEMigrl和pGEMigr2，分別轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆，酶切鑑定正確後送博亞生物公司測序。測序結果表明目的片段的DNA序列與GenBank中公布的序列一致。2)雙元轉化載體的構建菸草GR2酶基因的RNAi雙元轉化載體構建流程如圖2所示，將上述測序正確的pGEMigrl經EcoRI和Kpnl雙酶切，回收小片段，連接於經同樣酶切的質粒pKANNIBAL(Constructdesignforefficient,effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants,PlantJournal,2001,27(6)581-590)(CSIR0惠贈)(公眾可從CSIROPlantIndustry(CSIR0PlantIndustry,CnrCluniesRossStreetandBarryDriveBlackMountain,Canberra,ACT,郵寄地址GP0Boxl600CANBERRAACT2601AUSTRALIA)或中科院植物所光合中心獲得)，生成pKAigrl，轉化大腸桿菌後進行酶切鑑定；然後將上述測序正確的pGEMigr2經Xbal和Clal雙酶切，回收小片段，連接於經同樣酶切的pKAigrl，生成沐Aigr，在pKAigr中，igrl和igr2之間具有內含子，其核苷酸序列如序列表中的序列3所示，然後將pKAigr轉化大腸桿菌，進行酶切鑑定(圖3A)。Notl酶切pKAigr，回收小片段，連接於經Notl酶切的pART27質粒(Constructdesignforefficient,effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants,PlantJournal,2001,27(6)581-590)(CSIR0惠贈)(公眾可從CSIROPlantIndustry(CSIROPlantIndustry,CnrCluniesRossStreetandBarryDriveBlackMountain,Canberra,ACT,郵寄地址GP0Boxl600CANBERRAACT2601AUSTRALIA)或中科院植物所光合中心獲得)，生成pARTigr，轉化大腸桿菌後酶切鑑定(如圖3B)。2、pARTigr的根癌農桿菌轉化用下述三親雜交方法轉化根癌農桿菌LBA4404(中科瑞泰生物公司)，在Kan、Str、Rif三抗培養基上篩選陽性克隆，挑取單克隆於含Kan、Rif抗生素的YEP培養基(lLYEP培養基中含10g胰蛋白腖；10g酵母提取粉；5gNaCl，其餘為水，高壓滅菌1520min)中振蕩培養至對數生長期，收集少量菌體，用primerigrl引物進行菌落PCR檢測，結果如圖4所示，用primerigrl從重組農桿菌菌株可以PCR到條帶專一、大小在960bp左右的目的條帶，表明目的質粒轉化至根癌農桿菌中。同樣的方法進行pART27的農桿菌轉化。三親雜交法1)挑取含植物表達載體的大腸桿菌DH5a單克隆，接種於附加卡鈉黴素(Kan)(100mg/L)的LB液體培養基中，37'C過夜振蕩培養。2)挑取含pRK2013輔助質粒的大腸桿菌朋101(中科瑞泰生物公司)，接種於附加Kan(100mg/L)的LB液體培養基中，30。C過夜振蕩培養。3)挑取LBA4404根癌農桿菌單克隆，接種於附加Rif(100mg/L)和Str(50mg/L)的YEP液體培養基中，28。C振蕩培養48h。4)分別取上述三種00600=0.6的菌液各100|il，放入同一個無菌1.5ral離心管中混勻，12000g離心30s，棄上清，加入0.5ml新鮮無抗生素的LB液體培養液重懸菌體，將菌液點在無抗生素的LB平板上(16點)，超靜臺中吹乾後28。C過夜共培養。5)用接種環交叉三環，稀釋於500^1的新鮮LB液體培養液中，按102、103和104的比例配比稀釋，塗布於附加Kan(100mg/L)、Rif(100mg/L)、Str(50mg/L)三抗的YEP平板上，吹乾後，於28'C倒置培養至少48h。6)篩選陽性克隆。3、菸草的轉化用葉圓盤方法轉化菸草W38(北京市種子站)，將含有pARTigr的根癌農桿菌侵染葉圓片，侵染後的葉圓片在含卡鈉黴素(300ug/ml)的篩選培養基上生長，每1周後更換一次新的篩選培養基，生長分化2周後，實驗組中浸染葉圓片中可見有愈傷分化(圖5A-a),分化4-6周後成幼芽(圖5A-b)，而未經農桿菌侵染的葉圓片在篩選培養基上不能分化生長直至變黃枯死(圖片未顯示)。實驗組中幼芽生長出比較明顯的幼葉時剪下插入生根培養基中生根培養(圖5B)。生根的幼苗栽種在溫室中生長直至開花結籽，收穫Tl代轉基因菸草種子。T1代種子在含卡鈉黴素(Kan)(300ug/ml)的MS培養基上萌發(圖5C)。野生型對照菸草種子不能正常萌發生長，而轉pARTigr菸草種子只有很小一部分不能正常萌發生長，這是可能由於遺傳分離造成的。萌發試驗表明目的基因通過母本傳遞給子一代。按照獲得轉基因菸草(轉pARTigr菸草)的方法，得到空載體植物即轉pART27菸草和Tl代轉pART27菸草種子。二、轉基因菸草的檢測1、轉基因植株基因組DNA的PCR鑑定Tl代轉基因菸草(轉pARTigr菸草)種子分別在含卡鈉黴素的培養基上篩選後，移栽到蛭石中在培養間中生長6周，取菸草葉片，CTAB小量提取方法提取基因組DNA，用primerigrl引物對不同的轉基因菸草進行PCR檢觀ij，野生型對照菸草和轉pART27菸草的基因組DNA的PCR鑑定步驟同上，結果如圖6所示，野生型菸草植株屮以及轉pART27菸草不能擴增出任何條帶，而在轉pARTigr菸草中可見條帶專一的960bp左右的條帶。2、轉基因菸草GR酶總活測定分別取培養間中生長6周的轉pARTigr菸草幼苗葉片、野生型對照菸草幼苗葉片和轉pART27菸草幼苗葉片，液氮研磨，提取可溶性蛋白，按下述方法進行GR酶總活性的測定。實驗重複7次，結果如表l(wt為野生型對照；iT為轉pART27菸草株系；i2-i46為不同轉pARTigi"菸草株系)所示，在不同的轉pARTigr菸草中約30—70%的GR酶總活性被抑制。根據不同的GR酶總活性，本發明選擇轉pARTigr菸草植株i2(GR酶總活約為對照的70X)、i21、i28和i42(GR酶總活性約為對照的30%)，用於以後的試驗。GR酶總活性的測定法參照(Gonzdlez,A.，Steffen，K丄.andLynch,J.P.(1998)Lightandexcessmanganese:implicationsforoxidativestressincommonbean.P/y;wW.,118:493-504)的方法。反應體系中含有100mMK2HP04-KH2P04緩衝液，pH7.5;2.5mMEDTA;0.75mMDTNB(5,5'匿dithiobis(2-nitrobenzoicacid)二硫二硝基苯甲酸)；0.1mMNADPH;1mMGSSG;40嗎蛋白的酶液。反應總體積為1ml，用0.1mMNADPH啟動反應，反應在25。C下進行。生成的產物在412nm處有吸收峰。反應方程式如下NADPH+H++GSSG—NADPf+2GSH;GSH+DTNB—GSTNB+TNB;用sigma公司商用穀胱甘肽還原酶做標準曲線。酶活單位是unitmg.1protein;其中，一個酶活力單位U的定義在25。C、pH為7.5條件下，每分鐘內催化l)oM底物的酶量。表1不同轉基因菸草中GR酶總活性。括號內的數據為GR總活性的相對百分數，試驗數據為7個重複的平均值士SE。3、轉基因菸草的RT-PCR檢測用RT-PCR方法來檢測轉基因植株中GR酶的威NA轉錄水平。取溫室中生長一致的轉pARTlgr菸草幼苗葉片、轉pART27菸草幼苗葉片以及野生型對照菸草幼苗葉片，用Trizol方法提取總RNA，在甲醛瓊脂糖凝膠電泳上檢測其提取質量。如圖7A所示，不同菸草的總RNA在電泳圖片上表現出較銳利的條帶，沒有明顯的彌散，28S條帶亮0.032±0皿(100)0.033±0.002(100)0.022±0.003(68.8)0.014±0.002(43.8)0.024±0.001(75)0.028士0.002(87.5)0.029±0扁(90.6)O.Oll士O扁(34.4)0.019±0.001(59.4)0扁±0.004(62.5)0.019±0扁(59.3)0.018±0.002(56.3)0.010±0扁(31.3)0.018±0週(56.3)O.OIO土O.OOI(31.3)0.020±0.003(62.5)度約為18S的2倍，表明我們提取的RNA具有較好的完整性。在260nm測定RNA的濃度，然後取相同量的RNA(2ug)用作模板，以primerigrl為引物，進行RT-PCR，以肌動蛋白(actin)的mRNA水平作為內標。i21、i28和i42菸草葉片中GR酶的轉錄水平明顯低於對照菸草，i2中GR酶的轉錄處於中間水平，iT與野生型菸草無明顯差異(圖7B)。不同轉pARTigr菸草中GR酶的轉錄水平分別和它們的酶活具有相似的趨勢。4、轉基因菸草植株的Western檢測分別取不同轉pARTigr菸草葉片、轉pART27菸草葉片和野生型對照菸草葉片100mg，液氮中研磨後加入1.5ml含0.612M，0.07%巰基乙醇(體積百分比)的丙酮，繼續研磨至勻漿狀，一2(TC沉澱3h，4'C，8000g離心5min，用含0.07%(體積百分比)巰基乙醇的丙酮溶液洗3遍，沉澱乾燥後溶於2XSDS增溶液，上樣等蛋白量(15ug)，電泳，電泳結束後轉膜，封閉，與一抗(製備方法如下所示)、二抗結合(二抗購買於中杉金橋公司)，用PIERCE公司的SuperSignalWesternPicoTrialKit進行顯色，反應3-4min分鐘後用X光片曝光顯影。一抗的製備RT-PCR獲得菸草GR2基因的編碼序列(所用弓I物為upper:TCAAAGCTTGCTACATCTCTGAGCACACCA，lower:ACACTCGAGTCAAACTCCAGCTGCAGCTTT)。獲得的PCR產物經Hindlll-Xhol酶切，連接於經同樣雙酶切的pET28a(天根生物公司)，連接後的質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)(天根生物)。轉化後的BL21細胞震蕩培養至對數生長期後，加入0.4raMIPTG，震蕩培養5h後，收集菌體，用His柱方法純化回收目的蛋白(試劑盒購於Ncmigen)。從圖8的結果中可以看出，不同轉基因株系中GR酶的總蛋白含量具有明顯的差異，i21、i28、i42中可檢測到的GR蛋白總含量明顯低於對照菸草，i2植株中的可檢測到的GR蛋白總含量處於巾間水平(圖15)，iT與野生型菸草無明顯差異，表明不同轉基因菸草中GR酶被不同程度的抑制。不同轉基因菸草中GR蛋白總量分別與其酶活性，RNA含量的變化趨勢是一致的。5、低溫處理對轉基因菸草的影響1)低溫處理條件下不同轉基因菸草的生K:Tl代轉pARTigr菸草種子、轉pART27菸草種子和野生型對照菸草種子在MS培養基萌發1周後，轉到低溫培養箱(ll土rC，連續光照，光強40txmo1m2sec—')培養3周。檢測幼苗生長和葉綠素含量，實驗重複5次，結果如圖9所示，低溫下不同轉pARTigr菸草幼苗生長和葉綠素含量與對照相比均有明顯差異。低溫條件下轉pARTigr菸草的生長明顯受抑制。野牛型對照和iT菸草的每株鮮重無明顯差異，約為8.9mg左右，而每株i21，i28，i42菸草的鮮重為7.7mg左右，i2菸草的每株鮮重為8.3mg。低溫條件下轉pARTigr菸草的葉綠素含量明顯低於野生型菸草，i21，i28和i42的葉綠素含量(490-514Pgg—1FW)明顯低於對照菸草(62lPgg—1FW)。i2的葉綠素含量稍稍低於對照菸草。iT菸草的葉綠素含量與野生型對照之間無明顯差異。2)低溫處理條件下不同轉基因菸草光合作用的變化按照步驟l)的低溫條件進行低溫處理3周後的幼苗，用Flurocam螢光成像系統(PSI公司)測定不同菸草的光合作用的變化，結果如表2所示，轉pARTigr菸草的Fv/Fm和NPQ明顯低於野生型菸草，表明了轉pARTigr菸草與野生型對照的菸草相比，光合作用能力下降。tableseeoriginaldocumentpage113)低溫處理條件下不同轉基因菸草MDA和活性氧積累的變化收穫低溫處理3周後的菸草小苗用於測定活性氧HA和MDA的積累。結果表明(圖10)，低溫處理後，轉pARTigr菸草的MDA和HA的含量都明顯高於野生型對照菸草，其中i21，i28和i42菸草中MDA和HA的含量最高，i2菸草中次之。iT和wt菸草中兩者的含量最低，且兩者之間無明顯差異。表明低溫脅迫條件下，轉pARTigr菸草中大量積累的11202導致嚴重的膜脂過氧化，因而MDA大量積累，從而使轉pARTigr菸草受到更嚴重的光氧化脅迫傷害。4)低溫處理條件下不同轉基因菸草穀胱甘肽-抗壞血酸循環途徑的變化穀胱甘肽-抗壞血酸循環是植物中活性氧清除的重要途徑。收穫低溫處理3周後的菸草小苗用於測定轉pARTigr菸草抗壞血酸—穀胱甘肽循環中抗氧化酶的變化。圖11的結果表明，低溫處理後不同轉pARTigr菸草i2、i21、i28和i42中GR酶的活性都不冋程度的低於野生型對照菸草，iT和wt之間無明顯差異(圖IIA)，但是APX、MDHAR、DHAR的活性在轉基因菸草和野生型菸草之間無明顯差異(圖11B、C、D)。我們測定此抗氧化循環中的抗氧化物的結果表明(圖12)，低溫處理後，i2、m、i28和i42菸草中GSSG的含量明顯高於對照，且i21、i28和i42菸草中GSSG的含量最卨(圖12B)。GSH的含量在不同測定植株之間無明顯差異(圖12A)。低溫處理後i2、i21，i28和i42中GSH/GSSG的比率明顯低於對照菸草(圖12C)。低溫處理也會引起抗壞血酸的顯著變化。i2、i21、i28和i42菸草中ASC的含量均明顯低於對照菸草(圖12D)，但是DHA的含量在所有測定菸草中無明顯差異(圖12E)。DHA/ASC的變化也很明顯，i2、i21、i28和i42菸草中的DHA/ASC都明顯低於對照菸草中DHA/ASC的比率(圖12F)。在所有抗氧化系統的測定中，iT和wt之間都無明顯差異。以上這些結果表明低溫處理後，轉pARTigr菸草中GR酶活性的降低導致穀胱甘肽-抗壞血酸循環中穀胱甘肽庫和抗壞血酸庫的變化，從而影響活性氧仏02的清除，引起其大量積累。實施例2.過表達GR2酶一、過表達GR2酶轉基因菸草的獲得1、目的基因的克隆取菸草幼苗葉片約0.2g，用Trizol方法提取菸草RNA，進行反轉錄生成第一鏈DNA，根據Genbank中已知的菸草GR2基因序列(X76293，gi:431954)的自5'端第1-1675位的核苷酸序列設計引物，引物序列如下primergr:upper:5'ATCGCATGGGGCTACATCTCTGAGCACAC3，Ncollower:5，ATGGGTTACCTCAAACTCCAGCTGCAGCTT3'BstEII以上述priniergr為引物，以反轉錄產生的第一鏈DNA為模板進行PCR擴增，反應程序為94。C3min;94°C變性45s;，58°C45s;卜25個循環72°C延伸2min;」72°C延伸10min;PCR擴增獲得專一的目的條帶，約為1700bp左右的片段(如圖13)。回收PCR產物，連接於pGEM-TEasyvector(Promega公司)，生成pGEMgr，轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆，酶切鑑定正確後送博亞生物公司測序。測序結果表明目的片段的DNA序列與GeneBank為X76293(gi:431954)的自5'端第1-1675位的核苷酸序列一致。2、雙元轉化載體的構建將pCAMBIA1301(中科瑞泰生物公司)經Ncol、BstEII雙酶切，切下GUS片段，回收大片段。將測序正確的pGEMgr，經NcoI、BstEII雙酶切，回收1700bp左右的片段，將上述兩個片段連接，經NcoI、BstEII酶切鑑定正確的連接質粒(圖14)(命名為pCAMBIA1301gr)用於轉化根癌農桿菌。3、pCAMBIA1301gr的根癌農桿菌轉化按照實施例1中步驟一中的步驟2提供的方法，進行pCAMBIA1301gr的根癌農桿菌轉化，用primergr進行菌落PCR，檢測質粒轉化情況(圖15)。4、菸草的轉化按照實施例1中步驟一中的步驟3中提供的方法，進行菸草的轉化，在潮黴素抗性培養基上進行篩選，得到轉pCAMBIA1301gr菸草。按照獲得轉pCAMBIA1301gr菸草的方法，得到空載體植物即轉pCAMBIA1301菸草。二、轉pCAMBIA1301gr菸草的檢測1、轉pCAMBIA1301gr菸草植株基因組DNA的PCR鑑定。提取不同轉pCAMBIA1301gr菸草的基因組DNA，對pC細BIA1301質粒上的35S啟動子進行PCR檢測，所用引物為35Supper:GAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGA;35Slower:CCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGAACT。PCR結果如圖16所示，結果表明在eT和大部分轉pCAMBIA1301gr菸草中能得到專一的480bp左右的條帶，而wt中不能獲得此專一條帶。2、轉pCAMBIA1301gr菸草GR酶總活性的檢測經PCR檢測的轉基因菸草小苗在培養間中培養6周後，取葉片測定其GR酶的總活性。一個酶活力單位U的定義在25'C、pH為7.5條件下，每分鐘內催化1^M底物的酶量。測定結果如表3中所示，不同轉pCAMBIA1301gr菸草中GR酶的總活性約為菸草對照的2-5倍，其中的e6，e8中GR酶的總活性是野生型菸草對照的5倍左右，因此我們選取e6，e8用於以後的處理實驗。表3.不同轉pCAMBIA1301gr菸草中GR酶總活性。括號內的數據為GR總活性的相對百分數，試驗數據為7個重複的平均值iSE，0.032±0.002(100)0.03l士0皿(100)0.102±0.007(318)0.097士0.012(303)0.142±0.009(443)O扁士O.Oll(212)0.125±0.011(390)0.163±0扁(509)0.072±0.004(225)0.165土0.0丄5(516)tableseeoriginaldocumentpage14注wt為野生型對照菸草；el、e2等為不同轉pCAMBIA1301gr菸草株系；eT為轉化pCAMBIA1301質粒的轉基因菸草。3、MV處理對轉pCAMBIA1301gr菸草的影響甲基紫精(MV)能夠阻斷電子傳遞，從而將02還原生成02—，因此MV處理可以造成氧化脅迫。光下MV處理對植物葉片造成的光漂白傷害常常用來檢測不同植株的抗光氧化能力。本發明用MV處理轉pCAMBIA1301gr菸草的離體葉片，結果如圖所示(圖17)，MV處理後e6和e8的抗光氧化能力朋顯高於野生型菸草對照的抗光氧化能力。以上這些結果表明在菸草中過量表達其GR2酶基因，能夠明顯提髙轉基因菸草的抗光氧化能力。序列表<110〉中國科學院植物研究所<120〉GR2酶基因在培育抗光氧化脅迫轉基因植物中的應用<130〉CGGNAL92401<160〉3<210〉1<211〉968<212〉DNA〈213〉菸草屬菸草(Nicotianatabacumcv.)1ctcacccactcccgtagtaccccatcatcattatcctgtacccgccgccgtttcaccgcc60ccacgcgccgagtcctccaatggcgctgacgctcctcgccactacgactttgacttattc120accatcggtgctggtagcggtggtgttagggcttctcgttttgcgtctaattttggggct180tctgttgctgtttgtgagctccctttctccactatttcttctgattccactggtggcgtt240ggtggcacgtgtgtacttcgtggatgcgtacccaagaaattactcgtgtacgcgtcaaaa300tattctcatgagtttgaggaaagttgtggttttggatggaactatgatgtggaacctaga360tttgattggagcaccctcattgccaataaaaatgccgagttgcagcgcctcacgggtatt420tacaagaatattctgaagaatgctggtgtcactctgattgaagggagaggaaaggttgtg480geitcctcEitacggtggatgtggatggaaaactctactcggctaag犯catactgatttca540gttgggggacgcccatttatcccagacattcctggtagcgaatatgctatagattccgatGOOgctgcccttgatttgccaacgaagcctaacaaaattgccattgtcggaggcggttacatt660gcacttgaatttgctggaatcttcaatggcttgaaaagtgaggtccatgtttttataaga720caaaagaaggttttgagaggatttgatg肌gaaattagggattttgttggtgaacagatg780tcactgagaggaattgagttccatactgaggagtcgcctcaggctattgtaaagtcagcg840gatggctcactgtctttaaagactagcagaggaacagttgaaggtttctctcatatcatg900tttgcaacgggaa.gaagacctaatac朋agaatttaggattagagacagtgggagtgaaa960atgacaaa9682<211〉968<212〉腿<213〉菸草屬菸草(Nicotianatabac咖cv.)2aaacagtaaaagtgagggtgacagagattaggatttaagaaacateiatccagaagaaggg60caacgtttgtactatactctctttggaagttgacaaggagacgatcagaaatttctgtca120ctcggtaggcgactgaaatgttatcggactccgctgaggagtcataccttgagttaagga180gagtcactgtagacaagtggttgttttagggattaaagaagtagtttaggagagttttgg240aagaaaacagaata/tttttgtacctggagtgaaaagttcggtaacttctaaggtcgttta300agttcacgttacattggcgg8ggctgttaccgtt3犯3C33tccg犯gcaaccgtttagt360tcccgtcgtagccttagatatcgtataagcgatggtccttacagaccctatttacccgca420gggggttgactttagtcataca^gaatcggctcatctcaaaaggtaggtgtaggtggcat化0actcctaggtgttggaaaggagagggaagttagtctcactgtggtcgtaagaagtcttat540aagaacatttatgggcactccgcgacgttgagccgtaaaaataaccgttactcccacgag600gttagtttagatccaaggtgtagtatcaaggtaggttttggtgttgaaaggagtttgagt660actcttataaaactgcgcatgtgctcattaaagaacccatgcgtaggtgcttcatgtgtg720cacggtggttgcggtggtcaccttagtcttctttatcacctctttccctcgagtgtttgt780cgttgtcttcggggttttaatxtgcgttttgctcttcgggattgtggtggcgatggtcgt840ggctaccacttattcagtttcagcatcaccgctcctcgcagtcgcggtaacctcctgagc900cgcgcaccccgccactttgccgccgcccatgtcctattactactaccccatgatgccctc960acccactc9683<211〉745<212〉腿黃菊屬三脈黃菊(Flaveriatrinervia)〈400〉3tttcttttttccttttagtataaaatagttaagtgatgttaattagtatgsttataataaGOtatagttgtta_taa_ttgtgaaa肌at肌tttat肌atata^ttgtttacataaac肌cat3120gtaatgtaaaaaaatatgacaagtgatgtgtaagacgaagaagataaaagttgagagtaa18016gtatattatttttaatgaatttgatcgaacatgtaagatgatatactagcattaatattt240gttttaatcataatagtaattctagctggtttgatgaatta犯tatcaatgataaaatac300tatagtaaaaataagaataaataaattaaaataatatttttttatgattaatagtttatt360atataattaaatatxtataccattactaaatattttagttteieLaagttaataaatatttt420gttagaaattccaatctgcttgtaatttatcaataaacaaaMattaaataacaagctaa480agtaacaaataatatcaaactaatag肌acagtaatctaatgtaacaa^acataatctaa540tgctaatataacaaagcgcaagatctatcattttatatagtattattttcaatcaacatt600cttattaatttctaaataatacttgtagttttattaacttctaaatggattgactattaa660ttaaatg3attagtcg肌catgaata犯caaggt3ac3tgatagatcatgtcattgtgtt720atcattgatcttacatttggattga74權利要求1、一種培育抗光氧化脅迫轉基因植物的方法，是將GR2酶基因導入植物中，得到的抗光氧化脅迫植物，所述GR2酶基因序列是Genbank號為X76293(gi431954)的自5′端第1-1675位的核苷酸序列。2、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述植物為菸草。3、根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述GR2酶基因通過表達載體導入植物中，所述表達載體是將GR2酶基因插入pCAMBIA1301的多克隆位點，得到的重組載體。4、一個DNA片段，由基因片段A、B和C依次連接組成；所述基因片段A的核苷酸序列為序列表中的序列l，所述基因片段C的核苷酸序列為序列表中的序列2;所述基因片段B是內含子。5、根據權利要求4所述的片段，其特徵在於所述內含子的核苷酸序列是序列表中序列3。6、含有權利要求4或5所述的DNA片段的重組載體。7、根據權利要求6所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為權利要求3或4所述的DNA片段插入pART27的多克隆位點，得到的重組載體。8、含有權利要求4或5所述的DNA片段的轉基因細胞系或重組菌。9、一種DNA分子，其核苷酸序列是序列表中的序列1或序列2。10、權利要求3或4所述的DNA片段或權利要求6或7所述的重組載體在培育光氧化脅迫敏感型轉基因植物中的應用。全文摘要本發明公開了一種GR2酶基因在培育抗光氧化脅迫轉基因植物中的應用。本發明提供的GR2酶基因可以用來培育抗光氧化脅迫轉基因植物，所述GR2酶基因序列是Genbank號為X76293(gi431954)的自5′端第1-1675位的核苷酸序列。本發明另一目的在於提供一個DNA片段，由基因片段A、B和C依次連接組成；所述基因片段A的核苷酸序列為序列表中的序列1(名稱為igr1)，所述基因片段C的核苷酸序列為序列表中的序列2(名稱為igr2)；所述基因片段B是內含子。本發明將GR2酶過表達，使得轉基因菸草對光氧化脅迫的抗性大大降低。文檔編號C12N15/63GK101597621SQ20091008829公開日2009年12月9日申請日期2009年7月13日優先權日2009年7月13日發明者丁順華,盧從明,盧慶陶,楊志攀,楊輝霞,溫曉剛申請人:中國科學院植物研究所