一種用於造血幹細胞培養的滋養層的製備方法與流程

2023-05-31 10:22:36 1

本發明涉及一種用於造血幹細胞的滋養層的製備方法。

背景技術：

臍帶血被認為是一種除了骨髓移植以外治療血液系統疾病，尤其是血液系統腫瘤的重要資源。從1988年第一例臨床成功移植臍帶血以來，其應用隨著細胞治療研究的發展得到的了長足的進步。雖然相比骨髓和外周血，臍帶血在造血重建中的應用比例仍然處於相對較低的水平，到目前為止，超過25000例臍帶血成功移植的案例仍使人們對這一曾被丟棄的寶貴資源充滿了信心。作為造血幹細胞(Hematopoietic Stem Cell，HSC)的來源，臍帶血對比骨髓和外周血有兩個天然的優勢，首先，臍帶血移植的移植物抗宿主病(GVHD)風險遠遠小於其他兩者，這對異體移植的成功有重要意義；其次，臍帶血移植時的HLA配型要求很低，大大的降低了患者獲取可用細胞源的難度。儘管如此，臍帶血想要替代骨髓成為HSC最主要的來源並非易事，其中有兩個問題是制約臍帶血造血幹細胞的主要原因，即數量不足和植入時間長。為了克服臍帶血的這些不足之處，研究人員嘗試了許多不同的方法，其中分離並體外擴增臍帶血造血幹細胞是目前被認為最有臨床前景的手段。

間充質幹細胞(MSC)是幹細胞家族的重要成員，來源於發育早期的中胚層和外胚層，可以以其作為滋養層培養造血幹細胞。但是，採用MSC作為滋養層培養造血幹細胞時，MSC會大量增殖，並在培養一段時間後會大量脫落凋亡，產生的大量溶酶體等物質，並改變培養基pH值環境，極大的影響造血幹細胞的擴增，並引起凋亡。有文獻報導用絲裂黴素處理MSC細胞可以阻止其增殖，但殘留的絲裂黴素會對將要擴增的造血幹祖細胞造成非常不利的影響。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明提供了一種新的用於造血幹細胞的滋養層的製備方法。

本發明用於造血幹細胞的滋養層的製備方法，步驟如下：

(1)取細胞培養板，包被膠原蛋白，得包被了膠原蛋白的細胞培養板；

(2)取間充質幹細胞的細胞懸液，接種到步驟(1)中包被了膠原蛋白的細胞培養板中，培養至細胞融合度為70-90％時，即可。

步驟(1)中，所述膠原蛋白是鼠尾膠原蛋白。

步驟(1)中，每孔包被0.8-1.2ml膠原蛋白，優選為1ml膠原蛋白。

步驟(2)中，接種的間充質幹細胞懸液的濃度為1×105～1.5×105個細胞/孔。

步驟(2)中，培養採用的培養基為用於造血幹細胞培養的無血清培養基。

其中，所述無血清培養基培養為SFEM無血清培養基。

SFEM無血清培養基，購自stem cell公司。

本發明還提供了前述方法製備得到的滋養層。

本發明還提供了前述滋養層在培養造血幹細胞中的用途。

本發明造血幹細胞的培養方法，它是以前述滋養層為滋養層進行培養。

優選地，所述培養方法的步驟如下：取前述的滋養層，接種造血幹細胞，加入無血清培養基，培養即可；所述無血清培養基是每1ml添加有50-100ngSCF、25-50ng TPO、10-50ng Flt-3L的SFEM無血清培養基。

本發明方法製備的滋養層，能夠為造血祖幹細胞(HSPC)的體外擴增提供有力的支持作用，顯著提高HSPC的擴增效率，能夠極大程度的緩解HSPC不足的問題，應用前景良好。

顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。

附圖說明

圖1本發明製備的MSC滋養層細胞增殖和細胞形態情況

圖2本發明製備的MSC滋養層細胞在共培養12天後的存活率情況

圖3本發明製備的MSC滋養層共培養的造血幹祖細胞在擴增12天後的情況

具體實施方式

主要儀器及試劑：

SFEM 無血清培養基，購自stem cell公司貨號09650；

造血幹細胞培養基：SFEM無血清培養基，購自stem cell公司；

SCF 幹細胞生長因子

TPO 促血小板生成素

FLT-3 配體 FMS樣酪氨酸激酶配體

以上三種細胞因子購自Peprotech公司；

胰酶，購自gbico公司；

Ficoll，購自天津市灝洋生物製品科技有限責任公司；

生理鹽水，購自四川科倫藥業股份有限公司；

CD34+細胞分離磁珠，購自Miltenyi公司。

實施例1 用於造血幹細胞的滋養層的製備

1、間充質幹細胞按照如下方法製備

(1)取新鮮臍帶一根，放置於90mm玻璃平皿中，剪下一段長約10cm的臍帶，倒入生理鹽水，漂洗臍帶，將表面血汙洗去。

(2)用眼科剪將臍帶剪至約1.5cm的小段並剖開，漂洗清除血管內血汙，將臍帶轉入另一乾淨平皿中。

(3)倒入生理鹽水，再次漂洗臍帶；重複漂洗2-3次，除淨血汙。

(4)準備4-6個直徑100mm塑料培養皿並標記，每皿中放入1段1.5cm長的臍帶(多餘的臍帶組織丟棄)並加入2ml培養基(DMEM+F12+10％胎牛血清)。用眼科剪將臍帶剪碎成肉糜狀(2-3mm3的顆粒)。

(5)用剪刀將臍帶碎塊均勻的平鋪在平皿上。將培養皿置於37℃，5％CO2培養箱中培養。(移動培養皿時，勿使組織碎塊晃動)

(6)培養24小時後補加8ml培養基(DMEM+F12+10％胎牛血清)；培養至第7天時進行半量換液，之後每3天進行半量換液。

(7)第10天觀察細胞爬出情況，直至2個以上的皿中，10個細胞以上克隆數≥4，即可去除全部組織塊；待平均匯合度達30-50％左右時進行傳代。

(9)待P1代細胞生長至80％匯合度時進行消化凍存至液氮中待用。

2、臍帶MSC細胞滋養層的製備方法

(1)製備移動濃度的MSC細胞懸液：

1)從液氮中取出凍存的P1代MSC置於37°水浴中迅速解凍細胞。

2)用3ml無血清培養基(MSC無血清培養基)稀釋凍存液，並小心的輕輕混勻，將細胞懸液吸入10ml離心管中。

3)室溫下離心，500g，3分鐘。

4)吸去上清，用5ml無血清培養基充分混勻，臺盼藍染色計數細胞濃度。

5)將6x105個細胞(0.6x105個/ml)接種到10cm培養皿中。

6)37℃，5％CO2培養箱中培養48-60小時，每天觀察細胞生長狀態。

7)當在顯微鏡下觀察細胞融合度達到80-90％時，從培養箱取出培養皿。

8)吸取培養基，用常溫PBS小心洗細胞一次。

9)加入1ml胰酶消化細胞，在37℃培養箱中靜置1分鐘。

10)用1ml胎牛血清終止消化反應，再加入3ml無血清培養基，充分混勻細胞，將細胞懸液吸入10ml離心管中。

11)室溫下離心，500g，3分鐘。

12)吸去上清，用5ml SFEM無血清培養基充分混勻，得MSC細胞懸液，臺盼藍染色計數細胞濃度。

(2)取一個6孔板，每孔加入1ml鼠尾膠原蛋白(0.8-1.2ml均可)，置於37℃培養箱中待用。

(3)從培養箱取出之前預處理過得6孔板，用無菌PBS洗兩次。

(4)將MSC細胞懸液按照1x105個細胞/孔(1-1.5x105)接種到6孔板中，輕輕水平搖晃混勻。

(16)將6孔板置於37℃培養箱中，當細胞融合度達到70％時即可作為滋養層，接種CD34+造血幹細胞。

實施例2 用於造血幹細胞的滋養層的製備

1、間充質幹細胞為市售產品。

2、臍帶MSC細胞滋養層的製備方法

(1)製備移動濃度的MSC細胞懸液：

同實施例1。

(2)取一個6孔板，每孔加入0.8ml鼠尾膠原蛋白，置於37℃培養箱中待用。

(3)從培養箱取出之前預處理過得6孔板，用無菌PBS洗兩次。

(4)將MSC細胞懸液按照1.5x105個細胞/孔接種到6孔板中，輕輕水平搖晃混勻。

(5)將6孔板置於37℃培養箱中，當細胞融合度達到80％時即可作為滋養層，接種CD34+造血幹細胞。

實施例3 用於造血幹細胞的滋養層的製備

1、間充質幹細胞：製備方法同實施例1。

2、臍帶MSC細胞滋養層的製備方法

(1)製備移動濃度的MSC細胞懸液：

同實施例1。

(2)取一個6孔板，每孔加入1.2ml鼠尾膠原蛋白，置於37℃培養箱中待用。

(3)從培養箱取出之前預處理過得6孔板，用無菌PBS洗兩次。

(4)將MSC細胞懸液按照1.5x105個細胞/孔接種到6孔板中，輕輕水平搖晃混勻。

(5)將6孔板置於37℃培養箱中，當細胞融合度達到90％時即可作為滋養層，接種CD34+造血幹細胞。

如下用實驗例的方式來說明本發明的有益效果：

實施例1 採用本發明滋養層培養造血幹細胞

一、實驗方法

(一)造血幹/祖細胞的獲取

1.取新鮮臍帶血100ml，用50ml離心管分裝後在室溫下900g 15分鐘離心。

用移液管吸去上層的血漿部分，在加入與下層細胞等體積的生理鹽水，2.在50ml離心管中按每管20ml的量加入Ficoll溶液，將上一步獲得的血細胞懸液小心的滴加到Ficoll溶液上。

3.在室溫下以400g，30min的條件進行離心。

4.離心完成後，吸出離心管中的白膜層部分，用生理鹽水稀釋到40ml體積，並用血細胞分類計數儀進行細胞計數。

5.通過計數結果，從細胞懸液中取出1×108單個核細胞，進行離心。

用10ml MACs Buffer洗滌細胞沉澱，離心900g，10min。

6.將離心後的上清液去掉，用300ul MACs Buffer重懸細胞沉澱。

向細胞懸液中先後加入100ul封閉液和100ul CD34+分選磁珠，充分混勻後在4℃條件下孵育30min。

7.用5ml MACs Buffer稀釋洗滌細胞懸液，離心900g，10min去除離心上清。將分選細胞的磁力柱放置於磁力架，用1ml MACs Buffer潤洗。

8.用1ml MACs Buffer重懸細胞，將細胞懸液加到磁力柱中。用1ml MACs Buffer洗磁力柱，重複3-5次。

9.將磁力柱從磁力架上取下，置於一個新的15ml離心管中，加入1ml MACs Buffer並用磁力柱塞迅速推入磁力柱管，將細胞衝洗到離心管中。

10.離心900g，10min，用無血清培養基重懸細胞，並用血球計數板機型計數。

取部分分選的CD34+細胞進行流式細胞檢測，即為造血幹/祖細胞。

(二)造血幹細胞的培養

將前述步驟獲得的CD34+細胞按照1-2×105/孔接種到實施例1製備的間充質幹細胞滋養層的6孔板上，每孔加入2ml培養基(SFEM無血清培養基+50-100ng/ml SCF+25-50ng/ml TPO+10-50ng/ml Flt-3L三種因子)，並同時以現有方法製備的MSC滋養層對照組。

現有方法製備MSC滋養層：用MSC培養基(lonza MSCBMCD Cat.00190620)培養MSC細胞，然後用胰酶消化，離心後重懸，按照1x104個/ml接種到六孔板中，置於37℃培養箱培養。待細胞融合度達到70％-80％時，加入絲裂黴素處理1小時，用PBS洗細胞兩次後，加入培養基備用。

每3天補液到2ml體積，到第12天時收集培養細胞，並進行計數分析。

二、實驗結果

1、滋養層的增殖速度

如圖1所示，通過本發明所述的方法製備的MSC滋養層在培養48小時後，相比傳統方法鋪板的MSC，細胞增殖速度大大降低，細胞體積明顯增大，胎盤藍計數結果顯示，本發明的方法在培養72小時候，細胞數量僅為傳統方法的40％左右。

2、滋養層的凋亡情況

如圖2所示，通過本發明所述的方法製備的MSC滋養層在加入CD34+細胞共同培養12天後，用胰酶將MSC消化下來後進行胎盤藍染色技術，本發明的細胞的存活率遠遠大於傳統方法製備的滋養層共培養相同時間的情況。

3、造血幹細胞的增殖數量

如圖3所示，通過本發明所述的方法製備的MSC滋養層共培養的CD34+造血幹祖細胞在培養12天後增殖數量明顯高於傳統方法。擴增後細胞的死亡率也大大低於傳統方法。

綜上，本發明方法製備的滋養層，其本身的增殖速度慢，細胞死亡少，用其培養培養造血幹細胞，造血幹細胞的增殖數量明顯高於傳統方法製備的滋養層培養的增殖數量，具有良好的工業應用前景。