用於培養絲狀真菌的培養基的製作方法
2023-06-15 03:11:21
專利名稱：用於培養絲狀真菌的培養基的製作方法
技術領域：
本發明涉及控制植物病害試劑的技術領域，特別地是涉及用於培養絲狀真菌(filamentaryfungi)的培養基，更具體地是涉及用於培養食線蟲真菌(nematophagus fungi)的培養基。
背景技術：
使用微生物特別是真菌作為控制植物病害的試劑已日益普及。以真菌為基礎的產品已經市場化，該產品用於對抗昆蟲、植物真菌或其它農作物寄生蟲類。
例如，美國專利5 811 092描述了用於殺滅線蟲的試劑，該試劑能殺滅跟結線蟲屬(Meloidogyne)、Hetherodera、莖線蟲(Ditylenchus)的一類線蟲，特別是絲狀真菌的Arthrobotrys conoides Dreschsler株。
上述線蟲是造成蔬菜和菌類嚴重疾病的罪魁禍首，並造成了巨大的經濟損失，導致50-70％的收割損失。
使用食線蟲真菌可作為一種傳統的在耕作之前施用在土壤中的抗寄生物化學藥劑(例如溴化甲烷、三氯硝基甲、二氯丙烯等)或直接作用於農作物的氨基甲酸鹽的替代物。這些抗寄生物的化學藥劑和氨基甲酸鹽會引起一系列問題，例如土壤不育、破壞生態平衡以及潛在的對人和動物的毒性，因此需避免使用。
因而，食線蟲真菌特別合適用於有機農業中，但由於它仍需要相當高的成本，因此，難於工業性地高產量生產。
這樣，所以，需要獲得一種廉價的食線蟲真菌可用於農業生產中。
本發明需要解決的問題就是提供一種用於培養絲狀真菌、特別是食線蟲真菌的培養基，該培養基允許這樣的微生物在工業水平、快速、高產量地生長，從而降低終產物的生產成本。
發明內容
根據本發明提供的一種用於培養絲狀真菌的培養基，上述問題已被解決。該培養基包括至少一種碳源，該碳源選自糖蜜、麥精和蔗糖；以及至少一種有機氮源，該有機氮源選自酵母提取物和玉米漿。
更適宜的是，上述的至少一種碳源的重量含量為所述培養基的乾重的70-85％，上述的至少一種氮源的重量含量為所述培養基的乾重的15-30％。
根據本發明所述的培養基還可以包括礦物氮源，硝酸銨或銨鹽。上述礦物氮源通常是在真菌生長時期逐漸加入到培養基而總量不高於所述培養基幹重的10％，通常重量含量在5-8％之間。
本發明所述培養基的優選的成份為由75-85％的麥精，和15-25％(該百分率—如本說明書的其餘部分所描述的一樣—是培養基的乾重的重量百分含量)的酵母提取物組成。
根據本發明的另一種優選的培養基含有60-65％糖蜜，10-15％蔗糖，10-15％的玉米漿，10-15％的酵母提取物。優選地，該培養基還含有5-8％的礦物氮源，特別是磷酸氫二銨。
根據本發明，另一種優選的培養基含有兩種碳源，即重量含量為25-30％的麥精和重量含量為40-45％的糖蜜，以及重量含量為25-30％的玉米漿。
具體實施例方式
本發明將根據實施例做進一步的描述，但其僅為例證性的目的而不起到限制性作用。
在對實施例描述前，我們認為，提供一些關於培養基的成份的說明將有助於理解本發明。
麥精和/或糖蜜和/或蔗糖被用作為碳源。
麥精是由穀類作物(通常是大麥)的芽得到的。在萌芽時，產生特殊的酶(澱粉酶)，其能將澱粉轉化為糖類。所述麥精含有大約60％的麥芽糖，維生素以及眾多微量元素。
糖蜜是工業糖的副產物，為黑褐色的黏性液體，含有10％的水，35％的蔗糖，20％的其它糖和15％灰渣物質。
酵母提取物和玉米漿用作有機氮源。
酵母提取物是通過啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的自我分解得到的，為淡黃色的精細粉末，易溶於水。該酵母提取物含有多肽、游離胺基酸、嘌呤和嘧啶基，以及可溶於水的維生素B族。所述酵母提取物具有10％的總氮含量以及5％α-amminic氮含量。
所述玉米漿是通過在50℃將玉米浸泡在含有二氧化硫的水中24-48小時而得到的。在浸泡時該反應物允許圍繞在澱粉周圍的蛋白質網狀物變性並對抑制不合需要的微生物的增長提供有利條件。所述玉米漿的總氮含量為7％，α-amminic氮含量為1.7％，並還含有5％的糖、4％的鉀、3％的磷以及17％的各種礦物質。
上述所提到的各種基於碳源和氮源的培養基已通過測試。這些培養基能可以分成以下三類-第1類以麥精作為主要碳源的培養基；-第2類以糖蜜作為主要碳源的培養基；-第3類以麥精和糖蜜作為主要碳源的培養基。
根據本發明所述培養基的有機氮源的含量可以減少，可用無機氮源(硝酸銨或無機氮化合物)替代部分所述的有機氮源，在培養時小量地逐步加入到培養基中。
在培養時添加的無機氮可提供予微生物更好的營養，並且，對於絲狀真菌而言，能加固其菌絲體。
用無機氮源替代部分所述的有機氮源還具有降低產物成本的優點，因為有機氮源(酵母提取物和玉米漿)是本發明所述培養基中最昂貴的成份。
根據本發明所述的培養基特別適合於Moniliales(叢梗孢目)族中的絲狀真菌的培養，特別地，在以下的實施例中，Arthrobotrys conoides Dreschsler絲狀真菌將被用到。
實施例1有關第1類的培養基絲狀真菌生長在含有150ml培養基的300ml Erlen燒瓶中。
培養基中含有20g/l的麥精和4g/l的酵母提取物，該培養基在接種真菌孢子之前已被滅菌。
接種後在27℃培養6天。從開始後的第三天，在培養基中取樣去檢測乾重(g/l)和繁殖體的數量(CFU/l)。為了檢測乾重，20ml的培養基被過濾並被在乾燥箱中100℃乾燥24小時。在1ml的培養基中測定繁殖體的數量。
總的結果可從以下表1得到表1
實施例2重複實施例1的試驗，試驗在含有1.2升如實施例1所述的培養基、容量為2升的袖珍型反應器中進行。試驗條件和實施例1一樣，唯一不同的是在孢子接種後的第一天開始取樣。
所述袖珍型反應器是具有圓形底部、刀片式攪拌器、加熱和冷卻裝置、鼓風裝置以及pH測量計和溫度計的容器。
總的結果可從以下表2得到
表2
實施例3有關第2類的培養基絲狀真菌在含有150ml培養基的300ml Erlen燒瓶中進行培養。
培養基中含有25g/l的糖蜜和5g/l的蔗糖，5g/l的玉米漿，5g/l的酵母提取物。該培養基在接種真菌孢子之前已被滅菌。
接種後在27℃培養6天。
開始後的第三天，在培養基中取樣去檢測乾重(g/l)和繁殖體的數量(CFU/l)。為了檢測乾重，20ml的培養基被過濾並被在乾燥箱中100℃乾燥24小時。在1ml的培養基中測定繁殖體的數量。
總的結果可從以下表3得到表3
實施例4重複實施例3的試驗，試驗在含有1.2升如實施例3所述的培養基、容量為2升的如實施例2所述的袖珍型反應器中進行。試驗條件和實施例3一樣，唯一不同的是在孢子接種後的第天開始取樣。
總的結果可從以下表4中得到表4
結果表明，從第5天開始，可能會出現異常，但這僅僅是由於培養基中的真菌過度密集而引起的，這樣不允許再採取相似的樣本。
最後的樣本直接來自反應器。
這樣，在第7天時，每升培養基中可獲得具有3.77×109繁殖體的、多於10g的真菌。
實施例5絲狀真菌培養在含有150ml的培養基的300ml Erlen燒瓶中。
培養基中含有15g/l糖蜜膏、10g/l的麥精和10g/l玉米漿，該培養基在接種真菌孢子之前已被滅菌。
接種後在大約27℃培養6天。從開始後的第三天，在培養基中取樣檢測乾重(g/l)和繁殖體的數量(CFU/l)。為了檢測乾重，20ml的培養基被過濾並被在乾燥箱中100℃乾燥24小時。在1ml的培養基中測定繁殖體的數量。
總的結果可從以下表5中得到
表5
實施例6重複實施例5的試驗，試驗在含有1.2升如實施例5所述的培養基、容量為2升的如實施例2所述的袖珍型反應器中進行。試驗條件和實施例5一樣，唯一不同的是在孢子接種後的第一天開始取樣。
總的結果可從以下表6中得到表6
在第7天中，每升培養基中可獲得含有2.22×109繁殖體的、多於10g的真菌。
實施例7為了減少兩種價格最昂貴的有機氮成份的含量，實施例3所述的培養基改良如下25g/l糖蜜，5g/l蔗糖、2.5g/l玉米漿、2.5g/l的酵母提取物。
利用這樣的培養基，通過上述真菌類，培養試驗(A)與另兩個培養試驗(B and C)做比較，培養試驗(B and C)中用了同樣的培養基，以及隨後從第四天開始在培養基中加入礦物氮源。
在試驗B中，0.21g的磷酸氫二銨從第四天起(最好是第4天、第6天、第8天)加入三次，總的添加量為0.63g。在試驗C中分三次加入磷酸氫二銨，每次0.28g，同樣是從第四天起(最好是第4天、第6天、第8天)，總的添加量為0.84g。
該試驗在500ml Erlen燒瓶中進行，並且含有300ml培養基的燒瓶在接種真菌孢子前滅菌。
在第9天和最後一天培養中，試驗(A)中培養基總氮含量相等於0.85g/l，而加入了磷酸氫二銨的培養基中，總氮含量分別等於1.05g/l(A)，1.26g/l(B)。
從開始後的第三天起，從培養基中每隔一天取樣測定乾重(g/l)和繁殖體的數量(CFU/l)。為了檢測乾重，20ml的培養基被過濾並被在乾燥箱中100℃乾燥24小時。在1ml的培養基中測定繁殖體的數量。
總的結果可從以下表7中得到表7
MS＝乾重(g/l)。
CFU＝繁殖體/升可從以上表中看出，從培養的第七天起，在相同的培養時間內，因為添加了無機氮源，特別是少量(試驗B)的添加，從而相當可觀地提高了乾重，並且，繁殖體數量的增加大於100％。
權利要求
1.一種用於培養絲狀真菌的培養基，其特徵是，該培養基包含至少一種碳源，該碳源選自糖蜜、麥精和蔗糖；以及至少一種有機氮源，該有機氮源選自酵母提取物和玉米漿。
2.根據權利要求1所述的用於培養絲狀真菌的培養基，其特徵是，所述的至少一種碳源的重量含量為所述培養基幹重的70-85％，所述的至少一種氮源的重量含量為所述培養基幹重的15-30％。
3.根據權利要求1或2所述的用於培養絲狀真菌的培養基，其特徵是，所述的培養基還包含礦物氮源。
4.根據權利要求3所述的用於培養絲狀真菌的培養基，其特徵是，所述礦物氮源的重量含量不高於所述培養基幹重的10％，優選在5-8％之間。
5.根據權利要求3或4所述的用於培養絲狀真菌的培養基，其特徵是，所述礦物氮源為硝酸銨或銨鹽。
6.根據權利要求1或2所述的用於培養絲狀真菌的培養基，其特徵是，培養基為由重量含量為75-85％的麥精和15-25％的酵母提取物組成，所述重量含量是所述培養基幹重的重量百分比。
7.根據權利要求1或2所述的用於培養絲狀真菌的培養基，其特徵是，所述培養基包含有60-65％糖蜜，10-15％蔗糖，10-15％的玉米漿，10-15％的酵母提取物。
8.根據權利要求7所述的用於培養絲狀真菌的培養基，其特徵是，所述培養基還含有5-8％的礦物氮源。
9.根據權利要求8所述的用於培養絲狀真菌的培養基，其特徵是，所述的礦物氮源是磷酸氫二銨。
10.根據權利要求1或2所述的用於培養絲狀真菌的培養基，其特徵是，所述培養基包括重量含量為25-30％的麥精、40-45％的糖蜜，以及25-30％的玉米漿，所述重量含量為所述培養基幹重的重量百分比。
11.一種在工業水平培養絲狀真菌—特別是食線蟲真菌的方法，其特徵是，包括以下步驟在如權利要求1和2所述的培養基中接種所述真菌的孢子；所述培養基在23-27℃培養5-10天；測定所述真菌的繁殖和生長量。
12.根據權利要求11所述的培養方法，其特徵是，還進一步包括，從真菌孢子接種後的第4天起逐漸加入小量的礦物氮源。
13.根據權利要求11所述的培養方法，其特徵是，所述礦物氮源選自硝酸銨和銨鹽，其加入的總量不高於所述培養基幹重的10％，優選在5-8％之間。
全文摘要
本發明公開了一種用於培養絲狀真菌的培養基，該培養基含有至少一種碳源，該碳源選自糖蜜、麥精和蔗糖；以及至少一種有機氮源，該有機氮源選自酵母提取物和玉米漿。本發明還公開了一種在工業水平培養絲狀真菌－特別是食線蟲真菌的方法，該方法包括以下步驟在如權利要求1和2所述的培養基中接種所述真菌的孢子；所述培養基在23－27℃培養5－10天；測定所述真菌的繁殖和生長量。
文檔編號C12N1/14GK1926230SQ200580004379
公開日2007年3月7日 申請日期2005年2月8日 優先權日2004年2月11日
發明者伊莉莎白·潘卡-米拉貝爾 申請人:卡薩勒尿素股份有限公司