一種半抗原與含氨基載體的結合物及其製備方法和用途的製作方法

2023-05-31 05:20:26 1

專利名稱：一種半抗原與含氨基載體的結合物及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬藥物製劑領域，涉及一種半抗原與含氨基載體的結合物及其製備方法和 用途。
背景技術：
已知半抗原為不完全性單一性抗原，機體皮膚外搽，或動物口服後可結合蛋白，約 在7-10天後在生物體內誘導強烈的細胞免疫反應，半抗原如二硝基氟苯及二硝基氟苯均 在生物體內不會自然生成，在自然界所有生物中，蛋白質的胺基酸殘基中也不含二硝基苯 結構，除非有人為標記。有研究公開了通過Sanger』 s反應，即DNFB或DNCB的二硝基苯置 換氨基上的氫，在微鹼性條件下，蛋白質與DNFB混合達到結合。該方法為大量共價結合標 記到檢測用的抗體或檢測用的抗原上，利用針對二硝基苯單克隆抗體，產生免疫測定的信 號放大作用，以及與靶向載體結合後，在機體內誘導，帶動，強化免疫提供了化學基礎。目 前，針對單一抗原決定簇的單克隆抗體已廣泛用微量抗原性物質的測定，雖然目前使用單 抗或抗體的免疫測定方法已可達到納克級，但仍然不能滿足臨床及科學研究的需要，尋求 更為敏感和特異的方法一直是研究人員孜孜不倦的追求。近十年來，有研究用單抗的靶向 作用對腫瘤作為輔助治療，如抗HER-2單抗赫賽丁(Herceptin)治療乳房癌，頭面部癌症， 抗⑶22單抗美羅華(Rituximab)治療B細胞淋巴瘤，且已證實具有一定的療效。但實踐顯 示，總體上單純使用單抗所誘導的靶向免疫作用有限，遠不能達到防治慢性感染，尤其是防 治惡性腫瘤。尋求一種在病灶部位可發揮更大免疫作用，防治效果好，能滿足預防及治療需 要的藥物一直是本領域研究人員的關注熱點。與本發明相關的現有技術有下述參考文獻參考文獻[1],楊國亮王俠生主編現代皮膚病學1996年5月第1版第1次印刷[2]. Maja Aleksic, Camilla K, David A Basketter et al. Investigating protein haptenation mechanisms of skin sensitisers using human serum albumin as a modal protein. Toxicology in vitro. 2007,21,723-73[3] . Bernard Metz , Gideon F. A. Kerstent, Peter Hoogerhout et al. Identification of formaldehyde-induced modifications of protein. The journal of biological chemistry. 2003,279(8) :6235_6243[4].吳仁蔚胡思順肖 運力等檢測禽流感病毒抗體的重組核抗原間接ELISA 方法的建立畜牧獸醫學報2006，37 (10) 1067-72[5],王弦謝小強曹亮等HER_2_neU基因在乳腺癌中的研究進展生物學雜誌 2008,25(1) 5-8[6],孫婷婷徐江平劉輝貝伐單抗對耐藥鼻咽癌細胞凋亡的影響解放軍醫學雜 志 2008,33(12) 1438-1440[7],王磊武士華王松俊單克隆抗體相關專利申請分析中國預防醫學雜誌2006,7(6) 569-570[8].劉端棋戰淑君分子靶向治療藥物的研究進展中國腫瘤2008,17(11): 942

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種半抗原與含氨基載體的結合 物。本發明所述的半抗原與含氨基載體的結合物具有式(I)的結構。所述結構包括其同分異構體；所述的半抗原為二硝基氟苯(DNFB)或二硝基氯苯(DNCB)；所述的含氨基載體，可以是單抗或抗體或抗原或免疫表位或特異結合免疫球蛋白 的物質，如葡萄球菌蛋白A(即SPA)，以及其他具有靶向結合的物質，如對肝癌具有較高親 和力的、人工結合了氨基乙醇(作為連接橋)的碘化油酯等。所述的半抗原與含氨基載體的結合物把半抗原二硝基苯結構結合到慢性感染病 原體的免疫抗原上，從而達到誘導，強化免疫防治腫瘤，慢性感染目的。 本發明中，所述的半抗原DNFB或DNCB與所述的載體的結合通過載體上的氨基， DNFB在微鹼性條件下，二硝基苯部分置換氨基上的氫，與氨基共價結合。本發明的進一步目的是提供所述半抗原與含氨基載體的結合物的製備方法。本發明經實驗表明，在一定範圍內，DNFB的結合對HBIG的抗體效價沒有影響，免 疫球蛋白(抗體)抗體可以作為半抗原二硝基氟苯免疫靶向治療的有效載體。本發明採用 Sanger' s反應，其中的半抗原DNFB或DNCB通過載體上的氨基，DNFB在微鹼性條件下，二 硝基苯部分置換氨基上的氫，與氨基共價結合製得到半抗原與含氨基載體的結合物。本發明所述的載體可以是用於免疫測定的抗體或抗原，結合利用針對單一抗原 (如DNFB)的單抗，可使測定信號放大；重複間隔循環使用，可使測定信號擴增；銜接有關的 量化顯示方法，可使檢測微量靶向載體的靶向物(如抗原性，抗體性物質)的敏感性提高。本發明中，每個載體結合半抗原分子數由載體所含有的游離氨基數決定，載體在 最大量結合半抗原分子的同時，必須不影響載體的靶向結合功能，該最大有效結合數是決 定免疫信號擴增的最大因素。本發明的進一步目的是提供所述以上物質在微量檢測以及防治腫瘤，慢性感染方 面的用途。本發明利用半抗原在一定範圍內，在一個蛋白、抗原或抗體中結合2-200半抗原 DNFB分子後其免疫性不變的特性，並以抗DNFB的單抗測定可提高測定信號的方法，提供一種對免疫測定(如ELISA)明顯提高靈敏度1-200倍的方法及診斷用試劑。本發明中，半抗原二硝基苯結構共價結合到靶向抗體、抗原或單抗，或腫瘤抗原，或腫瘤抗原表位，或感染病原體的抗原，或病原體抗原表位，或特異結合免疫球蛋白的物 質，如葡萄球菌蛋白A(SPA)，腫瘤高親和力蛋白或短肽，及其他具有導向或靶向作用的結構 中含氨基的物質中產生偶聯體，能發揮半抗原免疫的靶向治療作用，可作為治療劑，或防治 用疫苗，可誘導，帶動，強化特異免疫，對防治腫瘤，慢性感染性疾病實施免疫預防或治療。所述的慢性感染疾病可以是慢性B型肝炎，慢性C型肝炎等。本發明的結合物還用於微量定性定量分析檢測，組織組化染色。本發明中，含半抗原二硝基苯結構在體內誘導細胞免疫作為殺傷作用彈頭，結合 具有靶向作用的載體，對癌瘤，慢性感染具有特異識別力，在靶向病灶部位，利用其強有力 的半抗原細胞免疫，在局部誘導多種免疫活化因子，改善局部免疫微環境，實現施強化免疫 治療癌瘤或感染。本發明經實驗顯示，所述的半抗原二硝基氟苯在體外沒有免疫系統參與的情況 下，可直接抑制肝癌細胞，以MTT法測定其IC50為32. 22 μ Μ, IC90為49. 53 μ Μ，雖然同時 測定的5氟尿嘧啶(5-FU)的IC50雖較DNFB明顯為小，為3. 62 μ Μ,但IC90卻> 200 μ Μ, 提示半抗原二硝基苯結構可作為前藥(prodrug)結構設計藥物，表明二硝基苯結構共價結 合後的化合物具有直接抗癌作用。本發明的半抗原DNFB或DNCB與含氨基載體的結合物可 進一步製備防治腫瘤的藥物。與現有抗癌藥相比，本發明可明顯有激活，誘導，強化特異免疫發揮作用，通過注 射或血管介入治療，適用於肝癌、直腸癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌及淋巴瘤，局 部浸潤性型白血病等的治療，也可直接或與其他藥物混合用於局部治療，腹腔，胸腔等腔隙 治療等。


圖1是小鼠肝癌瘤內注射抑瘤效果，其中顯示，DNFB瘤內注射小鼠皮下移植瘤結果，D溶液為DNFB Img溶0. Iml磷酸 緩衝液(PBS)，無水乙醇(ETH)為0. 1ml，對照組為0. Iml的PBS溶液。D溶液及ETH組抑瘤 率分別為74. 43%, 59. 2%，兩者與對照組相比均有顯著差異(ρ分別< 0. 01及< 0. 05)。圖2是吸光度變化，其中顯示了，在500ul磷酸氫鈉(PBS)緩衝溶液體系中，2mg，4mg，Omg (即對照組) DNFB與13mg高效價B肝免疫球蛋白(HBIG)結合後對半系列稀釋測定的效價比較，經雙因 素方差分析無差異(P < 0. 05)，以紫外分光光度法測定，結合內標定量，2mg，4mg結合體系 中，分別有6. 12%,7. 86%的胺基酸殘基實現了與HBIG的結合。
具體實施例方式下述通過實施例進一步說明本發明，但不能限制本發明的內容。實施例1以半抗原二硝基氟苯和抗B型肝炎表面抗原的單克隆抗體為反應原料，在弱鹼性 條件下，通過Sanger』 s反應，氟脫落結合單抗中氨基上的氫，把二硝基苯部分置換共價結合到氨基上，獲得目標產物二硝基苯共價結合的B肝表面抗原單抗，其中一個目標產物中， 結合率為二硝基苯有1-200個，該結合量不影響單抗的特異識別功能。上述半抗原也可採用二硝基氯苯，二硝基溴苯，或二硝基碘苯。經免疫測定(如ELISA)，結果顯示，免疫反應測定信號放大高達200倍，明顯提高 免疫測定的靈敏度。常溫下把結合B肝免疫球蛋白(HBIG(13mg/500ul PBS)水溶液分別與不同劑量 (2，4，8mg)的半抗原二硝基氟苯(DNFB)混合，分別組成二毫克管，四毫克管，八毫克管，混 勻過夜後離心，僅見八毫克管的HBIG水溶液出現沉澱，二毫克管，四毫克管及未加DNFB的 HBIG水溶液對照管，各取半量作對半稀釋後分別以HiTrap分子篩柱脫鹽，三個洗脫液再分 別作對半系列稀釋11次，使二毫克管，四毫克管及對照組分別各組成12個標本，共36個標 本。以ELISA法分別檢測B肝表面抗體的效價。取二毫克 管，四毫克管的另一半分別予飽 和硫酸銨沉澱後取上清，分別以紫外光光度分析儀測定A34tl,與加入不同劑量DNFB的五個 系列濃度作內標的對照管上清相比較，推算二毫克管，四毫克管上清中DNFB的剩餘含量， 從而計算相應管中HBIG結合掉的DNFB量。結果顯示二毫克管，四毫克管及對照組，經雙因素方差分析及q檢驗，三組間同 稀釋度間吸光差值(OD45tl-OD63tl)無差異(ρ > 0.05)，而各稀釋度間則有非常顯著差異(ρ < 0. 01)。飽和硫酸銨沉澱結合分光光度法測定證實二毫克管，四毫克管中6. 5mg HBIG分 別了結合了 0. 67mg禾口 0. 86mg的DNFB，相當於每mg的HBIG分別結合了 0. 104mg及0. 132mg 的DNFB，即每一個HBIG分子分別結合了 88. 72及113. 48個DNFB半抗原分子，約佔HBIG氨 基酸殘基的6. 12%和7. 86%。實驗證實在一定範圍內，DNFB的結合對HBIG的抗體效價 沒有影響，免疫球蛋白(抗體)可作為半抗原DNFB免疫靶向治療慢性病毒感染或腫瘤的一 種有效載體。實施例2按實施例1的製備方法，採用二硝基苯共價結合的腫瘤或感染靶向製劑，製備由 半抗原誘導的免疫靶向治療腫瘤藥物，或/和由二硝基氟苯作為原藥直接具有的抗癌作 用。結果顯示，結合比率同實施例1 ；DNFB瘤內注射小鼠皮下移植瘤抑瘤率良好。所述的腫瘤或感染靶向製劑可選自抗HER-2單抗赫賽丁或B肝單抗。實施例3按實施例1的製備方法，採用二硝基苯共價結合的腫瘤或慢性感染病原體的免疫 抗原或抗原表位製備由半抗原誘導建立，或強化特異免疫的防治藥物。如DNFB結合B肝表 面抗原，DNFB結合黑色素瘤腫瘤消退抗原表位等，可用於特異性預防或作為腫瘤治療性疫 苗等，結果顯示，其結合比率同實施例1。所述的靶向治療腫瘤或慢性感染藥物其特徵是以 具有靶向作用的化合物作為結合腫瘤的導向部分，與半抗原決定簇部分以共價結合，實施 腫瘤或慢性感染的靶向治療。表1 體外對SMMC-7721肝癌細胞株48小時細胞存活率(MTT法，六孔值的均數)。測試終濃度 二硝基氟苯(DNFB) 五氟尿嘧啶(5-FU)OuM1001002uM102. 9953. 03IOuM101. 3238. 08
50uM8. 9217. 82IOOuM1. 5416. 55 200uM1. 3413. 37估計IC5032. 22uM3. 62uM估計IC9049. 53uM> 200uM表2 =DNFB及5_FU分別對SMMC-7721肝癌細胞株48小時細胞存活率(在0，2， 10，50，100，200uM時，MTT法測定的六孔具體數值)DNFB 組1.062 1.072 1.066 1.124 1.213 1.2311. 107 1. 114 1. 176 1. 1451. 121 1. 2971. 126 1. 074 1. 210 1. 144 1. 135 1. 1640. 192 0. 148 0. 147 0. 1450. 142 0. 1400. 065 0. 079 0. 085 0. 0670. 074 0. 0700.063 0.067 0.076 0.0710.076 0.0745-FU 組1. 204 1. 190 1. 156 1. 2221. 282 1. 3910. 662 0. 675 0. 666 0. 6770. 726 0. 7020. 484 0. 507 0. 476 0. 4800. 520 0. 5790. 235 0. 250 0. 279 0. 2580. 279 0. 3060. 223 0. 244 0. 244 0. 2410. 270 0. 2950. 200 0. 214 0. 207 0. 2280. 222 0. 220無細胞對照組0. 054 0.057 0.060 0.0510. 054 0.065。
權利要求
一種半抗原與含氨基載體的結合物，其特徵是所述的半抗原與含氨基載體的結合物所述結構包括其同分異構體，具有式(I)的結構F2009100491746C0000011.tif
2.按權利要求1所述的半抗原與含氨基載體的結合物，其特徵是所述的半抗原為二硝 基氟苯或二硝基氯苯。
3.按權利要求1所述的半抗原與含氨基載體的結合物，其特徵是所述的含氨基載體， 選自單抗或抗體或抗原或免疫表位或特異結合免疫球蛋白的物質，及其他具有靶向結合的 物質。
4.按權利要求3所述的半抗原與含氨基載體的結合物，其特徵是所述的特異結合免疫 球蛋白的物質是葡萄球菌蛋白。
5.按權利要求3所述的半抗原與含氨基載體的結合物，其特徵是所述的其他具有靶向 結合的物質選自對肝癌具有較高親和力的或人工結合了氨基乙醇的碘化油酯。
6.權利要求1或2的半抗原與含氨基載體的結合物的製備方法，其特徵是所述的半抗 原與載體的結合是通過載體上的氨基，在微鹼性條件下，二硝基苯部分置換氨基上的氫，與 氨基共價結合反應得到。
7.權利要求1的半抗原與含氨基載體的結合物在免疫微量測定中的應用。
8.權利要求1的半抗原與含氨基載體的結合物在製備防治腫瘤藥物中的用途。
9.權利要求1的半抗原與含氨基載體的結合物在製備防治慢性感染疾病藥物中的用途。
全文摘要
本發明屬藥物合成領域，涉及一種半抗原與含氨基載體的結合偶聯物及其製備方法和用途。本發明通過Sanger’s反應獲得半抗原與含氨基載體的結合偶聯物。利用半抗原的免疫性以及載體功能，結合使用針對半抗原的單抗，可在微量測定時放大信號，明顯提高測定的靈敏度。含半抗原二硝基苯結構在體內誘導細胞免疫作為殺傷作用彈頭，結合具有靶向作用的載體，對癌瘤，慢性感染具有特異識別力，在靶向病灶部位，在局部誘導多種免疫活化因子，改善局部免疫微環境，實現施強化免疫治療癌瘤或感染。本發明的結合物可用於免疫微量測定，製備防治腫瘤的藥物。
文檔編號A61P35/00GK101856497SQ20091004917
公開日2010年10月13日 申請日期2009年4月10日 優先權日2009年4月10日
發明者何曉俊, 儲豔秋, 匡春香, 戴兆雲, 方明珠, 蔣公羽, 黃偉達 申請人:復旦大學附屬華東醫院