果蔗腋芽脫毒組培快繁方法
2023-05-31 02:36:41 1
專利名稱：果蔗腋芽脫毒組培快繁方法
技術領域：
本發明涉及甘蔗脫毒組培技術領域。
背景技術：
甘蔗(含果蔗)宿根矮化病在中國主產蔗區及世界各地蔗區廣泛發生已有多年，導致品種種性退化，嚴重影響甘蔗品質和產量。獲得甘蔗無病毒(菌)植株的方法有多種，例如熱處理脫毒(菌)、莖尖培養脫 毒(菌)和愈傷組織培養脫毒以及組合方法。其中普遍採用的較好方法為莖尖培養脫毒 (菌)法，具體步驟是通過蔗株頂端分生組織切取莖尖(0. 2mm以下分生組織)、誘導產生 幼芽、長成小植株獲得脫毒苗。莖尖分生組織脫毒法存在的問題是要切取很微小(0.2mm 以下)的莖尖分生組織，需在顯微鏡下操作，具有一定難度；而且，切取莖尖組織越小，褐化 率越高、成活率就越低，而切取莖尖組織偏大，又不能完全脫除病毒(菌)，同時容易造成汙 染；因此，生產上迫切需要一種更好的方法來滿足甘蔗或果蔗脫毒(菌)組培快繁的需要。
發明內容
本發明目的是提出一種果蔗脫毒組培快繁方法，以切取較大的果蔗植株腋芽為外 植體，先誘導腋芽萌動，再分化形成完整植株，其能夠在短期內而且較為容易獲得大量的無 病毒(菌)果蔗組培苗，克服莖尖分生組織脫毒(菌)法存在的操作難度大、成活率低、生 產成本偏高等問題。本發明的目的通過以下技術方案來實現。一種果蔗脫毒組培快繁的方法，其特徵在於包括如下步驟1)植體的選取與滅菌取果蔗的腋芽，經滅菌處理後，作為所用外植體；2)腋芽誘導培養將步驟1)處理後的腋芽在無菌條件下，摘取腋芽組織，接種在 腋芽誘導培養基上，誘導芽生成；3)分化培養將步驟2)形成的誘導芽移至分化培養基分化出叢芽；4)增殖培養將步驟3)分化形成的叢芽切成每2 3株為一組接在增殖培養基 中，再分化出叢芽；5)生根培養將步驟4)增殖形成的叢芽切成單株接種在生根培養基中進行生根 培養，生根組培苗生成；6)移栽當步驟5)的生根組培苗生長至3 5cm時，將生根組培苗移栽於移栽基 質培養至成苗；7)病毒(菌)檢測利用PCR技術對步驟5)的成苗進行RSD菌檢測。其特徵在於步驟3)中的分化培養基配方為MS+TDZ (0. 001 0. 01)mg/L+IBA (0. 02 0. 05)mg/L+蔗糖(30 40) g/L+精氨酸 (100 150)mg/L+肌醇(100 150)mg/L。本發明具有如下突出的實質性特點和顯著進步
1)本發明以果蔗腋芽為外植體，培養時，取材的體積較大(2 3mm)，接種操作容 易，成活率高達90%以上。2)本發明採用的分化培養基配方，在分化培養過程中能快速使誘導芽分化出叢芽，採用本發明繁殖果蔗脫毒苗速度快，月繁殖係數達5 10倍，適合於大規模工廠化生產。
圖1為本發明的實施例檢測結果(瓊脂糖凝膠電泳圖)。檢測對照材料以甘蔗宿根矮化病菌分離培養菌株、帶病菌植株為材料。(目的片 段約256bp)圖片說明1、15為DL2000，2為RSD菌株，3為清水對照，4為帶RSD菌果蔗植株， 5-14為隨機抽取的十株果蔗腋芽組培苗。
具體實施例方式通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明。實施例1一種果蔗脫毒組培快繁的方法，按如下步驟進行1)外植體的選取與滅菌於7 11月，取果蔗的腋芽，經75%酒精浸泡0. 5 1. Omin，再用0. 汞溶液處理3 4min後，無菌水衝洗3 5次。2)腋芽誘導培養將步驟1)處理後的腋芽在無菌條件下，摘取2 3mm的腋芽， 小心去除葉鞘，接種在液態腋芽誘導培養基(MS+6-BA 0. 5mg/L+IBA 0. 02mg/L+活性炭lg/ L+蔗糖30g/L+精氨酸100mg/L+肌醇100mg/L+瓊脂5g/L)的上，誘導芽生成。3)分化培養將步驟2)誘導形成的誘導芽移至分化培養基(MS+TDZ 0. 003mg/ L+IBA 0. 02mg/L+蔗糖30g/L+精氨酸100mg/L+肌醇100mg/L+瓊脂5g/L)上誘導出叢芽。4)增殖培養將步驟3)增殖形成的叢芽切成每2 3株為一組接在增殖培養基 (MS+6-BA 0. 8mg/L+IBA 0. 02mg/L+ 瓊脂 5g/L+ 蔗糖 30g/L+ 精氨酸 100mg/L+ 肌醇 IOOmg/ L)中，再分化出叢芽。5)生根培養將步驟4)增殖形成的叢芽切成單株接種在生根培養基(MS+IBA
0.2mg/L+NAA 0. lmg/L+瓊脂5g/L+蔗糖50g/L+多效唑0. 5mg/L)中進行生根培養，誘導出 根，生根組培苗生成。6)移栽當步驟5)的生根組培苗長至3 5cm時，將生根組培苗移栽於移栽基質 (泥炭土 珍珠巖蛭石=3.5 1 2.5)中，培養成苗。7)病毒(菌)檢測利用PCR擴增技術對步驟6)的成苗進行RSD菌檢測，檢測結 果見圖1，從圖中可以看出，本發明培殖的組培苗不含RSD菌。各種培養基中的MS為基本培養基(含蔗糖30g/L，瓊脂5g/L，PH值為6. 2)。實施例2一種果蔗脫毒組培快繁的方法，按如下步驟進行1)植體的選取與滅菌於7 11月，取果蔗的腋芽，經75%酒精浸泡0.5
1.Omin，再用0. 的汞溶液處理3 4min後，無菌水衝洗3 5次。
2)腋芽誘導培養將步驟1)處理後的腋芽在無菌條件下，摘取2 3mm的腋芽， 小心去除葉鞘，接種在腋芽誘導培養基(MS+6-BA 0. 8mg/L+IBA 0. 04mg/L+活性炭1. 8g/L+ 精氨酸150mg/L+肌醇130mg/L)上，誘導芽生成。3)分化培養將步驟2)誘導形成的誘導芽移至分化培養基(MS+TDZ 0. OOSmg/ L+IBAO. 04mg/L+蔗糖35g/L+精氨酸120mg/L+肌醇130mg/L)的上，誘導出叢芽。4)增殖培養將步驟3)增殖形成的叢芽切每成2 3株為一組接在增殖培養基 (MS+6-BA1. 2mg/L+IBA0. 05mg/L+精氨酸 140mg/L+肌醇 140mg/L+蔗糖 25g/L)中，再分化出 叢芽。5)生根培養將步驟4)增殖形成的叢芽切成單株接種在生根培養基 (MS+IBAO. 4mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖40g/L+多效唑0. 8mg/L)中進行生根培養，誘導出根，生 根組培苗生成。6)移栽當步驟5)的生根組培苗長至3 5cm時，將生根組培苗移栽於移栽基質 (泥炭土 珍珠巖蛭石=3:1:2)中，培養成苗。7)病毒(菌)檢測利用PCR擴增技術對步驟6)的成苗進行RSD菌檢測，檢測結
果與實施例一相同。各種培養基中的MS為基本培養基(含蔗糖35g/L，瓊脂8g/L，PH值為5. 8)。
權利要求
果蔗腋芽脫毒組培快繁的方法，包括如下步驟1)外植體的選取與滅菌取果蔗的腋芽，經滅菌處理後，作為所用外植體；2)腋芽誘導培養將步驟1)處理後的腋芽在無菌條件下，摘取腋芽組織，接種在腋芽誘導培養基上，誘導芽生成；3)分化培養將步驟2)的誘導芽移至分化培養基分化出叢芽；4)增殖培養將步驟3)分化形成的叢芽切成每2～3株為一組接在增殖培養基中，再分化出叢芽；5)生根培養將步驟4)增殖形成的叢芽切成單株接在生根培養基中進行生根培養，長成生根組培苗；6)移栽當步驟5)的生根組培苗生長至3～5cm時，將生根組培苗移栽於移栽基質培養至成苗；7)病毒(菌)檢測利用PCR技術對步驟6)的成苗進行RSD菌檢測；其特徵在於步驟3)中的分化培養基配方為MS+TDZ(0.001～0.01)mg/L+IBA(0.02～0.05)mg/L+蔗糖(30～40)g/L+精氨酸(100～150)mg/L+肌醇(100～150)mg/L。
2.如權利要求1所述的果蔗脫毒組培快繁的方法，其特徵在於步驟3)中的分化培養基 配方中還包括瓊脂(5 7) g/L。
3.如權利要求1或2所述的果蔗脫毒組培快繁的方法，其特徵在於步驟2)中採用的腋 芽誘導培養基配方為MS+6-BA (0. 5 l)mg/L+IBA (0. 02 0. 05)mg/L+活性炭(1 2) g/L+精氨酸(100 150)mg/L+肌醇(100 150)mg/L。
4.如權利要求3所述的果蔗脫毒組培快繁的方法，其特徵在於步驟2)中採用的腋芽誘 導培養基配方中還包括蔗糖(30 40) g/L和瓊脂(5 7) g/L)。
5.如權利要求1狂2所述的果蔗脫毒組培快繁的方法，其特徵在於步驟4)中的增殖培 養基配方為MS+6-BA (0. 5 1. 5) mg/L+IBA (0. 02 0. 05) mg/L+ 蔗糖(20 40) g/L+ 精氨酸(100 150)mg/L+肌醇(100 150)mg/L。
6.如權利要求5所述的果蔗脫毒組培快繁的方法，其特徵在於步驟4)中的增殖培養基 配方中還包括瓊脂(5 7) g/L。
7.如權利要求1或2所述的果蔗脫毒組培快繁的方法，其特徵在於步驟5)中的生根培 養基的配方為MS+IBA(0. 2 0. 5)mg/L+NAA(0. 1 0. 2)mg/L+ 蔗糖(30 50) g/L+ 多效唑(0. 5 l)mg/L。
8.如權利要求7所述的果蔗脫毒組培快繁的方法，其特徵在於步驟5)中的生根培養基 為配方還包括瓊脂(5 7) g/L。
9.如權利要求1所述的果蔗脫毒組培快繁的方法，其特徵在於步驟6)中的移栽基質為泥炭土 珍珠巖蛭石=3 4 1 2 3。
10.如權利要求1所述的果蔗脫毒組培快繁的方法，其特徵在於步驟1)中所述的滅菌處理是將外植體經75%酒精浸泡0. 5 1. Omin，再用 0. 汞溶 液滅菌3 4min，最後用無菌水衝洗3 5次。
全文摘要
本發明涉及甘蔗脫毒組培技術領域。提出一種果蔗脫毒組培快繁的方法，其特徵在於包括如下步驟1)植體的選取與滅菌；2)腋芽誘導培養；3)分化培養；4)增殖培養；5)生根培養；6)移栽；7)病毒(菌)檢測；其特徵在於步驟3)中的分化培養基配方為MS+TDZ(0.001～0.01)mg/L+IBA(0.02～0.05)mg/L+蔗糖(30～40)g/L+精氨酸(100～150)mg/L+肌醇(100～150)mg/L。本發明以果蔗腋芽為外植體，接種操作容易，成活率高達90％以上。所採用的分化培養基配方，在分化培養過程中能快速使誘導芽分化出叢芽，採用本發明繁殖果蔗脫毒苗速度快，月繁殖係數達5～10倍，適合於大規模工廠化生產。
文檔編號A01H4/00GK101803574SQ20101016057
公開日2010年8月18日 申請日期2010年4月23日 優先權日2010年4月23日
發明者劉睿, 楊湛端, 沈萬寬, 譚嘉娜, 陳仲華, 陳月桂 申請人:廣州甘蔗糖業研究所