一株類腸膜魏斯氏菌MbWp-171及其產品與應用
2024-04-15 15:15:05 1
171。
11.類腸膜魏斯氏菌主要來源於果酒、泡菜等植物，主要用於植物性產品發酵，在本發明實施例中，其分離得到的類腸膜魏斯氏菌具有良好的產酸能力，因而也具有較好的抑菌特性，能夠抑制病原菌，促進宿主生長發育，從而在抗生素替代物方面具有一定的潛在應用價值。
12.在發明實施例中，發明人所分離得到的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171具有如下生物學特性：革蘭氏陽性菌，無鞭毛、不運動，不形成芽孢，兼性厭氧；菌體形狀菌體呈不規則短杆狀，兩端呈圓形或稍細小，成對或短鏈排列，其菌落光滑且邊緣完整，呈乳白色。最適生長溫度為36.5-37.5℃；最適ph值為5.7～7.0。
13.根據本發明的第一個方面，在本發明的一些實施方式中，所述類腸膜魏斯氏菌的16srrna基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
14.在發明實施例中，發明人通過對類腸膜魏斯氏菌mbwp-171進行系統發育樹構建，發現其與現有技術中發現的類腸膜魏斯氏菌存在一定的同源性差異。
15.本發明的第二個方面，提供一種含有本發明第一個方面所述類腸膜魏斯氏菌的產品，所述產品的劑型包括固體粉劑、液體菌劑、顆粒接種菌劑、冷凍菌泥液、瓊脂載體菌劑。
16.當然，本領域技術人員也可以根據實際使用需求，合理調整其劑型選擇，使其獲得更高的貯藏存活率或使用效果。
17.根據本發明的第二個方面，在本發明的一些實施方式中，所述產品為類腸膜魏斯氏菌包埋凍乾粉。
18.在本發明實施例中，發明人通過採用凍乾粉的方式，有效的提高了其貯藏存活率，其相比於正常貯藏，有效活菌數提高了近10000倍。在本發明實施例中，該類腸膜魏斯氏菌包埋凍乾粉活菌數大於1000億cfu/g，經25℃貯藏6個月活菌存活率為60％以上。而且，本發明實施例中的製備方法是在非嚴格厭氧環境下進行包埋凍幹處理，在凍幹處理前分步驟使用多種價格低廉且容易獲得的抗氧化成分對類腸膜魏斯氏菌進行微膠囊化包埋處理，有效防止氧氣與類腸膜魏斯氏菌細胞膜系統的相互作用，從而阻止損害dna合成的行為，並且能夠清除在菌株凍幹前產生的自由基，從而預防乾燥過程中的氧化損傷，並使類腸膜魏斯氏菌在常溫貯藏條件下不易失活。
19.上述方法不僅限於對本發明中的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171進行凍幹，還適用於對其它兼性厭氧菌的凍幹處理，以獲得相同或者相似的效果。
20.在本發明的一些實施方式中，所述類腸膜魏斯氏菌包埋凍乾粉的製備原料包括本發明第一個方面所述的類腸膜魏斯氏菌、海藻酸鈉、碳酸鈣、乳粉、大豆油、醋酸鹽和輔劑。
21.當然，本領域技術人員可以根據實際使用需求，合理添加其他用於包埋或提高包埋效果的材料，包括但不限於海藻酸鈉、碳酸鈣、乳粉、大豆油。
22.在本發明的一些實施方式中，所述大豆油中添加有冰乙酸或吐溫。
23.在本發明的一些實施方式中，所述大豆油為含0.3～0.7％(v/v)冰乙酸的大豆油。
24.在本發明的一些實施方式中，所述大豆油為含0.5％(v/v)冰乙酸的大豆油。
25.在本發明的一些實施方式中，所述大豆油為含1～2％(v/v)吐溫的大豆油。
26.在本發明的一些實施方式中，所述大豆油為含1.5％(v/v)吐溫的大豆油。
27.在本發明的一些實施方式中，所述海藻酸鈉、碳酸鈣、乳粉均為其與水配置而成的
水溶液。
28.在本發明的一些實施方式中，海藻酸鈉水溶液、碳酸鈣水溶液、類腸膜魏斯氏菌菌液、醋酸鹽水溶液、乳粉水溶液、含冰乙酸的大豆油的質量比為10～15：3～6：1～4：200～230：350～370：390～420。
29.在本發明的一些實施方式中，海藻酸鈉水溶液、碳酸鈣水溶液、類腸膜魏斯氏菌菌液、醋酸鹽水溶液、乳粉水溶液、含冰乙酸的大豆油的質量比為13：5：3：214：366：400。
30.在本發明的一些實施方式中，所述類腸膜魏斯氏菌菌液中活菌數為2000～3000億cfu/g。
31.在本發明的一些實施方式中，所述類腸膜魏斯氏菌菌液中活菌數為2500億cfu/g。
32.在本發明的一些實施方式中，所述海藻酸鈉水溶液的質量濃度為3～8wt％。
33.在本發明的一些實施方式中，所述海藻酸鈉水溶液的質量濃度為5wt％。
34.在本發明的一些實施方式中，所述碳酸鈣水溶液的質量濃度為(45～55)wt％。
35.在本發明的一些實施方式中，所述碳酸鈣水溶液的質量濃度為50wt％。
36.在本發明的一些實施方式中，所述醋酸鹽水溶液的質量濃度為(40～60)wt％。
37.在本發明的一些實施方式中，所述醋酸鹽水溶液的質量濃度為50wt％。
38.在本發明的一些實施方式中，所述醋酸鹽為醋酸鈉。
39.在本發明的一些實施方式中，所述乳粉為脫脂乳粉，所述脫脂乳粉水溶液的質量濃度為(10～20)wt％。
40.在本發明的一些實施方式中，所述脫脂乳粉水溶液的質量濃度為15wt％。
41.在本發明的一些實施方式中，所述輔劑包括乳化劑、ph調節劑、凍幹保護劑、載體、溶劑。
42.當然，本領域技術人員可以根據實際使用需求，合理添加其他輔劑，包括但不限於乳化劑、ph調節劑、凍幹保護劑、載體、溶劑。
43.在本發明的一些實施方式中，所述類腸膜魏斯氏菌包埋凍乾粉的活化方法為：向類腸膜魏斯氏菌包埋凍乾粉中加入0.3～0.5ml的復甦溶解液，然後將溶液轉接至1～2個mrs瓊脂平板和mrs液體培養基中，36.5-37.5℃復甦培養24-72h，鑑定無誤後確認其純度再繼續進行傳代培養。
44.在本發明的一些實施方式中，所述復甦溶解液為mrs液體培養基。
45.在本發明的一些實施方式中，所述mrs液體培養基組分為：按質量份計，酪蛋白酶消化物10份，牛肉膏10份，酵母膏粉4份，磷酸氫二鉀2份，檸檬酸三銨2份，乙酸鈉5份，硫酸鎂(mgso4·
7h2o)0.2份，硫酸錳(mnso4·
4h2o)0.05份，磷酸氫二鉀2份，葡萄糖20份，吐溫80 1份，水1000份，ph值為7.0
±
0.2。
46.使用本發明實施例中的類腸膜魏斯氏菌包埋凍乾粉在製備食品、飼料及醫藥保健產品過程中，其在常溫貯藏過程中不易失活，貨架期內能夠有效保證活菌數，從而保證食品、飼料及醫藥保健產品等產品的功效。
47.本發明的第三個方面，提供一種類腸膜魏斯氏菌包埋凍乾粉的製備方法，包括如下步驟：
48.取本發明第一個方面所述的類腸膜魏斯氏菌，加入海藻酸鈉、碳酸鈣和部分大豆油，充分乳化後再加入乳粉、剩餘大豆油和醋酸鹽，離心，除去上清後冷凍乾燥即得。
49.在本發明的一些實施方式中，所述製備方法具體為：
50.在厭氧環境下，取本發明第一個方面所述的類腸膜魏斯氏菌，加入提前滅菌處理的海藻酸鈉溶液與碳酸鈣溶液，然後再加入一部分大豆油(所述大豆油中添加有乳化劑)，充分攪拌乳化。在非嚴格厭氧環境中，向乳化後的溶液中加入脫脂乳粉和剩餘的大豆油(所述大豆油中添加有ph調節劑)，充分攪拌混勻。再加入醋酸鹽，靜置2～2.5h，離心，除去上清得到類腸膜魏斯氏菌包埋微膠囊，冷凍乾燥得到凍乾粉。
51.在本發明的一些優選實施方式中，所述乳化劑為吐溫。
52.在本發明的一些實施方式中，第一次加入的大豆油為含1～2％(v/v)吐溫的大豆油。
53.在本發明的一些實施方式中，第一次加入的大豆油為含1.5％(v/v)吐溫的大豆油。
54.在本發明的一些優選實施方式中，所述ph調節劑為冰乙酸。
55.在本發明的一些實施方式中，第2次加入的大豆油為含0.3～0.7％(v/v)冰乙酸的大豆油。
56.在本發明的一些實施方式中，第2次加入的大豆油為含0.5％(v/v)冰乙酸的大豆油。
57.當然，本領域技術人員也可以根據實際使用需求合理選擇其他乳化劑和ph調節劑，包括但不限於吐溫80和冰乙酸。
58.在本發明的一些優選實施方式中，所述製備方法還包括對類腸膜魏斯氏菌包埋微膠囊進行洗滌，洗滌液為生理鹽水，洗滌次數為2～3次。
59.在本發明的一些實施方式中，海藻酸鈉水溶液、碳酸鈣水溶液、類腸膜魏斯氏菌菌液、醋酸鹽水溶液、乳粉水溶液、含冰乙酸的大豆油的質量比為10～15：3～6：1～4：200～230：350～370：390～420。
60.在本發明的一些實施方式中，海藻酸鈉水溶液、碳酸鈣水溶液、類腸膜魏斯氏菌菌液、醋酸鹽水溶液、乳粉水溶液、含冰乙酸的大豆油的質量比為13：5：3：214：366：400。
61.在本發明的一些實施方式中，所述類腸膜魏斯氏菌菌液中活菌數為2000～3000億cfu/g。
62.在本發明的一些實施方式中，所述類腸膜魏斯氏菌菌液中活菌數為2500億cfu/g。
63.在本發明的一些實施方式中，所述海藻酸鈉水溶液的質量濃度為3～8wt％。
64.在本發明的一些實施方式中，所述海藻酸鈉水溶液的質量濃度為5wt％。
65.在本發明的一些實施方式中，所述碳酸鈣水溶液的質量濃度為(45～55)wt％。
66.在本發明的一些實施方式中，所述碳酸鈣水溶液的質量濃度為50wt％。
67.在本發明的一些實施方式中，所述醋酸鹽水溶液的質量濃度為(40～60)wt％。
68.在本發明的一些實施方式中，所述醋酸鹽水溶液的質量濃度為50wt％。
69.在本發明的一些實施方式中，所述醋酸鹽為醋酸鈉。
70.在本發明的一些實施方式中，所述乳粉為脫脂乳粉，所述脫脂乳粉水溶液的質量濃度為(10～20)wt％。
71.在本發明的一些實施方式中，所述脫脂乳粉水溶液的質量濃度為15wt％。
72.本發明的第四個方面，提供本發明第一個方面所述的類腸膜魏斯氏菌在製備改善
或治療炎症的藥物中的應用。
73.在本發明的一些實施方式中，所述炎症包括結腸炎。
74.在本發明實施例中，發明人通過結腸炎小鼠模型驗證了本發明第一個方面所述的類腸膜魏斯氏菌能夠顯著改善或治療結腸炎，從而說明類腸膜魏斯氏菌mbwp-171具有炎症改善或治療功能。
75.本發明的第五個方面，提供本發明第一個方面所述的類腸膜魏斯氏菌在製備發酵產品中的應用。
76.根據本發明的第五個方面，在本發明的一些實施方式中，所述產品包括藥物、食品、飼料、飼料添加劑和化妝品。
77.在本發明的一些實施方式中，所述食品包括酸奶、奶酪、發酵酒、發酵蔬菜或其他發酵食品。
78.本發明的有益效果是：
79.1.本發明提供了一種類腸膜魏斯氏菌，其命名為類腸膜魏斯氏菌mbwp-171，該類腸膜魏斯氏菌具有良好的產酸能力和抗膽鹽效果，因而也具有較好的抑菌特性，能夠抑制病原菌，促進宿主生長發育，具有極為廣泛的應用價值。而且，通過試驗驗證，還發現了該類腸膜魏斯氏菌具有炎症治療效果，而且在食品發酵中也具有較好的應用效果。
80.2.本發明還提供了一種含有上述類腸膜魏斯氏菌mbwp-171的凍乾粉產品及其製備方法，該方法工藝簡單，原材料成本低廉，能夠極大的提高類腸膜魏斯氏菌的貯藏存活率，從而為類腸膜魏斯氏菌產品的再開發和利用提供了有效的技術支持。
附圖說明
81.圖1為類腸膜魏斯氏菌mbwp-171的革蘭氏染色顯微鏡觀察圖。
82.圖2為類腸膜魏斯氏菌mbwp-171的系統發育樹。
83.圖3為類腸膜魏斯氏菌mbwp-171的生長曲線圖，橫坐標為時間(h)。
84.圖4為本發明實施例中的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉的貯藏穩定性結果圖。
85.圖5為本發明實施例中的各組小鼠疾病活動指數dai評分圖。
86.圖6為本發明實施例中的各組小鼠血清中ifn、il-6、il-10、il-1β、lps水平的檢測結果。
87.圖7為本發明實施例中的各組小鼠血清中no、mpo以及gsh-px水平的檢測結果。
88.圖8為本發明實施例中的各組小鼠小腸病理切片圖。
89.圖9為本發明實施例中的各組小鼠結腸長度對比圖。
90.圖10為本發明實施例中的dss+mbwp-171活菌(l171)的液相色譜圖。
91.圖11為類腸膜魏斯氏菌mbwp-171發酵流變學特性變化圖。
92.圖12為類腸膜魏斯氏菌mbwp-171在不同溫度條件下的對比圖。
93.圖13為類腸膜魏斯氏菌mbwp-171隨發酵時間的產酸變化圖，橫坐標為時間(min)。
具體實施方式
94.為了使本發明的發明目的、技術方案及其技術效果更加清晰，以下結合具體實施方式，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解的是，本說明書中描述的具體實施方式僅僅
是為了解釋本發明，並非為了限定本發明。
95.所使用的實驗材料和試劑，若無特別說明，均為常規可從商業途徑所獲得的耗材和試劑。
96.類腸膜魏斯氏菌mbwp-171的獲得
97.本發明實施例中的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171(weissella paramesenteroides mbwp-171)是發明人從嶺南桑果園自然發酵6～18個月的桑葚果酒(購自廣州永和鎮創鮮果桑採摘園)中分離得到的具有耐酸和耐膽汁酸功能的益生菌。該菌株已於2022年2月11日在廣東省微生物菌種保藏中心(保藏地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓)進行保藏，保藏編號為gdmcc no:62250。其分類命名為weissella paramesenteroides。
98.在本發明實施例中，發明人所分離得到的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171具有如下生物學特性：革蘭氏陽性菌(革蘭氏染色結果如圖1所示)，無鞭毛、不運動，不形成芽孢，兼性厭氧；菌體形狀菌體呈不規則短杆狀，兩端呈圓形或稍細小，成對或短鏈排列，其菌落光滑且邊緣完整，呈乳白色。最適生長溫度為36.5-37.5℃；最適ph值為5.7～7.0。
99.採用16s rrna sanger雙脫氧測序對上述類腸膜魏斯氏菌mbwp-171進行鑑定(交由廣州藍光生物技術有限公司完成)，其序列為：
[0100]5』‑
ctcaggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgaacgctttgtctttaattgatctgacgagcttgctctgatgtgattttatctgacaaagagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtaacctacctcttagcaggggataacatttggaaacaagtgctaataccgtataataccaacaaccgcatggttgttggttgaaagatggttctgctatcactaagagatggacccgcggtgcattagctagttggtaaggtaatggcttaccaaggcaatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacaatgggactgagacacggcccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgcaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaagggtttcggctcgtaaaacactgttataagagaagaacggcactgagagtaactgttcagtgtgtgacggtatcttaccagaaaggaacggctaaatacgtgccagcagccgcggtaatacgtatgttccaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcagacggttatttaagtctgaagtgaaagccctcagctcaactgaggaatggctttggaaactggatgacttgagtgcagtagaggaaagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctttctggactgtaactgacgttgaggctcgaaagtgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacaccgtaaacgatgagtgctagatgttcgagggtttccgcccttgagtgtcgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccttgctaatcctagaaataggacgttcccttcggggacaaggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattattagttgccagcattcagttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggcatatacaacgagtcgccaacccgcgagggtgcgctaatctcttaaagtatgtctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagc-3』(seq id no：1)。
[0101]
構建類腸膜魏斯氏菌mbwp-171的系統發育樹，結果如圖2所示。
[0102]
類腸膜魏斯氏菌mbwp-171的生長曲線以及相關理化性質如圖3和表1所示。
[0103]
其中，理化性質測試包括糖發酵試驗、牛奶腖化效果測試、最適宜碳源測試、產乳酸檢測、抗膽鹽測試(使用含有不同含量的膽鹽的mrs培養基進行培養)、觸酶試驗。
[0104]
其中，糖發酵試驗、牛奶腖化效果測試和觸酶試驗方法參考《益生菌》(《乳業科學與技術叢書》編委會，乳業生物技術國家重點實驗室編.乳業科學與技術叢書益生菌.北京：化學工業出版社,2016.01.)。最適宜碳源測試方法參考文獻(趙國聲,韓浩.蛹蟲草菌絲液體培養基中適宜碳源和氮源的研究[j].河北農業科學,2011,15(08):39-41.)；產乳酸檢測方法參考(吳錦蘭,付玉麟,周小玲,陳正培,熊建文,崔娜,鞏僖.酸筍中高產乳酸乳酸菌的篩選、鑑定及發酵條件優化[j].中國釀造,2021,40(01):65-69.)。
[0105]
表1類腸膜魏斯氏菌mbwp-171的理化性質
[0106][0107]
實施例1類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉
[0108]
(1)類腸膜魏斯氏菌mbwp-171菌泥的製備：
[0109]
取上述實施例中分離獲得的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171，使用mrs液體培養基(購於廣東環凱微生物)37℃厭氧培養24小時，傳代培養2次得到種子液。取適量種子液接種至發酵培養基中37℃恆溫厭氧發酵，得到類腸膜魏斯氏菌mbwp-171高密度培養液(測得培養液中類腸膜魏斯氏菌mbwp-171活菌數為10億cfu/ml)。5000rpm離心15min，去除上清，得到類腸膜魏斯氏菌mbwp-171菌泥(測得菌泥中類腸膜魏斯氏菌mbwp-171活菌數為2500億cfu/g)。
[0110]
其中，上述發酵培養基的組分為：按質量份計，酪蛋白酶消化物10份(購自廣東環凱微生物)，牛肉膏10份，酵母膏粉4份，磷酸氫二鉀2份，檸檬酸三銨2份，乙酸鈉5份，硫酸鎂(mgso4·
7h2o)0.2份，硫酸錳(mnso4·
4h2o)0.05份，磷酸氫二鉀2份，葡萄糖20份，吐溫80 1份，水1000份，ph值為7.0。
[0111]
(2)微膠囊包埋：
[0112]
在本實施例中，按照下述方法先製備包埋預製液，具體包括：
[0113]
包埋預製液1:將0.02kg海藻酸鈉加水配製成5％的水溶液，經115℃滅菌15min，即得；
[0114]
包埋預製液2:將0.07kg碳酸鈣加水配製成50％溶液，經115℃滅菌15min，即得；
[0115]
包埋預製液3:將0.05kg醋酸鹽(在本實施例中，醋酸鹽為醋酸鈉)加水配製成50％溶液，經115℃滅菌15min，即得；
[0116]
包埋預製液4:將1kg脫脂乳粉加水配製成15％溶液，經115℃滅菌7min，即得；
[0117]
包埋預製液5:將含有0.5％(v/v)冰乙酸的大豆油經115℃滅菌7min，即得。
[0118]
在厭氧環境中，向步驟(1)中獲得的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171菌泥中加入包埋預製液1和2(即5wt％海藻酸鈉溶液與50wt％碳酸鈣溶液)混合均勻後再加入40ml含有600μl吐溫80的大豆油，4℃條件下400r/min攪拌15min，充分乳化混合。在非嚴格厭氧環境中，向
混合液中繼續加入10ml包埋預製液4(即15wt％脫脂乳粉溶液)和10ml包埋預製液5(即含0.5％冰乙酸的大豆油)，4℃條件下400r/min攪拌30min。攪拌完成後加入60ml ph為5.5的包埋預製液3(即50wt％醋酸鹽溶液)，放置2h。4000rpm離心10min，得到類腸膜魏斯氏菌mbwp-171微膠囊。
[0119]
(3)類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉的製備：
[0120]
用生理鹽水洗滌3次上述類腸膜魏斯氏菌mbwp-171微膠囊，液氮速凍至-50℃，真空乾燥(真空度≤30pa)35h後得到類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉。
[0121]
實施例2類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉
[0122]
步驟同實施例1，區別在於，在步驟(2)中，15wt％脫脂乳粉溶液的加入量為20ml，含0.5％冰乙酸的大豆油的加入量為20ml。
[0123]
類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉的效果測試
[0124]
取上述實施例1中的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉，使用本領域常規的活菌數檢測方法對25℃貯藏6個月(180天)後的活菌數進行測定，計算其活菌存活率。以不進行包埋的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉作為對照。
[0125]
結果如圖4所示。
[0126]
可以發現，未經過包被處理的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉在經過25℃貯藏6個月後，其活菌數為10億cfu/g左右，相比貯藏前，存活率僅為0.06％。而實施例1中的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉在經過25℃貯藏6個月後，其活菌數為1000億cfu/g左右，相比貯藏前，存活率為60％。由上述結果可知，上述方法製備得到的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉，通過採用微膠囊包埋處理，有效減少了菌體對外界不良環境的脅迫作用，減少細胞損傷，提高了類腸膜魏斯氏菌mbwp-171的貯藏穩定性，避免了其在常溫貯藏過程中易失活，貨架期內無法有效保證活菌數，影響其功效的弊端，可以廣泛應用於食品、飼料及醫藥產品中，穩定產品品質和發揮其健康功效。
[0127]
實施例2中的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉的測試效果同實施例1。
[0128]
類腸膜魏斯氏菌mbwp-171對急性結腸炎的改善和治療作用
[0129]
在本發明實施例中，發明人採用動物試驗的方式驗證上述類腸膜魏斯氏菌mbwp-171在改善和治療急性結腸炎中的作用。
[0130]
在本實施例中，所用的受試動物為48隻spf級c57bl/6j小鼠(體重為19～21g)，購於廣東維通利華實驗動物技術有限公司，將所有實驗小鼠置於佛山科學技術學院食品科學與工程學院實驗動物中心的無菌spf實驗室進行為期3天的安全檢查，48隻c57bl/6j小鼠通過自由飲水進食適應環境7天後根據體重分為空白組、dss造模組、陽性藥組，mbwp-171活菌組、mbwp-171死菌組、mbwp-171益生元組以上6組，每組八隻，每組分為兩籠，每籠4隻，同時在對小鼠進行分組的時候打耳標進行標記，以及在籠子上做好標記。在此期間，小鼠被給予充足的水和飼料，控制spf實驗室的溫度恆定在23～171℃，相對溼度為40～50％，按照12h光照和12h黑暗的照明周期為控制自動切換系統，室內光照強度控制在15～20勒克斯。
[0131]
具體試驗步驟為：
[0132]
取試驗小鼠在23～25℃和12h光照/黑暗的周期下熟悉正常飲食，進行7天的適應。然後將dss造模組、陽性藥組，活菌組、死菌組、益生元組5個組別的40隻c57bl/6j小鼠自由飲用4％ dss溶液並同時作出如下處理，以構建急性結腸炎(uc)模型。分別在第1、3、5天換
水三次。所有組的飼料不加限制，可自由食用。在實驗7天期間，均為每天對所有組中的小鼠進行稱重、灌胃和觀察，收集並觀察小鼠糞便，第8天處死小鼠，對所有小鼠實施安樂死。
[0133]
各組具體處理情況為：
[0134]
(1)空白組(ck)：不飲用4％ dss溶液，自由飲用蒸餾水，每日灌胃生理鹽水；
[0135]
(2)dss造模組(dss)：自由飲用4％ dss溶液，每日灌胃生理鹽水；
[0136]
(3)陽性藥組(sasp)：自由飲用4％ dss溶液，每天灌胃0.171g/l的柳氮磺吡啶水溶液，灌胃量為0.2ml/10g小鼠體重。
[0137]
(4)mbwp-171活菌組(l171)：自由飲用4％ dss溶液，每天灌胃1
×
108cfu/ml mbwp-171活菌菌液，灌胃量為0.2ml/10g小鼠體重。；
[0138]
(5)mbwp-171死菌組(d171)：自由飲用4％ dss溶液，每天灌胃1
×
108cfu/ml mbwp-171死菌菌液(復水後65℃保溫10min)，灌胃量為0.2ml/10g小鼠體重。
[0139]
(6)mbwp-171益生元組(p171)：自由飲用4％ dss溶液，每天灌胃0.2ml/10g小鼠體重的mbwp-171培養液代謝物溶液。
[0140]
其中，類腸膜魏斯氏菌mbwp-171菌液為：取上述實施例1中製備得到的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉用無菌生理鹽水配製成1
×
108cfu/ml的菌懸液。mbwp-171培養液代謝物溶液的製備方法為：將mbwp-171活菌液離心，過濾去除菌泥後得到的濾液。
[0141]
期間，每日對各組試驗小鼠的生理狀態進行觀察，包括其毛髮光亮、毛髮粗糙程度、糞便粘稠度、腹瀉與便血情況、對刺激的反應、震顫、痙攣、沉睡臥倒情況，每日定期收集小鼠糞便並稱量體重。
[0142]
其中，使用糞便隱血試劑盒，對小鼠的血便、大便稠度和體重減輕進行記錄。疾病活躍指數(disease activity index，dai)評分是體重降低百分比例、代表腹瀉情況的糞便粘稠程度和糞便潛血三個指標的加總，評分標準詳情如下表2所示。
[0143]
表2dai評分標準
[0144]
評分體重下降百分比糞便粘稠度糞便潛血00正常陰性11～5％軟便淺藍25～10％粘液樣便藍色310～20％稀液狀便深藍4》20％ 肉眼血便
[0145]
將收集的各組小鼠的體重下降百分比、糞便粘稠度和糞便潛血三項評價得分綜合起來進行疾病活動評分，結果如圖5所示。
[0146]
將體重下降百分比例、糞便粘稠程度和糞便潛血三項評價得分綜合起來進行疾病活動評分，結果如圖5顯示，其中dss組出現明顯的體重下降，且表現出液化糞便和肉眼可見的便血症狀，表明dss造模結腸炎成功。與dss模型組相比，mbwp-171對正常小鼠無顯著影響，且可以顯著緩解dss小鼠體重減輕、液化糞便以及便血等症狀，同時下調dai評分。
[0147]
對實驗小鼠麻醉後進行眼球取血，得到的血漿在4℃條件下3 000rpm離心5min，吸取上清，分裝保存於-20℃，備用。使用elisa試劑盒測定血清中的ifn、il-6、il-10、il-1β、lps、no、mpo以及gsh-px水平。
[0148]
結果如圖6和圖7所示。
[0149]
與dss組相比，灌胃l171、d171、p171以及柳氮磺吡啶組的小鼠血清均有不同程度降低促炎性細胞因子水平、提高抗炎性細胞因子水平的作用。灌胃l171的整體效果優於d171，d171優於p171，而柳氮磺吡啶的效果較差。l171、d171、p171的效果較柳氮磺吡啶組更為顯著。
[0150]
ifn-γ被認為是一種促炎性細胞因子，因為它能增強tnf的活性並誘導一氧化氮(no)；il-1β是一種有效促炎細胞因子，主要由淋巴細胞、巨噬細胞以及單核細胞分泌產生。當有病毒感染或者發生炎症後，模式識別受體(prr)和toll樣受體(tlr)表達增多導致il-1β表達增強。il-6是一種多效性促炎細胞因子，不僅影響免疫系統，還在其他系統和生理機制中發揮作用，如調節細胞生長，以及細胞活化、增殖、存活和分化；白細胞介素10(il-10)，也被稱為人類細胞因子合成抑制因子(csif)，是一種抗炎細胞因子；脂多糖(lps)是免疫細胞(包括b細胞，單核細胞，巨噬細胞和其他lps反應性細胞)的強活化劑，這些免疫細胞需要lps等免疫原性刺激物，才能產生細胞因子。
[0151]
與dss組相比，灌胃l171、d171、p171以及柳氮磺吡啶在降低ifn-γ的水平效果顯著，但在降低il-1β和il-6水平上的效果顯著性較低，l171的攝入在促進il-1β、il-6和lps兩種細胞因子和免疫反應標誌物的調節中都發揮了極為顯著的效果；d171的攝入在促進ifn-γ、il-1β、il-6和il-10四種細胞因子的調節中發揮了顯著的效果；p171的攝入在促進ifn-γ、il-1β和il-10三種細胞因子和免疫反應標誌物的調節中都發揮了顯著的效果；柳氮磺吡啶則只在il-6和il-10兩種細胞因子和免疫反應標誌物的調節中發揮了較為顯著的效果。
[0152]
將結腸從小鼠器官中分離，用鋼尺對其進行測量，記錄結腸長度，同時拍照記錄。小鼠結腸處理乾淨後，剪下距肛門1-2cm處的結腸1cm左右收集到1.5ml ep管中，同時注入1ml多聚甲醛溶液固定，做好標記，備用。取實驗小鼠小腸組織製作小腸組織切片並進行he染色。
[0153]
一氧化氮(no)是一種反應性自由基，在神經傳遞、免疫反應、細胞凋亡等重要生理功能中發揮重要作用，體內no水平和信號失調常發生於某些疾病狀態，濃度水平合適的no對於保護肝臟等器官缺血性損傷很重要，長期高濃度no可能引發多種癌症、炎症，包括青少年糖尿病、多發性硬化、關節炎、潰瘍性結腸炎。mpo是中性粒細胞的功能標誌和激活標誌，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細胞(pmn)的功能和活性狀態。穀胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，gsh-px)是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。gsh-px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映機體硒水平。與dss組相比，灌胃l171、d171和p171在調節no、mpo以及gsh-px的水平效果顯著，柳氮磺吡啶則不具有顯著性。
[0154]
結果如圖8和圖9所示。
[0155]
根據對各組小鼠進行組織學分析評分，並結合小鼠小腸病理切片結果(圖8)和各組結腸長度對比圖(圖9)，可以發現，相比ck組，dss組出現顯著的結腸炎病理特徵，說明結腸炎造模無誤。而相比ck組，l171組並未出現顯著變化，其組織形態良好，未出現炎症浸潤等現象，說明類腸膜魏斯氏菌mbwp-171並不會引發炎症等相關問題。而相比於dss組，l171組的炎症浸潤情況顯著緩解，說明類腸膜魏斯氏菌mbwp-171顯著緩解了dss引起的腸道損傷。且使用類腸膜魏斯氏菌mbwp-171及其代謝物餵養的小鼠結腸長度最佳，從而證明了類腸膜魏斯氏菌mbwp-171可以緩解因dss引起的腸道損傷，具有改善或治療結腸炎的作用。
[0156]
採用液相色譜法(liquid chromatography，lc)測定糞便中短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸和異戊酸)的濃度。
[0157]
結果如圖10(l171組小鼠糞便短鏈脂肪酸液相色譜圖)所示。
[0158]
與dss模型組相比，mbwp-171可以顯著提高糞便短鏈脂肪酸的水平，有利於腸道健康。
[0159]
類腸膜魏斯氏菌mbwp-171發酵效果測試
[0160]
發明人為了進一步探究其在食品發酵領域的可行性，取上述實施例1中製備得到的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171凍乾粉用無菌生理鹽水配製成1
×
108cfu/ml的菌懸液，然後加入10wt％的脫脂乳粉和8wt％的白砂糖進行混合發酵，發酵溫度為37℃。
[0161]
(1)流變學特性檢測：
[0162]
使用粘度計分析其發酵過程中的流變學特性變化。
[0163]
結果如圖11所示。
[0164]
(2)發酵溫度優化：
[0165]
按照上述組分配方，分別檢測類腸膜魏斯氏菌mbwp-171在不同的發酵溫度(25、28、31、34、37和42℃)下發酵產品中的活菌情況(以od600進行標表徵)。
[0166]
結果如表3和圖12所示。
[0167]
表3不同發酵溫度下的類腸膜魏斯氏菌mbwp-171的活菌情況
[0168]
溫度/℃od600nm251.299281.818311.92342.011372.075422.021
[0169]
結果發現，類腸膜魏斯氏菌mbwp-171在28～42℃條件下的發酵效果最佳，此時的活菌數和菌活力最佳。
[0170]
(3)產酸效果：
[0171]
按照上述組分配方，在發酵開始3h後使用ph計監控發酵產品中的酸度變化。
[0172]
結果如圖13所示。
[0173]
可以發現，類腸膜魏斯氏菌mbwp-171的產酸效果穩定，在發酵1410min後進入穩定期，獲得的產品ph值約為4.2，具有較好的產酸性能。
[0174]
上述結果說明，類腸膜魏斯氏菌mbwp-171可以有效用於食品發酵領域，其發酵效果優異。
[0175]
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。