禽卡氏桿菌溶血素基因pcr診斷試劑盒的製作方法
2023-06-25 09:04:06 2
專利名稱：禽卡氏桿菌溶血素基因pcr診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，尤其是一種禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒。
背景技術：
禽卡氏桿菌病是近年來新發現的蛋雞的一種傳染病，是由卡氏桿菌 (Gallibacterium anatis)引起蛋雞群的一種產蛋量下降的疾病，臨床上以輸卵管囊腫和卵巢炎等為主要特徵。卡氏桿菌不僅是禽卡氏桿菌病的病原，而且還能夠引起其他多種禽類患病。卡氏桿菌常與雞減蛋症候群病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、黴形體、禽肺病毒等病原混合感染，使病情加重和複雜化，給養禽業帶來了巨大的經濟損失。有些觀點認為，該菌是雞和其他禽類上呼吸道正常菌群，但是有報導顯示在不同生物安全系統中檢測雞群的帶菌狀態，有些雞為陰性。至於該菌如何從上呼吸道突破屏障變為系統感染以及該菌對正常雞的健康狀況照成何種影響，現在還沒有闡明。最簡單的描述，該菌是帶有莢膜的，非運動的細菌，同時大部分菌株具有溶血活性。溶血素是該菌一種重要的毒力因子，現在缺少一種能對臨床樣品中的禽卡氏桿菌病溶血素毒力基因進行簡便、快捷、靈敏、準確的試劑盒。
發明內容
本發明的目的是提供一種禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，它可以快速檢測到分離到的禽卡氏桿菌是否含有溶血素這個重要的毒力基因，並且簡便、靈敏、準備。本發明是這樣實現的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，它包括500 μ 1 濃度為25 mg/ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩衝液，50 μ IPCR酶，200 μ 1超純水，30 μ 1的Marker DL2000,50y 1等體積混合的引物PI, P2，引物PU P2的濃度均為 20 μ M, 30 μ 1的陰性對照以及30 μ 1的陽性對照。裂解液為由！"ris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH為8. 0，以及佔裂解液總體積5%的 triton X-100組成的混合溶液。PCR 酶的組分包括 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/μ 1。引物Ρ1，Ρ2的序列分別為 陰性對照為去離子水；
陽性對照為重組PMD18-T-gtxA質粒。PCR方法的建立
PCR體系在25 μ 1反應體系中最佳反應條件為，退火溫度60° C，Taq DNA polymerase 1 U，引物濃度ΙΟμΜ，用引物均有效擴增出了其目的片段，片段大小為116^p。無非特異性片段產生(見圖1)。結果表明禽卡氏桿菌溶血素基因PCR檢測方法建立成功。
敏感性試驗
在PCR反應中，10CFU/ml 1 X IO8 CFU/ml稀釋的卡氏桿菌進行PCR，卡氏桿菌溶血素基因的最低檢測量為100 CFU (見圖2)。結果表明建立的PCR敏感性高。特異性試驗
以禽卡氏桿菌、豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌進行PCR反應。 禽卡氏桿菌為陽性，而豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌的擴增結果均為陰性(見圖3)。應用建立的PCR方法，重複檢測卡氏桿菌DNA樣品3次，結果均一致。從實驗結果可以知道禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒能夠對臨床中禽卡氏桿菌溶血素基因進行快捷、靈敏、準確的檢測。由於採用了上述技術方案，本發明通過對PCR反應條件進行優化，研製了檢測禽卡氏桿菌溶血素基因PCR試劑盒，通過PCR檢測結果與陰性對照及陽性對照比較，可以得到檢測結論，從而起到快速檢測分離到的禽卡氏桿菌是否溶血素基因的目的。本發明檢測結果準確，並且快捷、靈敏，檢測方式簡單，使用效果好。
附圖1為禽卡氏桿菌溶血素基因PCR試驗圖；M :DL2000 ；1 禽卡氏桿菌溶血素基因PCR結果。附圖2為禽卡氏桿菌溶血素基因PCR敏感性試驗圖；M:DL2000 ；1 8 =IXlO8 CFU/ml 10CFU/ml稀釋的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR結果。附圖3為PCR特異性試驗圖；M :DL2000 ；1 溶血素陽性的禽卡氏桿菌PCR產物；2 溶血素陰性的禽卡氏桿菌PCR產物；3 豬鏈球菌PCR產物；4 多殺性巴氏桿菌PCR產物；5 鼠傷寒沙門氏菌PCR產物；6 大腸桿菌PCR產物。
具體實施例方式
具體實施例方式禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，它包括500 μ 1濃度為25 mg/ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩衝液，TE緩衝液的具體組成成分為 Tris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH 為 8. 0 ；50 μ IPCR 酶，PCR 酶為自配的 PCR 預混液，其具體成分為 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/ μ 1 ；200 μ 1 超純水，30 μ 1 的 Marker DL2000, 50 μ 1 等體積混合的引物Pl，Ρ2，引物PI、Ρ2的濃度均為20 μ Μ，30 μ 1的陰性對照以及30 μ 1的陽性對照。
權利要求
1.一種禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特徵在於它包括500 μ 1濃度為25 mg/ml的蛋白酶K，1500 μ 1裂解液，2000 μ ITE緩衝液，50 μ IPCR酶，200 μ 1超純水，30 μ 1 的Marker DL2000, 50 μ 1等體積混合的引物Pl，Ρ2，引物PI、Ρ2的濃度均為20 μ Μ，30 μ 1 的陰性對照以及30 μ 1的陽性對照。
2.根據權利要求1所述的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特徵在於裂解液為由！"ris-base 50mM, EDTA 2 mM，pH為8. 0，以及佔裂解液總體積5%的triton X-100 組成的混合溶液。
3.根據權利要求1所述的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特徵在於PCR 酶的組分包括 IOmM 的 Tris-base，50mM 的 KCl、3mM 的 MgCl2、25mM 的 dNTP Mixture 以及 0. 5U 的 Taq DNA polymerase/μ 1。
4.根據權利要求1所述的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特徵在於引物 PI, Ρ2 的序列分別為P1 :CTCCACGGCAGTACACGA ；P2 :GGCGGTAGAGGCATTAGA。
5.根據權利要求1所述的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特徵在於陰性對照為去離子水。
6.根據權利要求1所述的禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，其特徵在於陽性對照為重組PMD18-T-gtxA質粒。
全文摘要
本發明公開了一種禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，它包括500μl濃度為25mg/ml的蛋白酶K，1500μl裂解液，2000μlTE緩衝液，50μlPCR酶，200μl超純水，30μl的MarkerDL2000，50μl等體積混合的引物P1，P2，引物P1、P2的濃度均為20μM，30μl的陰性對照以及30μl的陽性對照。本發明通過對PCR反應條件進行優化，研製了禽卡氏桿菌溶血素基因PCR診斷試劑盒，通過PCR檢測結果與陽性對照和陰性對照比較，得出檢測結論，從而起到快速鑑定菌株中是否含有禽卡氏桿菌溶血素基因。本發明檢測結果準確，並且快捷、靈敏，檢測方法簡單，使用效果確實。
文檔編號C12Q1/68GK102251049SQ20111022709
公開日2011年11月23日 申請日期2011年8月9日 優先權日2011年8月9日
發明者馮惠明, 孫志華, 徐安衡, 李武魁, 楊向東, 楊德明, 許玉清 申請人:昆明雲嶺廣大種禽飼料有限公司