蘇木素在檢測免疫效應細胞介導的細胞毒效應中的應用的製作方法

2023-06-01 05:19:11 3

專利名稱：蘇木素在檢測免疫效應細胞介導的細胞毒效應中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及蘇木素在檢測免疫效應細胞介導的細胞毒效應中的應用。
背景技術：
M、 CTL和DC等免疫效應細胞具有重要的抗腫瘤作用。隨著腫瘤免疫學研究的深入進展，顯示細胞介導的細胞毒效應測定方法應運而生，為腫瘤生物治療的基礎和臨床研究奠定了基礎。目前，檢測細胞介導的細胞毒效應方法較多，基本可分為同位素法和非同位素法兩類。同位素法包括4h"Cr釋放法和'H-TdR摻入法。這兩種方法雖然敏感、特異，但前者存在半衰期短、自然釋放率高等問題，後者則需要複雜的儀器設備，同時二者均可造成環境汙染，使其應用受到限制。非同位素法包括流式細胞分析(FACS)法、乳酸脫氫酶法、微量NAG釋放法、結晶紫染色法和克隆形成法等，諸多方法均有不盡人意之處，例如FACS法特異、敏感，但需要大型儀器設備和配套試劑，不適合基層推廣應用。MTT比色法敏感、簡便、無環境汙染，不需複雜儀器設備，近年來通過對各種實驗條件的不斷完善， 一直用於細胞增殖活性和細胞毒效應測定。各種NK細胞系的相繼建立為進一步研究NK細胞的功能提供了良好的模型。然而服細胞系一般來源於惡性腫瘤，具有倍增周期短、代謝率高等生物學特性，在採用MTT比色法檢測該類細胞介導的細胞毒效應時，重複性較差的情況時有發生，基於此，建立穩定、特異、簡便、經濟的檢測細胞介導的細胞毒效應的方法具有重要的應用價值。
蘇木素是一種天然染料，通過氧化變為蘇木紅，通常用於生物組織切片細胞核的染色。目前尚無將蘇木素染色法用於測定細胞介導的細胞毒效應測定的相關研究報導。

發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一種利用蘇木素檢測免疫效應細胞介導的細胞毒效應的測定方法，也是蘇木素的一種新用途。
具體應用時，方法如下將貼壁腫瘤細胞懸液置於細胞培養板中，貼壁後，加入待測免疫效應細胞，構成一定的效靶比，於培養箱中共孵育適當時間後，取出，棄上清，用PBS洗板3次(以去除效應細胞)後，立即加入4%多聚甲醛固定30分鐘，然後加入蘇木素染色液，100ul/孔，染色20分鐘後，蒸餾水洗3 5次(以去除未結合的染料)，室溫晾乾；加入1%的鹽酸酒精脫色，100p1/孔，脫色後立即用酶標儀測定540nm處的吸光度值並記錄，計算各效耙比的殺傷率，公式如下
3殺傷率(。/。M一M^^xiooA
其中，OD(E)表示效應細胞(E)孔OD值，OD(T)表示靶細胞(T)孔OD值，OD(E+T)表示效應 細胞(E)+耙細胞(T)孔OD值。
在加入蘇木素染色液前，用4%的多聚甲醛固定待測細胞液(效應細胞已被洗去，主要用 來固定靶細胞，但也有部分未洗去的效應細胞被固定)，固定30分鐘。
所述蘇木素染色液是按文獻《常用蘇^:素幾種配方與染色結果的比較》(李文，張賽霞,
解剖學雜誌，2000; 23 (4): 393)中的描述配製的，方法如下所示1.5g蘇木素用5ml無 水乙醇溶解，蒸餾水溶解鉀明礬(加溫至90°C,勿煮沸)，將溶解的蘇木素和碘酸鈉同時加入 鉀明礬水溶液內，流水冷卻至室溫，再加甘油，震蕩l小時後即可使用，染液可保用6個月。
所述1%鹽酸酒精溶液是指鹽酸和酒精體積分數分別為1%和70%的溶液。
所述PBS是指0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液，PH=7.2。
所述4°/。的多聚甲醛溶液是按照文獻《組織培養和細胞學技術》(鄂徵，北京出版社 P146)中的描述配製的，方法如下將多聚甲醛40g溶於0.1molPBS lOOOml中，加熱至60 'C左右，不斷攪拌至透明，也可加少許lmolNaOH使溶液透明。
本方法的基^:原理如下蘇木素染色法利於立即固定的細胞著色，而固定前早已死亡或 自溶的細胞及碎片不能吸附染料，所以細胞必須進行固定後方可進行蘇木素染色。在測定OD 值之前，用1%鹽酸酒精將吸附在細胞核上的染料溶解，此時各孔中液體呈現粉紅色。選擇 540nm波長立即進行測定，活細胞數量越多，細胞狀況越好，則染色越深，所測OD值越高， 反之，活細胞越少，狀況越差，則染色越淺，OD值越低，從而對活細胞進行定量。
本發明的發明人採用蘇木素染色法觀察人貼壁腫瘤細胞系H印2的增殖活性，測定了人 NK細胞系NK92、 NKL和YT對SGC7901和H印2細胞系的細胞毒效應，紐西蘭白兔CTL細胞對 VX2細胞的殺傷活性；同時與MTT比色法及CCK-8比色法進行比較；結果顯示NK92、 NKL和 YT三種效應細胞對SGC7901和Hep2細胞殺傷6h或12h後，在效靶比分別為10:1、5:1、2. 5:1 和1.25:1時，三種方法所測結果具有良好的效靶關係，且殺傷趨勢基本一致，重複性較好
(CV<8%)。蘇木素染色法和MTT比色法所測兔CTL殺傷效應結果高度一致，線性關係明顯。 研究表明將蘇木素染色法用於效應細胞對貼壁腫瘤細胞系的細胞毒效iS的測定，具有特異、 穩定、簡便、經濟等優點。


圖1為H印2細胞增殖曲線圖；圖2為NK92對SGC7901的殺傷作用比較示意圖； 圖3為NK92對H印2的殺傷作用比較示意圖； 圖4為NKL對SGC7901的殺傷作用比較示意圖； 圖5為NKL對H印2的殺傷作用比較示意圖； 圖6為YT對SGC7901的殺傷作用比較示意圖； 圖7為YT細胞對H印2的殺傷作用比較示意圖； 圖8為兔CTL細胞對VX2的殺傷效應示意圖。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步的說明-實施例1:檢測H印2細胞增殖活性
(1) 蘇木素染色法檢測H印2細胞增殖活性取含100ml/L小牛血清的RPMT1640培養基 (完全培養基)加入96孔細胞培養板中，100ul/孔。用2.5g/L的胰酶消化H印2細胞，離
心後棄上清，用完全培養基調相應的細胞濃度。然後各取100iU細胞懸液分別加入上述96 孔細胞培養板各相應孔中，混勻後倍比2稀釋，依次設8個稀釋度，每個稀釋度3復孔，然 後各孔補充完全培養基至200y 1，並設酶標儀調零孔。將96孔細胞培養板置37°C、50ml/L C02 恆溫飽和溼度培養箱中孵育44小時。取出96孔細胞培養板甩棄上清，立即加入40g/L的多 聚甲醛溶液，150iil/孔，固定30分鐘後收集固定液。PBS洗3次，棄上清，室溫晾乾。取 蘇木素染色液100ul加入各孔，染色20分鐘。蒸餾水洗3-5次以去除未結合的染料，室溫 晾乾。於倒置顯微鏡下觀察細胞著色狀況，加入1%鹽酸酒精，100til/孔，此時各孔液體呈 現不同程度的粉紅色，脫色後立即用酶標儀測定540nm處的吸光度值並記錄。繪製H印2細胞 增殖曲線，如圖1所示。
(2) MTT比色法觀察H印2細胞的增殖活性，按文獻田志剛，張建華，等.MTT法在檢測 細胞增殖與細胞毒效應中的應用[J].中國腫瘤生物治療雜誌，1994,1(1) :74-79.中的方法 進行，繪製細胞增殖曲線，如圖1所示。
結果採用蘇木素染色法和MTT比色法同時觀察孵育44h的H印2細胞的增殖活性，雖然 兩種方法需選擇兩種不同的波長(540nm和570隨)，但細胞在0。 063-8X IOVL密度範圍內兩 種測定方法所顯示的0D值均呈現正向線性關係，表明蘇木素染色法與MTT比色法均能客觀地 反映細胞的數量及活性狀態(圖1)。
實施例2:檢測人NK細胞系的細胞毒效應 (1)蘇木素染色法檢測人NK細胞系的細胞毒效應-I. 人NK細胞系的培養擴增NK92細胞培養基為含125ml/L胎牛血清、125ml/L馬血清 和1 X 105U/L rhIL-2的a -MEM培養基，2-3天傳代。NKL細胞培養基為含100ml/L胎牛血清 和1 X 105 U/L rhIL-2的RPMI1640培養基，2-3天傳代。YT細胞培養基為含100m〗/L小牛血 清的RPMI1640培養基，2-3天傳代。
II. 人NK細胞系的細胞毒效應檢測2.5ml/L胰酶消化H印2和SGC7901細胞，離心後用 完全培養基調細胞數為1X10VL，加入96孔細胞培養板中，置37。C、 50ml/L 032恆溫飽和溼 度培養箱中孵育12小時使其貼壁。將NK92、 NKL、 YT細胞用Hanks液洗滌細胞1次，去除殘 存的rhlL-2，避免其幹擾實驗結果。加入不含rhlL-2的培養基重懸細胞並調相應的細胞數， 分別取細胞懸液100u 1加入96孔細胞培養板各相應孔構成一定的效靶比，另外分別設相應 濃度的效應細胞對照，靶細胞對照，均為3復孔或6復孔，另設l孔酶標儀調零孔，補充各 對照孔培養基至200 n 1。將其置培養箱中孵育相應的時間(NK92細胞為6h;NKL和YT細胞為 16h)。取出96孔細胞培養板，立即棄上清，用PBS洗板3次，以去除效應細胞。立即加入 40g/L的多聚甲醛溶液，150nl/孔，固定30分鐘後收集固定液。PBS洗3次，棄上清，室溫 晾乾。取蘇木素染色液100y l加入各孔，染色20分鐘。蒸餾水洗3-5次以去除未結合的染 料，室溫晾乾。加入1%鹽酸酒精，100yl/孔，脫色後立即用酶標儀測定540nm處的吸光度 值並記錄。計算各效靶比的殺傷率。公式如下
殺傷率(%) =1 一 ,x 100%;
OD(r)
OD(E):效應細胞(E)孔OD值；OD(T):靶細胞(T)孔OD值；OD(E+T):效應細胞(E)+靶細 胞(T)孔OD值。
(2) MTT比色法檢測人NK細胞系的細胞毒效應，按文獻田志剛，張建華，等.MTT法在 檢測細胞增殖與細胞毒效應中的應用[J].中國腫瘤生物治療雜誌，1994， 1(1) :74-79.中的 方法進行。
(3) CCK-8比色法檢測人NK細胞系的細胞毒效應2. 5ml/L胰酶消化H印2和SGC7901 細胞，離心後用完全培養基調細胞數為1X107L，加入96孔細胞培養板中，置37'C、 50ml/L C02恆溫飽和溼度培養箱中孵育12小時使其貼壁。將NK92、 NKL、 YT細胞用Hanks液洗滌細 胞1次，去除殘存的rhIL-2，避免其幹擾實驗結果。加入不含rhIL-2的培養基重懸細胞並 調相應的細胞數，分別取細胞懸液100y 1加入96孔細胞培養板各相應孔構成一定的效靶比， 另外分別設相應濃度的效應細胞對照，靶細胞對照，均為3復孔或6復孔，另設l孔酶標儀 調零孔，補充各對照孔培養基至200u 1。將其置培養箱中孵育相應的時間(NK92細胞為6h;NKL
6和YT細胞為16h)。取出96孔細胞培養板，加入CCK-8， 20n 1/孔，繼續孵育2小時後，用 酶標儀測定450nm處的吸光度值。計算各效靶比的殺傷率，公式同(1)。 結果
A. NK92細胞對貼壁腫瘤細胞的細胞毒效應NK92細胞與SGC7901或H印2細胞共同孵 育6h後，分別採用蘇木素染色法、MTT比色法和CCK-8比色法測定NK92細胞的殺傷活性， 結果比較如圖2、圖3所示，圖2、 3表明隨著效靶比不斷升髙，NK92細胞的殺傷活性逐漸增 強。在效靶比為10: 1時對兩種腫瘤細胞的殺傷活性接近90%，雖然殺傷時間較短但NK92細 胞對兩種腫瘤細胞均有較強的殺傷效應。同時三種方法所測結果均顯示出良好的效耙反應關 系。但蘇木素染色法所測各效靶比殺傷率略高於MTT比色法及CCK-8比色法。
B. NKL細胞對貼壁腫瘤細胞的細胞毒效應NKL細胞與SGC7901或H印2細胞共同孵育 16h後，分別採用蘇木素染色法、MTT比色法和CCK-8比色法測定NKL細胞的殺傷活性，結果 比較如圖4、圖5所示，圖4表明在效靶比為10: 1時，三種方法所測NKL對SGC7901細胞 的殺傷活性可達50%以上。在5:1、 2.5:1和1.25:1時，其殺傷效應雖呈線性關係，但差異 較小。圖5顯示NKL細胞對H印2細胞殺傷反應線性關係良好，三種方法所測結果有較好的相 關性。
C. YT細胞對貼壁腫瘤細胞的細胞毒效應YT細胞與SGC7901或H印2細胞共同孵育16h 後，三種方法均顯示出YT細胞對2種腫瘤細胞有一定的殺傷活性，結果比較如圖6、圖7所 示，隨著效靶比的不斷降低，其殺傷活性逐漸減弱。
實施例3:檢測兔CTL細胞的細胞毒效應
(1)蘇木素染色法檢測兔CTL細胞的細胞毒效應用2.5ml/L胰酶消化VX2細胞，離心 洗滌後用完全培養基調相應的細胞濃度，將其加入96孔細胞培養板各相應孔中，100ul/孔； 然後將96孔細胞培養板置37°C、50ral/L 0)2恆溫飽和溼度培養箱中孵育使其貼壁。將荷瘤(VX2 細胞)12天的紐西蘭白兔處死，無菌取脾臟，剪碎，100目鋼網研磨製備脾單個細胞懸液，洗 滌2次後分別調整相應的細胞濃度，加入96孔細胞培養板各相應孔中，100ul/孔。設40:1、 20:1、 10:1和5:1四個效耙比(E:T)，並設相應的CTL效應細胞對照和VX2耙細胞對照，均 為6復孔，各對照孔補充完全培養基至200 y 1/孔，另設1孔酶標儀調零孔。將％孔細胞培 養板置37。C、 50ml/L 0)2恆溫飽和溼度培養箱中培養44小時。取出96孔板，立即棄上清， 用PBS洗板3次，棄上清(旨在去除相應各孔懸浮的CTL細胞，減少效應細胞對檢測結果的幹 擾)，立即加入40g/L的多聚甲醛溶液，150nl/孔，固定30分鐘。取蘇木素染色液100ul 加入各孔，染色20分鐘。蒸餾水洗3-5次以去除未結合的染料，室溫晾乾。加入1%鹽酸酒精，100ul/孔，脫色後立即用酶標儀測定540nm處的吸光度值並記錄。計算各效靶比的殺傷 率，公式同實施例2。
(2) MTT比色法測定兔CTL細胞的細胞毒效應按文獻田志剛，張建華，等.MTT法在檢 測細胞增殖與細胞毒效應中的應用[J].中國腫瘤生物治療雜誌，1994, 1(1) :74-79.中的方 法進行。
結果將VX2細胞荷瘤紐西蘭白兔，12天後取荷瘤兔脾臟，製備脾單個細胞(CTL)懸液， 以VX2細胞為靶細胞，採用蘇木素染色法和MTT比色法測定CTL細胞對VX2的細胞毒效應， 結果如圖8所示，圖8表明隨著效耙比的升高，CTL細胞對VX2細胞的殺傷逐漸增強。在效 靶比(E:T)為40:1時，殺傷率可接近100%，顯示出CTL細胞敏感特異的細胞毒效應。同時兩 種方法所測結果高度一致，且具有良好的效靶比反應關係。
以上實施例中用到的儀器與試劑如下
NK92、 NKL和YT細胞系均為人NK細胞系，購自美國ATCC。
H印2細胞系(人喉癌細胞)和SGC7901 (人胃腺癌細胞)購自中國科學院典型培養物保 藏中心。
紐西蘭白兔購自山東省農科院。
a-MEM、 RPMI1640培養基、胎牛血清為GIBICO產品，按說明書配製。 重組人白介素2 (rhIL-2)為長春生物製品研究所產品，用生理鹽水溶解至5X10'U/L， 4'C存放備用。
胰酶Hanks溶液，將體積分數為0. 25%的胰酶溶於Hanks溶液中。
MTT (四甲基偶氮唑鹽)為Fluka產品，用生理鹽水溶解為5g/L，過濾除菌。
1(W的SDS (十二垸基硫酸鈉)水溶液為Sigma產品。
CCK-8，日本同仁化學研究所產品。
小牛血清為山東省勁牛生物材料有限公司產品。
馬血清為中外合資蘭州民海生物材料公司產品。
96孔細胞培養板為Costar公司產品。
BioRad550酶標儀為美國BioRad公司產品。
C02孵育箱為日本ESPEC公司產品。
8道微量移液器為法國吉爾森產品。
綜合討論免疫效應細胞對相應靶細胞的細胞毒效應是腫瘤免疫學的重要組成部分。在 進行免疫效應細胞對貼壁生長的腫瘤細胞系的細胞毒實驗時，由於某些效應細胞(例如某些NK細胞系、LAK細胞等)具有增殖快和代謝率高等生物學特性，致使傳統的MTT方法所測結 果穩定性較差。本研究採用MTT比色法觀察NK92細胞對H印2和SGC7901細胞的殺傷效應時， MTT比色法所測殺傷率均明顯低於蘇木素染色法，其原因可能與兩種方法不同的作用原理有 關。MTT比色法通過測定細胞中線粒體脫氫酶活性而反映細胞數量及狀況，細胞在死亡初期 (或短時間內)，仍可攝取一定量的MTT並還原形成甲臢，致使所測OD值偏高，殺傷率降低。 另外，採用MTT比色法和CCK-8比色法測定細胞介導的細胞毒效應時，效靶細胞均攝取MTT 或CCK-8形成甲臢。在效、靶細胞反應初期，效應細胞處在活化早期，代謝旺盛，殺傷效應 相對較弱，採用上述兩種方法測定其殺傷效應，通常所測效靶反應孔的0D值較高，所以將 MTT及CCK-8比色法用於此類實驗時，應適當延長反應時間，方可獲得較穩定的測定結果。 而採用蘇木素染色法檢測這類效應細胞的殺傷效應時，需先將培養板各孔中的培養基甩棄， 再經3次PBS洗滌後，各孔中絕大多數細胞被甩棄，大大避免了效應細胞的幹擾(既使效應細 胞去除不徹底，在計算殺傷活性時仍需減去各效靶比組效應細胞對照孔OD值的均數)。例如 本研究所述NK細胞系及荷瘤兔CTL活性檢測，進行蘇木素染色時，染料僅在固定前的活細胞 中富集，即僅顯示靶細胞的OD值，大大避免了效應細胞的幹擾，從而真實地反映出此類細胞 的細胞毒效應。
蘇木素染色法檢測細胞增殖活性，在一定密度範圍內細胞數量與OD值呈線性關係。當細 胞密度過大或培養時間較長可引起培養基中營養成分過度消耗，導致部分細胞死亡或生長不 良，幹擾實驗結果，所以應進行預實驗選擇每種細胞適合的初始培養濃度。同時嚴密控制細 胞孵育時間，洗板後立即進行固定，脫色後立即進行酶標儀測定，亦是獲得滿意實驗結果的 基本條件。
在採用蘇木素染色法進行細胞介導的細胞毒效應測定過程中，使用多通道微量移液器不 僅可簡化試驗程序而且可大大減少各孔之間的誤差。同時染色後蘇木素染色液可回收反覆使 用多次，與昂貴的CCK-8試劑相比本方法的經濟實用則顯得頗為突出。
權利要求
1.蘇木素在檢測免疫效應細胞介導的細胞毒效應中的應用。
2. 根據權利要求l所述的應用，其特徵在於，應用方法如下將貼壁腫瘤細胞懸液置於細胞 培養板中，貼壁後，加入待測免疫效應細胞，構成一定的效靶比，於培養箱中共孵育適當時間後，取出，棄上清，用PBS洗板3次後，立即加入4%多聚甲醛固定30分鐘，然後加 入蘇木素染色液，100ul/孔，染色20分鐘後，蒸餾水洗3 5次，室溫晾乾；加入1%的 鹽酸酒精脫色，100yl/孔，脫色後立即用酶標儀測定540nm處的吸光度值並記錄，計算 各效靶比的殺傷率，公式如下殺傷率(%)=1 — OD("r)-，(￡) x 100%;其中，OD(E)表示效應細胞(E)孔OD值，OD(T)表示靶細胞(T)孔OD值，OD(E+T)表示效應 細胞(E)+靶細胞(T)孔OD值。
全文摘要
本發明公開了一種利用蘇木素檢測免疫效應細胞介導的細胞毒效應的測定方法將貼壁腫瘤細胞懸液置於細胞培養板中，貼壁後，加入待測免疫效應細胞，構成一定的效靶比，於培養箱中共孵育適當時間後，取出，棄上清，用PBS洗板3次(以去除效應細胞)後，立即加入4％多聚甲醛固定30分鐘，然後加入蘇木素染色液，100μl/孔，染色20分鐘後，蒸餾水洗3～5次(以去除未結合的染料)，室溫晾乾；加入1％的鹽酸酒精脫色，100μl/孔，脫色後立即用酶標儀測定540nm處的吸光度值並記錄，計算各效靶比的殺傷率，公式如圖所示。研究表明本方法具有特異、穩定、簡便、經濟等優點。
文檔編號G01N33/53GK101650364SQ20091001728
公開日2010年2月17日 申請日期2009年7月31日 優先權日2009年7月31日
發明者張建華, 王郡甫, 紅 陳 申請人:山東省醫學科學院基礎醫學研究所