一種抗5-羥甲基糠醛的抗體的製作方法

2023-06-07 22:35:06 3

專利名稱：一種抗5-羥甲基糠醛的抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及選擇一種具有-COOH的、又最大可能包含5-羥甲基糠醛原有結構的化合物作為5-羥甲基糠醛半抗原，並將半抗原製成抗原、進而產生抗體；以及此類半抗原、抗原的合成與抗體製備方法。本發明屬於生物技術領域。
背景技術：
近年來，隨著生活水平的提高，油炸食品中的有害致癌物質已經引起人們的廣泛關注。5-羥甲基糠醛是油炸食品中的一種普遍存在的物質。它是具有一個呋喃環結構的糠醛化合物，主要是由己糖在酸和加熱條件下分解而產生的。它廣泛存在於含有糖類物質的食品中，如麵包、薯片、蘋果汁、速溶咖啡、嬰兒乳製品、蜂蜜、牛奶等。有關研究表明5-HMF可能會引發並促進結腸小囊異常生長(ACF)，具有一定程度的基因毒性，並且對眼、黏膜或皮膚有刺激性，食之過多會引起中毒，造成動物橫紋肌麻痺和內臟損害。儘管關於5-羥甲基糠醛的毒副作用還存在著一定爭議，但是它的研究及檢測對醫學領域同樣有著重要的參考依據。按照GB18796-2005中規定蜂蜜中5-羥甲基糠醛最大含量不得超過40ug/g，國際果汁加工聯合會(IFFJP)建議果汁中5-羥甲基糠醛的最大殘留限量為5 10ug/ml，濃縮果汁中最大殘留限量為25ug/ml。然而，由於5-羥甲基糠醛的分子量為126.1，小於1000dolton(道爾頓)，一般傳統上採用液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)或質譜等物化方法對其殘留進行檢測。雖然這些傳統的理化分析方法靈敏度較高，而且較為準確，但由於它們普遍操作繁瑣複雜、成本較高、分析速度慢，所以難以滿足實際分析的需要，因此迫切需要發展一種簡單、快速、靈敏的分析技術。而免疫分析技術正是一種快速、靈敏、操作簡單、費用低的檢測技術。其基本原理認為:抗原抗體的免疫反應涉及分子間的立體結構，電荷、氫鍵及範德華引力作用等諸多因素，具有極高特異性和靈敏性，遵循質量作用定律，不僅可體內進行，也可體外進行，這些特點使其能被利用建立免疫分析方法，可達到傳統理化分析技術無法達到的選擇性和靈敏度。所以，免疫分析為5-羥甲基糠醛殘留研究提供了一條新的分析檢測途徑。

發明內容
本發明設計合成了小分子目標分析物半抗原，並與載體蛋白質偶聯，製備有效人工抗原，免疫動物製備針對小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學反應和易被檢測識別的標記物的放大作用，從而定性定量的檢測樣本中超微量小分子目標物，可用於樣本測定。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和全抗原及抗體的製備。本發明為達到 以上目的，所設計的技術方案是合成分子結構式如下圖所示的5-羥甲基糠醛半抗原，然後將半抗原與載體蛋白聯接合成人工抗原，免疫動物，獲得抗體。
權利要求
1.5-羥甲基糠醛的人工抗原和抗體其特徵在於使用分子式為
2.權利要求1所述的5-羥甲基糠醛人工抗原的製備方法，其特徵在於是用下述步驟製得: (1)半抗原的合成 將144.9mg 5-羥甲基糠醛加入少量新制的四氫呋喃溶液中使其溶解，再依次加入.4-二甲基吡啶140.3mg，三乙胺0.317ml，琥珀酸酐230mg，在60°C油浴中攪拌反應9個小時，溶劑在減壓條件下被除去，而殘留物用體積比為1: 9.5: 0.05的甲醇/ 二氯甲烷/冰乙酸溶解，初級產物通過色譜柱用體積比為1: 9.5: 0.05的甲醇/ 二氯甲烷/冰乙酸純化，所得到的產物經過收集，真空條件下旋轉蒸發而得到相對純淨的淡黃色半抗原； (2)半抗原活化酯的合成 精確稱取半抗原3.42mg溶於200 μ I N, N-二甲基甲醯胺(DMF)中，溶解後再加入.31.2Img的:N，N' - 二環己基碳二亞胺(DCC)和8.7Img N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，混合後於室溫避光條件下反應24h，取反應液於4000r/min，4°C條件下離心lOmin，取上清液作為含有活化酯的溶液I ; (3)人工抗原的合成 載體蛋白牛血清白蛋白(BSA) 20mg溶於4ml pH值為7.4的0.01mol/ml的磷酸鹽緩衝液(PBS)中，然後在冰浴條件下將含有活化酯的溶液I緩慢逐滴加入到BSA中，滴加完畢後放於4°C冰箱內過夜，將反應液裝入透析袋後，4°C下pH = 7.4的0.01mol/mL的PBS中透析3天，每天換透析液3-4次，透析完後，精確量取蛋白質偶聯物溶液的體積，測定濃度，分裝，-20°C保存；
3.權利要求1所述的5-羥甲基糠醛酶標抗原的製備方法，其特徵在於是用下述步驟製得: 取5-羥甲基糠醛半抗原1.03mg溶於200ul DMF中，再加入9.4mg DCC和2.62mg N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)，磁力攪拌避光反應24h合成活化酯。採用上述合成的活化酯4°C，4000r/min離心後取上清液作為溶液A，冰浴條件下將溶液A逐滴加入含5mg辣根過氧化酶(HRP)的濃度為130mmol/L，pH = 8.1的2ml碳酸氫鈉緩衝液中，4°C反應過夜，最後將反應液置入透析袋中，再在4°C下pH = 7.4的0.01mol/ml PBS中透析3天,每天換透析液3_4次，透析完後即可得到酶標抗原，用於顯色反應；
4.權利要求1所述的5-羥甲基糠醛抗體的製備方法，其特徵在於是用下述步驟製得: 免疫動物選用雄性紐西蘭大白兔，免疫方法採用皮下和肌肉注射法，初免後進行四次加強免疫，加強免疫分別於初次免疫後2周、4周、6周和8周後免疫四次，免疫後10天由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測，具體做法是: 初次免疫:取Img按照權利要求2所述方法合成的人工抗原溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配製的溶液中，進行動物免疫； 加強免疫:用1.0mg上述人工抗原溶於0.9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配製的溶液，進行動物免疫； 抗體純化:定時監測動物抗體效價，當抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，採集血液，並離心獲得抗 血清，使用G-S印harose蛋白親和層析柱對抗血清進行純化，獲得抗5_羥甲基糠醛的特異性抗體。
全文摘要
5-羥甲基糠醛的人工抗原和抗體的製備涉及具有5-羥甲基糠醛基本結構的半抗原、人工抗原和抗體的製備。本發明以簡便的方法製備了特異性良好的5-羥甲基糠醛的抗體。該抗體是以5-羥甲基糠醛與琥珀酸酐合成半抗原，然後分別與KLH和HRP連接合成人工抗原和酶標抗原。人工抗原再經動物免疫，取血，分出抗血清，純化制的抗體。該抗體穩定，具有良好的特異性和靈敏度，且合成方法簡單，可用於食品中5-羥甲基糠醛的快速免疫檢測，具有良好的應用前景。
文檔編號C07D307/46GK103073633SQ201110325900
公開日2013年5月1日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者方國臻, 張燕, 王俊平, 王碩, 呂燕顏 申請人:天津科技大學